Summary
在本报告中,我们提出了一种协议,允许研究人员生成眼内葡萄膜炎的小鼠模型。通常被称为实验性自身免疫性葡萄膜炎(EAU),这个已建立的模型捕获了人类疾病的许多方面。在这里,我们将描述如何使用几个读数来诱导和监测疾病进展。
Abstract
实验性自身免疫性葡萄膜炎(EAU)是由免疫细胞对自身抗原的反应驱动的。这种非感染性眼内炎症性疾病模型的许多特征概括了影响人类的后葡萄膜炎的临床表型。EAU已被可靠地用于研究新型炎症疗法的疗效,其作用方式,并进一步研究支持眼内疾病疾病进展的机制。在这里,我们提供了关于C57BL / 6J小鼠EAU诱导的详细方案 - 这是使用最广泛的具有这种疾病易感性的模式生物。疾病严重程度和进展的临床评估将通过眼底镜检查、组织学检查和荧光素血管造影进行。诱导程序包括皮下注射含有来自眼蛋白间光感受器类视黄醇结合蛋白(也称为视黄醇结合蛋白 3)的肽 (IRBP1-20)、完全弗氏佐剂 (CFA) 的乳剂,并补充杀死 结核分枝杆菌。 在颈部后部注射这种粘性乳剂,然后腹膜内注射 百日咳博德特 氏菌毒素。在症状发作(第12-14天)和全身麻醉下,拍摄眼底镜图像以通过临床检查评估疾病进展。这些数据可以直接与较晚的时间点和疾病高峰期(第20-22天)的数据进行比较,并分析差异。同时,该协议允许研究人员使用荧光素血管造影评估血管通透性和损伤的潜在差异。EAU可以在其他小鼠品系中诱导 - 野生型或转基因 - 并与新疗法相结合,为研究药物疗效和/或疾病机制提供灵活性。
Introduction
该协议将演示如何通过在乳化佐剂中单次皮下注射视网膜抗原来诱导C57BL / 6J小鼠中的实验性自身免疫性葡萄膜炎(EAU)。监测和评估疾病进展的方法将通过眼底成像和组织学检查进行详细说明,并在其中概述测量参数。此外,还将讨论荧光素血管造影,这是一种检查视网膜血管结构和通透性的技术。
该EAU模型概括了人类非感染性后葡萄膜炎在临床病理学特征以及驱动疾病的基本细胞和分子机制方面的核心特征。EAU由自反应CD4 + T淋巴细胞的Th1和/或Th17亚群介导,如过继转移实验和IFNγ耗尽小鼠所示1。我们对这些细胞在葡萄膜炎中潜在作用的大部分理解来自研究EAU2,其中在视网膜组织内检测到Th1和Th17细胞3。通常,EAU被用作临床前模型来评估新疗法在减轻疾病方面的效用。成功调节EAU疾病的治疗方法在临床上显示出一定的疗效,并达到了FDA批准的地位。例如一组免疫调节药物,例如T细胞靶向疗法:环孢素,FK-506和雷帕霉素4,5,6。最近,在该模型中还探索了针对新途径的干预措施,以研究对疾病结果的机制和影响。这些包括通过染色质读取器Bromodomain末端外(BET)蛋白和P-TEFb抑制剂靶向转录调节3。此外,更传统的方法(如VLA-4抑制剂)最近已证明通过调节效应CD4 + T细胞抑制EAU7。此外,还发现用 RORγt 反向激动剂 TMP778 靶向 Th17 细胞可显着抑制 EAU8。此外,该模型为研究视网膜中的慢性自身免疫性炎症以及伴随的潜在机制(如淋巴细胞启动)提供了机会。
EAU临床前研究的主要读数是通过进行视网膜眼底镜成像进行临床评估,较少通过光学相干断层扫描(OCT)评估视网膜完整性。然后在终止时通过流式细胞术进行视网膜组织病理学评估和视网膜细胞的免疫表型。眼底镜检查是一种易于使用的实时成像系统,可以对整个视网膜进行快速且可重复的临床评估。对于免疫组织化学评估,这些技术基于视网膜切片的制备,使我们能够研究炎症和结构损伤程度的组织结构9。该协议将概述所有所用技术的评估标准和常规评分系统。使用眼底镜成像记录的损伤程度通常与组织学变化密切相关。这种监测和评估疾病严重程度的双重方法提供了更高的灵敏度和更可靠的测量结果。
EAU是一种成熟的常用模型,用于免疫介导的眼病的临床前测试和调查。该模型可靠且可重复,疾病发病率>95%,并生成全面的数据,可用于验证或否定治疗眼内炎症性疾病的新疗法,这是全球工作年龄失明的主要原因10。
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Protocol
所有实验均按照1986年英国动物(科学程序)法案和机构动物福利和伦理审查机构(AWERB)指南进行。
1. 外壳 C57BL/6J 小鼠
- 将小鼠置于特定的无病原体环境中,在12小时的明暗循环中 随意提供食物和水。
- 对成年女性C57BL / 6J进行所有实验(优先考虑女性,因为葡萄膜炎患者中女性与男性的发病率为1.4:1)。按体重和年龄随机分配6-8周龄之间的雌性C57BL / 6J小鼠。将小鼠饲养在单独通风的笼子(IVC)中,每笼子5-6只小鼠。
2. C57BL/6小鼠的免疫
- IRBP1-20 - CFA 乳液制剂
注意:乳液制备对于疾病的可重复性和发病率至关重要;因此,必须尽一切努力在整个制备过程和实验过程中保持一致性。在制备乳液时,应事先在所有试剂的计算中考虑损失。根据计划免疫的小鼠数量,这种损失可能约为准备量的1.5倍(或准备体积的50%)。请参阅以下示例。为了免疫10只小鼠,准备15只小鼠并使用400μg(每20g小鼠的肽)x 15只小鼠= 6mg。每只小鼠应接受 200 μL 进行免疫(总共 3 mL)。最终体积包括肽溶液和CFA的比例为1:1,因此肽溶液为1.5 mL,CFA为1.5 mL。- 使用无菌技术在层流柜中制备所有无菌溶液。
- 称取所需量(每20g小鼠400μg)的人IRBP1-20 (LAQGAYRTAVDLESLASQLT)冻干肽。将肽溶解在100%DMSO中。在-20°C下以冻干形式储存库存。
注意:为确保粉末完全溶解,每个薄片必须首先与DMSO接触,并且没有残留固体的迹象。分小份添加PBS以达到最终体积。不要与涡旋混合,而是用移液器轻轻搅拌。DMSO的终浓度不应超过总肽制备体积的1%。在底部锥形的 20 mL 塑料管中制备乳液应使 DMSO 更好地接近冻干粉末。 - 将 DMSO-PBS 肽溶液以 1:1 v/v 加入已补充 1.5 mg/mL 杀死的 结核分枝杆菌 的 CFA 中,最终浓度为 2.5 mg/mL。滴加,轻柔而频繁地移液,形成粘稠且均匀分布的乳液。
- 使用 1000 μL 移液器(设置为 700 μL 以防止进一步损失)和移液器对肽溶液和 CFA 充气,以产生奶油状浓稠稠度。该技术涉及使用移液器反复上下吸气,直到达到所需的厚度。为获得最佳结果,请确保在注射前将抗原溶液和佐剂充分混合。
- 腹腔注射百日咳毒素
- 将 1.5 μg 百日咳博德特氏 菌毒素悬浮在补充有 1% 小鼠血清11 的 100 μL RPMI 1640 培养基中。
- 用无菌注射器和23G针头进行腹腔注射。
注意:为了避免对注射部位的干扰,必须在注射抗原之前施用百日咳毒素。 - 暂时将每只小鼠转移到单独的笼子中,接受单次100μL腹膜内注射 百日咳博德特 氏菌毒素。
- 皮下注射IRBP乳剂
- 接下来,皮下注射IRBP乳剂。这个过程需要两名动物处理员根据健康和安全法规适当地穿着保护。
- 让一个训练有素的人将鼠标轻轻地束缚在笼子顶部的邋遢状位置,他们的腹部朝下,而另一个训练有素的人捏住皮肤,在脖子后面形成一个帐篷状的结构,针头可以插入手指和拇指之间的槽中。
注意:有针刺伤的危险。 - 针头定位后,注入 200 μL IRBP 乳液。取出针头时,在拔出之前旋转针头以闭合皮肤,然后对注射部位施加压力以防止乳液回流。
注意:乳液不得与小鼠皮肤或皮毛接触,因为这可能会导致刺激,在更严重的情况下,还会发生病变。如果发生这种情况,必须立即使用70%乙醇彻底擦拭该区域,然后干燥。
注意:如果在研究结束时需要引流淋巴结进行检查,则注射部位会有所不同。在这种情况下,皮下注射 100 μL 到侧腹两侧。这将在引流的腹股沟淋巴结处产生更强的反应,可以在收获时切除。但是,如果预期结果只是发展 EAU,则最好在颈部后部单次注射 200 μL,以避免多个注射部位的不适。
3. 临床评估 - 小鼠眼底检查
注意:临床疾病应使用眼底检查,通过使用眼底镜和用于可视化的发现软件进行明场实时成像。
- 在疾病发作时(第12-14天),使用氯胺酮(50mg / mL)和Domitor(Metomidine; 1mg / mL)的组合在全身麻醉下镇静小鼠。稀释 1 份多米托;1.5份氯胺酮和2.5份无菌注射水,然后腹膜内注射每30g100μL。使用1 mL无菌注射器和23G针头进行上述麻醉组合。
- 在此之后,监控鼠标以确保所有反射都丢失并且对刺激没有反应。
- 接受腹膜注射后,当小鼠仍然被抱在肚子里时,立即将1%托吡卡胺和2.5%去氧肾上腺素局部涂抹在每只眼睛上以进行瞳孔扩张。旨在用两种扩张溶液完全覆盖角膜。瞳孔完全散大可能需要几分钟。
- 之后,大量涂抹在眼部粘泪软膏上,并在整个成像过程中保持眼部水分,以保持眼睛充分润滑和水分。
- 同时,打开软件(例如,发现),并设置眼底镜(例如,美光)以在明场下捕获图像。为每个鼠标分配一个文件夹,并根据拍摄的每只眼睛用R或L标记图像。
- 将鼠标安装在专用载物台上进行实时可视化,并定位显微镜以完全进入视网膜。
- 为了准确表示疾病,请拍摄整个视网膜区域的图像,除了视盘外,还覆盖了外围的所有角落。为此,请在整个过程中调整目镜。在整个成像过程中,眼睛始终保持完全润滑至关重要;通过以恒定的速度补充眼膏来确保这一点。
- 在此阶段,请参阅第 4 节(下文)以进行荧光素血管造影。
- 完成所有成像后,在注射水中稀释麻醉逆转抗镇静剂(5 mg/mL 抗四聚体),并以 0.1 mg/kg 腹膜外注射。将小鼠放回笼子里,放在预热的垫子上,吃湿浸的饮食,直到恢复。完全恢复的特点是全身运动和以稳定的步态在笼子周围行走,通常需要几个小时。
- 在指定的实验终点(例如,第21-23天),重复步骤4.1-4.5并再次拍摄整个视网膜区域的照片,覆盖视盘和外围的所有角落,以准确表示疾病。
4. 荧光素血管造影
- 为了测量这些动物的血管渗漏,在麻醉下,给每只小鼠在颈部后部皮下注射2%荧光素,并使视网膜集中在活图像的中间。
- 将眼底镜设置为465-490nm处的蓝光激发滤光片。从激发的荧光素捕获的光在520-530nm之间。
- 荧光素注射后1.5分钟后,拍摄每个视网膜的照片,并在7分钟再次重复。
注意:时间对于这些事件至关重要,如果无法同时捕获两个事件,则只需对一只眼睛进行成像。
5. 临床疾病评分
- 临床评估基于以下标准的严重程度:视盘炎症、视网膜血管袖带、视网膜组织浸润和结构损伤。
- 以0到5的等级授予这些参数中的每一个分数,总分代表整个眼睛的临床疾病,每只眼睛的最高得分为20分。 表1 可用作评分标准的指南。
6. 组织学和组织学评分
- 通过颈椎脱位对小鼠实施安乐死后,通过将眼睑撬开以方便进入整个眼睛来去除眼睛。
- 接下来,将弯曲的镊子放在地球后面,目的是抓住眼眶结缔组织和视神经。注意避免挤压地球。
- 对于固定,将眼睛放在4%戊二醛中至少15分钟,以尽量减少视网膜脱离,然后转移到10%甲醛至少24小时。 1-2毫升的固定剂将提供足够的体积来覆盖两只眼睛。
- 在石蜡中进行包埋,在切片机上切片,并根据标准方案进行染色。对于任何类型的染色,建议使用3-4 μm的切片厚度。
- 使用苏木精和伊红(H&E)染色的标准方案对眼睛进行组织学检查。
- 根据EAU评分标准,根据视网膜和脉络膜内的免疫细胞浸润程度,视网膜层的破坏,肉芽肿形成的程度和视网膜脱离的程度,以0-4的等级分配分数,表明视网膜损伤,如前所述(Agarwal 2013)并在 表211中总结。
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Representative Results
在该协议中,我们描述了一种通过用源自IRBP的葡萄膜肽免疫小鼠来诱导实验性自身免疫性葡萄膜炎(EAU)模型的分步方法。涵盖了采用广泛使用和易于获取的方法评估疾病,尽管这些方法不是排他性的,可以添加到其他成像技术中或部分替代。C57BL / 6J小鼠中EAU的最初迹象可以在免疫后两周内检测到,并在三周内达到疾病高峰,如图 1所示。眼底镜下的变化在疾病进展期间被归类为炎症变化,除了基于浸润免疫细胞和结构损伤的组织学变化外,还包括视网膜组织、血管和视盘炎症和视网膜结构损伤(图 2)。这些临床和组织病理学变化可以在免疫接种后长达 85 天内检测到,并对评估进行分级和评分,以研究疾病进展。为了避免在定性视觉评分中出现无意的偏差,图像应由不止一位专家进行评估,评分员需要对治疗组不知情。
我们在这里展示了临床和组织学评分系统(表1 和 表2)如何指导科学家量化EAU的严重程度,验证治疗的疗效并探索药物作用的机制。血管渗漏也是该模型和人类葡萄膜炎的病理特征。我们展示了荧光素血管渗漏的例子(图3),作为该模型中评估疾病的另一种方法。
图1.IRBP1-20 诱导的 EAU 中临床和组织学疾病进展的示意图时间表。 标志着IRBP1-20 诱导的EAU向疾病高峰的浸润和进展的时间表。从免疫接种开始,通过眼底成像和组织病理学分析检测到的临床疾病的最初迹象落在第 12-14 天之间。然后,根据这些参数,疾病将继续进展,直到在第21-23天左右达到峰值。 请点击此处查看此图的大图。
图2.代表性的眼底图像与C57BL / 6J小鼠IRBP1-20诱导的EAU疾病不同阶段的组织学切片相关。来自用IRBP1-20肽免疫的同一只动物的C57BL / 6J的临床眼底镜和相应的组织图像。(A和B)从健康和CFA注射小鼠获得的眼底镜图像和眼睛组织学切片。视网膜没有炎症迹象,相应的组织学切片显示视网膜层保留。(C)免疫后14天从C57BL / 6J小鼠获得的眼底镜图像显示EAU的典型体征,在疾病早期表现为严重的视盘肿胀,相应的组织学显示免疫细胞浸润到玻璃体间隙。(D)免疫接种后21天从C57BL / 6J小鼠获得的眼睛眼底镜图像显示血管袖口和浸润免疫群体的迹象。组织学数据显示视网膜折叠(黄色箭头)发生严重的结构变化。V=血管,O=视盘,R=视网膜,L=晶状体,玻璃体=玻璃体,iO=发炎的视盘,iV=发炎的血管,iR=发炎的视网膜,i=玻璃体浸润细胞,RFs=视网膜褶皱。请点击此处查看此图的大图。
图3.在疾病高峰期使用美光III成像系统拍摄的荧光血管造影的代表性图像。 将C57BL / 6J小鼠皮下注射2%荧光素和示踪剂循环后在不同时间点拍摄的图像。(A)CFA仅在荧光素给药后1.5和7分钟服用对照小鼠。(B)接受荧光素后分别拍摄IRBP1-20 免疫小鼠的代表性图像1.5和7分钟。白色箭头表示容器泄漏。 请点击此处查看此图的大图。
得分 | 光盘 | 视网膜血管 | 视网膜组织浸润 | 结构损坏 | ||||
1 | 轻微炎症 | 1-4 个轻度袖口 | 1-4个小病变或1个线性病变 | 涉及 1/4 至 3/4 视网膜区域的视网膜病变或视网膜萎缩 | ||||
2 | 轻度炎症 | >4 个轻度袖口或 1-3 个中度袖口 | 5-10个小病变或2-3个线性病变 | 泛视网膜萎缩伴多个小病变(瘢痕)或 <3 个线性病变(瘢痕) | ||||
3 | 中度炎症 | >3个中等袖口 | >10 个小病变或 >3 个线性病变 | 泛视网膜萎缩伴 >3 个线性病变或融合性病变(瘢痕) | ||||
4 | 严重炎症 | >1 严重袖带 | 线性病变汇合 | 折叠视网膜脱离 | ||||
5 | *不可见(白色或极度脱落) | *不可见(白色或极度脱落) | *不可见(白色或极度脱落) | *不可见(白色或极度脱落) |
表 1.用于评估EAU临床疾病严重程度的常规临床评分量表。 表显示了用于评估免疫IRBP1-20 的小鼠疾病严重程度的标准。根据上面概述的眼底图像上可见的标志分配分数,每只眼睛的总分为20分。*由于后房内的浸润和视网膜脱离的遮挡无法评估。表经徐华等人许可改编,20088.
年级 | 标准 |
0 | 无变化 |
0.5(迹线) | 轻度炎症细胞浸润。无组织损伤 |
1 | 渗透;视网膜褶皱和局灶性视网膜脱离;脉络膜和视网膜少有小肉芽肿,血管周围炎 |
2 | 中度浸润;视网膜褶皱、脱离和局灶性感光细胞损伤;中小型肉芽肿、血管周围炎和血管炎 |
3 | 中度至重度渗透;广泛的视网膜折叠伴脱离,中度感光细胞损伤;中等大小的肉芽肿性病变;视网膜下新生血管形成 |
表 2.组织学评分 EAU
表格显示了用于根据疾病的组织病理学特征评估 EAU 严重程度的标准。根据上述H&E染色标志分配分数,每只眼睛的总分为四分。经 Agarwal 等人许可改编的表格2013 11.
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Discussion
实验动物模型是研究疾病发病机制和新治疗范式临床前测试的必要工具。在当前的协议中,我们讨论了诱导,监测和评分EAU的方法,这是眼内炎症性葡萄膜炎的实验模型。当根据此处概述的方案执行所有程序时,该EAU模型具有超过95%的疾病发病率,并导致慢性单相EAU的发展。为了达到这一发生率水平,我们强调抗原制备和乳剂注射的重要性,这两者都在上面详细介绍。EAU在动物中的主要特征是视网膜和/或脉络膜炎症,视网膜血管炎,光感受器破坏和视力丧失,所有这些都代表了人类后葡萄膜炎的许多基本临床病理学特征12。对葡萄膜炎中涉及的基本细胞和分子机制的大部分理解源于本文所述的诱导EAU模型。EAU可以通过用淋巴细胞识别的视网膜抗原进行主动免疫在小鼠13 和大鼠11 中诱导。这些视网膜抗原有多种形式;IRBP(用于小鼠)或视网膜可溶性抗原(S-Ag)用于大鼠。在C57BL / 6J背景下诱导EAU会产生更慢性的疾病形式,在免疫后三周观察到峰值病理。相比之下,将视网膜抗原应用于 B10RIII 背景14 可诱导急性单相和临床重度形式的 EAU,其中峰值病理通常在诱导后两周内出现,疾病在第 3 周消退。
已经在C57BL / 6J小鼠中测试了不同的IRBP表位,IRBP1-20肽已被证明是一种具有高发生率和严重程度的可重复模型。最近,据报道,IRBP的一种新的葡萄凝绿表位,人IRBP的氨基酸残基651至670诱导具有较高临床发病率和严重疾病表现的EAU11,如果这符合科学目标,可以优先使用。由于已知肠道共生微生物群和自身反应性T细胞受体(TCR)的活化在应用不同的抗原时会干扰疾病的发作15,我们建议该领域的初学者使用hIRBP1-20或hIRBP651-670肽,剂量滴定在300-500μg之间,以获得可靠的模型。事实上,该模型的变异性已在其他地方记录,报告强调了住房系统和微生物组之间差异的重要性,这可能会影响疾病的严重程度和发病率15。因此,可能需要或多或少的肽抗原和百日咳毒素。
我们描述的分析还有许多其他模型可以执行。这些包括在IRBP T细胞受体(TCR)转基因(R161H)小鼠中进展的自发性葡萄膜炎,其中眼部炎症在16岁时发生5-6周。EAU也可以通过转移葡萄膜效应CD4 + T细胞来过继诱导。来自引物小鼠的活化IRBP特异性CD4 + T细胞可用作效应细胞的来源3,11。该模型表示疾病的效应阶段,同时避免了在诱导模型中使用CFA的复杂性。
此外,使用眼部炎症模型作为研究其他炎症性疾病的适当工具有很多优点,特别是那些具有效应Th1和Th17亚群病理的疾病。使用该模型的主要优点是用于监测疾病发展和进展的非侵入性和可量化的方法,即眼底镜检查和血管造影。这些非侵入性成像系统可以轻松访问神经元组织,否则这些组织将隐藏在保护性解剖屏障后面。监测疾病进展的其他方法包括应用OCT成像,OCT成像在检测细胞浸润方面比眼底成像更敏感,特别是在EAU发病的早期阶段。该技术允许以非侵入性方式纵向和水平视网膜的多层横截面可视化。 体内 OCT成像增加了眼底镜和组织学检查无法获得的视网膜厚度信息17。越来越多的更复杂的非侵入性成像技术,如自适应光学扫描激光检眼镜和多模态成像工具,将进一步提高我们在小型啮齿动物中研究这种疾病的能力。此外,使用流式细胞术等技术解剖和分离常驻和浸润细胞群以更深入地分析免疫表型的能力为提供有见地的信息提供了绝佳的机会。
根据从眼底镜检查获得的临床标准,有一些已建立的评分系统8,9,18。虽然这些在眼科研究中心之间略有不同,但都是可靠的,与组织病理学特征相关,并且能够准确反映疾病的严重程度。在目前的研究中,我们参考了Xu等人开发的评分系统8。该系统提供了更详细的评估方法,具有更多的临床测量参数。它包括最高分 20 分,这比限制为最多 5 分的其他系统引入了更宽的评分窗口。这对于进一步探索治疗方法更为重要。然而,在使用如此精细和详细的参数集时,最大限度地减少操作员错误至关重要,并且可能需要对操作员进行仔细培训和对解释进行独立验证。
在这里,我们提出了一种在雌性C57BL / 6小鼠中诱导EAU的方案,因为女性的发病率增加:男性在临床环境中以1.4:1的比例出现葡萄膜炎。然而,应考虑用于诱导自身免疫性疾病的小鼠的性别,因为这可能会影响细胞因子环境11,并且还揭示了它们对治疗干预的反应方式的重要差异。另一个考虑因素是诱导疾病时小鼠的年龄。例如,我们研究了B10RIII小鼠的易感性年龄依赖性,并得出结论,超过8周的小鼠EAU发病率较低(我们小组未发表的研究)。
总之,眼内疾病的动物模型为研究人类后葡萄膜炎提供了宝贵的工具,并促进了CsA等新疗法的开发。然而,没有动物模型本身可以再现人类葡萄膜炎的全部谱,因为每种动物模型都具有独特的特征,使其适合研究疾病的特定方面。该EAU模型是通过应用补充佐剂的IRBP肽来诱导自身免疫的,这些佐剂会引发先天免疫反应。然而,尚不清楚人类所有形式的后葡萄膜炎是否都是自身免疫性的,以及抗原模拟是否是触发因素。此外,尚不清楚感染是否与引发人类葡萄膜炎有关。尽管如此,本文描述的模型是一个有用且可重复的通用模型,可用于收集有关这种威胁视力的疾病的病因、发病机制和治疗的有用信息。
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Disclosures
作者与本作品没有利益冲突。
Acknowledgments
JG获得了UCL影响力学生奖学金和玫瑰树信托基金的资金,以支持CB。VC获得了Akari Therapeutics Inc.的研究合作资助。我们要感谢伦敦大学学院眼科研究所,生物服务部门,特别是Alison O'Hara女士和她的团队的技术支持。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
antisedan | ZOETIS, USA | for waking up | |
Complete Freund’s Adjuvant; CFA | Sigma, UK | F5881 | for immunisation |
Domitor | Orion Pharma, Finland | for anesthesia | |
Flourescein | Sigma, UK | F2456 | for Angiography |
IRBP1-20 | Chamberidge peptide, UK | peptide;antigen | |
Ketamine | Orion Pharma, Finland | for anesthesia | |
Micron III | Phoenix Research, USA | for fundoscopy | |
Mouse Serum | Sigma, UK | M5905 | for immunisation |
Mycobacterium terberculosis | Sigma, UK | 344289 | for immunisation |
Pertussis Toxin | Sigma, UK | P2980 | for immunisation |
phenylephrine hydrochloride 2.5% | Bausch & Lomb UK | PHEN25 | for dilation |
Tropicamide 1% | SANDOZ | for dilation | |
Viscotears | WELDRICKS Pharmacy, UK | 2082642 | for eye lubrication |
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