Summary
في هذا التقرير نقدم بروتوكولا يسمح للمحقق بإنشاء نموذج فأر لالتهاب القزحية داخل العين. يشار إليه بشكل أكثر شيوعا باسم التهاب العنبية المناعي الذاتي التجريبي (EAU) ، يلتقط هذا النموذج الثابت العديد من جوانب الأمراض البشرية. هنا ، سنصف كيفية تحفيز ومراقبة تطور المرض باستخدام العديد من القراءات.
Abstract
التهاب العنبية المناعي الذاتي التجريبي (EAU) مدفوع بالخلايا المناعية التي تستجيب للمستضدات الذاتية. تلخص العديد من ميزات هذا النموذج غير المعدي للمرض الالتهابي داخل العين النمط الظاهري السريري لالتهاب العنبية الخلفي الذي يصيب البشر. تم استخدام EAU بشكل موثوق لدراسة فعالية العلاجات الالتهابية الجديدة وطريقة عملها ولمزيد من التحقيق في الآليات التي تدعم تطور المرض لاضطرابات العين. هنا ، نقدم بروتوكولا مفصلا حول تحريض EAU في الماوس C57BL / 6J - الكائن النموذجي الأكثر استخداما مع قابلية لهذا المرض. سيتم إثبات التقييم السريري لشدة المرض وتطوره باستخدام تنظير قاع القاع والفحص النسيجي وتصوير الأوعية بالفلوريسين. يتضمن إجراء الحث الحقن تحت الجلد لمستحلب يحتوي على ببتيد (IRBP1-20) من بروتين ربط الريتينويد بين مستقبلات العين (المعروف أيضا باسم بروتين ربط الريتينول 3) ، مساعد فرويند الكامل (CFA) ومكمل مع المتفطرة السلية المقتولة. يتبع حقن هذا المستحلب اللزج على الجزء الخلفي من الرقبة حقنة واحدة داخل الصفاق من توكسين السعال الديكي Bordetella . في بداية الأعراض (اليوم 12-14) وتحت التخدير العام ، يتم التقاط صور تنظير القاع لتقييم تطور المرض من خلال الفحص السريري. يمكن مقارنة هذه البيانات مباشرة مع تلك الموجودة في نقاط زمنية لاحقة وذروة المرض (اليوم 20-22) مع تحليل الاختلافات. في الوقت نفسه ، يسمح هذا البروتوكول للمحقق بتقييم الاختلافات المحتملة في نفاذية السفينة وتلفها باستخدام تصوير الأوعية بالفلوريسين. يمكن تحفيز EAU في سلالات الفئران الأخرى - سواء من النوع البري أو المعدل وراثيا - ودمجها مع علاجات جديدة توفر المرونة لدراسة فعالية الدواء و / أو آليات المرض.
Introduction
سيوضح هذا البروتوكول كيفية إحداث التهاب القزحية المناعي الذاتي التجريبي (EAU) في الماوس C57BL / 6J عن طريق حقن واحد تحت الجلد لمستضد شبكية في مادة مساعدة مستحلبة. سيتم تفصيل طرق مراقبة وتقييم تطور المرض من خلال التصوير بالمنظار والفحص النسيجي ، مع تحديد معلمات القياس في الداخل. بالإضافة إلى ذلك ، سيتم مناقشة تصوير الأوعية بالفلوريسئين ، وهي تقنية لفحص بنية الأوعية الدموية في شبكية العين ونفاذيتها.
يلخص نموذج EAU هذا السمات المركزية لالتهاب العنبية الخلفي غير المعدي لدى البشر فيما يتعلق بالخصائص السريرية المرضية والآليات الخلوية والجزيئية الأساسية التي تدفع المرض. يتم التوسط في EAU بواسطة مجموعات فرعية Th1 و / أو Th17 من الخلايا الليمفاوية CD4 + T ذاتية التفاعل ، كما هو موضح في تجارب النقل بالتبني ومع الفئران المستنفدةIFNγ 1. يأتي الكثير من فهمنا للأدوار المحتملة لهذه الخلايا في التهاب القزحية من دراسة EAU2 حيث يتم اكتشاف كل من خلايا Th1 و Th17 داخل أنسجة الشبكية3. في كثير من الأحيان ، يتم استخدام EAU كنموذج قبل السريري لتقييم فائدة العلاجات الجديدة في تخفيف المرض. أظهرت الأساليب العلاجية التي نجحت في تعديل مرض EAU بعض الفعالية في العيادة ووصلت إلى حالة معتمدة من إدارة الغذاء والدواء. ومن الأمثلة على ذلك مجموعات من الأدوية المنظمة للمناعة مثل علاجات استهداف الخلايا التائية: السيكلوسبورين ، FK-506 ، و rapamycin4،5،6. في الآونة الأخيرة ، تم أيضا استكشاف التدخلات التي تستهدف مسارات جديدة في هذا النموذج للتحقيق في كل من الآلية والتأثير على نتائج المرض. وتشمل هذه استهداف تنظيم النسخ من خلال بروتينات قارئ الكروماتين Bromodomain Extra-Terminal (BET) ومثبطات P-TEFb3. علاوة على ذلك ، أظهرت الأساليب الأكثر تقليدية مثل مثبط VLA-4 مؤخرا قمعا في EAU عن طريق تعديل الخلايا التائيةCD4 + T 7. بالإضافة إلى ذلك ، تم العثور على استهداف خلايا Th17 باستخدام TMP778 ، وهو ناهض عكسي RORγt ، لقمع EAU8 بشكل كبير. علاوة على ذلك ، يوفر هذا النموذج فرصة لدراسة التهاب المناعة الذاتية المزمن في شبكية العين والآليات الأساسية المصاحبة مثل تحضير الخلايا الليمفاوية.
القراءات الأساسية للدراسات قبل السريرية EAU هي التقييم السريري عن طريق إجراء تصوير تنظير قاع الشبكية وأقل تكرارا ، من خلال تقييم سلامة الشبكية عن طريق التصوير المقطعي للتماسك البصري (OCT). ثم يتم إجراء التقييم النسيجي المرضي للشبكية والتنميط المناعي لخلايا الشبكية عن طريق قياس التدفق الخلوي عند الإنهاء. تنظير قاع العين هو نظام تصوير حي سهل الاستخدام يسمح بإجراء تقييم سريري سريع وقابل للتكرار لشبكية العين بأكملها. بالنسبة للتقييمات المناعية الكيميائية ، تعتمد التقنيات على إعداد أقسام الشبكية التي تسمح لنا بدراسة بنية الأنسجة لدرجة الالتهاب والضرر الهيكلي9. سيتم تحديد معايير التقييم وأنظمة التسجيل التقليدية ، لجميع التقنيات المستخدمة ، ضمن هذا البروتوكول. غالبا ما يرتبط مدى الضرر المسجل باستخدام التصوير بالمنظار ارتباطا وثيقا بالتغيرات النسيجية. يوفر هذا النهج المزدوج لرصد وتقييم شدة المرض حساسية أكبر ونتائج قياس أكثر موثوقية.
EAU هو نموذج راسخ وشائع الاستخدام للاختبار قبل السريري والتحقيق في أمراض العين المناعية. هذا النموذج موثوق به وقابل للتكرار مع حدوث مرض بنسبة >95٪ ويولد بيانات شاملة يمكن استخدامها للتحقق من صحة أو رفض العلاجات الجديدة لعلاج مرض التهاب العين الذي يمثل سببا رئيسيا للعمى في سن العمل في جميع أنحاء العالم10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم إجراء جميع التجارب وفقا لقانون الحيوانات في المملكة المتحدة (الإجراءات العلمية) لعام 1986 ، والمبادئ التوجيهية المؤسسية لهيئة رعاية الحيوان والمراجعة الأخلاقية (AWERB).
1. إسكان الفئران C57BL / 6J
- الفئران المنزلية في بيئة محددة خالية من مسببات الأمراض ، في دورة الضوء والظلام لمدة 12 ساعة والغذاء والماء المتاحة حسب الطلب.
- إجراء جميع التجارب على الإناث البالغات C57BL / 6J (يتم اختيار الإناث بشكل تفضيلي حيث يوجد معدل من النساء إلى الرجال 1.4 إلى 1 في مرضى التهاب القزحية). اختيار إناث الفئران C57BL / 6J بشكل عشوائي بين 6-8 أسابيع حسب الوزن والعمر. ضع الفئران في أقفاص جيدة التهوية (IVC) في مجموعات من 5-6 فئران لكل قفص.
2. تحصين الفئران C57BL / 6
- IRBP1-20 - إعداد مستحلب CFA
ملاحظة: إعداد المستحلب ضروري لاستنساخ وحدوث المرض. على هذا النحو ، يجب بذل كل جهد ممكن للحفاظ على الاتساق طوال عملية التحضير وعبر التجارب. عند تحضير المستحلب ، يجب حساب الخسارة في حسابات جميع الكواشف مسبقا. يمكن أن تكون هذه الخسارة حوالي 1.5x (أو 50٪ إضافية من الحجم المحضر) ، بناء على عدد الفئران المخطط لها للتحصين. يرجى الاطلاع على المثال التالي أدناه. لتحصين 10 فئران ، قم بإعداد 15 فأرا واستخدم 400 ميكروغرام (ببتيد لكل 20 جم من الماوس) × 15 فأرا = 6 مجم. يجب أن يتلقى كل فأر 200 ميكرولتر للتحصين (إجمالي 3 مل). يتكون الحجم النهائي من نسبة 1: 1 من محلول الببتيد و CFA ، وبالتالي 1.5 مل من محلول الببتيد و 1.5 مل من CFA.- تحضير جميع المحاليل المعقمة في خزانة تدفق رقائقي باستخدام تقنيات معقمة.
- قم بوزن الكمية المطلوبة (400 ميكروغرام لكل 20 جم ماوس) من الببتيد البشري IRBP1-20 (LAQGAYRTAVDLESLASQLT) المجفف بالتجميد. حل الببتيد في 100 ٪ DMSO. يخزن المرق في صورة مجففة بالتجميد عند -20 درجة مئوية.
ملاحظة: لضمان إذابة المسحوق بالكامل ، يجب أن تتلامس كل تقشر مع DMSO أولا ولا تظهر أي علامة على وجود مادة صلبة متبقية. أضف PBS في أجزاء صغيرة للوصول إلى الحجم النهائي. لا تخلط مع دوامة ، بدلا من ذلك استخدم التحريض اللطيف مع ماصة. يجب ألا يتجاوز التركيز النهائي ل DMSO 1٪ من إجمالي حجم تحضير الببتيد. يجب أن يسمح تحضير المستحلب في أنبوب بلاستيكي سعة 20 مل ذو قاع مدبب بإمكانية وصول DMSO بشكل أفضل إلى المسحوق المجفف بالتجميد. - أضف محلول الببتيد DMSO-PBS عند 1: 1 فولت / فولت إلى CFA الذي تم استكماله بالفعل ب 1.5 مجم / مل من المتفطرة السلية المقتولة ، لإعطاء تركيز نهائي قدره 2.5 مجم / مل. أضف قطرة قطرة قطرة ، ماصة بلطف وبشكل متكرر لتشكيل مستحلب لزج وموزع بالتساوي.
- قم بتهوية محلول الببتيد و CFA باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر (مضبوطة على 700 ميكرولتر لمنع المزيد من الخسارة) وماصة لتوليد تناسق سميك كريمي. تتضمن هذه التقنية استخدام الماصة للشفط بشكل متكرر لأعلى ولأسفل حتى الوصول إلى السماكة المطلوبة. للحصول على أفضل النتائج ، تأكد من خلط محلول المستضد والمواد المساعدة جيدا قبل الحقن.
- الحقن داخل الصفاق من سم السعال الديكي
- تعليق 1.5 ميكروغرام من توكسين السعال الديكي Bordetella في 100 ميكرولتر من وسائط RPMI 1640 المكملة بمصل الماوس1٪ 11.
- قم بإجراء الحقن باستخدام حقنة معقمة وإبرة 23G.
ملاحظة: من أجل تجنب الاضطرابات في موقع الحقن ، يجب إعطاء سم السعال الديكي قبل حقن المستضد. - انقل كل فأر مؤقتا إلى قفص منفصل لتلقي حقنة واحدة سعة 100 ميكرولتر من توكسين السعال الديكي Bordetella .
- الحقن تحت الجلد لمستحلب IRBP
- بعد ذلك ، قم بحقن مستحلب IRBP تحت الجلد. تتطلب هذه العملية اثنين من مناولي الحيوانات يرتديان ملابس مناسبة مع الحماية وفقا للوائح الصحة والسلامة.
- اطلب من شخص مدرب أن يقيد الفأر برفق أعلى القفص في وضع يشبه القفا ، مع توجيه معدته لأسفل بينما يقرص الشخص الآخر المدرب الجلد لتشكيل هيكل يشبه الخيمة على الجزء الخلفي من الرقبة حيث يمكن إدخال الإبرة لفتحة بين الإصبع والإبهام.
تنبيه: هناك خطر إصابة وخز الإبرة. - بمجرد وضع الإبرة ، قم بحقن 200 ميكرولتر من مستحلب IRBP. عند إزالة الإبرة ، قم بتدوير رأس الإبرة لإغلاق الجلد قبل سحبه والضغط بعد ذلك على موقع الحقن لمنع ارتداد المستحلب.
تنبيه: يجب ألا يتلامس المستحلب مع جلد الفأر أو الفراء لأن هذا قد يسبب تهيجا وفي الحالات الأكثر شدة ، تتطور الآفة. في حالة حدوث ذلك ، يجب مسح المنطقة على الفور وبشكل كامل باستخدام 70٪ من الإيثانول ثم تجفيفها.
ملاحظة: إذا كانت هناك حاجة إلى الغدد الليمفاوية المستنزفة للفحص في نهاية الدراسة ، فسيكون موقع الحقن مختلفا. في هذه الحالة ، قم بحقن 100 ميكرولتر على جانبي الجناح تحت الجلد. سيؤدي ذلك إلى توليد استجابة أقوى في الغدد الليمفاوية الأربية المستنزفة ، والتي يمكن استئصالها في وقت الحصاد. ومع ذلك ، إذا كانت النتيجة المقصودة هي فقط تطوير EAU ، فمن الأفضل حقنة واحدة من 200 ميكرولتر في الجزء الخلفي من الرقبة لتجنب الانزعاج من مواقع الحقن المتعددة.
3. التقييم السريري - فحص قاع الفأر
ملاحظة: يجب تسجيل المرض السريري باستخدام فحص قاع العين ، عبر التصوير المباشر للمجال الساطع باستخدام منظار القاع وبرنامج Discover المستخدم للتصور.
- عند بداية المرض (اليوم 12-14)، تخدير الفئران تحت التخدير العام باستخدام مزيج من الكيتامين (50 ملغ/مل) ودوميتور (ميديتوميدين؛ 1 ملغ/مل). تمييع 1-جزء Domitor. 1.5 جزء من الكيتامين و 2.5 جزء من الماء المعقم القابل للحقن ، ثم حقن 100 ميكرولتر لكل 30 جم داخل الصفاق. استخدم محاقن معقمة سعة 1 مل وإبر 23 جرام للمجموعة المذكورة أعلاه من التخدير.
- بعد ذلك ، راقب الماوس للتأكد من فقدان جميع ردود الفعل وأنه لا يستجيب للمنبهات.
- مباشرة بعد تلقي الحقن الوريدي وبينما لا يزال الفأر محتجزا في ، ضع 1٪ تروبيكاميد و 2.5٪ فينيليفرين موضعيا على كل عين لتوسيع حدقة العين. اهدف إلى تغطية القرنية بالكامل باستخدام كلا المحلولين المتوسعين. قد يستغرق الأمر بضع دقائق قبل أن يتوسع حدقة العين بالكامل.
- بعد ذلك ، ضعيه بسخاء على مرهم اللزوجة للعين وحافظي عليه طوال عملية التصوير من أجل الحفاظ على ترطيب العين وترطيبها بالكامل.
- في غضون ذلك ، افتح البرنامج (على سبيل المثال ، Discover) ، واضبط منظار القاع (على سبيل المثال ، Micron) لالتقاط الصور تحت برايتفيلد. خصص لكل ماوس فردي مجلدا وقم بتسمية الصور ب R أو L وفقا لكل عين تم تصويرها.
- قم بتركيب الماوس على مسرح مصمم خصيصا للتصور المباشر ووضع المجهر للوصول الكامل إلى شبكية العين.
- للحصول على تمثيل دقيق للمرض ، التقط صورا لمنطقة الشبكية بأكملها ، تغطي جميع أركان المحيط بالإضافة إلى القرص البصري. لتحقيق ذلك ، اضبط العدسة طوال الوقت. من الأهمية بمكان أن تظل العين مشحمة بالكامل في جميع الأوقات طوال عملية التصوير. تأكد من ذلك عن طريق تعبئة مرهم العين بمعدل ثابت.
- راجع القسم 4 (أدناه) في هذه المرحلة لإجراء تصوير الأوعية بالفلوريسين.
- بمجرد اكتمال جميع التصوير، يتم تخفيف مضاد التخدير العكسي المضاد للتخدير (5 ملغ/مل مضاد السيدان) في الماء القابل للحقن وتطبيق الدواء عند 0.1 ملغ/كغ من الهايدان. أعد الماوس إلى قفص وضعه على حصيرة مسخنة مسبقا مع إمكانية الوصول إلى نظام غذائي مبلل حتى الشفاء. يتميز الشفاء التام بحركة الجسم بالكامل والمشي حول القفص بمشية ثابتة ، وعادة ما يستغرق بضع ساعات.
- في نقطة النهاية التجريبية المحددة (على سبيل المثال ، اليوم 21-23) ، كرر الخطوات 4.1-4.5 والتقط صورا لمنطقة الشبكية بأكملها مرة أخرى ، مع تغطية القرص البصري وجميع أركان المحيط لالتقاط تمثيل دقيق للمرض.
4. تصوير الأوعية بالفلوريسئين
- لقياس تسرب الأوعية الدموية في هذه الحيوانات ، أثناء التخدير ، أعط كل فأر حقنة من 2٪ فلوريسئين تحت الجلد في الجزء الخلفي من الرقبة ووضعها بحيث تكون شبكية العين مركزية في منتصف الصورة الحية.
- اضبط منظار الأساس على مرشح إثارة الضوء الأزرق عند 465-490 نانومتر. يتراوح الضوء الملتقط من الفلوريسئين المثير بين 520-530 نانومتر.
- بعد 1.5 دقيقة بعد حقن الفلوريسئين ، التقط صورة لكل شبكية وكرر مرة أخرى في 7 دقائق.
ملاحظة: التوقيت أمر بالغ الأهمية لهذه الأحداث ، إذا لم تتمكن من التقاط كليهما ، فقم فقط بتصوير عين واحدة.
5. تسجيل الأمراض السريرية
- بناء التقييم السريري على شدة المعايير التالية: التهاب القرص البصري ، تكبيل الأوعية الدموية في شبكية العين ، تسلل أنسجة الشبكية والأضرار الهيكلية.
- امنح كل معلمة من هذه المعلمات درجة على مقياس من 0 إلى 5 ويمثل المجموع الجماعي المرض السريري للعين بأكملها ، بحد أقصى 20 درجة يمكن الحصول عليها لكل عين. يمكن استخدام الجدول 1 كدليل لمعايير التسجيل.
6. علم الأنسجة والتسجيل النسيجي
- بعد القتل الرحيم للفئران عن طريق خلع عنق الرحم ، قم باستئصال العينين عن طريق فصل الجفون عن بعضها البعض لسهولة الوصول إلى العين بأكملها.
- بعد ذلك ، ضع ملقط منحني خلف الكرة الأرضية بقصد الإمساك بالنسيج الضام المداري والعصب البصري. احرص على تجنب الضغط على الكرة الأرضية.
- للتثبيت ، ضع العين في 4٪ جلوتارالدهيد لمدة لا تقل عن 15 دقيقة لتقليل انفصال الشبكية ، ثم انقلها إلى 10٪ فورمالديهايد لمدة 24 ساعة على الأقل. 1-2 مل من المثبت سيعطي حجما كافيا لتغطية عينين.
- أداء التضمين في البارافين ، والتقسيم على microtome ، وتلطيخ وفقا للبروتوكولات القياسية. يوصى بسمك المقطع 3-4 ميكرومتر لأي نوع من التلطيخ.
- إجراء الفحص النسيجي للعيون باستخدام البروتوكولات القياسية لتلطيخ الهيماتوكسيلين والإيوسين (H&E).
- تعيين درجات على مقياس من 0-4 ، وفقا لمعايير تسجيل EAU ، بناء على مدى تسلل الخلايا المناعية داخل الشبكية والمشيمية ، واضطراب طبقات الشبكية ، ودرجة تكوين الورم الحبيبي ومدى انفصال الشبكية ، مع الإشارة إلى تلف الشبكية ، كما هو موضح سابقا (Agarwal 2013) وملخصه في الجدول 211.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
في هذا البروتوكول ، نصف طريقة خطوة بخطوة لإحداث نموذج لالتهاب القزحية المناعي الذاتي التجريبي (EAU) عن طريق تحصين الفئران بببتيد شبكية عنبي مشتق من IRBP. يتم تغطية تقييم المرض باستخدام مناهج مستخدمة على نطاق واسع ويمكن الوصول إليها بسهولة على الرغم من أنها ليست حصرية ويمكن إضافتها أو استبدالها جزئيا بتقنيات تصوير أخرى. يمكن اكتشاف العلامات الأولى ل EAU في الفئران C57BL / 6J بعد أسبوعين من التحصين والوصول إلى ذروة المرض في غضون ثلاثة أسابيع كما هو موضح في الشكل 1. تصنف التغيرات القاعية أثناء تطور المرض على أنها تغيرات التهابية ، والتي تشمل أنسجة الشبكية ، والتهاب الأوعية الدموية والقرص البصري ، والأضرار الهيكلية للشبكية (الشكل 2) بالإضافة إلى التغيرات النسيجية القائمة على تسلل الخلايا المناعية والأضرار الهيكلية. يمكن الكشف عن هذه التغيرات السريرية والنسيجية المرضية لمدة تصل إلى 85 يوما بعد التحصين ، وتصنيفها وتسجيلها للتقييم يقترح دراسة تطور المرض. من أجل تجنب التحيز غير المقصود في التسجيل البصري النوعي ، يجب تقييم الصور من قبل أكثر من خبير واحد ويتطلب الهدافون أن يكونوا أعمى عن مجموعات العلاج.
نوضح هنا كيف أن أنظمة التسجيل السريرية والنسيجية (الجدول 1 والجدول 2) توجه العلماء لتحديد شدة EAU ، للتحقق من فعالية العلاجات واستكشاف آلية عمل الدواء. تسرب الأوعية الدموية هو أيضا سمة مرضية للنموذج وفي التهاب القزحية البشري. نعرض أمثلة على تسرب الفلوريسئين في الأوعية الدموية (الشكل 3) كطريقة أخرى لتقييم المرض في هذا النموذج.
الشكل 1. الجدول الزمني التخطيطي لتطور المرض السريري والنسيجي في IRBP1-20 المستحث EAU. جدول زمني يشير إلى بداية التسلل وتطور IRBP1-20 الناجم عن EAU نحو ذروة المرض. من التحصين ، تقع العلامات الأولى للمرض السريري ، كما تم اكتشافها عن طريق التصوير بالمنظار والتحليل النسيجي المرضي ، بين الأيام 12-14. سيستمر المرض بعد ذلك في التقدم ، وفقا لهذه المعايير ، حتى يتم الوصول إلى الذروة في حوالي اليوم 21-23. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2. صور قاعية تمثيلية مرتبطة بالمقاطع النسيجية في مراحل مختلفة من مرض EAU الناجم عن IRBP1-20 في الفئران C57BL / 6J. تنظير القاع السريري وصور الأنسجة المقابلة ل C57BL / 6J من نفس الحيوان المحصن بببتيد IRBP 1-20. (A و B) صور تنظير القاع والأقسام النسيجية للعين التي تم الحصول عليها من الفئران السليمة والمحقونة CFA. لا يوجد لدى شبكية العين أي علامة على وجود التهاب وتظهر أقسام الأنسجة المقابلة طبقات شبكية محفوظة. (ج) تظهر الصورة التنظيرية للعين التي تم الحصول عليها من الفأر C57BL / 6J بعد 14 يوما من التحصين علامات كلاسيكية ل EAU ، حيث تظهر تورم القرص البصري الشديد في المرحلة المبكرة من المرض ، وتظهر الأنسجة المقابلة تسلل الخلايا المناعية إلى الفضاء الزجاجي. (د) تظهر الصور التنظيرية للعين التي تم الحصول عليها من الفأر C57BL / 6J بعد 21 يوما من التحصين علامات تكبيل الأوعية والتسلل إلى السكان المناعيين. توضح بيانات الأنسجة تغيرات هيكلية شديدة عن طريق طي الشبكية (الأسهم الصفراء). V = وعاء ، O = قرص بصري ، R = شبكية العين ، L = عدسة ، فيتامين = الجسم الزجاجي ، iO = قرص بصري ملتهب ، iV = وعاء ملتهب ، iR = شبكية ملتهبة ، i = تسلل الخلايا في الجسم الزجاجي ، RFs = طيات الشبكية. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 3. صور تمثيلية لتصوير الأوعية الفلورية مأخوذة باستخدام نظام التصوير Micron III في ذروة المرض. تم حقن الفئران C57BL / 6J تحت الجلد مع 2٪ فلوريسئين والصور التي تم التقاطها في نقاط زمنية مختلفة بعد دوران المقتفي. (أ) يتم أخذ فأر التحكم CFA فقط في 1.5 و 7 دقائق بعد إعطاء الفلوريسين. (ب) صور تمثيلية للفئران المحصنة IRBP1-20 تم التقاطها لمدة 1.5 و 7 دقائق ، على التوالي ، بعد تلقي الفلوريسين. يشير السهم الأبيض إلى تسرب السفينة. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
| نقاط | القرص البصري | الأوعية الشبكية | تسلل أنسجة الشبكية | الأضرار الهيكلية | ||||
| 1 | الحد الأدنى من الالتهاب | 1-4 أصفاد خفيفة | 1-4 آفات صغيرة أو آفة خطية واحدة | آفات الشبكية أو ضمور الشبكية التي تشمل 1/4 إلى 3/4 منطقة الشبكية | ||||
| 2 | التهاب خفيف | >4 أصفاد خفيفة أو 1-3 أساور معتدلة | 5-10 آفات صغيرة أو 2-3 آفات خطية | ضمور الشبكية الشامل مع آفات صغيرة متعددة (ندوب) أو آفات خطية <3 (ندوب) | ||||
| 3 | التهاب معتدل | >3 أصفاد معتدلة | >10 آفات صغيرة أو >3 آفات خطية | ضمور الشبكية الشامل مع >3 آفات خطية أو آفات متقاربة (ندوب) | ||||
| 4 | التهاب شديد | >1 الكفة الشديدة | الآفة الخطية المتقاربة | انفصال الشبكية مع قابلة للطي | ||||
| 5 | * غير مرئي (أبيض أو انفصال شديد) | * غير مرئي (أبيض أو انفصال شديد) | * غير مرئي (أبيض أو انفصال شديد) | * غير مرئي (أبيض أو انفصال شديد) | ||||
الجدول 1. مقياس التسجيل السريري التقليدي لتقييم شدة المرض السريري EAU. جدول يوضح المعايير المستخدمة لتقييم مدى شدة المرض في الفئران المحصنة ب IRBP1-20. تم تخصيص الدرجات وفقا للعلامات المميزة الموضحة أعلاه والتي تظهر على صور قاع العين ، وتم إعطاء كل عين درجة إجمالية من أصل عشرين. * بسبب حجب التسلل وانفصال الشبكية داخل الغرفة الخلفية لا يمكن تقييمها. تم تكييف الجدول بإذن من Xu H. ، وآخرون ، 20088.
| درجة | معايير |
| 0 | لا تغيير |
| 0.5 (تتبع) | تسلل الخلايا الالتهابية الخفيفة. لا تلف الأنسجة |
| 1 | تسلل; طيات الشبكية وانفصال الشبكية البؤري ؛ عدد قليل من الأورام الحبيبية الصغيرة في المشيمية والشبكية ، التهاب التامور الوعائي |
| 2 | تسلل معتدل طيات الشبكية والانفصال وتلف خلايا مستقبلات الضوء البؤرية ؛ الأورام الحبيبية الصغيرة والمتوسطة الحجم والتهاب التامور الوعائي والتهاب الأوعية الدموية |
| 3 | تسلل متوسط إلى ثقيل ؛ طي شبكية واسع النطاق مع انفصال ، تلف خلايا مستقبلات الضوء المعتدل ؛ آفات حبيبية متوسطة الحجم ؛ الأوعية الدموية تحت الشبكية |
الجدول 2. تسجيل EAU نسيجيا
جدول يوضح المعايير المستخدمة لتقييم شدة EAU بناء على السمات النسيجية المرضية للمرض. تم تخصيص الدرجات وفقا للعلامات المميزة الموضحة أعلاه على تلطيخ H&E ، وتم إعطاء كل عين درجة إجمالية من أصل أربعة. تم تكييف الجدول بإذن من Agarwal et al. 201311.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
النماذج الحيوانية التجريبية هي أدوات ضرورية لدراسة التسبب في المرض والاختبارات قبل السريرية للنماذج العلاجية الجديدة. في البروتوكول الحالي ، ناقشنا منهجية لتحفيز ومراقبة وتسجيل EAU ، وهو نموذج تجريبي لالتهاب القزحية الالتهابي داخل العين. يحتوي نموذج EAU هذا على أكثر من 95٪ من حالات المرض عندما يتم تنفيذ جميع الإجراءات وفقا للبروتوكول الموضح هنا ، ويؤدي إلى تطوير EAU مزمن أحادي الطور. لتحقيق مستوى الإصابة هذا ، نؤكد على أهمية تحضير المستضد وحقن المستحلب ، وكلاهما مفصل أعلاه. السمات الرئيسية ل EAU في الحيوانات هي التهاب الشبكية و / أو المشيمية ، والتهاب الأوعية الدموية في شبكية العين ، وتدمير المستقبلات الضوئية وفقدان الرؤية ، وكلها تمثل العديد من السمات السريرية المرضية الأساسية لالتهاب القزحية الخلفيالبشري 12. الكثير من فهم الآليات الخلوية والجزيئية الأساسية المشاركة في التهاب العنبية المستمدة من نموذج EAU المستحث كما هو موضح هنا. يمكن تحفيز EAU في الفئران13 والجرذان11 عن طريق التحصين النشط مع مستضدات الشبكية التي تتعرف عليها الخلايا الليمفاوية. تأخذ مستضدات الشبكية هذه أشكالا عديدة. IRBP (للفئران) أو مستضد قابل للذوبان في شبكية العين (S-Ag) للفئران. يؤدي تحفيز EAU على خلفية C57BL / 6J إلى توليد شكل أكثر مزمنة من المرض ، مع ملاحظة ذروة علم الأمراض بعد ثلاثة أسابيع من التحصين. وبالمقارنة ، فإن تطبيق مستضد الشبكية على خلفية B10RIII14 يؤدي إلى شكل حاد أحادي الطور وشديد سريريا من EAU حيث تظهر ذروة علم الأمراض عادة في غضون أسبوعين من الحث ، ويهدأ المرض بحلول الأسبوع 3.
تم اختبار حوائط IRBP مختلفة في الفئران C57BL / 6J وأثبت الببتيد IRBP1-20 أنه نموذج قابل للتكرار مع مستويات عالية من الحدوث والشدة. في الآونة الأخيرة ، تم الإبلاغ عن حامية جديدة من IRBP ، بقايا الأحماض الأمينية 651 إلى 670 من IRBP البشري للحث على EAU مع حدوث سريري أعلى ومظهر مرض شديد11 ويمكن استخدامها في الأفضلية إذا كان هذا يلبي الأهداف العلمية. نظرا لأنه من المعروف أن تأثير الجراثيم المتعايشة في الأمعاء وتنشيط مستقبلات الخلايا التائية ذاتية التفاعل (TCRs) يتداخل مع ظهور المرض عند تطبيق مستضدات مختلفة15 ، فإننا نوصي المبتدئين في هذا المجال باستخدام إما hIRBP1-20 أو hIRBP651-670 الببتيدات بجرعة معايرة بين 300-500 ميكروغرام من أجل تحقيق نموذج موثوق. في الواقع ، تم توثيق التباين في هذا النموذج في مكان آخر مع تقارير تسلط الضوء على أهمية الاختلافات بين أنظمة الإسكان والميكروبيوم التي قد تؤثر على شدة المرض وحدوثه15. وبالتالي ، قد تكون هناك حاجة إلى مستضد الببتيد أكثر أو أقل وسم السعال الديكي.
هناك عدد من النماذج الأخرى التي يمكن إجراء تحليلنا الموصوف عليها. وتشمل هذه التهاب العنبية التلقائي الذي يتطور في مستقبلات الخلايا التائية IRBP (TCR) الفئران المعدلة وراثيا (R161H) حيث يتطور التهاب العين بحلول 5-6 أسابيع من سن16. يمكن أيضا تحفيز EAU بالتبني عن طريق نقل الخلايا المستجيبة CD4 + T العنبية. يمكن استخدام خلايا CD4 + T المنشطة والخاصة ب IRBP والمشتقة من الفئران المهيأة كمصدر للخلايا المستجيبة 3,11. يمثل هذا النموذج مرحلة المستجيب للمرض مع تجنب تعقيدات استخدام CFA في النموذج المحرض.
علاوة على ذلك ، هناك العديد من المزايا لاستخدام نماذج التهاب العين كأدوات مناسبة للتحقيق في الأمراض الالتهابية الأخرى ، على وجه الخصوص ، تلك التي لديها مستجيب Th1 و Th17 مجموعة فرعية من الأمراض. تتمثل المزايا الرئيسية لاستخدام هذا النموذج في الطرق غير الغازية والقابلة للقياس الكمي لمراقبة تطور المرض وتطوره ، وهي تنظير قاع العين وتصوير الأوعية. تسمح أنظمة التصوير غير الغازية هذه بالوصول السهل إلى الأنسجة العصبية ، والتي يمكن إخفاؤها خلف حواجز تشريحية واقية. تشمل الطرق الإضافية لمراقبة تطور المرض تطبيق التصوير المقطعي المحوسب ، وهو أكثر حساسية من التصوير بالمنظار في الكشف عن الارتشاح الخلوي ، خاصة في المرحلة المبكرة من بداية EAU. تسمح هذه التقنية بتصورات مقطعية متعددة الطبقات وأفقية لشبكية العين طوليا وبطريقة غير جراحية. في الجسم الحي يضيف التصوير المقطعي المحوسب معلومات عن سمك الشبكية التي لا يمكن الحصول عليها عن طريق الفحوصات بالمنظار والأنسجة17. وعلى نحو متزايد، فإن توافر تقنيات التصوير غير الغازية الأكثر تطورا، مثل تنظير العيون بالليزر بالمسح البصري التكيفي وأدوات التصوير متعدد الوسائط، سيزيد من قدرتنا على التحقيق في هذا المرض في القوارض الصغيرة. علاوة على ذلك ، فإن القدرة على تشريح وعزل مجموعات الخلايا المقيمة والمتسللة لإجراء تحليل أعمق للأنماط المناعية ، باستخدام تقنيات مثل التدفق الخلوي ، توفر فرصا كبيرة لتقديم معلومات ثاقبة.
هناك عدد قليل من أنظمة التسجيل الراسخة بناء على المعايير السريرية التي تم الحصول عليها من تنظير قاع القاع8،9،18. في حين أن هذه تختلف قليلا بين مراكز أبحاث طب العيون ، إلا أنها جميعا موثوقة وترتبط بالسمات النسيجية المرضية وقادرة على عكس شدة المرض بدقة. في الدراسة الحالية ، نشير إلى نظام التسجيل الذي طوره Xu et al.8. يقدم هذا النظام نهج تقييم أكثر تفصيلا مع عدد أكبر من معلمات القياس السريري. وهو يتألف من درجة قصوى تبلغ 20 درجة مما يوفر نافذة أوسع للتسجيل من الأنظمة البديلة التي تقتصر على 5 كحد أقصى. هذا هو أكثر أهمية لمزيد من الاستكشاف ضمن الأساليب العلاجية. ومع ذلك ، فإن تقليل خطأ المشغل أمر بالغ الأهمية عند استخدام مثل هذه المجموعة المكررة والمفصلة من المعلمات وقد يتطلب تدريبا دقيقا للمشغل والتحقق المستقل من التفسير.
هنا ، نقدم بروتوكولا للحث على EAU في إناث الفئران C57BL / 6 حيث أن هناك زيادة في حدوث النساء: الرجال 1.4: 1 الذين يعانون من التهاب القزحية في الإعداد السريري. ومع ذلك ، ينبغي النظر في جنس الفئران المستخدمة لإحداث أمراض المناعة الذاتية لأن هذا قد يؤثر على بيئة السيتوكين11 ، ويكشف أيضا عن اختلافات مهمة في طريقة استجابتها للتدخل العلاجي. اعتبار آخر هو عمر الفئران في تحريض المرض. على سبيل المثال ، درسنا الاعتماد على العمر للحساسية في الفئران B10RIII وخلصنا إلى أن الفئران التي تزيد عن 8 أسابيع من الحياة لديها نسبة أقل من EAU (دراسة غير منشورة من مجموعتنا).
في الختام ، قدمت النماذج الحيوانية لمرض داخل العين أداة لا تقدر بثمن لدراسة التهاب القزحية الخلفي البشري وسهلت تطوير علاجات جديدة مثل CsA. ومع ذلك ، لا يوجد نموذج حيواني في حد ذاته يعيد إنتاج الطيف الكامل لالتهاب القزحية البشري ، حيث أن لكل منها خصائص فريدة تجعله مناسبا لدراسة جوانب معينة من المرض. يتم تحفيز نموذج EAU هذا عن طريق المناعة الذاتية من خلال تطبيق الببتيد IRBP المكمل بالمواد المساعدة التي تؤدي إلى استجابات مناعية فطرية. ومع ذلك ، من غير المعروف ما إذا كانت جميع أشكال التهاب العنبية الخلفي في البشر هي مناعة ذاتية وما إذا كان تقليد المستضدات عاملا محفزا. بالإضافة إلى ذلك ، ليس من الواضح ما إذا كان هناك ارتباط بالعدوى في إثارة التهاب القزحية البشري. ومع ذلك ، فإن النموذج الموصوف هنا هو نموذج عام مفيد وقابل للتكرار يمكن استخدامه لجمع معلومات مفيدة فيما يتعلق بالمسببات المرضية والتسبب في المرض والعلاج من هذا المرض الذي يهدد البصر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإعلان عن هذا العمل.
Acknowledgments
حصلت JG على منحة UCL Impact الدراسية وتمويل Rosetrees Trust لدعم CB. تلقت VC منحة تعاونية بحثية من شركة Akari Therapeutics Inc. نود أن نشكر معهد UCL لطب العيون ، وحدة الخدمات البيولوجية وخاصة السيدة أليسون أوهارا وفريقها على دعمهم الفني.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| antisedan | ZOETIS, USA | for waking up | |
| Complete Freund’s Adjuvant; CFA | Sigma, UK | F5881 | for immunisation |
| Domitor | Orion Pharma, Finland | for anesthesia | |
| Flourescein | Sigma, UK | F2456 | for Angiography |
| IRBP1-20 | Chamberidge peptide, UK | peptide;antigen | |
| Ketamine | Orion Pharma, Finland | for anesthesia | |
| Micron III | Phoenix Research, USA | for fundoscopy | |
| Mouse Serum | Sigma, UK | M5905 | for immunisation |
| Mycobacterium terberculosis | Sigma, UK | 344289 | for immunisation |
| Pertussis Toxin | Sigma, UK | P2980 | for immunisation |
| phenylephrine hydrochloride 2.5% | Bausch & Lomb UK | PHEN25 | for dilation |
| Tropicamide 1% | SANDOZ | for dilation | |
| Viscotears | WELDRICKS Pharmacy, UK | 2082642 | for eye lubrication |
References
- Lyu, C., et al. TMP778, a selective inhibitor of RORgammat, suppresses experimental autoimmune uveitis development, but affects both Th17 and Th1 cell populations. The European Journal of Immunology. 48, 1810-1816 (2018).
- Klaska, I. P., Forrester, J. V.
- Eskandarpour, M., Alexander, R., Adamson, P., Calder, V. L. Pharmacological Inhibition of Bromodomain Proteins Suppresses Retinal Inflammatory Disease and Downregulates Retinal Th17 Cells. The Journal of Immunology. 198, 1093-1103 (2017).
- Mochizuki, M., et al. Preclinical and clinical study of FK506 in uveitis. Current Eye Research. 11, Suppl 87-95 (1992).
- Nguyen, Q. D., et al. Intravitreal Sirolimus for the Treatment of Noninfectious Uveitis: Evolution through Preclinical and Clinical Studies. Ophthalmology. 125, 1984-1993 (2018).
- Leal, I., et al. Anti-TNF Drugs for Chronic Uveitis in Adults-A Systematic Review and Meta-Analysis of Randomized Controlled Trials. Frontiers in Medicine (Lausanne). 6, 104 (2019).
- Chen, Y. H., et al. Functionally distinct IFN-?+ IL-17A+ Th cells in experimental autoimmune uveitis: T-cell heterogeneity, migration, and steroid response. European Journal of Immunology. 50 (12), 1941-1951 (2020).
- Xu, H., et al. A clinical grading system for retinal inflammation in the chronic model of experimental autoimmune uveoretinitis using digital fundus images. Experimental Eye Research. 87, 319-326 (2008).
- Copland, D. A., et al. The clinical time-course of experimental autoimmune uveoretinitis using topical endoscopic fundal imaging with histologic and cellular infiltrate correlation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49, 5458-5465 (2008).
- Dick, A. D. Doyne lecture 2016: intraocular health and the many faces of inflammation. Eye (Lond). 31, 87-96 (2017).
- Agarwal, R. K., Silver, P. B., Caspi, R. R. Rodent models of experimental autoimmune uveitis. Methods in Molecular Biology. 900, 443-469 (2012).
- Caspi, R. R. A look at autoimmunity and inflammation in the eye. Journal of Clininical Investigation. 120, 3073-3083 (2010).
- Caspi, R. R., et al. Mouse models of experimental autoimmune uveitis. Ophthalmic Research. 40, 169-174 (2008).
- Shao, H., et al. Severe chronic experimental autoimmune uveitis (EAU) of the C57BL/6 mouse induced by adoptive transfer of IRBP1-20-specific T cells. Experimental Eye Research. 82, 323-331 (2006).
- Horai, R., et al. Microbiota-Dependent Activation of an Autoreactive T Cell Receptor Provokes Autoimmunity in an Immunologically Privileged Site. Immunity. 43, 343-353 (2015).
- Chen, J., et al. Comparative analysis of induced vs. spontaneous models of autoimmune uveitis targeting the interphotoreceptor retinoid binding protein. PLoS One. 8, 72161 (2013).
- Chen, J., Qian, H., Horai, R., Chan, C. C., Caspi, R. R. Use of optical coherence tomography and electroretinography to evaluate retinal pathology in a mouse model of autoimmune uveitis. PLoS One. 8, 63904 (2013).
- Harry, R., et al. Suppression of autoimmune retinal disease by lovastatin does not require Th2 cytokine induction. Journal of Immunology. 174, 2327-2335 (2005).
