Summary
In dit rapport presenteren we een protocol waarmee de onderzoeker een muismodel van intraoculaire uveïtis kan genereren. Meer algemeen aangeduid als experimentele auto-immune uveïtis (EAU), dit gevestigde model legt vele aspecten van de menselijke ziekte vast. Hierin zullen we beschrijven hoe de progressie van de ziekte kan worden geïnduceerd en gevolgd met behulp van verschillende uitlezingen.
Abstract
Experimentele auto-immune uveïtis (EAU) wordt aangedreven door immuuncellen die reageren op zelf-antigenen. Veel kenmerken van dit niet-infectieuze, intraoculaire ontstekingsziektemodel recapituleren het klinische fenotype van posterieure uveïtis die mensen treft. EAU is betrouwbaar gebruikt om de werkzaamheid van nieuwe inflammatoire therapieën, hun werkingsmechanisme te bestuderen en om de mechanismen die ten grondslag liggen aan de progressie van de ziekte van intraoculaire aandoeningen verder te onderzoeken. Hier bieden we een gedetailleerd protocol over EAU-inductie in de C57BL / 6J-muis - het meest gebruikte modelorganisme met gevoeligheid voor deze ziekte. Klinische beoordeling van de ernst en progressie van de ziekte zal worden aangetoond met behulp van fundoscopie, histologisch onderzoek en fluoresceïneangiografie. De inductieprocedure omvat subcutane injectie van een emulsie met een peptide (IRBP1-20) uit het oculaire eiwit interfotoreceptor retinoïde bindend eiwit (ook bekend als retinolbindend eiwit 3), Complete Freund's Adjuvant (CFA) en aangevuld met gedode Mycobacterium tuberculosis. Injectie van deze viskeuze emulsie op de achterkant van de nek wordt gevolgd door een enkele intraperitoneale injectie van Bordetella pertussis toxine. Bij het begin van de symptomen (dag 12-14) en onder algemene anesthesie worden fundoscopische beelden gemaakt om de progressie van de ziekte te beoordelen door middel van klinisch onderzoek. Deze gegevens kunnen direct worden vergeleken met die op latere tijdstippen en piekziekte (dag 20-22) met geanalyseerde verschillen. Tegelijkertijd stelt dit protocol de onderzoeker in staat om potentiële verschillen in vaatdoorlaatbaarheid en schade te beoordelen met behulp van fluoresceïneangiografie. EAU kan worden geïnduceerd in andere muizenstammen - zowel wildtype als genetisch gemodificeerd - en gecombineerd met nieuwe therapieën die flexibiliteit bieden voor het bestuderen van de werkzaamheid van geneesmiddelen en / of ziektemechanismen.
Introduction
Dit protocol zal aantonen hoe experimentele auto-immune uveïtis (EAU) in de C57BL/6J-muis kan worden geïnduceerd door een enkele subcutane injectie van een retinaal antigeen in een geëmulgeerd adjuvans. Methoden voor het monitoren en beoordelen van ziekteprogressie zullen worden gedetailleerd door middel van fundoscopische beeldvorming en histologisch onderzoek, met meetparameters die binnenin worden beschreven. Daarnaast zal fluoresceïneangiografie, een techniek voor het onderzoeken van de retinale bloedvatstructuur en permeabiliteit, worden besproken.
Dit EAU-model vat centrale kenmerken van niet-infectieuze posterieure uveïtis bij mensen samen met betrekking tot clinicopathologische kenmerken en de basale cellulaire en moleculaire mechanismen die ziekte veroorzaken. EAU wordt gemedieerd door Th1- en/of Th17-subgroepen van zelfreactieve CD4+T-lymfocyten, zoals aangetoond in adoptieve overdrachtsexperimenten en met IFNγ-uitgeputte muizen1. Veel van ons begrip van de mogelijke rollen voor deze cellen bij uveïtis komt van het bestuderen van EAU2, waar zowel Th1- als Th17-cellen worden gedetecteerd in de retinale weefsels3. Vaak wordt EAU gebruikt als een preklinisch model om het nut van nieuwe therapieën bij het verzachten van ziekten te beoordelen. Therapeutische benaderingen die met succes de EAU-ziekte hebben gemoduleerd, hebben enige werkzaamheid in de kliniek aangetoond en de door de FDA goedgekeurde status bereikt. Voorbeelden hiervan zijn groepen immunoregulerende geneesmiddelen zoals de T-celgerichte therapieën: ciclosporine, FK-506 en rapamycine 4,5,6. Onlangs zijn interventies gericht op nieuwe paden ook onderzocht in dit model om zowel het mechanisme als het effect op de uitkomst van de ziekte te onderzoeken. Deze omvatten gerichte transcriptionele regulatie via chromatinelezer Bromodomain Extra-Terminal (BET) eiwitten en P-TEFb-remmers3. Bovendien hebben meer conventionele benaderingen zoals een VLA-4-remmer onlangs onderdrukking in EAU aangetoond via modulatie van effector CD4 + T-cellen7. Bovendien is gebleken dat het richten op Th17-cellen met TMP778, een RORγt-inverse agonist, ook EAU8 aanzienlijk onderdrukt. Bovendien biedt dit model de mogelijkheid om chronische auto-immuunontsteking in het netvlies en de bijbehorende onderliggende mechanismen zoals lymfocytenpriming te bestuderen.
De primaire uitlezingen voor preklinische studies van EAU zijn klinische beoordeling door het uitvoeren van retinale fundoscopie beeldvorming en minder vaak, door het beoordelen van retinale integriteit door optische coherentie tomografie (OCT). Retinale histopathologische evaluatie en immunofenotypering van retinale cellen door middel van flowcytometrie worden vervolgens bij beëindiging uitgevoerd. Fundoscopie is een eenvoudig te gebruiken live beeldvormingssysteem dat een snelle en reproduceerbare klinische beoordeling van het hele netvlies mogelijk maakt. Voor immunohistochemische beoordelingen zijn de technieken gebaseerd op de voorbereiding van retinale secties waarmee we weefselarchitectuur kunnen bestuderen op de mate van ontsteking en structurele schade9. De beoordelingscriteria en conventionele scoresystemen, voor alle gebruikte technieken, zullen in dit protocol worden beschreven. De omvang van de schade die is geregistreerd met behulp van fundoscopische beeldvorming correleert vaak nauw met histologische veranderingen. Deze dubbele benadering voor het monitoren en beoordelen van de ernst van de ziekte zorgt voor een grotere gevoeligheid en betrouwbaardere meetresultaten.
EAU is een gevestigde, veelgebruikte model voor preklinische testen en onderzoek van immuungemedieerde oogziekte. Dit model is betrouwbaar en reproduceerbaar met >95% ziekte-incidentie en genereert uitgebreide gegevens die kunnen worden gebruikt om nieuwe therapieën voor de behandeling van intraoculaire ontstekingsziekten te valideren of af te wijzen die wereldwijd een belangrijke oorzaak van blindheid in de werkende leeftijd vormen10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de UK Animals (Scientific Procedures) Act van 1986 en de richtlijnen van het Institutional Animal Welfare and Ethical Review Body (AWERB).
1. Behuizing C57BL/6J muizen
- Huismuizen in een specifieke pathogeenvrije omgeving, op een 12 uur durende licht-donkercyclus en voedsel en water beschikbaar ad libitum.
- Voer alle experimenten uit op volwassen vrouwelijke C57BL/6J (vrouwen worden bij voorkeur gekozen omdat er een incidentie is van vrouwen op mannen 1,4 tot 1 bij uveïtispatiënten). Randomiseer vrouwelijke C57BL/6J muizen tussen 6-8 weken oud op gewicht en leeftijd. Huisvest de muizen in individueel geventileerde kooien (IVC) in groepen van 5-6 muizen per kooi.
2. Immunisatie van C57BL/6 muizen
- IRBP1-20 - CFA Emulsie Voorbereiding
OPMERKING: Emulsiepreparaat is essentieel voor de reproduceerbaarheid en incidentie van ziekten; als zodanig moet alles in het werk worden gesteld om de consistentie tijdens het voorbereidingsproces en tussen experimenten te behouden. Bij het bereiden van de emulsie moet vooraf rekening worden gehouden met het verlies in de berekeningen van alle reagentia. Dit verlies kan ongeveer 1,5x zijn (of 50% extra van het voorbereide volume), op basis van het aantal muizen dat gepland is voor immunisatie. Zie het volgende voorbeeld hieronder. Om 10 muizen te immuniseren, bereidt u 15 muizen voor en gebruikt u 400 μg (peptide per 20 g muis) x 15 muizen = 6 mg. Elke muis moet 200 μL krijgen voor immunisatie (3 ml totaal). Het uiteindelijke volume bestaat uit een verhouding van 1:1 van peptide-oplossing en CFA, vandaar 1,5 ml peptide-oplossing en 1,5 ml CFA.- Bereid alle steriele oplossingen in een laminaire flowkast met behulp van aseptische technieken.
- Weeg de gewenste hoeveelheid (400 μg per 20 g muis) menselijk IRBP1-20 (LAQGAYRTAVDLESLASQLT) gelyofiliseerd peptide af. Los peptide op in 100% DMSO. Bewaar de voorraad in gelyofiliseerde vorm bij -20 °C.
OPMERKING: Om ervoor te zorgen dat het poeder volledig is opgelost, moet elke vlok eerst contact maken met de DMSO en geen teken van resterende vaste stof vertonen. Voeg PBS in kleine porties toe om het uiteindelijke volume te bereiken. Meng niet met een vortex, maar gebruik in plaats daarvan voorzichtig roeren met een pipet. De uiteindelijke concentratie DMSO mag niet hoger zijn dan 1% van het totale peptidepreparaatvolume. Het voorbereiden van de emulsie in een plastic buis van 20 ml met een taps toelopende bodem moet een betere toegankelijkheid van DMSO tot het gelyofiliseerde poeder mogelijk maken. - Voeg DMSO-PBS-peptideoplossing toe bij 1:1 v/v aan CFA, dat al is aangevuld met 1,5 mg/ml gedode Mycobacterium tuberculosis, om een eindconcentratie van 2,5 mg/ml te geven. Voeg druppelsgewijs, pipetteer voorzichtig en vaak toe om een stroperige en gelijkmatig verdeelde emulsie te vormen.
- Belucht de peptideoplossing en CFA met een pipet van 1000 μL (ingesteld op 700 μL om verder verlies te voorkomen) en pipet om een romige dikke consistentie te genereren. Deze techniek omvat het gebruik van de pipet om herhaaldelijk op en neer te zuigen totdat de gewenste dikte is bereikt. Voor optimale resultaten, zorg ervoor dat de antigeenoplossing en het adjuvans grondig worden gemengd voordat u injecteert.
- Intraperitoneale injectie van kinkhoesttoxine
- Suspensie 1,5 μg Bordetella kinkhoesttoxine in 100 μL RPMI 1640 media aangevuld met 1% muizenserum11.
- Voer de i.p. injectie uit met een steriele spuit en een 23G naald.
OPMERKING: Om verstoringen van de injectieplaats te voorkomen, moet het kinkhoesttoxine worden toegediend voordat het antigeen wordt geïnjecteerd. - Breng elke muis tijdelijk over naar een aparte kooi om een enkele 100 μL i.p. injectie van Bordetella kinkhoesttoxine te ontvangen.
- Subcutane injectie van IRBP-emulsie
- Injecteer vervolgens de IRBP-emulsie subcutaan. Dit proces vereist twee dierenverzorgers die op de juiste manier zijn uitgerust met bescherming volgens gezondheids- en veiligheidsvoorschriften.
- Laat een getrainde persoon de muis lichtjes vasthouden bovenop de kooi in een nekvelachtige positie, met zijn maag naar beneden gericht, terwijl de andere getrainde persoon de huid knijpt om een tentachtige structuur op de achterkant van de nek te vormen waar de naald kan worden ingebracht om tussen de vinger en duim te glijden.
LET OP: Er is een gevaar voor prikaccidenten. - Zodra de naald is geplaatst, injecteert u 200 μL van de IRBP-emulsie. Draai bij het verwijderen van de naald de naaldkop om de huid te sluiten voordat u deze uittrekt en oefen daarna druk uit op de injectieplaats om reflux van de emulsie te voorkomen.
LET OP: De emulsie mag geen contact maken met de huid of vacht van de muis, omdat dit irritatie kan veroorzaken en in ernstigere gevallen een laesie kan ontwikkelen. Als dit gebeurt, moet het gebied onmiddellijk en grondig worden afgeveegd met 70% ethanol en vervolgens worden gedroogd.
OPMERKING: Als de drainerende lymfeklieren nodig zijn voor onderzoek aan het einde van het onderzoek, zal de injectieplaats anders zijn. Injecteer in dit geval 100 μL subcutaan aan beide zijden van de flank. Dit zal een sterkere reactie genereren op de drainerende inguinale lymfeklieren, die kunnen worden weggesneden op het moment van oogsten. Als het beoogde resultaat echter uitsluitend is om EAU te ontwikkelen, heeft een enkele injectie van 200 μL aan de achterkant van de nek de voorkeur om ongemak van meerdere injectieplaatsen te voorkomen.
3. Klinische evaluatie - Muis Fundus Onderzoek
OPMERKING: Klinische ziekte moet worden gescoord met behulp van fundusonderzoek, via bright-field live beeldvorming met behulp van een fundoscoop en Discover-software die wordt gebruikt voor visualisatie.
- Bij het begin van de ziekte (dag 12-14) verdoofde muizen onder algemene anesthesie met behulp van een combinatie van zowel Ketamine (50 mg / ml) als Domitor (Medetomidine; 1 mg / ml). Verdun 1-delige Domitor; 1,5 delen Ketamine en 2,5 delen steriel injecteerbaar water en injecteer vervolgens 100 μL per 30 g intraperitoneaal. Gebruik 1 ml steriele spuiten en 23G naalden voor de bovenstaande combinatie van anesthesie.
- Controleer hierna de muis om ervoor te zorgen dat alle reflexen verloren gaan en dat deze niet reageert op stimuli.
- Onmiddellijk na ontvangst van de i.p.-injectie en terwijl de muis nog steeds in een nekvel wordt gehouden, brengt u 1% tropicamide en 2,5% fenylefrine topisch aan op elk oog voor pupilverwijding. Streef ernaar om het hoornvlies volledig te bedekken met beide verwijdingsoplossingen. Het kan enkele minuten duren voordat de pupil volledig verwijd is.
- Breng daarna royaal aan op de oogviscotears zalf en onderhoud gedurende het hele beeldvormingsproces om het oog volledig gesmeerd en gehydrateerd te houden.
- Open in de tussentijd de software (bijvoorbeeld Discover) en stel de fundoscoop (bijv. Micron) in om beelden onder brightfield vast te leggen. Wijs elke individuele muis een map toe en label afbeeldingen met R of L volgens elk gefotografeerd oog.
- Monteer de muis op een speciaal gebouwd podium voor live visualisatie en plaats de microscoop voor volledige toegang tot het netvlies.
- Om een nauwkeurige weergave van de ziekte te krijgen, maakt u foto's van het hele retinale gebied, dat alle hoeken van de periferie beslaat, naast de optische schijf. Om dit te bereiken, past u het oculair overal aan. Het is van cruciaal belang dat het oog te allen tijde volledig gesmeerd blijft tijdens het beeldvormingsproces; zorg hiervoor door de oogzalf met een constante snelheid bij te vullen.
- Raadpleeg rubriek 4 (hieronder) in dit stadium om fluoresceïneangiografie uit te voeren.
- Zodra alle beeldvorming is voltooid, verdunt u anesthetische reversale antisedatie (5 mg / ml antisedan) in injecteerbaar water en dient u toe met 0,1 mg / kg i.p. Breng de muis terug naar een kooi en plaats hem op een voorverwarmde mat met toegang tot een nat geweekt dieet tot herstel. Volledig herstel wordt gekenmerkt door beweging van het hele lichaam en rond de kooi lopen met een gestage gang, meestal een paar uur.
- Herhaal op het aangewezen experimentele eindpunt (bijv. dag 21-23) stap 4.1-4.5 en maak opnieuw foto's van het hele retinale gebied, waarbij de optische schijf en alle hoeken van de periferie worden bedekt om een nauwkeurige weergave van de ziekte vast te leggen.
4. Fluoresceïne angiografie
- Om de lekkage van bloedvaten bij deze dieren te meten, terwijl u onder narcose bent, geeft u elke muis een injectie van 2% fluoresceïne subcutaan aan de achterkant van de nek en positie zodanig dat het netvlies in het midden van het live beeld wordt gecentraliseerd.
- Stel de fundoscoop in op een excitatiefilter voor blauw licht op 465-490 nm. Het licht dat wordt opgevangen door geëxciteerd fluoresceïne ligt tussen 520-530 nm.
- Maak na 1,5 min na de injectie met fluoresceïne een foto van elk netvlies en herhaal dit na 7 minuten opnieuw.
OPMERKING: Timing is van cruciaal belang voor deze gebeurtenissen, als u niet in staat bent om beide vast te leggen, beeld dan slechts één oog.
5. Klinische ziektescore
- Baseer de klinische beoordeling op de ernst van de volgende criteria: optische schijfontsteking, retinale vaatmanchetten, retinale weefselinfiltraat en structurele schade.
- Geef elk van deze parameters een score op een schaal van 0 tot 5 en het collectieve totaal is representatief voor de klinische ziekte voor het hele oog, met een maximale score van 20 per oog. Tabel 1 kan worden gebruikt als leidraad voor scoringscriteria.
6. Histologie en histologische scoring
- Na het euthanaseren van de muizen door cervicale dislocatie, enucleate de ogen door de oogleden uit elkaar te prikken voor gemakkelijke toegang tot het hele oog.
- Plaats vervolgens gebogen tangen achter de bol met de bedoeling het orbitale bindweefsel en de oogzenuw te grijpen. Zorg ervoor dat u de wereld niet samenknijpt.
- Plaats voor fixatie het oog in 4% glutaaraldehyde gedurende minimaal 15 minuten om netvliesloslating te minimaliseren en breng vervolgens over op 10% formaldehyde gedurende ten minste 24 uur. 1-2 ml fixatief zou voldoende volume geven om twee ogen te bedekken.
- Voer inbedding uit in paraffine, secties op een microtoom en kleuring volgens standaardprotocollen. 3-4 μm sectiedikte wordt aanbevolen voor elk type kleuring.
- Voer histologisch onderzoek van de ogen uit met behulp van standaardprotocollen voor Hematoxyline en Eosine (H &E) kleuring.
- Wijs scores toe op een schaal van 0-4, volgens de criteria voor EAU-scoring, op basis van de mate van de infiltratie van immuuncellen in het netvlies en het vaatvlies, de verstoring van de retinale lagen, de mate van granuloomvorming en de mate van netvliesloslating, wat wijst op retinale schade, zoals eerder beschreven (Agarwal 2013) en samengevat in tabel 211.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In dit protocol beschrijven we een stapsgewijze methode voor het induceren van een model van experimentele auto-immune uveïtis (EAU) door muizen te immuniseren met een uveitogene retinale peptide afgeleid van IRBP. De beoordeling van ziekten waarbij gebruik wordt gemaakt van veelgebruikte en gemakkelijk toegankelijke benaderingen, wordt behandeld, hoewel deze niet exclusief zijn en kunnen worden toegevoegd aan of gedeeltelijk worden vervangen door andere beeldvormingstechnieken. De eerste tekenen van EAU bij C57BL/6J-muizen kunnen twee weken na immunisatie worden gedetecteerd en piekziekte binnen drie weken worden bereikt, zoals geïllustreerd in figuur 1. Fundoscopische veranderingen worden tijdens ziekteprogressie geclassificeerd als inflammatoire veranderingen, waaronder retinale weefsel, vasculaire en optische schijfontsteking en retinale structurele schade (figuur 2) naast histologische veranderingen op basis van infiltrerende immuuncellen en structurele schade. Deze klinische en histopathologische veranderingen kunnen tot 85 dagen na immunisatie worden gedetecteerd en beoordeeld en gescoord voor evaluatie stelt voor om ziekteprogressie te bestuderen. Om onbedoelde vertekening in de kwalitatieve visuele score te voorkomen, moeten de beelden door meer dan één expert worden geëvalueerd en moeten scorers blind worden gemaakt voor de behandelingsgroepen.
We laten hier zien hoe de klinische en histologische scoresystemen (tabel 1 en tabel 2) wetenschappers begeleiden om de ernst van EAU te kwantificeren, de werkzaamheid van behandelingen te valideren en het werkingsmechanisme van geneesmiddelen te onderzoeken. Vasculaire lekkage is ook een pathologisch kenmerk van het model en bij menselijke uveïtis. We tonen voorbeelden van vasculaire lekkage van fluoresceïne (figuur 3) als een andere methode voor het beoordelen van ziekten in dit model.
Figuur 1. Schematische tijdlijn van klinische en histologische ziekteprogressie in IRBP1-20 geïnduceerde EAU. Een tijdlijn die het begin van infiltratie en progressie van IRBP1-20 markeert, veroorzaakte EAU in de richting van piekziekte. Vanaf immunisatie vallen de eerste tekenen van klinische ziekte, zoals gedetecteerd door fundoscopische beeldvorming en histopathologische analyse, tussen dag 12-14. De ziekte zal dan blijven vorderen, volgens deze parameters, totdat een piek wordt bereikt rond dag 21-23. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Representatieve fundoscopische beelden correleren met histologische secties in verschillende stadia van IRBP1-20 geïnduceerde EAU-ziekte bij C57BL/ 6J-muizen. Klinische fundoscopische en overeenkomstige weefselbeelden van C57BL/6J van hetzelfde dier geïmmuniseerd met IRBP 1-20 peptide. (A en B) fundoscopische beelden en histologische delen van het oog verkregen van gezonde en CFA geïnjecteerde muizen. Retina heeft geen teken van ontsteking en overeenkomstige histologiesecties vertonen bewaarde retinale lagen. (C) Fundoscopisch beeld van het oog verkregen van C57BL / 6J-muis 14 dagen na immunisatie vertoont klassieke tekenen van EAU, presenterend met ernstige zwelling van de optische schijf in het vroege stadium van de ziekte, overeenkomstige histologie toont infiltrerende immuuncellen in glasvochtruimte. (D) Fundoscopische beelden van ogen verkregen van C57BL/6J muis 21 dagen na immunisatie vertonen tekenen van vaatmanchetten en infiltrerende immuunpopulaties. Histologische gegevens tonen ernstige structurele veranderingen door retinale vouwing (gele pijlen). V= vat, O= optische schijf, R=retina, L=lens, Vit=glasvocht,iO= ontstoken optische schijf, iV= ontstoken vat, iR= ontstoken netvlies, i= infiltrerende cellen in glasvocht, RFs=retinale plooien. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Representatieve beelden van fluorescerende angiografie genomen met behulp van Micron III-beeldvormingssysteem op piekziekte. C57BL/6J-muizen werden subcutaan geïnjecteerd met 2% fluoresceïne en beelden die op verschillende tijdstippen na circulatie van de tracer werden genomen. (A) CFA controleert alleen muis genomen op 1,5- en 7-minuten na toediening van fluoresceïne. (B) Representatieve beelden van IRBP1-20 geïmmuniseerde muizen genomen respectievelijk 1,5 en 7 minuten na ontvangst van fluoresceïne. Witte pijl geeft lekkage van het vat aan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Partituur | Optische schijf | Retinale vaten | Retinaal weefselinfiltraat | Structurele schade | ||||
| 1 | Minimale ontsteking | 1-4 milde manchetten | 1-4 kleine laesies of 1 lineaire laesie | Retinale laesies of retinale atrofie waarbij 1/4 tot 3/4 retina gebied betrokken is | ||||
| 2 | Milde ontsteking | >4 milde manchetten of 1-3 matige manchetten | 5-10 kleine laesies of 2-3 lineaire laesies | Pan retinale atrofie met meerdere kleine laesies (littekens) of <3 lineaire laesies (littekens) | ||||
| 3 | Matige ontsteking | >3 matige manchetten | >10 kleine laesies of >3 lineaire laesies | Pan retinale atrofie met >3 lineaire laesies of confluente laesies (littekens) | ||||
| 4 | Ernstige ontsteking | >1 ernstige manchetten | Lineaire laesie confluent | Netvliesloslating met vouwen | ||||
| 5 | * Niet zichtbaar (white out of extreme onthechting) | * Niet zichtbaar (white out of extreme onthechting) | * Niet zichtbaar (white out of extreme onthechting) | * Niet zichtbaar (white out of extreme onthechting) | ||||
Tabel 1. Conventionele klinische scoringsschaal voor het evalueren van de ernst van de klinische ziekte van EAU. Tabel met criteria die worden gebruikt om de ernst van de ziekte te evalueren bij muizen die zijn geïmmuniseerd met IRBP1-20. Scores werden toegekend volgens de hierboven geschetste keurmerken die zichtbaar waren op de fundusbeelden, elk oog kreeg een totale score van de twintig. * Vanwege de obscuratie van infiltraat en netvliesloslating in de achterste kamer kan niet worden beoordeeld. Tabel aangepast met toestemming van Xu H., et al., 20088.
| Graad | Criteria |
| 0 | Geen verandering |
| 0,5 (spoor) | Milde inflammatoire celinfiltratie. Geen weefselschade |
| 1 | Infiltratie; retinale plooien en focale retinale loslatingen; weinig kleine granulomen in vaatvlies en netvlies, perivasculitis |
| 2 | Matige infiltratie; retinale plooien, loslatingen en focale fotoreceptorcelbeschadiging; kleine tot middelgrote granulomen, perivasculitis en vasculitis |
| 3 | Middelzware tot zware infiltratie; uitgebreide retinale vouwing met loslatingen, matige fotoreceptorcelbeschadiging; middelgrote granulomateuze laesies; subretinale neovascularisatie |
Tabel 2. Histologisch scorende EAU
Tabel met criteria die worden gebruikt om de ernst van EAU te evalueren op basis van histopathologische kenmerken van de ziekte. Scores werden toegewezen volgens de hierboven geschetste kenmerken op H &E-kleuring, elk oog kreeg een totale score van vier. Tabel aangepast met toestemming van Agarwal et al. 201311.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Experimentele diermodellen zijn noodzakelijke hulpmiddelen voor het bestuderen van ziektepathogenese en preklinisch testen van nieuwe therapeutische paradigma's. In het huidige protocol hebben we een methodologie besproken voor het induceren, monitoren en scoren van EAU, een experimenteel model van intraoculaire inflammatoire uveïtis. Dit EAU-model heeft meer dan 95% ziekte-incidentie wanneer alle procedures worden uitgevoerd volgens het hierin beschreven protocol en resulteert in de ontwikkeling van chronische, monofasische EAU. Om dit incidentieniveau te bereiken, benadrukken we het belang van antigeenpreparaat en injectie van de emulsie, die beide hierboven zijn beschreven. De belangrijkste kenmerken van EAU bij dieren zijn retinale en / of choroïdale ontsteking, retinale vasculitis, fotoreceptorvernietiging en verlies van gezichtsvermogen, die allemaal veel essentiële clinicopathologische kenmerken van menselijke posterieure uveïtis vertegenwoordigen12. Veel van het begrip van de fundamentele cellulaire en moleculaire mechanismen die betrokken zijn bij uveïtis is afgeleid van het geïnduceerde EAU-model zoals hierin beschreven. EAU kan worden geïnduceerd bij muizen13 en ratten11 door actieve immunisatie met retinale antigenen die worden herkend door lymfocyten. Deze retinale antigenen nemen vele vormen aan; IRBP (voor muizen) of retinaal oplosbaar antigeen (S-Ag) voor ratten. Het induceren van EAU op een C57BL / 6J-achtergrond genereert een meer chronische vorm van de ziekte, met piekpathologie waargenomen drie weken na immunisatie. Ter vergelijking: het toepassen van retinaal antigeen op een B10RIII-achtergrond14 induceert een acuut-monofasische en klinisch ernstige vorm van EAU waarbij piekpathologie zich meestal binnen twee weken na inductie presenteert en de ziekte in week 3 afneemt.
Verschillende IRBP-epitopen zijn getest in C57BL/6J-muizen en IRBP1-20-peptide heeft bewezen een reproduceerbaar model te zijn met een hoge incidentie en ernstniveaus. Onlangs is een nieuwe uveitogene epitoop van IRBP, aminozuurresiduen 651 tot 670 van humaan IRBP gemeld om EAU te induceren met een hogere klinische incidentie en ernstige ziektemanifestatie11 en kunnen bij voorkeur worden gebruikt als dit voldoet aan de wetenschappelijke doelstellingen. Aangezien bekend is dat de impact van darmcommensale microbiota en de activering van autoreactieve T-celreceptoren (TCR's) interfereren met het begin van de ziekte bij het toepassen van verschillende antigenen15, raden we beginners op dit gebied aan om hIRBP1-20 of hIRBP651-670 peptiden te gebruiken in een dosis getitreerd tussen 300-500 μg om een betrouwbaar model te bereiken. Inderdaad, variabiliteit in dit model is elders gedocumenteerd met rapporten die het belang benadrukken van verschillen tussen huisvestingssystemen en het microbioom die van invloed kunnen zijn op de ernst en incidentie van de ziekte15. Er kan dus meer of minder peptide-antigeen en kinkhoesttoxine nodig zijn.
Er zijn een aantal andere modellen waarop onze beschreven analyse kan worden uitgevoerd. Deze omvatten spontane uveïtis die vordert in IRBP T-celreceptor (TCR) transgene (R161H) muizen waar oculaire ontsteking zich ontwikkelt op 5-6 weken van de leeftijd van16. EAU kan ook adoptief worden geïnduceerd door uveitogene effector CD4 +T-cellen over te brengen. Geactiveerde, IRBP-specifieke CD4+T-cellen afgeleid van geprimeerde muizen kunnen worden gebruikt als bron van effectorcellen 3,11. Dit model vertegenwoordigt de effectorfase van de ziekte en vermijdt de complexiteit van het gebruik van CFA in het induceerbare model.
Verder zijn er veel voordelen aan het gebruik van oculaire ontstekingsmodellen als geschikte hulpmiddelen om andere ontstekingsziekten te onderzoeken, in het bijzonder die met effector Th1 en Th17 subgroeppathologie. De belangrijkste voordelen van het gebruik van dit model zijn de niet-invasieve en kwantificeerbare methoden voor het monitoren van ziekteontwikkeling en progressie, namelijk fundoscopie en angiografie. Deze niet-invasieve beeldvormingssystemen bieden gemakkelijke toegang tot neuronale weefsels, die anders verborgen zouden zijn achter beschermende anatomische barrières. Aanvullende methoden voor het monitoren van ziekteprogressie omvatten de toepassing van OCT-beeldvorming, die gevoeliger is dan fundoscopische beeldvorming bij het detecteren van cellulaire infiltraten, vooral in het vroege stadium van het begin van EAU. De techniek maakt meerlaagse cross- en horizontale-sectionele visualisaties van het netvlies longitudinaal en op een niet-invasieve manier mogelijk. In vivo OCT-beeldvorming voegt informatie over retinale dikte toe die niet kon worden verkregen door fundoscopische en histologische onderzoeken17. In toenemende mate zal de beschikbaarheid van nog geavanceerdere niet-invasieve beeldvormingstechnieken, zoals adaptieve optica scanning laser oftalmoscopie en multimodale beeldvormingstools, onze capaciteit om deze ziekte bij kleine knaagdieren te onderzoeken verder vergroten. Bovendien biedt het vermogen om residente en infiltrerende celpopulaties te ontleden en te isoleren voor een diepere analyse van immunofenotypen, met behulp van technieken zoals flowcytomety, grote kansen om inzichtelijke informatie te leveren.
Er zijn een paar gevestigde scoresystemen op basis van klinische criteria verkregen uit fundoscopie 8,9,18. Hoewel deze enigszins verschillen tussen oogheelkundige onderzoekscentra, zijn ze allemaal betrouwbaar, correleren ze met histopathologische kenmerken en zijn ze in staat om de ernst van de ziekte nauwkeurig weer te geven. In de huidige studie verwijzen we naar het scoresysteem ontwikkeld door Xu et al.8. Dit systeem biedt een meer gedetailleerde beoordelingsaanpak met een groter aantal klinische meetparameters. Het omvat een maximale score van 20 die een breder venster voor score introduceert dan alternatieve systemen die beperkt zijn tot een maximum van 5. Dit is belangrijker voor verdere verkenning binnen therapeutische benaderingen. Het minimaliseren van fouten bij de bediener is echter van cruciaal belang bij het gebruik van een dergelijke verfijnde en gedetailleerde reeks parameters en kan een zorgvuldige opleiding van de bediener en onafhankelijke validatie van de interpretatie vereisen.
Hier presenteren we een protocol om EAU te induceren bij vrouwelijke C57BL/6-muizen, omdat er een verhoogde incidentie is van vrouwen: mannen 1,4:1 presenteren zich met uveïtis in de klinische setting. Niettemin moet het geslacht van de muizen die worden gebruikt voor het induceren van auto-immuunziekten worden overwogen, omdat dit het cytokinemilieu kan beïnvloeden11 en ook belangrijke verschillen kan onthullen in de manier waarop ze reageren op therapeutische interventie. Een andere overweging is de leeftijd van de muizen bij ziekte-inductie. We hebben bijvoorbeeld leeftijdsafhankelijkheid van gevoeligheid bij B10RIII-muizen bestudeerd en geconcludeerd dat muizen gedurende 8 weken van het leven een lagere incidentie van EAU hebben (ongepubliceerde studie van onze groep).
Kortom, diermodellen van intraoculaire aandoeningen hebben een waardevol hulpmiddel geboden om menselijke posterieure uveïtis te bestuderen en hebben de ontwikkeling van nieuwe therapieën zoals CsA vergemakkelijkt. Geen enkel diermodel op zichzelf reproduceert echter het volledige spectrum van menselijke uveïtis, omdat elk unieke kenmerken heeft die het geschikt maken voor het bestuderen van bepaalde aspecten van de ziekte. Dit EAU-model wordt geïnduceerd door auto-immuniteit door de toepassing van IRBP-peptide aangevuld met adjuvantia die aangeboren immuunresponsen veroorzaken. Het is echter niet bekend of alle vormen van posterieure uveïtis bij mensen auto-immuun zijn en of antigene mimicry een triggerende factor is. Bovendien is het niet duidelijk of er een verband is met infectie bij het veroorzaken van menselijke uveïtis. Niettemin is het hierin beschreven model een nuttig en reproduceerbaar generiek model dat kan worden gebruikt om nuttige informatie te verzamelen over etiologie, pathogenese en therapie van deze zichtbedreigende ziekte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten te verklaren met dit werk.
Acknowledgments
JG kreeg een UCL Impact Studentship en Rosetrees Trust-financiering om CB te ondersteunen. VC ontving een onderzoekssubsidie van Akari Therapeutics Inc. We willen het UCL Institute of Ophthalmology, Biological Service Unit bedanken, in het bijzonder mevrouw Alison O'Hara en haar team voor hun technische ondersteuning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| antisedan | ZOETIS, USA | for waking up | |
| Complete Freund’s Adjuvant; CFA | Sigma, UK | F5881 | for immunisation |
| Domitor | Orion Pharma, Finland | for anesthesia | |
| Flourescein | Sigma, UK | F2456 | for Angiography |
| IRBP1-20 | Chamberidge peptide, UK | peptide;antigen | |
| Ketamine | Orion Pharma, Finland | for anesthesia | |
| Micron III | Phoenix Research, USA | for fundoscopy | |
| Mouse Serum | Sigma, UK | M5905 | for immunisation |
| Mycobacterium terberculosis | Sigma, UK | 344289 | for immunisation |
| Pertussis Toxin | Sigma, UK | P2980 | for immunisation |
| phenylephrine hydrochloride 2.5% | Bausch & Lomb UK | PHEN25 | for dilation |
| Tropicamide 1% | SANDOZ | for dilation | |
| Viscotears | WELDRICKS Pharmacy, UK | 2082642 | for eye lubrication |
References
- Lyu, C., et al. TMP778, a selective inhibitor of RORgammat, suppresses experimental autoimmune uveitis development, but affects both Th17 and Th1 cell populations. The European Journal of Immunology. 48, 1810-1816 (2018).
- Klaska, I. P., Forrester, J. V. Mouse models of autoimmune uveitis. Current Pharmaceutical Design. 21, 2453-2467 (2015).
- Eskandarpour, M., Alexander, R., Adamson, P., Calder, V. L. Pharmacological Inhibition of Bromodomain Proteins Suppresses Retinal Inflammatory Disease and Downregulates Retinal Th17 Cells. The Journal of Immunology. 198, 1093-1103 (2017).
- Mochizuki, M., et al. Preclinical and clinical study of FK506 in uveitis. Current Eye Research. 11, Suppl 87-95 (1992).
- Nguyen, Q. D., et al. Intravitreal Sirolimus for the Treatment of Noninfectious Uveitis: Evolution through Preclinical and Clinical Studies. Ophthalmology. 125, 1984-1993 (2018).
- Leal, I., et al. Anti-TNF Drugs for Chronic Uveitis in Adults-A Systematic Review and Meta-Analysis of Randomized Controlled Trials. Frontiers in Medicine (Lausanne). 6, 104 (2019).
- Chen, Y. H., et al. Functionally distinct IFN-?+ IL-17A+ Th cells in experimental autoimmune uveitis: T-cell heterogeneity, migration, and steroid response. European Journal of Immunology. 50 (12), 1941-1951 (2020).
- Xu, H., et al. A clinical grading system for retinal inflammation in the chronic model of experimental autoimmune uveoretinitis using digital fundus images. Experimental Eye Research. 87, 319-326 (2008).
- Copland, D. A., et al. The clinical time-course of experimental autoimmune uveoretinitis using topical endoscopic fundal imaging with histologic and cellular infiltrate correlation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49, 5458-5465 (2008).
- Dick, A. D. Doyne lecture 2016: intraocular health and the many faces of inflammation. Eye (Lond). 31, 87-96 (2017).
- Agarwal, R. K., Silver, P. B., Caspi, R. R. Rodent models of experimental autoimmune uveitis. Methods in Molecular Biology. 900, 443-469 (2012).
- Caspi, R. R. A look at autoimmunity and inflammation in the eye. Journal of Clininical Investigation. 120, 3073-3083 (2010).
- Caspi, R. R., et al. Mouse models of experimental autoimmune uveitis. Ophthalmic Research. 40, 169-174 (2008).
- Shao, H., et al. Severe chronic experimental autoimmune uveitis (EAU) of the C57BL/6 mouse induced by adoptive transfer of IRBP1-20-specific T cells. Experimental Eye Research. 82, 323-331 (2006).
- Horai, R., et al. Microbiota-Dependent Activation of an Autoreactive T Cell Receptor Provokes Autoimmunity in an Immunologically Privileged Site. Immunity. 43, 343-353 (2015).
- Chen, J., et al. Comparative analysis of induced vs. spontaneous models of autoimmune uveitis targeting the interphotoreceptor retinoid binding protein. PLoS One. 8, 72161 (2013).
- Chen, J., Qian, H., Horai, R., Chan, C. C., Caspi, R. R. Use of optical coherence tomography and electroretinography to evaluate retinal pathology in a mouse model of autoimmune uveitis. PLoS One. 8, 63904 (2013).
- Harry, R., et al. Suppression of autoimmune retinal disease by lovastatin does not require Th2 cytokine induction. Journal of Immunology. 174, 2327-2335 (2005).
