Summary
I denne rapporten presenterer vi en protokoll som gjør det mulig for etterforskeren å generere en musemodell av intraokulær uveitt. Mer ofte referert til som eksperimentell autoimmun uveitt (EAU), fanger denne etablerte modellen mange aspekter av menneskelig sykdom. Her vil vi beskrive hvordan man induserer og overvåker sykdomsprogresjon ved hjelp av flere avlesninger.
Abstract
Eksperimentell autoimmun uveitt (EAU) drives av immunceller som reagerer på selvantigener. Mange funksjoner i denne ikke-smittsomme, intraokulære inflammatoriske sykdomsmodellen rekapitulerer den kliniske fenotypen av bakre uveitt som påvirker mennesker. EAU har blitt brukt pålitelig for å studere effekten av nye inflammatoriske terapier, deres virkemåte og for å undersøke mekanismene som ligger til grunn for sykdomsprogresjon av intraokulære lidelser. Her gir vi en detaljert protokoll om EAU-induksjon i C57BL/6J-musen - den mest brukte modellorganismen med følsomhet for denne sykdommen. Klinisk vurdering av sykdommens alvorlighetsgrad og progresjon vil bli demonstrert ved hjelp av fundoskopi, histologisk undersøkelse og fluoresceinangiografi. Induksjonsprosedyren innebærer subkutan injeksjon av en emulsjon inneholdende et peptid (IRBP1-20) fra det okulære proteininterfotoreceptor retinoidbindende protein (også kjent som retinolbindende protein 3), Complete Freund's Adjuvant (CFA) og supplert med drept Mycobacterium tuberculosis. Injeksjon av denne viskøse emulsjonen på baksiden av nakken etterfølges av en enkelt intraperitoneal injeksjon av Bordetella kikhostetoksin . Ved symptomdebut (dag 12-14) og under generell anestesi tas fundoskopiske bilder for å vurdere sykdomsprogresjon gjennom klinisk undersøkelse. Disse dataene kan direkte sammenlignes med de på senere tidspunkter og topp sykdom (dag 20-22) med analyserte forskjeller. Samtidig tillater denne protokollen etterforskeren å vurdere potensielle forskjeller i fartøypermeabilitet og skade ved hjelp av fluoresceinangiografi. EAU kan induseres i andre musestammer - både villtype eller genetisk modifisert - og kombineres med nye terapier som gir fleksibilitet for å studere legemiddeleffektivitet og / eller sykdomsmekanismer.
Introduction
Denne protokollen vil demonstrere hvordan man induserer eksperimentell autoimmun uveitt (EAU) i C57BL/6J-musen ved en enkelt subkutan injeksjon av et retinaantigen i et emulgert adjuvans. Metoder for overvåking og vurdering av sykdomsprogresjon vil bli detaljert gjennom fundoskopisk avbildning og histologisk undersøkelse, med måleparametere skissert innenfor. I tillegg vil fluoresceinangiografi, en teknikk for å undersøke retinal blodkarstruktur og permeabilitet bli diskutert.
Denne EAU-modellen rekapitulerer sentrale trekk ved ikke-infeksiøs bakre uveitt hos mennesker med hensyn til kliniskpatologiske egenskaper og de grunnleggende cellulære og molekylære mekanismene som driver sykdom. EAU medieres av Th1- og/eller Th17-undergrupper av selvreaktive CD4+T-lymfocytter, som vist i adoptivoverføringseksperimenter og med IFNγ-utarmede mus1. Mye av vår forståelse av de potensielle rollene for disse cellene i uveitt kommer fra å studere EAU2 hvor både Th1 og Th17 celler oppdages i retinal vev3. Ofte brukes EAU som en preklinisk modell for å vurdere nytten av nye terapier i dempende sykdom. Terapeutiske tilnærminger som har lykkes modulert EAU sykdom har vist noen effekt i klinikken og nådd FDA godkjent status. Eksempler på disse er grupper av immunregulerende legemidler som T-cellemålrettede terapier: ciklosporin, FK-506 og rapamycin 4,5,6. Nylig har intervensjoner rettet mot nye veier også blitt utforsket i denne modellen for å undersøke både mekanisme og effekt på sykdomsutfall. Disse inkluderer målretting av transkripsjonsregulering gjennom kromatinleser Bromodomain Extra-Terminal (BET) proteiner og P-TEFb-hemmere3. Videre har mer konvensjonelle tilnærminger som en VLA-4-hemmer nylig vist undertrykkelse i EAU via modulering av effektor CD4 + T-celler7. I tillegg har målretting av Th17-celler med TMP778, en RORγt invers agonist, også blitt funnet å undertrykke EAU8 betydelig. Videre gir denne modellen en mulighet til å studere kronisk autoimmun betennelse i netthinnen og de medfølgende underliggende mekanismene som lymfocyttpriming.
De primære avlesningene for EAU prekliniske studier er klinisk vurdering ved å utføre retinal fundoskopiavbildning og sjeldnere ved å vurdere retinal integritet ved optisk koherenstomografi (OCT). Retinal histopatologisk utredning og immunfenotyping av retinale celler ved flowcytometri gjøres da ved seponering. Fundoskopi er et brukervennlig live bildebehandlingssystem som muliggjør rask og reproduserbar klinisk vurdering av hele netthinnen. For immunhistokjemiske vurderinger er teknikkene basert på fremstilling av retinale seksjoner som tillater oss å studere vevsarkitektur for graden av betennelse og strukturell skade9. Vurderingskriteriene og konvensjonelle poengsystemer, for alle teknikker som brukes, vil bli skissert i denne protokollen. Skadeomfanget registrert ved hjelp av fundoskopisk avbildning korrelerer ofte nært med histologiske forandringer. Denne doble tilnærmingen til overvåking og vurdering av sykdommens alvorlighetsgrad gir større sensitivitet og mer pålitelige måleresultater.
EAU er en veletablert, ofte brukt modell for preklinisk testing og undersøkelse av immunmediert øyesykdom. Denne modellen er pålitelig og reproduserbar med >95% sykdomsforekomst og genererer omfattende data som kan brukes til å validere eller avvise nye terapier for behandling av intraokulær inflammatorisk sykdom som representerer en viktig årsak til arbeidstidsblindhet over hele verden10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle forsøkene ble utført i samsvar med UK Animals (Scientific Procedures) Act fra 1986, og institusjonelle retningslinjer for dyrevelferd og etisk gjennomgang (AWERB).
1. Bolig C57BL/6J mus
- Husmus i et spesifikt patogenfritt miljø, på en 12 timers lys-mørk syklus og mat og vann tilgjengelig ad libitum.
- Utfør alle eksperimenter på voksne kvinner C57BL/6J (kvinner velges fortrinnsvis da det er en forekomst av kvinner til menn 1,4 til 1 hos uveittpasienter). Randomiser kvinnelige C57BL/6J mus mellom 6-8 uker gamle etter vekt og alder. Huser musene i individuelt ventilerte bur (IVC) i grupper på 5-6 mus per merd.
2. Immunisering av C57BL/6 mus
- IRBP1-20 - CFA-emulsjonsforberedelse
MERK: Emulsjonspreparat er avgjørende for reproduserbarhet og forekomst av sykdom; Som sådan må alle anstrengelser gjøres for å opprettholde konsistens gjennom hele forberedelsesprosessen og på tvers av eksperimenter. Ved fremstilling av emulsjonen bør tap regnskapsføres i beregningene av alle reagenser på forhånd. Dette tapet kan være omtrent 1,5 x (eller 50% ekstra av det tilberedte volumet), basert på antall mus planlagt for immunisering. Se følgende eksempel nedenfor. For å immunisere 10 mus, klargjør 15 mus og bruk 400 μg (peptid per 20 g mus) x 15 mus = 6 mg. Hver mus skal få 200 μL for immunisering (3 ml totalt). Det endelige volumet består av et 1:1-forhold mellom peptidløsning og CFA, derav 1,5 ml peptidløsning og 1,5 ml CFA.- Klargjør alle sterile oppløsninger i et laminært strømningskabinett ved hjelp av aseptiske teknikker.
- Vei ut ønsket mengde (400 μg per 20 g mus) av humant IRBP1-20 (LAQGAYRTAVDLESLASQLT) lyofilisert peptid. Oppløs peptid i 100% DMSO. Oppbevar lager i lyofilisert form ved -20 ° C.
MERK: For å sikre at pulveret er fullstendig oppløst, må hvert flak først komme i kontakt med DMSO og ikke vise tegn til gjenværende fast stoff. Tilsett PBS i små porsjoner for å nå det endelige volumet. Ikke bland med en virvel, bruk i stedet forsiktig omrøring med en pipette. Den endelige konsentrasjonen av DMSO bør ikke overstige 1% av det totale peptidprepareringsvolumet. Forberedelse av emulsjonen i et 20 ml plastrør med konisk bunn bør tillate bedre tilgjengelighet av DMSO til det frysetørkede pulveret. - Tilsett DMSO-PBS peptidløsning ved 1:1 v/v til CFA som allerede er supplert med 1,5 mg/ml drept Mycobacterium tuberculosis , for å gi en endelig konsentrasjon på 2,5 mg/ml. Tilsett dråpevis, pipetter forsiktig og ofte for å danne en tyktflytende og jevnt fordelt emulsjon.
- Luft peptidløsningen og CFA ved hjelp av en 1000 μL pipette (satt til 700 μL for å forhindre ytterligere tap) og pipette for å generere en kremaktig tykk konsistens. Denne teknikken innebærer å bruke pipetten til å aspirere gjentatte ganger opp og ned til den når ønsket tykkelse. For optimale resultater, sørg for at antigenoppløsningen og adjuvansen blandes grundig før injisering.
- Intraperitoneal injeksjon av kikhostetoksin
- Suspender 1,5 μg Bordetella kikhostetoksin i 100 μL RPMI 1640-medier supplert med 1 % museserum11.
- Injiser i.p. injeksjonen med en steril sprøyte og 23G kanyle.
MERK: For å unngå forstyrrelser på injeksjonsstedet, må kikhostetoksinet administreres før antigenet injiseres. - Overfør midlertidig hver mus til et separat bur for å motta en enkelt 100 μL i.p. injeksjon av Bordetella kikhostetoksin .
- Subkutan injeksjon av IRBP-emulsjon
- Deretter injiserer IRBP-emulsjonen subkutant. Denne prosessen krever to dyrehåndterere som er riktig antrukket med beskyttelse i henhold til helse- og sikkerhetsforskrifter.
- La en trent person lett holde musen på toppen av buret i en scruff-lignende stilling, med magen vendt nedover mens den andre trente personen klemmer huden for å danne en teltlignende struktur på baksiden av nakken der nålen kan settes inn for å spore mellom fingeren og tommelen.
FORSIKTIG: Det er fare for nålestikkskade. - Når nålen er plassert, injiser 200 mikrol av IRBP-emulsjonen. Når kanylen fjernes, roteres kanylehodet for å lukke huden før du trekker den ut, og trykk deretter på injeksjonsstedet for å forhindre tilbakeløp av emulsjonen.
FORSIKTIG: Emulsjonen må ikke komme i kontakt med musens hud eller pels, da dette kan forårsake irritasjon og i mer alvorlige tilfeller utvikle en lesjon. Hvis dette skjer, må området tørkes umiddelbart og grundig med 70% etanol og deretter tørkes.
MERK: Hvis drenerende lymfeknuter er nødvendig for undersøkelse ved slutten av studien, vil injeksjonsstedet være annerledes. I dette tilfellet injiseres 100 μL subkutant på begge sider av flanken. Dette vil generere en sterkere respons ved drenering av inguinal lymfeknuter, som kan bli skåret ut ved høsting. Hvis det tiltenkte resultatet utelukkende er å utvikle EAU, er imidlertid en enkelt injeksjon på 200 μl bak i nakken å foretrekke for å unngå ubehag fra flere injeksjonssteder.
3. Klinisk evaluering - mus fundus undersøkelse
MERK: Klinisk sykdom skal skåres ved hjelp av fundusundersøkelse, via bright-field live imaging ved hjelp av et fundoskop og Discover-programvare som brukes til visualisering.
- Ved sykdomsdebut (dag 12-14) sedat mus i narkose ved bruk av en kombinasjon av både ketamin (50 mg/ml) og domitor (metomidin; 1 mg/ml). Fortynn 1-del Domitor; 1,5 deler Ketamin og 2,5 deler sterilt injiserbart vann, injiser deretter 100 μL per 30 g intraperitonealt. Bruk 1 ml sterile sprøyter og 23G kanyler for ovennevnte kombinasjon av anestesi.
- Etter dette, overvåk musen for å sikre at alle reflekser går tapt og at den ikke reagerer på stimuli.
- Umiddelbart etter å ha mottatt i.p. injeksjon og mens musen fortsatt holdes i en skrue, påfør 1% tropikamid og 2,5% fenylefrin lokalt til hvert øye for pupillutvidelse. Målet er å dekke hornhinnen helt med begge dilaterende løsninger. Det kan ta noen minutter før pupillen er fullt utvidet.
- Etterpå, bruk sjenerøst på øyet viscotears salve og opprettholde gjennom hele bildeprosessen for å holde øyet fullt smurt og hydrert.
- I mellomtiden åpner du programvaren (f.eks. Discover), og setter fundoskopet (f.eks. Micron) til å ta bilder under brightfield. Tildel hver enkelt mus en mappe og merk bilder med R eller L i henhold til hvert øye fotografert.
- Monter musen på en spesialbygd scene for live visualisering og plasser mikroskopet for full tilgang til netthinnen.
- For å få en nøyaktig representasjon av sykdommen, ta bilder av hele retinalområdet, som dekker alle hjørner av periferien i tillegg til optisk plate. For å oppnå dette, juster okularet hele veien. Det er avgjørende for øyet å forbli fullt smurt til enhver tid gjennom hele bildeprosessen; Sørg for dette ved å fylle opp øyesalven med konstant hastighet.
- Se avsnitt 4 (nedenfor) på dette stadiet for å utføre fluoresceinangiografi.
- Når all avbildning er fullført, fortynn bedøvelse reversering anti-sedasjon (5 mg / ml Antisedan) i injiserbart vann og administrer ved 0,1 mg / kg i.p. Sett musen tilbake i et bur og legg på en forvarmet matte med tilgang til et vått gjennomvåt kosthold til utvinning. Fullstendig restitusjon er preget av bevegelse av hele kroppen og å gå rundt buret med jevn gange, vanligvis tar noen timer.
- Ved det angitte eksperimentelle endepunktet (f.eks. dag 21-23), gjenta trinn 4.1-4.5 og ta bilder av hele retinalområdet igjen, som dekker optisk plate og alle hjørner av periferien for å fange en nøyaktig representasjon av sykdom.
4. Fluorescein angiografi
- For å måle fartøylekkasje hos disse dyrene, mens de er under anestesi, gi hver mus en injeksjon med 2% fluorescein subkutant på baksiden av nakken og plasser slik at netthinnen er sentralisert midt i det levende bildet.
- Sett fundoskopet til et eksitasjonsfilter for blått lys ved 465-490 nm. Lyset fanget fra eksitert fluorescein er mellom 520-530 nm.
- Etter 1,5 min etter fluoresceininjeksjon, ta et bilde av hver netthinne og gjenta igjen etter 7 minutter.
MERK: Timing er kritisk for disse hendelsene, hvis ikke klarer å fange begge, så bare bilde ett øye.
5. Skåring av klinisk sykdom
- Baser den kliniske vurderingen på alvorlighetsgraden av følgende kriterier: optisk skivebetennelse, retinal kar cuffing, retinal vevsinfiltrat og strukturell skade.
- Gi hver av disse parameterne en score på en skala fra 0 til 5, og den kollektive summen er representativ for klinisk sykdom for hele øyet, med en maksimal score på 20 oppnåelig per øye. Tabell 1 kan brukes som veiledning for skåringskriterier.
6. Histologi og histologisk scoring
- Etter euthanizing musene ved cervical dislokasjon, enucleate øynene ved prizing øyelokkene fra hverandre for enkel tilgang til hele øyet.
- Deretter plasserer du buede tang bak kloden med den hensikt å gripe det orbitale bindevevet og optisk nerve. Pass på å unngå å klemme kloden.
- For fiksering, legg øyet i 4% glutaraldehyd i minst 15 minutter for å minimere retinal detachment, og overfør deretter til 10% formaldehyd i minst 24 timer. 1-2 ml fikseringsmiddel vil gi nok volum til å dekke to øyne.
- Utfør innebygging i parafin, seksjonering på en mikrotome og farging i henhold til standardprotokoller. 3-4 μm seksjonstykkelse anbefales for alle typer farging.
- Utfør histologisk undersøkelse av øynene ved hjelp av standardprotokoller for hematoksylin og Eosin (H &E) farging.
- Tilordne score på en skala fra 0-4, i henhold til kriteriene for EAU-skåring, basert på omfanget av immuncelleinfiltrasjonen i retina og choroid, forstyrrelsen av retinallagene, graden av granulomdannelse og omfanget av retinal detachment, som indikerer retinal skade, som tidligere beskrevet (Agarwal 2013) og oppsummert i tabell 211.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denne protokollen beskriver vi en trinnvis metode for å indusere en modell av eksperimentell autoimmun uveitt (EAU) ved immunisering av mus med et uveitogent retinalt peptid avledet fra IRBP. Vurdering av sykdom ved bruk av mye brukte og lett tilgjengelige tilnærminger dekkes, selv om disse ikke er eksklusive og kan legges til eller delvis erstattes av andre bildebehandlingsteknikker. De første tegnene på EAU hos C57BL/6J-mus kan påvises to uker etter immunisering og maksimal sykdom nådd innen tre uker som illustrert i figur 1. Fundoskopiske forandringer klassifiseres under sykdomsprogresjon som inflammatoriske forandringer, som inkluderer retinalt vev, kar- og skiveinflammasjon og strukturell retinal skade (figur 2) i tillegg til histologiske forandringer basert på infiltrerende immunceller og strukturell skade. Disse kliniske og histopatologiske endringene kan påvises i opptil 85 dager etter immunisering, og gradert og skåret for evaluering foreslår å studere sykdomsprogresjon. For å unngå utilsiktet skjevhet i den kvalitative visuelle skåringen, bør bildene evalueres av mer enn én ekspert og skårere må være blindet for behandlingsgruppene.
Vi viser her hvordan de kliniske og histologiske scoringssystemene (tabell 1 og tabell 2) veileder forskere for å kvantifisere EAU-alvorlighetsgraden, for å validere effekten av behandlinger og å utforske mekanismen for narkotikavirkning. Vaskulær lekkasje er også et patologisk trekk ved modellen og i menneskelig uveitt. Vi viser eksempler på vaskulær lekkasje av fluorescein (figur 3) som en annen metode for å vurdere sykdom i denne modellen.
Figur 1. Skjematisk tidslinje for klinisk og histologisk sykdomsprogresjon i IRBP1-20 indusert EAU. En tidslinje som markerte starten på infiltrasjon og progresjon av IRBP1-20 induserte EAU mot maksimal sykdom. Fra immunisering faller de første tegnene på klinisk sykdom, som oppdaget ved fundoskopisk avbildning og histopatologisk analyse, mellom dag 12-14. Sykdommen vil deretter fortsette å utvikle seg, i henhold til disse parametrene, til en topp er nådd rundt dag 21-23. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2. Representative fundoskopiske bilder korrelert med histologiske snitt i forskjellige stadier av IRBP1-20 indusert EAU-sykdom i C57BL/6J-mus. Kliniske fundoskopiske og korresponderende vevsbilder av C57BL/6J fra samme dyr immunisert med IRBP 1-20 peptid. (A og B) fundoskopiske bilder og histologiske deler av øyet oppnådd fra friske og CFA-injiserte mus. Netthinnen har ingen tegn til inflammasjon og tilsvarende histologisnitt viser bevarte netthinnelag. (C) Fundoskopisk bilde av øyet oppnådd fra C57BL/6J mus 14 dager etter immunisering viser klassiske tegn på EAU, og presenterer med alvorlig optisk skivehevelse i tidlig stadium av sykdommen, tilsvarende histologi viser infiltrerende immunceller i glasslegemet. (D) Fundoskopiske bilder av øyet tatt fra C57BL/6J-mus 21 dager etter immunisering viser tegn på at fartøyet har satt håndjern og infiltrert immunpopulasjoner. Histologidata viser alvorlige strukturelle endringer ved netthinnefolding (gule piler). V= kar, O= optisk disk, R=retina, L=linse, Vit=glasslegeme,iO= betent optisk disk, iV= betent kar, iR= betent netthinne, i= infiltrerende celler i glasslegemet, RFs=retinale folder. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3. Representative bilder av fluorescerende angiografi tatt med Micron III bildebehandlingssystem ved topp sykdom. C57BL/6J-mus ble injisert subkutant med 2% fluorescein og bilder tatt på forskjellige tidspunkter etter sirkulasjon av sporstoffet. (A) CFA kontrollerer bare mus tatt 1,5 og 7 minutter etter fluoresceinadministrasjon. (B) Representative bilder av IRBP1-20 immuniserte mus tatt henholdsvis 1,5 og 7 minutter etter å ha mottatt fluorescein. Hvit pil indikerer fartøylekkasje. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Score | Optisk plate | Retinal fartøy | Retinal vevsinfiltrat | Strukturelle skader | ||||
| 1 | Minimal betennelse | 1-4 milde mansjetter | 1-4 små lesjoner eller 1 lineær lesjon | Retinal lesjoner eller retinal atrofi som involverer 1/4 til 3/4 retina området | ||||
| 2 | Mild betennelse | >4 milde mansjetter eller 1-3 moderate mansjetter | 5-10 små lesjoner eller 2-3 lineære lesjoner | Pan retinal atrofi med flere små lesjoner (arr) eller <3 lineære lesjoner (arr) | ||||
| 3 | Moderat betennelse | >3 Moderate mansjetter | >10 små lesjoner eller >3 lineære lesjoner | Pan retinal atrofi med >3 lineære lesjoner eller konfluerende lesjoner (arr) | ||||
| 4 | Alvorlig betennelse | >1 Alvorlig mansjett | Lineær lesjon konfluent | Retinal detachment med folding | ||||
| 5 | * Ikke synlig (hvit ut eller ekstrem løsrivelse) | * Ikke synlig (hvit ut eller ekstrem løsrivelse) | * Ikke synlig (hvit ut eller ekstrem løsrivelse) | * Ikke synlig (hvit ut eller ekstrem løsrivelse) | ||||
Tabell 1. Konvensjonell klinisk skåringsskala for evaluering av alvorlighetsgrad av klinisk sykdom i EAU. Tabell som viser kriterier brukt for å evaluere graden av sykdomsalvorlighetsgrad hos mus immunisert med IRBP1-20. Poengene ble fordelt i henhold til kjennetegnene som er skissert ovenfor var synlige på fundusbildene, hvert øye ble gitt en total poengsum ut av tjue. * På grunn av tilsløring av infiltrat og netthinneløsning inne i bakre kammer kan ikke vurderes. Tabell tilpasset med tillatelse fra Xu H., et al., 20088.
| Trinn | Kriterier |
| 0 | Ingen endring |
| 0,5 (spor) | Mild inflammatorisk celleinfiltrasjon. Ingen vevskader |
| 1 | Infiltrasjon; retinal folder og fokale retinal detachments; få små granulomer i choroid og retina, perivaskulitt |
| 2 | Moderat infiltrasjon; retinal folder, løsrivelser og fokal fotoreceptor celleskade; små til mellomstore granulomer, perivaskulitt og vaskulitt |
| 3 | Middels til tung infiltrasjon; omfattende retinal folding med løsrivelser, moderat fotoreceptorcelleskade; mellomstore granulomatøse lesjoner; subretinal neovaskularisering |
Tabell 2. Histologisk scoring EAU
Tabell som viser kriterier brukt for å evaluere alvorlighetsgraden av EAU basert på histopatologiske trekk ved sykdom. Poengene ble fordelt i henhold til kjennetegnene som er skissert ovenfor på H&E-farging, hvert øye ble gitt en totalscore av fire. Tabell tilpasset med tillatelse fra Agarwal et al. 201311.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Eksperimentelle dyremodeller er nødvendige verktøy for å studere sykdomspatogenese og preklinisk testing av nye terapeutiske paradigmer. I den nåværende protokollen har vi diskutert en metodikk for å indusere, overvåke og score EAU, en eksperimentell modell for intraokulær inflammatorisk uveitt. Denne EAU-modellen har mer enn 95% sykdomsforekomst når alle prosedyrer utføres i henhold til protokollen som er skissert her, og resulterer i utvikling av kronisk, monofasisk EAU. For å oppnå dette insidensnivået understreker vi viktigheten av antigenpreparering og injeksjon av emulsjonen, som begge er beskrevet ovenfor. Hovedtrekkene til EAU hos dyr er retinal og/eller koroidal inflammasjon, retinal vaskulitt, fotoreseptorødeleggelse og synstap, som alle representerer mange viktige kliniskpatologiske trekk ved humant bakre uveitt12. Mye av forståelsen av de grunnleggende cellulære og molekylære mekanismene involvert i uveitt stammer fra den induserte EAU-modellen som beskrevet her. EAU kan induseres hos mus13 og rotter11 ved aktiv immunisering med retinale antigener som gjenkjennes av lymfocytter. Disse retinale antigenene tar mange former; IRBP (for mus) eller retinalt løselig antigen (S-Ag) for rotter. Inducing EAU på en C57BL/6J bakgrunn genererer en mer kronisk form av sykdommen, med topp patologi observert tre uker etter immunisering. Til sammenligning induserer bruk av retinaantigen til en B10RIII-bakgrunn14 en akutt-monofasisk og klinisk alvorlig form for EAU hvor maksimal patologi vanligvis presenterer innen to uker etter induksjon, og sykdommen avtar innen uke 3.
Ulike IRBP-epitoper har blitt testet i C57BL/6J-mus, og IRBP1-20 peptid har vist seg å være en reproduserbar modell med høy forekomst og alvorlighetsgrad. Nylig har en ny uveitogen epitop av IRBP, aminosyrerester 651 til 670 av human IRBP blitt rapportert å indusere EAU med høyere klinisk forekomst og alvorlig sykdomsmanifestasjon11 og kan brukes fremfor dette dersom dette oppfyller de vitenskapelige målene. Siden virkningen av tarmkommensalmikrobiota og aktiveringen av autoreaktive T-cellereseptorer (TCR) er kjent for å forstyrre sykdomsutbruddet ved bruk av forskjellige antigener15, anbefaler vi for nybegynnere på dette feltet å bruke enten hIRBP1-20 eller hIRBP651-670 peptider i en dose titrert mellom 300-500 μg for å oppnå en pålitelig modell. Faktisk har variabilitet i denne modellen blitt dokumentert andre steder med rapporter som fremhever viktigheten av forskjeller mellom boligsystemer og mikrobiomet som kan påvirke sykdommens alvorlighetsgrad og forekomst15. Dermed kan det være nødvendig med mer eller mindre peptidantigen og kikhostetoksin.
Det finnes en rekke andre modeller som vår beskrevne analyse kan utføres på. Disse inkluderer spontan uveitt som utvikler seg i IRBP T-cellereseptor (TCR) transgene (R161H) mus hvor okulær betennelse utvikler seg ved 5-6 ukers alder16. EAU kan også induseres adoptivt ved å overføre CD4+T-celler med uveitogen effektor. Aktiverte, IRBP-spesifikke CD4 + T-celler avledet fra primede mus kan brukes som kilde til effektorceller 3,11. Denne modellen representerer effektorfasen av sykdommen, samtidig som man unngår kompleksiteten ved å bruke CFA i den induserbare modellen.
Videre til dette er det mange fordeler med å bruke okulære inflammatoriske modeller som passende verktøy for å undersøke andre inflammatoriske sykdommer, spesielt de med effektor Th1 og Th17 undergruppe patologi. De viktigste fordelene ved å bruke denne modellen er de ikke-invasive og kvantifiserbare metodene for å overvåke sykdomsutvikling og progresjon, som er fundoskopi og angiografi. Disse ikke-invasive bildebehandlingssystemene gir enkel tilgang til nevronvev, som ellers ville være skjult bak beskyttende anatomiske barrierer. Ytterligere metoder for overvåking av sykdomsprogresjon inkluderer anvendelse av OCT-avbildning, som er mer følsom enn fundoskopisk avbildning ved påvisning av cellulære infiltrater, spesielt i tidlig stadium av EAU-utbruddet. Teknikken tillater flerlags tverr- og horisontalsnittsvisualiseringer av netthinnen i lengderetningen og på en ikke-invasiv måte. In vivo OCT-avbildning legger til informasjon om netthinnetykkelse som ikke kunne oppnås ved fundoskopiske og histologiske undersøkelser17. I økende grad vil tilgjengeligheten av enda mer sofistikerte ikke-invasive bildebehandlingsteknikker, som adaptiv optikk, skanning, laser, oftalmoskopi og multimodale bildebehandlingsverktøy, ytterligere fremme vår evne til å undersøke denne sykdommen hos små gnagere. Videre gir evnen til å dissekere og isolere beboere og infiltrerende cellepopulasjoner for dypere analyse av immunfenotyper, ved hjelp av teknikker som flowcytomety, store muligheter til å levere innsiktsfull informasjon.
Det er noen få etablerte skåringssystemer basert på kliniske kriterier hentet fra fundoskopi 8,9,18. Selv om disse varierer noe mellom oftalmologiforskningssentre, er alle pålitelige, korrelerer med histopatologiske trekk og er i stand til nøyaktig å reflektere alvorlighetsgraden av sykdommen. I denne studien viser vi til skåringssystemet utviklet av Xu et al.8. Dette systemet tilbyr en mer detaljert vurderingsmetode med større antall kliniske måleparametere. Den består av en maksimal poengsum på 20 som introduserer et bredere vindu for scoring enn alternative systemer begrenset til maksimalt 5. Dette er viktigere for videre utforskning innen terapeutiske tilnærminger. Minimering av operatørfeil er imidlertid avgjørende ved bruk av et slikt raffinert og detaljert sett med parametere, og kan kreve nøye opplæring av operatøren og uavhengig validering av tolkningen.
Her presenterer vi en protokoll for å indusere EAU hos kvinnelige C57BL/6-mus, da det er økt forekomst av kvinner: menn 1.4: 1 som presenterer uveitt i klinisk setting. Likevel bør kjønnene til musene som brukes til å indusere autoimmun sykdom vurderes, da dette kan påvirke cytokinmiljøet11, og også avsløre viktige forskjeller i måten de reagerer på terapeutisk inngrep. En annen vurdering er musenes alder ved sykdomsinduksjon. For eksempel har vi studert aldersavhengighet av følsomhet hos B10RIII-mus og konkludert med at mus over 8 ukers levetid har lavere forekomst av EAU (upublisert studie fra vår gruppe).
Avslutningsvis har dyremodeller av intraokulær sykdom gitt et uvurderlig verktøy for å studere menneskelig bakre uveitt og har lagt til rette for utvikling av nye terapier som CsA. Imidlertid reproduserer ingen dyremodell i seg selv hele spekteret av menneskelig uveitt, da hver har unike egenskaper som gjør den egnet til å studere spesielle aspekter av sykdommen. Denne EAU-modellen induseres av autoimmunitet ved bruk av IRBP-peptid supplert med adjuvanser som utløser medfødte immunresponser. Det er imidlertid ikke kjent om alle former for bakre uveitt hos mennesker er autoimmune og om antigen etterligning er en utløsende faktor. I tillegg er det ikke klart om det er en sammenheng med infeksjon ved å utløse human uveitt. Ikke desto mindre er modellen beskrevet her en nyttig og reproduserbar generisk modell som kan brukes til å samle nyttig informasjon om etiologi, patogenese og terapi av denne synstruende sykdommen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å oppgi med dette verket.
Acknowledgments
JG ble tildelt en UCL Impact Studentship og Rosetrees Trust finansiering for å støtte CB. VC mottok et forskningssamarbeidsstipend fra Akari Therapeutics Inc. Vi vil gjerne takke UCL Institute of Ophthalmology, Biological Service Unit spesielt Ms Alison O'Hara og hennes team for deres tekniske støtte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| antisedan | ZOETIS, USA | for waking up | |
| Complete Freund’s Adjuvant; CFA | Sigma, UK | F5881 | for immunisation |
| Domitor | Orion Pharma, Finland | for anesthesia | |
| Flourescein | Sigma, UK | F2456 | for Angiography |
| IRBP1-20 | Chamberidge peptide, UK | peptide;antigen | |
| Ketamine | Orion Pharma, Finland | for anesthesia | |
| Micron III | Phoenix Research, USA | for fundoscopy | |
| Mouse Serum | Sigma, UK | M5905 | for immunisation |
| Mycobacterium terberculosis | Sigma, UK | 344289 | for immunisation |
| Pertussis Toxin | Sigma, UK | P2980 | for immunisation |
| phenylephrine hydrochloride 2.5% | Bausch & Lomb UK | PHEN25 | for dilation |
| Tropicamide 1% | SANDOZ | for dilation | |
| Viscotears | WELDRICKS Pharmacy, UK | 2082642 | for eye lubrication |
References
- Lyu, C., et al. TMP778, a selective inhibitor of RORgammat, suppresses experimental autoimmune uveitis development, but affects both Th17 and Th1 cell populations. The European Journal of Immunology. 48, 1810-1816 (2018).
- Klaska, I. P., Forrester, J. V.
- Eskandarpour, M., Alexander, R., Adamson, P., Calder, V. L. Pharmacological Inhibition of Bromodomain Proteins Suppresses Retinal Inflammatory Disease and Downregulates Retinal Th17 Cells. The Journal of Immunology. 198, 1093-1103 (2017).
- Mochizuki, M., et al. Preclinical and clinical study of FK506 in uveitis. Current Eye Research. 11, Suppl 87-95 (1992).
- Nguyen, Q. D., et al. Intravitreal Sirolimus for the Treatment of Noninfectious Uveitis: Evolution through Preclinical and Clinical Studies. Ophthalmology. 125, 1984-1993 (2018).
- Leal, I., et al. Anti-TNF Drugs for Chronic Uveitis in Adults-A Systematic Review and Meta-Analysis of Randomized Controlled Trials. Frontiers in Medicine (Lausanne). 6, 104 (2019).
- Chen, Y. H., et al. Functionally distinct IFN-?+ IL-17A+ Th cells in experimental autoimmune uveitis: T-cell heterogeneity, migration, and steroid response. European Journal of Immunology. 50 (12), 1941-1951 (2020).
- Xu, H., et al. A clinical grading system for retinal inflammation in the chronic model of experimental autoimmune uveoretinitis using digital fundus images. Experimental Eye Research. 87, 319-326 (2008).
- Copland, D. A., et al. The clinical time-course of experimental autoimmune uveoretinitis using topical endoscopic fundal imaging with histologic and cellular infiltrate correlation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49, 5458-5465 (2008).
- Dick, A. D. Doyne lecture 2016: intraocular health and the many faces of inflammation. Eye (Lond). 31, 87-96 (2017).
- Agarwal, R. K., Silver, P. B., Caspi, R. R. Rodent models of experimental autoimmune uveitis. Methods in Molecular Biology. 900, 443-469 (2012).
- Caspi, R. R. A look at autoimmunity and inflammation in the eye. Journal of Clininical Investigation. 120, 3073-3083 (2010).
- Caspi, R. R., et al. Mouse models of experimental autoimmune uveitis. Ophthalmic Research. 40, 169-174 (2008).
- Shao, H., et al. Severe chronic experimental autoimmune uveitis (EAU) of the C57BL/6 mouse induced by adoptive transfer of IRBP1-20-specific T cells. Experimental Eye Research. 82, 323-331 (2006).
- Horai, R., et al. Microbiota-Dependent Activation of an Autoreactive T Cell Receptor Provokes Autoimmunity in an Immunologically Privileged Site. Immunity. 43, 343-353 (2015).
- Chen, J., et al. Comparative analysis of induced vs. spontaneous models of autoimmune uveitis targeting the interphotoreceptor retinoid binding protein. PLoS One. 8, 72161 (2013).
- Chen, J., Qian, H., Horai, R., Chan, C. C., Caspi, R. R. Use of optical coherence tomography and electroretinography to evaluate retinal pathology in a mouse model of autoimmune uveitis. PLoS One. 8, 63904 (2013).
- Harry, R., et al. Suppression of autoimmune retinal disease by lovastatin does not require Th2 cytokine induction. Journal of Immunology. 174, 2327-2335 (2005).
