Summary
I denna rapport presenterar vi ett protokoll som gör det möjligt för utredaren att generera en musmodell av intraokulär uveit. Mer allmänt kallad experimentell autoimmun uveit (EAU), fångar denna etablerade modell många aspekter av mänsklig sjukdom. Här kommer vi att beskriva hur man inducerar och övervakar sjukdomsprogression med hjälp av flera avläsningar.
Abstract
Experimentell autoimmun uveit (EAU) drivs av immunceller som svarar på självantigener. Många funktioner i denna icke-infektiösa, intraokulära inflammatoriska sjukdomsmodell rekapitulerar den kliniska fenotypen av bakre uveit som påverkar människor. EAU har använts på ett tillförlitligt sätt för att studera effekten av nya inflammatoriska läkemedel, deras verkningsmekanism och för att ytterligare undersöka de mekanismer som ligger till grund för sjukdomsprogression av intraokulära störningar. Här tillhandahåller vi ett detaljerat protokoll om EAU-induktion i C57BL / 6J-musen - den mest använda modellorganismen med mottaglighet för denna sjukdom. Klinisk bedömning av sjukdomens svårighetsgrad och progression kommer att demonstreras med hjälp av fundoskopi, histologisk undersökning och fluoresceinangiografi. Induktionsproceduren innefattar subkutan injektion av en emulsion innehållande en peptid (IRBP1-20) från det okulära proteinet interfotoreceptor retinoidbindande protein (även känt som retinolbindande protein 3), Complete Freund's Adjuvant (CFA) och kompletterat med dödad Mycobacterium tuberculosis. Injektion av denna viskösa emulsion på baksidan av nacken följs av en enda intraperitoneal injektion av Bordetella pertussistoxin . Vid symtomdebut (dag 12-14) och under generell anestesi tas fundoskopiska bilder för att bedöma sjukdomsprogression genom klinisk undersökning. Dessa data kan direkt jämföras med dem vid senare tidpunkter och toppsjukdom (dag 20-22) med skillnader analyserade. Samtidigt tillåter detta protokoll utredaren att bedöma potentiella skillnader i kärlpermeabilitet och skada med hjälp av fluoresceinangiografi. EAU kan induceras i andra musstammar - både vildtyp eller genetiskt modifierad - och kombineras med nya terapier som erbjuder flexibilitet för att studera läkemedelseffektivitet och / eller sjukdomsmekanismer.
Introduction
Detta protokoll kommer att demonstrera hur man inducerar experimentell autoimmun uveit (EAU) i C57BL / 6J-musen genom en enda subkutan injektion av ett retinalt antigen i ett emulgerat adjuvans. Metoder för övervakning och bedömning av sjukdomsprogression kommer att beskrivas genom fundoskopisk avbildning och histologisk undersökning, med mätparametrar som beskrivs inom. Dessutom kommer fluoresceinangiografi, en teknik för att undersöka retinal blodkärlsstruktur och permeabilitet att diskuteras.
Denna EAU-modell rekapitulerar centrala egenskaper hos icke-infektiös bakre uveit hos människor med avseende på klinnopatologiska egenskaper och de grundläggande cellulära och molekylära mekanismerna som driver sjukdom. EAU medieras av Th1- och / eller Th17-undergrupper av självreaktiva CD4 + T-lymfocyter, vilket visas i adoptiva överföringsexperiment och med IFNγ-utarmade möss1. Mycket av vår förståelse av de potentiella rollerna för dessa celler i uveit kommer från att studera EAU2 där både Th1- och Th17-celler detekteras i näthinnans vävnader3. Ofta används EAU som en preklinisk modell för att bedöma nyttan av nya terapier för att dämpa sjukdom. Terapeutiska tillvägagångssätt som framgångsrikt har modulerat EAU-sjukdomen har visat viss effekt i kliniken och nått FDA-godkänd status. Exempel på dessa är grupper av immunreglerande läkemedel såsom T-cellriktade terapier: cyklosporin, FK-506 och rapamycin 4,5,6. Nyligen har interventioner riktade mot nya vägar också undersökts i denna modell för att undersöka både mekanism och effekt på sjukdomsutfall. Dessa inkluderar riktad transkriptionsreglering genom kromatinläsare, Bromodomain Extra-Terminal (BET) -proteiner och P-TEFb-hämmare3. Dessutom har mer konventionella tillvägagångssätt som en VLA-4-hämmare nyligen visat undertryckande i EAU via modulering av effektor CD4 + T-celler7. Dessutom har inriktning på Th17-celler med TMP778, en RORγt-invers agonist, också visat sig signifikant undertrycka EAU8. Dessutom erbjuder denna modell en möjlighet att studera kronisk autoimmun inflammation i näthinnan och de medföljande underliggande mekanismerna såsom lymfocytpriming.
De primära avläsningarna för EAU: s prekliniska studier är klinisk bedömning genom att utföra retinal fundoskopiavbildning och mindre ofta genom att bedöma retinal integritet med optisk koherenstomografi (OCT). Retinal histopatologisk utvärdering och immunofenotypning av retinala celler genom flödescytometri utförs sedan vid avslutning. Fundoskopi är ett lättanvänt live aging-system som möjliggör snabb och reproducerbar klinisk bedömning av hela näthinnan. För immunhistokemiska bedömningar är teknikerna baserade på beredning av retinala sektioner som gör att vi kan studera vävnadsarkitektur för graden av inflammation och strukturell skada9. Bedömningskriterierna och konventionella poängsystem, för alla tekniker som används, kommer att beskrivas i detta protokoll. Omfattningen av skador som registreras med hjälp av fundoskopisk avbildning korrelerar ofta nära med histologiska förändringar. Denna dubbla metod för övervakning och bedömning av sjukdomens svårighetsgrad ger större känslighet och mer tillförlitliga mätresultat.
EAU är en väletablerad, allmänt använd modell för preklinisk testning och utredning av immunmedierad ögonsjukdom. Denna modell är tillförlitlig och reproducerbar med >95% sjukdomsincidens och genererar omfattande data som kan användas för att validera eller förkasta nya terapier för behandling av intraokulär inflammatorisk sjukdom som utgör en viktig orsak till blindhet i arbetsför ålder över hela världen10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla experiment utfördes i enlighet med UK Animals (Scientific Procedures) Act från 1986 och institutionella riktlinjer för djurskydd och etisk granskning (AWERB).
1. Hölje C57BL / 6J möss
- Husmöss i en specifik patogenfri miljö, på en 12 timmars ljus-mörk cykel och mat och vatten tillgängligt ad libitum.
- Utför alla experiment på vuxen kvinnlig C57BL / 6J (kvinnor väljs företrädesvis eftersom det finns en incidens av kvinnor till män 1,4 till 1 hos uveitpatienter). Randomisera kvinnliga C57BL / 6J-möss mellan 6-8 veckor gamla efter vikt och ålder. Placera mössen i individuellt ventilerade burar (IVC) i grupper om 5-6 möss per bur.
2. Immunisering av C57BL / 6-möss
- IRBP1-20 - CFA-emulsionsberedning
OBS: Emulsionsberedning är väsentlig för reproducerbarhet och förekomst av sjukdom; Som sådan måste alla ansträngningar göras för att upprätthålla konsekvens under hela förberedelseprocessen och mellan experiment. Vid framställning av emulsionen bör förlust redovisas i beräkningarna av alla reagens i förväg. Denna förlust kan vara ungefär 1,5x (eller 50% extra av den beredda volymen), baserat på antalet möss som planeras för immunisering. Se följande exempel nedan. För att immunisera 10 möss, förbered 15 möss och använd 400 μg (peptid per 20 g mus) x 15 möss = 6 mg. Varje mus ska få 200 μl för immunisering (totalt 3 ml). Den slutliga volymen består av ett 1: 1-förhållande av peptidlösning och CFA, därav 1,5 ml peptidlösning och 1,5 ml CFA.- Bered alla sterila lösningar i ett laminärt flödesskåp med aseptisk teknik.
- Väg upp önskad mängd (400 μg per 20 g mus) frystorkad peptid av humant IRBP1-20 (LAQGAYRTAVDLESLASQLT). Lös upp peptid i 100% DMSO. Förvara lagret i frystorkad form vid -20 °C.
OBS: För att säkerställa att pulvret är helt upplöst måste varje flingor först komma i kontakt med DMSO och inte visa några tecken på kvarvarande fast ämne. Lägg till PBS i små portioner för att nå den slutliga volymen. Blanda inte med en virvel, använd istället mild omrörning med en pipett. Den slutliga koncentrationen av DMSO bör inte överstiga 1% av den totala peptidberedningsvolymen. Beredning av emulsionen i ett 20 ml plaströr med avsmalnande botten bör möjliggöra bättre tillgänglighet av DMSO till det frystorkade pulvret. - Tillsätt DMSO-PBS peptidlösning vid 1:1 v/v till CFA som redan har kompletterats med 1,5 mg/ml avdödad Mycobacterium tuberculosis , för att ge en slutlig koncentration på 2,5 mg/ml. Tillsätt droppvis, pipettera försiktigt och ofta för att bilda en viskös och jämnt fördelad emulsion.
- Lufta peptidlösningen och CFA med en 1000 μL pipett (inställd på 700 μL för att förhindra ytterligare förlust) och pipett för att generera en krämig tjock konsistens. Denna teknik innebär att pipetten används för att upprepade gånger aspirera upp och ner tills den når önskad tjocklek. För bästa resultat, se till att antigenlösningen och adjuvansen blandas noggrant före injektion.
- Intraperitoneal injektion av kikhostetoxin
- Suspendera 1,5 μg Bordetella pertussis-toxin i 100 μL RPMI 1640-media kompletterat med 1% musserum11.
- Utför injektionen med en steril spruta och 23G nål.
OBS: För att undvika störningar på injektionsstället måste kikhostetoxinet administreras innan antigenet injiceras. - Överför tillfälligt varje mus till en separat bur för att få en enda 100 μL i.p. injektion av Bordetella pertussis-toxin .
- Subkutan injektion av IRBP-emulsion
- Injicera sedan IRBP-emulsionen subkutant. Denna process kräver två djurhanterare som är lämpligt klädda med skydd enligt hälso- och säkerhetsbestämmelser.
- Låt en tränad person lätt hålla fast musen ovanpå buren i en skrubpliknande position, med magen vänd nedåt medan den andra tränade personen nyper i huden för att bilda en tältliknande struktur på baksidan av nacken där nålen kan sättas in för att springa mellan fingret och tummen.
VARNING: Det finns risk för nålsticksskada. - När nålen är placerad injiceras 200 μl IRBP-emulsion. När nålen tas bort, vrid nålhuvudet för att stänga huden innan du drar ut och tryck därefter på injektionsstället för att förhindra återflöde av emulsionen.
VARNING: Emulsionen får inte komma i kontakt med mushud eller päls eftersom detta kan orsaka irritation och i allvarligare fall en lesion att utvecklas. Om detta inträffar måste området torkas omedelbart och noggrant med 70% etanol och torkas sedan.
OBS: Om de dränerande lymfkörtlarna behövs för undersökning i slutet av studien kommer injektionsstället att vara annorlunda. Injicera i detta fall 100 μL subkutant på båda sidor av flanken. Detta kommer att generera ett starkare svar vid de dränerande inguinala lymfkörtlarna, som kan skäras ut vid skörden. Om det avsedda resultatet enbart är att utveckla EAU är dock en enda injektion på 200 μl i nacken att föredra för att undvika obehag från flera injektionsställen.
3. Klinisk utvärdering - Mouse Fundus Examination
OBS: Klinisk sjukdom ska poängsättas med hjälp av fundusundersökning, via live-avbildning med ljusfält med hjälp av ett fundoskop och Discover-programvara som används för visualisering.
- Vid sjukdomsdebut (dag 12-14), sedera möss under generell anestesi med en kombination av både ketamin (50 mg/ml) och domitor (medetomidin; 1 mg/ml). Späd 1-del Domitor; 1,5 delar ketamin och 2,5 delar sterilt injicerbart vatten, injicera sedan 100 μL per 30 g intraperitonealt. Använd 1 ml sterila sprutor och 23G nålar för ovanstående kombination av anestesi.
- Efter detta, övervaka musen för att säkerställa att alla reflexer går förlorade och att den inte svarar på stimuli.
- Omedelbart efter att ha fått den intrausiva injektionen och medan musen fortfarande hålls i en scruff, applicera 1% tropikamid och 2,5% fenylefrin lokalt på varje öga för pupillutvidgning. Sikta på att helt täcka hornhinnan med båda dilaterande lösningarna. Det kan ta några minuter innan pupillen är helt vidgad.
- Applicera sedan generöst på ögonviskotearsalvan och behåll hela bildprocessen för att hålla ögat helt smurt och hydratiserat.
- Under tiden öppnar du programvaran (t.ex. Discover) och ställer in fundoskopet (t.ex. Micron) för att ta bilder under brightfield. Tilldela varje enskild mus en mapp och märk bilder med R eller L enligt varje fotograferat öga.
- Montera musen på en specialbyggd scen för livevisualisering och placera mikroskopet för full åtkomst till näthinnan.
- För att få en korrekt representation av sjukdomen, ta bilder av hela näthinneområdet, som täcker alla hörn av periferin förutom den optiska skivan. För att uppnå detta, justera okularet hela tiden. Det är viktigt att ögat förblir fullt smord hela tiden under hela bildprocessen. Se till detta genom att fylla på ögonsalvan i konstant takt.
- Se avsnitt 4 (nedan) i detta skede för att utföra fluoresceinangiografi.
- När all avbildning är klar, späd anestesireversering anti-sedering (5 mg / ml Antisedan) i injicerbart vatten och administrera vid 0,1 mg / kg i.p. Sätt tillbaka musen i en bur och placera på en förvärmd matta med tillgång till en våtblöt diet tills återhämtning. Fullständig återhämtning kännetecknas av hela kroppsrörelsen och att gå runt buret med stadig gång, vilket vanligtvis tar några timmar.
- Vid det angivna experimentella slutmålet (t.ex. dag 21-23), upprepa steg 4.1-4.5 och ta fotografier av hela näthinneområdet igen, som täcker optisk skiva och alla hörn av periferin för att fånga en korrekt representation av sjukdomen.
4. Fluoresceinangiografi
- För att mäta kärlläckage hos dessa djur, under anestesi, ge varje mus en injektion av 2% fluorescein subkutant på baksidan av nacken och placera så att näthinnan är centraliserad i mitten av den levande bilden.
- Ställ in fundoskopet på ett excitationsfilter för blått ljus vid 465-490 nm. Ljuset som fångas från exciterat fluorescein är mellan 520-530 nm.
- Efter 1,5 min injektion efter fluoresceininjektion, ta ett fotografi av varje näthinna och upprepa igen vid 7 minuter.
OBS: Timing är avgörande för dessa händelser, om det inte går att fånga båda så bara bild ett öga.
5. Klinisk sjukdomsbedömning
- Basera den kliniska bedömningen på svårighetsgraden av följande kriterier: optisk diskinflammation, retinal kärlmanschett, retinal vävnadsinfiltrering och strukturell skada.
- Tilldela var och en av dessa parametrar en poäng på en skala från 0 till 5 och den kollektiva totalen är representativ för klinisk sjukdom för hela ögat, med en maximal poäng på 20 som kan erhållas per öga. Tabell 1 kan användas som vägledning för poängkriterier.
6. Histologi och histologisk poängsättning
- Efter avlivning av mössen genom cervikal dislokation, enukleera ögonen genom att pissa ögonlocken isär för enkel åtkomst till hela ögat.
- Placera sedan böjda pincett bakom jordklotet med avsikt att ta tag i orbital bindväv och optisk nerv. Var försiktig så att du inte klämmer på jordklotet.
- För fixering, placera ögat i 4% glutaraldehyd i minst 15 minuter för att minimera näthinneavlossning och överför sedan till 10% formaldehyd i minst 24 timmar. 1-2 ml fixeringsmedel skulle ge tillräckligt med volym för att täcka två ögon.
- Utför inbäddning i paraffin, sektionering på en mikrotom och färgning enligt standardprotokoll. 3-4 μm sektionstjocklek rekommenderas för alla typer av färgning.
- Utför histologisk undersökning av ögon med hjälp av standardprotokoll för färgning av hematoxylin och eosin (H&E).
- Tilldela poäng på en skala från 0-4, enligt kriterierna för EAU-poäng, baserat på omfattningen av immuncellsinfiltrationen i näthinnan och choroid, störningen av näthinneskikten, graden av granulombildning och omfattningen av retinalavskiljning, vilket indikerar retinal skada, som tidigare beskrivits (Agarwal 2013) och sammanfattas i tabell 211.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I detta protokoll beskriver vi en steg-för-steg-metod för att inducera en modell av experimentell autoimmun uveit (EAU) genom immunisering av möss med en uveitogen retinal peptid härledd från IRBP. Bedömning av sjukdomar med hjälp av allmänt använda och lättillgängliga metoder omfattas, även om dessa inte är exklusiva och kan kompletteras eller delvis ersättas med andra avbildningstekniker. De första tecknen på EAU hos möss med C57BL/6J kan detekteras två veckor efter immunisering och maximal sjukdom uppnås inom tre veckor, vilket illustreras i figur 1. Fundoskopiska förändringar klassificeras under sjukdomsprogression som inflammatoriska förändringar, som inkluderar retinal vävnad, vaskulär och optisk skivinflammation och retinal strukturell skada (figur 2) förutom histologiska förändringar baserade på infiltrerande immunceller och strukturell skada. Dessa kliniska och histopatologiska förändringar kan detekteras i upp till 85 dagar efter immunisering, och graderade och poängsatta för utvärdering föreslår att studera sjukdomsprogression. För att undvika oavsiktlig bias i den kvalitativa visuella poängsättningen bör bilderna utvärderas av mer än en expert och poängsättare måste blindas för behandlingsgrupperna.
Vi visar här hur de kliniska och histologiska poängsystemen (tabell 1 och tabell 2) vägleder forskare att kvantifiera EAU-svårighetsgrad, validera effekten av behandlingar och utforska mekanismen för läkemedelsverkan. Vaskulär läckage är också en patologisk egenskap hos modellen och i human uveit. Vi visar exempel på vaskulärt läckage av fluorescein (Figur 3) som en annan metod för att bedöma sjukdom i denna modell.
Figur 1. Schematisk tidslinje för klinisk och histologisk sjukdomsprogression i IRBP1-20-inducerad EAU. En tidslinje som markerar insättandet av infiltration och progression av IRBP1-20 inducerade EAU mot maximal sjukdom. Från immunisering faller de första tecknen på klinisk sjukdom, som detekteras genom fundoskopisk avbildning och histopatologisk analys, mellan dag 12-14. Sjukdomen kommer sedan att fortsätta att utvecklas, enligt dessa parametrar, tills en topp nås runt dag 21-23. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2. Representativa fundoskopiska bilder korrelerar med histologiska snitt i olika stadier av IRBP1-20-inducerad EAU-sjukdom hos C57BL/6J-möss. Kliniska fundoskopiska och motsvarande vävnadsbilder av C57BL/6J från samma djur immuniserade med IRBP 1-20 peptid. (A och B) fundoskopiska bilder och histologiska ögonsnitt erhållna från friska och CFA-injicerade möss. Näthinnan har inga tecken på inflammation och motsvarande histologiavsnitt visar bevarade näthinnelager. (C) Fundoskopisk bild av ögat erhållet från C57BL / 6J mus 14 dagar efter immunisering visar klassiska tecken på EAU, uppvisar svår optisk disksvullnad i det tidiga stadiet av sjukdomen, motsvarande histologi visar infiltrerande immunceller i glaskroppen. (D) Fundoskopiska bilder av ögat erhållna från C57BL/6J mus 21 dagar efter immunisering visar tecken på kärlmanschett och infiltrerande immunpopulationer. Histologidata visar allvarliga strukturella förändringar genom näthinneveckning (gula pilar). V= kärl, O= optisk skiva, R=näthinnan, L=lins, Vit=glaskroppen, iO= inflammerad optisk skiva, iV= inflammerat kärl, iR= inflammerad näthinna, i= infiltrerande celler i glaskroppen, RFs=näthinneveck. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3. Representativa bilder av fluorescerande angiografi tagna med Micron III bildsystem vid maximal sjukdom. C57BL/6J-möss injicerades subkutant med 2% fluorescein och bilder togs vid olika tidpunkter efter cirkulation av spårämnet. (A) CFA kontrollerar endast mus som tas 1,5 och 7 minuter efter administrering av fluorescein. (B) Representativa bilder av IRBP1-20 immuniserade möss tagna 1,5 respektive 7 minuter efter att ha fått fluorescein. Vit pil indikerar fartygsläckage. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Tjog | Optisk skiva | Retinala kärl | Retinal vävnad infiltrerar | Strukturella skador | ||||
| 1 | Minimal Inflammation | 1-4 milda manschetter | 1-4 små lesioner eller 1 linjär lesion | Retinala lesioner eller retinalatrofi som involverar 1/4 till 3/4 näthinneområde | ||||
| 2 | Mild inflammation | >4 milda manschetter eller 1-3 måttliga manschetter | 5-10 små lesioner eller 2-3 linjära lesioner | Pan retinalatrofi med flera små lesioner (ärr) eller <3 linjära lesioner (ärr) | ||||
| 3 | Måttlig inflammation | >3 måttliga manschetter | >10 små lesioner eller >3 linjära lesioner | Pan retinalatrofi med >3 linjära lesioner eller sammanflytande lesioner (ärr) | ||||
| 4 | Allvarlig inflammation | >1 svår manschett | Linjär lesion sammanflytande | Näthinneavlossning med vikning | ||||
| 5 | * Inte synlig (vit ut eller extrem lossning) | * Inte synlig (vit ut eller extrem lossning) | * Inte synlig (vit ut eller extrem lossning) | * Inte synlig (vit ut eller extrem lossning) | ||||
Tabell 1. Konventionell klinisk poängskala för utvärdering av EAU-klinisk sjukdoms svårighetsgrad. Tabell som visar kriterier som används för att utvärdera sjukdomens svårighetsgrad hos möss som immuniserats med IRBP1-20. Poängen fördelades enligt de kännetecken som beskrivs ovan och var synliga på fundusbilderna, varje öga fick en total poäng av tjugo. * På grund av skymning av infiltrat och näthinneavlossning inuti den bakre kammaren kan inte bedömas. Tabell anpassad med tillstånd från Xu H., et al., 20088.
| Gradera | Kriterier |
| 0 | Ingen förändring |
| 0.5 (spår) | Mild inflammatorisk cellinfiltration. Ingen vävnadsskada |
| 1 | Infiltration; retinala veck och fokala näthinneavlossningar; några små granulom i åderhinnan och näthinnan, perivaskulit |
| 2 | Måttlig infiltration; retinala veck, avlossningar och fokal fotoreceptorcellskada; små till medelstora granulom, perivaskulit och vaskulit |
| 3 | Medium till tung infiltration; omfattande retinal vikning med avlossningar, måttlig fotoreceptorcellskada; medelstora granulomatösa lesioner; subretinal kärlnybildning |
Tabell 2. Histologiskt poänggivande EAU
Tabell som visar kriterier som används för att utvärdera svårighetsgraden av EAU baserat på histopatologiska egenskaper hos sjukdomen. Poängen fördelades enligt de kännetecken som beskrivs ovan på H&E-färgning, varje öga fick en total poäng av fyra. Tabell anpassad med tillstånd från Agarwal et al. 201311.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Experimentella djurmodeller är nödvändiga verktyg för att studera sjukdomspatogenes och preklinisk testning av nya terapeutiska paradigmer. I det nuvarande protokollet har vi diskuterat en metod för att inducera, övervaka och poängsätta EAU, en experimentell modell av intraokulär inflammatorisk uveit. Denna EAU-modell har mer än 95% sjukdomsincidens när alla procedurer utförs enligt protokollet som beskrivs häri och resulterar i utvecklingen av kronisk, monofasisk EAU. För att uppnå denna incidensnivå betonar vi vikten av antigenberedning och injektion av emulsionen, vilka båda beskrivs ovan. Huvuddragen i EAU hos djur är retinal och / eller koroidal inflammation, retinal vaskulit, fotoreceptorförstöring och synförlust, som alla representerar många viktiga kliniska patologiska egenskaper hos human bakre uveit12. Mycket av förståelsen av de grundläggande cellulära och molekylära mekanismerna som är involverade i uveit härrör från den inducerade EAU-modellen som beskrivs häri. EAU kan induceras hos mus13 och råtta11 genom aktiv immunisering med retinala antigener som känns igen av lymfocyter. Dessa retinala antigener tar många former; IRBP (för möss) eller retinalt lösligt antigen (S-Ag) för råttor. Inducering av EAU på en C57BL / 6J-bakgrund genererar en mer kronisk form av sjukdomen, med topppatologi observerad tre veckor efter immunisering. Som jämförelse inducerar applicering av retinalt antigen på en B10RIII-bakgrund14 en akut-monofasisk och kliniskt svår form av EAU där topppatologi vanligtvis presenteras inom två veckor efter induktion och sjukdomen avtar vid vecka 3.
Olika IRBP-epitoper har testats på C57BL/6J-möss och IRBP1-20-peptid har visat sig vara en reproducerbar modell med hög incidens och svårighetsgrad. Nyligen har en ny uveitogen epitop av IRBP, aminosyrarester 651 till 670 av humant IRBP, rapporterats inducera EAU med högre klinisk incidens och allvarlig sjukdomsmanifestation11 och kan användas företrädesvis om detta uppfyller de vetenskapliga målen. Eftersom effekten av tarmkommensal mikrobiota och aktivering av autoreaktiva T-cellreceptorer (TCR) är kända för att störa sjukdomsuppkomsten vid applicering av olika antigener15, rekommenderar vi för nybörjare inom detta område att använda antingen hIRBP1-20 eller hIRBP651-670 peptider i en dos titrerad mellan 300-500 μg för att uppnå en tillförlitlig modell. Faktum är att variationer i denna modell har dokumenterats någon annanstans med rapporter som belyser vikten av skillnader mellan bostadssystem och mikrobiomet som kan påverka sjukdomens svårighetsgrad och förekomst15. Således kan mer eller mindre peptidantigen och kikhostetoxin krävas.
Det finns ett antal andra modeller som vår beskrivna analys kan utföras på. Dessa inkluderar spontan uveit som fortskrider hos IRBP T-cellreceptor (TCR) transgena (R161H) möss där okulär inflammation utvecklas vid 5-6 veckors ålder16. EAU kan också induceras adoptivt genom överföring av uveitogena effektor-CD4+T-celler. Aktiverade, IRBP-specifika CD4 + T-celler härledda från grundade möss kan användas som en källa till effektorceller 3,11. Denna modell representerar effektorfasen av sjukdomen samtidigt som man undviker komplexiteten i att använda CFA i den inducerbara modellen.
Utöver detta finns det många fördelar med att använda okulära inflammatoriska modeller som lämpliga verktyg för att undersöka andra inflammatoriska sjukdomar, särskilt de med effektor Th1 och Th17 delmängd patologi. De främsta fördelarna med att använda denna modell är de icke-invasiva och kvantifierbara metoderna för övervakning av sjukdomsutveckling och progression, som är fundoskopi och angiografi. Dessa icke-invasiva bildsystem möjliggör enkel åtkomst till neuronala vävnader, som annars skulle döljas bakom skyddande anatomiska barriärer. Ytterligare metoder för övervakning av sjukdomsprogression inkluderar tillämpning av OCT-avbildning, vilket är känsligare än fundoskopisk avbildning för att detektera cellulära infiltrat, särskilt i det tidiga skedet av EAU-debut. Tekniken möjliggör flerskiktiga tvär- och horisontella-snittsvisualiseringar av näthinnan i längdriktningen och på ett icke-invasivt sätt. In vivo OCT-avbildning lägger till information om näthinnans tjocklek som inte kunde erhållas genom fundoskopiska och histologiska undersökningar17. I allt högre grad kommer tillgången till ännu mer sofistikerade icke-invasiva avbildningstekniker, såsom adaptiv optik, skanning, laseroftalmoskopi och multimodala avbildningsverktyg, att ytterligare öka vår kapacitet att undersöka denna sjukdom hos små gnagare. Vidare ger förmågan att dissekera och isolera bosatta och infiltrerande cellpopulationer för djupare analys av immunfenotyper, med hjälp av tekniker som flödescytometri, stora möjligheter att leverera insiktsfull information.
Det finns några etablerade poängsystem baserade på kliniska kriterier erhållna från fundoskopi 8,9,18. Även om dessa skiljer sig något mellan oftalmologiska forskningscentra, är alla tillförlitliga, korrelerar med histopatologiska egenskaper och kan exakt återspegla svårighetsgraden av sjukdomen. I den aktuella studien hänvisar vi till poängsystemet som utvecklats av Xu et al.8. Detta system erbjuder en mer detaljerad bedömningsmetod med ett större antal kliniska mätparametrar. Den innehåller en maximal poäng på 20 vilket introducerar ett bredare fönster för poäng än alternativa system begränsade till högst 5. Detta är viktigare för vidare utforskning inom terapeutiska metoder. Att minimera operatörsfel är dock avgörande när man använder en sådan förfinad och detaljerad uppsättning parametrar och kan kräva noggrann utbildning av operatören och oberoende validering av tolkningen.
Här presenterar vi ett protokoll för att inducera EAU hos kvinnliga C57BL / 6-möss eftersom det finns en ökad förekomst av kvinnor: män 1.4: 1 presenterar uveit i klinisk miljö. Ändå bör könet hos mössen som används för att inducera autoimmun sjukdom övervägas eftersom detta kan påverka cytokinmiljön11 och också avslöja viktiga skillnader i hur de svarar på terapeutisk ingrepp. En annan faktor är mössens ålder vid sjukdomsinduktion. Till exempel har vi studerat åldersberoende av känslighet hos B10RIII-möss och kommit fram till att möss över 8 veckors liv har en lägre förekomst av EAU (opublicerad studie från vår grupp).
Sammanfattningsvis har djurmodeller av intraokulär sjukdom gett ett ovärderligt verktyg för att studera mänsklig bakre uveit och har underlättat utvecklingen av nya terapier som CsA. Ingen djurmodell i sig reproducerar emellertid hela spektrumet av human uveit, eftersom var och en har unika egenskaper som gör den lämplig för att studera särskilda aspekter av sjukdomen. Denna EAU-modell induceras av autoimmunitet genom applicering av IRBP-peptid kompletterad med adjuvans som utlöser medfödda immunsvar. Det är dock inte känt om alla former av bakre uveit hos människor är autoimmuna och om antigen efterlikning är en utlösande faktor. Dessutom är det inte klart om det finns ett samband med infektion för att utlösa human uveit. Icke desto mindre är modellen som beskrivs här en användbar och reproducerbar generisk modell som kan användas för att få användbar information om etiologi, patogenes och terapi av denna synhotande sjukdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att deklarera med detta arbete.
Acknowledgments
JG tilldelades en UCL Impact Studentship och Rosetrees Trust finansiering för att stödja CB. VC erhöll ett forskningsbidrag från Akari Therapeutics Inc. Vi vill tacka UCL Institute of Ophthalmology, Biological Service Unit, särskilt Alison O'Hara och hennes team för deras tekniska support.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| antisedan | ZOETIS, USA | for waking up | |
| Complete Freund’s Adjuvant; CFA | Sigma, UK | F5881 | for immunisation |
| Domitor | Orion Pharma, Finland | for anesthesia | |
| Flourescein | Sigma, UK | F2456 | for Angiography |
| IRBP1-20 | Chamberidge peptide, UK | peptide;antigen | |
| Ketamine | Orion Pharma, Finland | for anesthesia | |
| Micron III | Phoenix Research, USA | for fundoscopy | |
| Mouse Serum | Sigma, UK | M5905 | for immunisation |
| Mycobacterium terberculosis | Sigma, UK | 344289 | for immunisation |
| Pertussis Toxin | Sigma, UK | P2980 | for immunisation |
| phenylephrine hydrochloride 2.5% | Bausch & Lomb UK | PHEN25 | for dilation |
| Tropicamide 1% | SANDOZ | for dilation | |
| Viscotears | WELDRICKS Pharmacy, UK | 2082642 | for eye lubrication |
References
- Lyu, C., et al. TMP778, a selective inhibitor of RORgammat, suppresses experimental autoimmune uveitis development, but affects both Th17 and Th1 cell populations. The European Journal of Immunology. 48, 1810-1816 (2018).
- Klaska, I. P., Forrester, J. V.
- Eskandarpour, M., Alexander, R., Adamson, P., Calder, V. L. Pharmacological Inhibition of Bromodomain Proteins Suppresses Retinal Inflammatory Disease and Downregulates Retinal Th17 Cells. The Journal of Immunology. 198, 1093-1103 (2017).
- Mochizuki, M., et al. Preclinical and clinical study of FK506 in uveitis. Current Eye Research. 11, Suppl 87-95 (1992).
- Nguyen, Q. D., et al. Intravitreal Sirolimus for the Treatment of Noninfectious Uveitis: Evolution through Preclinical and Clinical Studies. Ophthalmology. 125, 1984-1993 (2018).
- Leal, I., et al. Anti-TNF Drugs for Chronic Uveitis in Adults-A Systematic Review and Meta-Analysis of Randomized Controlled Trials. Frontiers in Medicine (Lausanne). 6, 104 (2019).
- Chen, Y. H., et al. Functionally distinct IFN-?+ IL-17A+ Th cells in experimental autoimmune uveitis: T-cell heterogeneity, migration, and steroid response. European Journal of Immunology. 50 (12), 1941-1951 (2020).
- Xu, H., et al. A clinical grading system for retinal inflammation in the chronic model of experimental autoimmune uveoretinitis using digital fundus images. Experimental Eye Research. 87, 319-326 (2008).
- Copland, D. A., et al. The clinical time-course of experimental autoimmune uveoretinitis using topical endoscopic fundal imaging with histologic and cellular infiltrate correlation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49, 5458-5465 (2008).
- Dick, A. D. Doyne lecture 2016: intraocular health and the many faces of inflammation. Eye (Lond). 31, 87-96 (2017).
- Agarwal, R. K., Silver, P. B., Caspi, R. R. Rodent models of experimental autoimmune uveitis. Methods in Molecular Biology. 900, 443-469 (2012).
- Caspi, R. R. A look at autoimmunity and inflammation in the eye. Journal of Clininical Investigation. 120, 3073-3083 (2010).
- Caspi, R. R., et al. Mouse models of experimental autoimmune uveitis. Ophthalmic Research. 40, 169-174 (2008).
- Shao, H., et al. Severe chronic experimental autoimmune uveitis (EAU) of the C57BL/6 mouse induced by adoptive transfer of IRBP1-20-specific T cells. Experimental Eye Research. 82, 323-331 (2006).
- Horai, R., et al. Microbiota-Dependent Activation of an Autoreactive T Cell Receptor Provokes Autoimmunity in an Immunologically Privileged Site. Immunity. 43, 343-353 (2015).
- Chen, J., et al. Comparative analysis of induced vs. spontaneous models of autoimmune uveitis targeting the interphotoreceptor retinoid binding protein. PLoS One. 8, 72161 (2013).
- Chen, J., Qian, H., Horai, R., Chan, C. C., Caspi, R. R. Use of optical coherence tomography and electroretinography to evaluate retinal pathology in a mouse model of autoimmune uveitis. PLoS One. 8, 63904 (2013).
- Harry, R., et al. Suppression of autoimmune retinal disease by lovastatin does not require Th2 cytokine induction. Journal of Immunology. 174, 2327-2335 (2005).
