Summary
Neste relato apresentamos um protocolo que permite ao investigador gerar um modelo de uveíte intraocular em camundongo. Mais comumente referido como uveíte autoimune experimental (EAU), este modelo estabelecido captura muitos aspectos da doença humana. Aqui, descreveremos como induzir e monitorar a progressão da doença usando várias leituras.
Abstract
A Uveíte Autoimune Experimental (EAU) é impulsionada por células imunes que respondem a autoantígenos. Muitas características deste modelo de doença inflamatória intraocular não infecciosa recapitulam o fenótipo clínico da uveíte posterior que afeta humanos. A EAU tem sido usada de forma confiável para estudar a eficácia de novas terapias inflamatórias, seu modo de ação e para investigar melhor os mecanismos que sustentam a progressão da doença de distúrbios intraoculares. Aqui, fornecemos um protocolo detalhado sobre a indução de EAU no camundongo C57BL/6J - o organismo modelo mais utilizado com suscetibilidade a esta doença. A avaliação clínica da gravidade e progressão da doença será demonstrada por meio de fundoscopia, exame histológico e angiografia fluoresceína. O procedimento de indução envolve a injeção subcutânea de uma emulsão contendo um peptídeo (IRBP1-20) da proteína ocular interfotorreceptor retinóide proteína (também conhecida como proteína de ligação ao retinol 3), Adjuvante de Freund Completo (CFA) e suplementado com Mycobacterium tuberculosis morto. A injeção desta emulsão viscosa na parte de trás do pescoço é seguida por uma única injeção intraperitoneal de toxina Bordetella pertussis . No início dos sintomas (dia 12-14) e sob anestesia geral, são obtidas imagens fundoscópicas para avaliar a progressão da doença através do exame clínico. Esses dados podem ser comparados diretamente com aqueles em momentos posteriores e pico de doença (dia 20-22) com diferenças analisadas. Ao mesmo tempo, este protocolo permite que o investigador avalie possíveis diferenças na permeabilidade e dano dos vasos usando angiografia fluoresceína. A EAU pode ser induzida em outras cepas de camundongos - tanto selvagens quanto geneticamente modificadas - e combinada com novas terapias que oferecem flexibilidade para estudar a eficácia de medicamentos e/ou mecanismos de doenças.
Introduction
Este protocolo demonstrará como induzir a Uveíte Autoimune Experimental (EAU) em camundongos C57BL/6J por uma única injeção subcutânea de um antígeno da retina em um adjuvante emulsionado. Os métodos para monitorar e avaliar a progressão da doença serão detalhados por meio de imagens fundoscópicas e exame histológico, com parâmetros de medição delineados dentro. Além disso, a angiografia fluoresceína, uma técnica para examinar a estrutura e a permeabilidade dos vasos sanguíneos da retina, será discutida.
Este modelo EAU recapitula as características centrais da uveíte posterior não infecciosa em humanos no que diz respeito às características clínico-patológicas e aos mecanismos celulares e moleculares básicos que impulsionam a doença. A EAU é mediada por subconjuntos Th1 e/ou Th17 de linfócitos CD4+T auto-reativos, como demonstrado em experimentos de transferência adotiva e com camundongos empobrecidos de IFNγ1. Grande parte da nossa compreensão dos papéis potenciais para essas células na uveíte vem do estudo da EAU2, onde as células Th1 e Th17 são detectadas nos tecidos da retina3. Muitas vezes, a EAU é usada como um modelo pré-clínico para avaliar a utilidade de novas terapias na atenuação da doença. Abordagens terapêuticas que modularam com sucesso a doença EAU mostraram alguma eficácia na clínica e atingiram o status de aprovação da FDA. Exemplos disso são grupos de drogas imunorreguladoras, como as terapias direcionadas às células T: ciclosporina, FK-506 e rapamicina 4,5,6. Recentemente, intervenções direcionadas a novas vias também foram exploradas neste modelo para investigar o mecanismo e o efeito no desfecho da doença. Estes incluem o direcionamento da regulação transcricional através de proteínas Bromodomain Extra-Terminal (BET) leitoras de cromatina e inibidores de P-TEFb3. Além disso, abordagens mais convencionais, como um inibidor de VLA-4, demonstraram recentemente supressão na EAU via modulação de células T CD4+ efetoras7. Além disso, a segmentação de células Th17 com TMP778, um agonista inverso RORγt, também foi encontrada para suprimir significativamente EAU8. Além disso, este modelo oferece uma oportunidade para estudar a inflamação autoimune crônica na retina e os mecanismos subjacentes que o acompanham, como o priming de linfócitos.
As leituras primárias para estudos pré-clínicos de EAU são a avaliação clínica por meio da realização de imagens de fundoscopia da retina e, com menor frequência, pela avaliação da integridade da retina por Tomografia de Coerência Óptica (OCT). A avaliação histopatológica da retina e a imunofenotipagem das células da retina por citometria de fluxo são então realizadas no término. A fundoscopia é um sistema de imagem ao vivo fácil de usar que permite uma avaliação clínica rápida e reprodutível de toda a retina. Para as avaliações imuno-histoquímicas, as técnicas baseiam-se na preparação de cortes da retina que permitem estudar a arquitetura tecidual quanto ao grau de inflamação e dano estrutural9. Os critérios de avaliação e os sistemas convencionais de pontuação, para todas as técnicas utilizadas, serão descritos neste protocolo. A extensão do dano registrado usando imagens fundoscópicas geralmente se correlaciona estreitamente com alterações histológicas. Essa abordagem dupla para monitorar e avaliar a gravidade da doença proporciona maior sensibilidade e resultados de medição mais confiáveis.
A EAU é um modelo bem estabelecido e comumente usado para testes pré-clínicos e investigação de doenças oculares imunomediadas. Esse modelo é confiável e reprodutível com incidência de doença de >95% e gera dados abrangentes que podem ser utilizados para validar ou repudiar novas terapias para o tratamento da doença inflamatória intraocular que representa uma das principais causas de cegueira em idade ativa em todo o mundo10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Todos os experimentos foram realizados de acordo com a Lei de Animais (Procedimentos Científicos) do Reino Unido de 1986 e as diretrizes institucionais do Animal Welfare and Ethical Review Body (AWERB).
1. Ratos C57BL/6J de alojamento
- Abrigar ratos em um ambiente livre de patógenos específicos, em um ciclo claro-escuro de 12 horas e comida e água disponíveis ad libitum.
- Realizar todos os experimentos em mulheres adultas C57BL/6J (as fêmeas são escolhidas preferencialmente, pois há uma incidência de mulheres para homens de 1,4 a 1 em pacientes com uveíte). Randomize camundongos fêmeas C57BL/6J entre 6-8 semanas de idade por peso e idade. Hospede os ratos em gaiolas ventiladas individualmente (IVC) em grupos de 5-6 ratos por gaiola.
2. Imunização de camundongos C57BL/6
- IRBP1-20 - Preparação de emulsão CFA
NOTA: A preparação da emulsão é essencial para a reprodutibilidade e incidência da doença; como tal, todos os esforços devem ser feitos para manter a consistência durante todo o processo de preparação e entre os experimentos. Ao preparar a emulsão, a perda deve ser contabilizada nos cálculos de todos os reagentes de antemão. Essa perda pode ser de aproximadamente 1,5x (ou 50% a mais do volume preparado), com base no número de camundongos planejados para imunização. Veja o exemplo a seguir abaixo. Para imunizar 10 camundongos, prepare 15 camundongos e use 400 μg (peptídeo por 20 g de camundongo) x 15 camundongos = 6 mg. Cada rato deve receber 200 μL para imunização (3 ml no total). O volume final compreende uma proporção de 1:1 de solução peptídica e CFA, portanto, 1,5 mL de solução peptídica e 1,5 mL de CFA.- Prepare todas as soluções estéreis em um gabinete de fluxo laminar usando técnicas assépticas.
- Pesar a quantidade desejada (400 μg por rato 20 g) de péptido liofilizado IRBP1-20 humano (LAQGAYRTAVDLESLASQLT). Dissolva o peptídeo em 100% DMSO. Armazenar as existências na forma liofilizada a -20 °C.
NOTA: Para garantir que o pó está totalmente dissolvido, cada floco deve fazer contato com o DMSO primeiro e não mostrar nenhum sinal de sólido residual. Adicione o PBS em pequenas porções para chegar ao volume final. Não misture com um vórtice, em vez disso, use agitação suave com uma pipeta. A concentração final de DMSO não deve exceder 1% do volume total de preparação peptídica. A preparação da emulsão em um tubo de plástico de 20 mL com fundo cônico deve permitir uma melhor acessibilidade do DMSO ao pó liofilizado. - Adicionar solução peptídica DMSO-PBS a 1:1 v/v ao CFA, que já foi suplementado com 1,5 mg/mL de Mycobacterium tuberculosis morto, para dar uma concentração final de 2,5 mg/mL. Adicione gota a gota, pipetando suave e frequentemente para formar uma emulsão viscosa e uniformemente distribuída.
- Arejar a solução peptídica e CFA usando uma pipeta de 1000 μL (ajustada para 700 μL para evitar mais perdas) e pipeta para gerar uma consistência espessa cremosa. Esta técnica envolve o uso da pipeta para aspirar repetidamente para cima e para baixo até atingir a espessura desejada. Para obter os melhores resultados, certifique-se de que a solução antigénica e o adjuvante estão bem misturados antes da injeção.
- Injeção intraperitoneal de toxina pertussis
- Suspender 1,5 μg de toxina Bordetella pertussis em 100 μL de meio RPMI 1640 suplementado com soro de rato a 1%11.
- Realize a injeção i.p. com uma seringa estéril e agulha 23G.
NOTA: A fim de evitar perturbações no local da injeção, a toxina pertussis deve ser administrada antes de injetar o antígeno. - Transfira temporariamente cada rato para uma gaiola separada para receber uma única injeção i.p. de 100 μL de toxina Bordetella pertussis .
- Injeção subcutânea de emulsão de IRBP
- Em seguida, injete a emulsão IRBP por via subcutânea. Este processo requer dois manipuladores de animais adequadamente vestidos com proteção de acordo com os regulamentos de saúde e segurança.
- Peça a uma pessoa treinada que contenha levemente o rato em cima da gaiola em uma posição semelhante a uma desgrenhada, com o estômago voltado para baixo, enquanto a outra pessoa treinada aperta a pele para formar uma estrutura semelhante a uma tenda na parte de trás do pescoço, onde a agulha pode ser inserida para encaixar entre o dedo e o polegar.
CUIDADO: Existe o perigo de lesão por picada de agulha. - Uma vez posicionada a agulha, injete 200 μL da emulsão IRBP. Ao remover a agulha, gire a cabeça da agulha para fechar a pele antes de puxar para fora e aplique pressão depois no local da injeção para evitar o refluxo da emulsão.
CUIDADO: A emulsão não deve fazer contato com a pele ou pelo do rato, pois isso pode causar irritação e, em casos mais graves, uma lesão a se desenvolver. Se isso ocorrer, a área deve ser limpa imediatamente e completamente usando etanol a 70% e depois seca.
NOTA: Se os gânglios linfáticos drenantes forem necessários para exame no final do estudo, o local de injeção será diferente. Neste caso, injete 100 μL em ambos os lados do flanco por via subcutânea. Isso gerará uma resposta mais forte nos gânglios linfáticos inguinais drenantes, que podem ser excisados no momento da colheita. No entanto, se o resultado pretendido for apenas desenvolver EAU, uma única injeção de 200 μL na parte de trás do pescoço é preferível para evitar o desconforto de vários locais de injeção.
3. Avaliação Clínica - Exame de Fundo de Camundongo
NOTA: A doença clínica deve ser pontuada usando o exame de fundo de olho, através de imagens ao vivo de campo brilhante usando um fundoscópio e o software Discover usado para visualização.
- No início da doença (dia 12-14), ratos sedados sob anestesia geral usando uma combinação de cetamina (50 mg / mL) e Domitor (Medetomidina; 1 mg / mL). Diluir 1 parte Domitor; 1,5 partes de cetamina e 2,5 partes de água injetável estéril, em seguida, injetar 100 μL por 30 g por via intraperitoneal. Use seringas estéreis de 1 mL e agulhas 23G para a combinação de anestesia acima.
- Depois disso, monitore o mouse para garantir que todos os reflexos sejam perdidos e que ele não responda aos estímulos.
- Imediatamente após receber a injeção i.p. e enquanto o rato ainda estiver preso num scruff, aplique 1% de tropicamida e 2,5% de fenilefrina topicamente em cada olho para dilatação da pupila. Procure cobrir completamente a córnea com ambas as soluções dilatadoras. Pode levar alguns minutos até que a pupila esteja totalmente dilatada.
- Depois, aplique generosamente no olho pomada viscolárfica e mantenha durante todo o processo de imagem, a fim de manter o olho totalmente lubrificado e hidratado.
- Enquanto isso, abra o software (por exemplo, Discover) e defina o fundoscópio (por exemplo, Micron) para capturar imagens em campo brilhante. Aloque a cada mouse uma pasta individual e rotule as imagens com R ou L de acordo com cada olho fotografado.
- Monte o mouse em um palco construído especificamente para visualização ao vivo e posicione o microscópio para acesso total à retina.
- Para obter uma representação precisa da doença, tire imagens de toda a área da retina, cobrindo todos os cantos da periferia, além do disco óptico. Para conseguir isso, ajuste a ocular por toda parte. É crucial que o olho permaneça totalmente lubrificado em todos os momentos durante todo o processo de imagem; Certifique-se disso, completando a pomada ocular a uma taxa constante.
- Consulte a secção 4 (abaixo) nesta fase para realizar angiografia com fluoresceína.
- Uma vez que todas as imagens estejam completas, dilua o antissedação de reversão anestésica (5 mg/mL de Antissedã) em água injetável e administre a 0,1 mg/kg i.p. Devolva o rato a uma gaiola e coloque num tapete pré-aquecido com acesso a uma dieta molhada até à recuperação. A recuperação completa é caracterizada pelo movimento de todo o corpo e pela caminhada ao redor da gaiola com marcha constante, normalmente levando algumas horas.
- No desfecho experimental designado (por exemplo, dia 21-23), repita as etapas 4.1-4.5 e tire fotografias de toda a área da retina novamente, cobrindo o disco óptico e todos os cantos da periferia para capturar uma representação precisa da doença.
4. Angiografia fluoresceína
- Para medir o vazamento de vasos nesses animais, enquanto sob anestesia, dê a cada camundongo uma injeção de fluoresceína a 2% por via subcutânea na parte de trás do pescoço e posicione-a de modo que a retina seja centralizada no meio da imagem viva.
- Ajuste o fundoscópio para um filtro de excitação de luz azul a 465-490 nm. A luz capturada da fluoresceína excitada está entre 520-530 nm.
- Após 1,5 min após a injeção de fluoresceína, tire uma fotografia de cada retina e repita novamente aos 7 minutos.
NOTA: O tempo é crítico para esses eventos, se não for possível capturar ambos, basta visualizar um olho.
5. Pontuação da Doença Clínica
- Baseie a avaliação clínica na gravidade dos seguintes critérios: inflamação do disco óptico, manguito dos vasos da retina, infiltrado tecidual da retina e danos estruturais.
- Atribua a cada um desses parâmetros uma pontuação em uma escala de 0 a 5 e o total coletivo é representativo da doença clínica para todo o olho, com uma pontuação máxima de 20 obteníveis por olho. A Tabela 1 pode ser utilizada como guia para os critérios de pontuação.
6. Histologia e Escore Histológico
- Depois de eutanasiar os ratos por luxação cervical, enuclear os olhos valorizando as pálpebras separadas para facilitar o acesso a todo o olho.
- Em seguida, coloque pinças curvas atrás do globo com a intenção de agarrar o tecido conjuntivo orbital e o nervo óptico. Tome cuidado para evitar espremer o globo.
- Para fixação, coloque o olho em glutaraldeído a 4% por um mínimo de 15 minutos para minimizar o descolamento de retina e, em seguida, transfira para 10% de formaldeído por pelo menos 24 h. 1-2 mL de fixador daria volume suficiente para cobrir dois olhos.
- Realize a incorporação em parafina, seccionando em um micrótomo e corando de acordo com os protocolos padrão. A espessura da seção de 3-4 μm é recomendada para qualquer tipo de coloração.
- Realizar exame histológico dos olhos utilizando protocolos padrão para coloração de Hematoxilina e Eosina (H&E).
- Atribuir escores em uma escala de 0-4, de acordo com os critérios para pontuação EAU, com base na extensão da infiltração de células imunes dentro da retina e coroide, a ruptura das camadas da retina, o grau de formação de granuloma e a extensão do descolamento de retina, indicando danos na retina, conforme descrito anteriormente (Agarwal 2013) e resumido na Tabela 211.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Neste protocolo, descrevemos um método passo-a-passo para induzir um modelo de uveíte autoimune experimental (EAU) imunizando camundongos com um peptídeo uveitogênico da retina derivado do IRBP. A avaliação da doença empregando abordagens amplamente utilizadas e prontamente acessíveis é abordada, embora estas não sejam exclusivas e possam ser adicionadas ou parcialmente substituídas por outras técnicas de imagem. Os primeiros sinais de EAU em camundongos C57BL/6J podem ser detectados duas semanas após a imunização e o pico da doença atingiu dentro de três semanas, conforme ilustrado na Figura 1. As alterações fundososcópicas são classificadas durante a progressão da doença como alterações inflamatórias, que incluem tecido retiniano, inflamação vascular e do disco óptico e dano estrutural da retina (Figura 2), além de alterações histológicas baseadas na infiltração de células imunes e danos estruturais. Essas alterações clínicas e histopatológicas podem ser detectadas por até 85 dias após a imunização, e graduadas e pontuadas para avaliação propõem estudar a progressão da doença. A fim de evitar viés não intencional na pontuação visual qualitativa, as imagens devem ser avaliadas por mais de um especialista e os escoltores precisam estar cegos para os grupos de tratamento.
Mostramos aqui como os sistemas de pontuação clínica e histológica (Tabela 1 e Tabela 2) orientam os cientistas a quantificar a gravidade da UEA, a validar a eficácia dos tratamentos e a explorar o mecanismo de ação do fármaco. O vazamento vascular também é uma característica patológica do modelo e na uveíte humana. Estamos mostrando exemplos de extravasamento vascular de fluoresceína (Figura 3) como outro método de avaliação da doença neste modelo.
Figura 1. Linha do tempo esquemática da progressão clínica e histológica da doença na EAU induzida por IRBP1-20 . Uma linha do tempo que marca o início da infiltração e a progressão da IRBP1-20 induziu o EAU ao pico da doença. A partir da imunização, os primeiros sinais de doença clínica, detectados por imagem fundoscópica e análise histopatológica, caem entre os dias 12 e 14. A doença continuará a progredir, de acordo com esses parâmetros, até que um pico seja atingido por volta do dia 21-23. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Imagens fundoscópicas representativas correlacionadas com cortes histológicos em diferentes estágios da doença do EAU induzida por IRBP1-20 em camundongos C57BL/6J. Imagens clínicas fundoscópicas e teciduais correspondentes de C57BL/6J do mesmo animal imunizado com o péptido IRBP 1-20. (A e B) imagens fundoscópicas e cortes histológicos do olho obtidos de camundongos saudáveis e injetados com CFA. A retina não tem sinal de inflamação e as seções histológicas correspondentes mostram camadas retinianas preservadas. (C) A imagem fundoscópica do olho obtida de camundongo C57BL/6J 14 dias após a imunização demonstra sinais clássicos de EAU, apresentando inchaço grave do disco óptico no estágio inicial da doença, a histologia correspondente mostra infiltração de células imunes no espaço vítreo. (D) Imagens fundoscópicas de olho obtidas de camundongos C57BL/6J 21 dias após a imunização mostram sinais de manguito de vasos e infiltração de populações imunes. Os dados histológicos demonstram alterações estruturais graves por dobramento da retina (setas amarelas). V= vaso, O= disco óptico, R=retina, L=lente, Vit=vítreo,iO= disco óptico inflamado, iV= vaso inflamado, iR= retina inflamada, i= células infiltrantes no vítreo, RFs=dobras retinianas. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Imagens representativas de angiografia fluorescente tiradas usando o sistema de imagem Micron III no pico da doença. Camundongos C57BL/6J foram injetados por via subcutânea com fluoresceína a 2% e imagens tiradas em vários pontos de tempo após a circulação do traçador. (A) O CFA controla apenas o ratinho tomado aos 1,5 e 7 minutos após a administração de fluoresceína. (B) Imagens representativas de camundongos imunizados IRBP1-20 tomadas 1,5 e 7 minutos, respectivamente, após receberem fluoresceína. A seta branca indica vazamento do vaso. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Pontuação | Disco óptico | Vasos da Retina | Infiltrado do tecido da retina | Danos estruturais | ||||
| 1 | Inflamação mínima | 1-4 manguitos suaves | 1-4 lesões pequenas ou 1 lesão linear | Lesões retinianas ou atrofia retiniana envolvendo 1/4 a 3/4 da área da retina | ||||
| 2 | Inflamação leve | >4 manguitos leves ou 1-3 algemas moderadas | 5-10 lesões pequenas ou 2-3 lesões lineares | Atrofia pan-retiniana com múltiplas lesões pequenas (cicatrizes) ou <3 lesões lineares (cicatrizes) | ||||
| 3 | Inflamação moderada | >3 manguitos moderados | >10 lesões pequenas ou lesões lineares >3 | Atrofia pan-retiniana com lesões lineares >3 ou lesões confluentes (cicatrizes) | ||||
| 4 | Inflamação grave | >1 algemamento grave | Lesão linear confluente | Descolamento de retina com dobramento | ||||
| 5 | * Não visível (branco para fora ou desprendimento extremo) | * Não visível (branco para fora ou desprendimento extremo) | * Não visível (branco para fora ou desprendimento extremo) | * Não visível (branco para fora ou desprendimento extremo) | ||||
Tabela 1. Escala de pontuação clínica convencional para avaliar a gravidade da doença clínica do EAU. Tabela mostrando os critérios utilizados para avaliar a extensão da gravidade da doença em camundongos imunizados com IRBP1-20. Os escores foram alocados de acordo com as características descritas acima, sendo visíveis nas imagens do fundo de olho, cada olho recebeu uma pontuação total de vinte. * Devido ao obscurecimento do infiltrado e descolamento de retina dentro da câmara posterior não pode ser avaliado. Tabela adaptada com permissão de Xu H., et al., 20088.
| Grau | Critérios |
| 0 | Sem alterações |
| 0,5 (traço) | Infiltração celular inflamatória leve. Sem danos nos tecidos |
| 1 | Infiltração; dobras retinianas e descolamentos focais de retina; poucos granulomas pequenos na coroide e retina, perivasculite |
| 2 | Infiltração moderada; dobras retinianas, descolamentos e danos celulares fotorreceptores focais; granulomas de pequeno a médio porte, perivasculite e vasculite |
| 3 | Infiltração média a pesada; dobramento extenso da retina com descolamentos, dano celular fotorreceptor moderado; lesões granulomatosas de tamanho médio; neovascularização sub-retiniana |
Tabela 2. Pontuação histológica EAU
Tabela mostrando os critérios utilizados para avaliar a gravidade do UDE com base nas características histopatológicas da doença. Os escores foram alocados de acordo com as características descritas acima na coloração H & E, cada olho recebeu uma pontuação total de quatro. Tabela adaptada com permissão de Agarwal et al. 201311.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Modelos animais experimentais são ferramentas necessárias para o estudo da patogênese da doença e testes pré-clínicos de novos paradigmas terapêuticos. No protocolo atual, discutimos uma metodologia para induzir, monitorar e pontuar EAU, um modelo experimental de uveíte inflamatória intraocular. Esse modelo de EAU tem mais de 95% de incidência da doença quando todos os procedimentos são realizados de acordo com o protocolo aqui descrito, e resulta no desenvolvimento de EAU crônica e monofásica. Para atingir esse nível de incidência, ressaltamos a importância do preparo do antígeno e da injeção da emulsão, ambos detalhados acima. As principais características da UDE em animais são inflamação da retina e/ou coroidal, vasculite retiniana, destruição de fotorreceptores e perda de visão, que representam muitas características clínico-patológicas essenciais da uveíte posterior humana12. Grande parte da compreensão dos mecanismos celulares e moleculares básicos envolvidos na uveíte deriva do modelo EAU induzido, conforme descrito aqui. A EAU pode ser induzida em camundongos13 e ratos11 por imunização ativa com antígenos da retina reconhecidos pelos linfócitos. Estes antígenos da retina assumem muitas formas; IRBP (para camundongos) ou antígeno solúvel da retina (S-Ag) para ratos. A indução de EAU em um fundo C57BL/6J gera uma forma mais crônica da doença, com pico de patologia observado três semanas após a imunização. Em comparação, a aplicação do antígeno da retina a um fundo B10RIII14 induz uma forma aguda-monofásica e clinicamente grave de EAU, onde o pico de patologia geralmente se apresenta dentro de duas semanas após a indução e a doença diminui na semana 3.
Diferentes epítopos IRBP foram testados em camundongos C57BL/6J e o peptídeo IRBP1-20 provou ser um modelo reprodutível com alta incidência e níveis de gravidade. Recentemente, um novo epítopo uveitogênico de IRBP, resíduos de aminoácidos 651 a 670 de IRBP humano têm sido relatados para induzir EAU com maior incidência clínica e manifestação grave da doença11 e pode ser usado de preferência se isso atender aos objetivos científicos. Uma vez que o impacto da microbiota comensal intestinal e a ativação de receptores de células T auto-reativas (TCRs) são conhecidos por interferir no aparecimento da doença ao aplicar diferentes antígenos15, recomendamos que os iniciantes neste campo usem peptídeos hIRBP1-20 ou hIRBP651-670 em uma dose titulada entre 300-500 μg para alcançar um modelo confiável. De fato, a variabilidade nesse modelo foi documentada em outros lugares, com relatos destacando a importância das diferenças entre os sistemas habitacionais e o microbioma que podem afetar a gravidade e a incidência da doença15. Assim, mais ou menos antígeno peptídico e toxina pertussis podem ser necessários.
Há uma série de outros modelos para os quais nossa análise descrita pode ser realizada. Estes incluem uveíte espontânea que progride em camundongos transgênicos do receptor de células T IRBP (TCR) (R161H), onde a inflamação ocular se desenvolve por 5-6 semanas de idade16. A EAU também pode ser induzida de forma ativa pela transferência de células T efetoras uveitogênicas CD4+. Células CD4+T específicas para IRBP ativadas, derivadas de camundongos preparados, podem ser utilizadas como fonte de células efetoras 3,11. Este modelo representa a fase efetora da doença, evitando as complexidades do uso da AFC no modelo induzível.
Além disso, há muitas vantagens em usar modelos inflamatórios oculares como ferramentas apropriadas para investigar outras doenças inflamatórias, em particular, aquelas com patologia efetora dos subconjuntos Th1 e Th17. As principais vantagens do uso desse modelo são os métodos não invasivos e quantificáveis para monitorar o desenvolvimento e a progressão da doença, que são a fundoscopia e a angiografia. Esses sistemas de imagem não invasivos permitem fácil acesso a tecidos neuronais, que de outra forma estariam escondidos atrás de barreiras anatômicas protetoras. Métodos adicionais para monitorar a progressão da doença incluem a aplicação de imagens OCT, que são mais sensíveis do que a imagem fundoscópica na detecção de infiltrados celulares, especialmente no estágio inicial do início da EAU. A técnica permite visualizações transversais e horizontais de várias camadas da retina longitudinalmente e de forma não invasiva. In vivo A OCT acrescenta informações sobre a espessura da retina que não puderam ser obtidas por exames fundoscópicos e histológicos17. Cada vez mais, a disponibilidade de técnicas de imagem não invasivas ainda mais sofisticadas, como a oftalmoscopia a laser de varredura de óptica adaptativa e ferramentas de imagem multimodal, aumentará ainda mais nossa capacidade de investigar essa doença em pequenos roedores. Além disso, a capacidade de dissecar e isolar populações celulares residentes e infiltrantes para uma análise mais profunda dos imunofenótipos, usando técnicas como a citometria de fluxo, oferece grandes oportunidades para fornecer informações perspicazes.
Existem poucos sistemas de pontuação estabelecidos com base em critérios clínicos obtidos a partir da fundoscopia 8,9,18. Embora estes difiram ligeiramente entre os centros de pesquisa em oftalmologia, todos são confiáveis, correlacionam-se com características histopatológicas e são capazes de refletir com precisão a gravidade da doença. No presente estudo, referimo-nos ao sistema de pontuação desenvolvido por Xu et al.8. Este sistema oferece uma abordagem de avaliação mais detalhada com maior número de parâmetros de medição clínica. Compreende uma pontuação máxima de 20, que introduz uma janela mais ampla para a pontuação do que os sistemas alternativos limitados a um máximo de 5. Isso é mais importante para uma exploração mais aprofundada dentro de abordagens terapêuticas. Minimizar o erro do operador, no entanto, é fundamental ao usar um conjunto de parâmetros tão refinado e detalhado e pode exigir treinamento cuidadoso do operador e validação independente da interpretação.
Aqui, apresentamos um protocolo para induzir EAU em camundongos fêmeas C57BL/6, pois há um aumento da incidência de mulheres: homens 1,4:1 que apresentam uveíte no ambiente clínico. No entanto, o sexo dos camundongos utilizados para induzir doença autoimune deve ser considerado, pois isso pode afetar o meio citocina11, além de revelar diferenças importantes na forma como respondem à intervenção terapêutica. Outra consideração é a idade dos ratos na indução da doença. Por exemplo, estudamos a dependência etária da suscetibilidade em camundongos B10RIII e concluímos que camundongos com mais de 8 semanas de vida têm uma menor incidência de EAU (estudo não publicado do nosso grupo).
Em conclusão, modelos animais de doença intraocular forneceram uma ferramenta inestimável para estudar a uveíte posterior humana e facilitaram o desenvolvimento de novas terapias, como a CsA. No entanto, nenhum modelo animal por si só reproduz todo o espectro da uveíte humana, pois cada um tem características únicas que o tornam adequado para o estudo de aspectos particulares da doença. Este modelo EAU é induzido pela autoimunidade através da aplicação de peptídeo IRBP suplementado com adjuvantes que desencadeiam respostas imunes inatas. No entanto, não se sabe se todas as formas de uveíte posterior em humanos são autoimunes e se o mimetismo antigênico é um fator desencadeante. Além disso, não está claro se há uma associação com a infecção no desencadeamento da uveíte humana. No entanto, o modelo aqui descrito é um modelo genérico útil e reprodutível que pode ser usado para coletar informações úteis sobre etiologia, patogênese e terapia dessa doença que ameaça a visão.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não têm conflitos de interesse a declarar com este trabalho.
Acknowledgments
JG foi premiado com um financiamento UCL Impact Studentship e Rosetrees Trust para apoiar o CB. VC recebeu uma bolsa colaborativa de pesquisa da Akari Therapeutics Inc. Gostaríamos de agradecer ao Instituto de Oftalmologia da UCL, Unidade de Serviço Biológico, especialmente à Sra. Alison O'Hara e sua equipe por seu apoio técnico.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| antisedan | ZOETIS, USA | for waking up | |
| Complete Freund’s Adjuvant; CFA | Sigma, UK | F5881 | for immunisation |
| Domitor | Orion Pharma, Finland | for anesthesia | |
| Flourescein | Sigma, UK | F2456 | for Angiography |
| IRBP1-20 | Chamberidge peptide, UK | peptide;antigen | |
| Ketamine | Orion Pharma, Finland | for anesthesia | |
| Micron III | Phoenix Research, USA | for fundoscopy | |
| Mouse Serum | Sigma, UK | M5905 | for immunisation |
| Mycobacterium terberculosis | Sigma, UK | 344289 | for immunisation |
| Pertussis Toxin | Sigma, UK | P2980 | for immunisation |
| phenylephrine hydrochloride 2.5% | Bausch & Lomb UK | PHEN25 | for dilation |
| Tropicamide 1% | SANDOZ | for dilation | |
| Viscotears | WELDRICKS Pharmacy, UK | 2082642 | for eye lubrication |
References
- Lyu, C., et al. TMP778, a selective inhibitor of RORgammat, suppresses experimental autoimmune uveitis development, but affects both Th17 and Th1 cell populations. The European Journal of Immunology. 48, 1810-1816 (2018).
- Klaska, I. P., Forrester, J. V.
- Eskandarpour, M., Alexander, R., Adamson, P., Calder, V. L. Pharmacological Inhibition of Bromodomain Proteins Suppresses Retinal Inflammatory Disease and Downregulates Retinal Th17 Cells. The Journal of Immunology. 198, 1093-1103 (2017).
- Mochizuki, M., et al. Preclinical and clinical study of FK506 in uveitis. Current Eye Research. 11, Suppl 87-95 (1992).
- Nguyen, Q. D., et al. Intravitreal Sirolimus for the Treatment of Noninfectious Uveitis: Evolution through Preclinical and Clinical Studies. Ophthalmology. 125, 1984-1993 (2018).
- Leal, I., et al. Anti-TNF Drugs for Chronic Uveitis in Adults-A Systematic Review and Meta-Analysis of Randomized Controlled Trials. Frontiers in Medicine (Lausanne). 6, 104 (2019).
- Chen, Y. H., et al. Functionally distinct IFN-?+ IL-17A+ Th cells in experimental autoimmune uveitis: T-cell heterogeneity, migration, and steroid response. European Journal of Immunology. 50 (12), 1941-1951 (2020).
- Xu, H., et al. A clinical grading system for retinal inflammation in the chronic model of experimental autoimmune uveoretinitis using digital fundus images. Experimental Eye Research. 87, 319-326 (2008).
- Copland, D. A., et al. The clinical time-course of experimental autoimmune uveoretinitis using topical endoscopic fundal imaging with histologic and cellular infiltrate correlation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49, 5458-5465 (2008).
- Dick, A. D. Doyne lecture 2016: intraocular health and the many faces of inflammation. Eye (Lond). 31, 87-96 (2017).
- Agarwal, R. K., Silver, P. B., Caspi, R. R. Rodent models of experimental autoimmune uveitis. Methods in Molecular Biology. 900, 443-469 (2012).
- Caspi, R. R. A look at autoimmunity and inflammation in the eye. Journal of Clininical Investigation. 120, 3073-3083 (2010).
- Caspi, R. R., et al. Mouse models of experimental autoimmune uveitis. Ophthalmic Research. 40, 169-174 (2008).
- Shao, H., et al. Severe chronic experimental autoimmune uveitis (EAU) of the C57BL/6 mouse induced by adoptive transfer of IRBP1-20-specific T cells. Experimental Eye Research. 82, 323-331 (2006).
- Horai, R., et al. Microbiota-Dependent Activation of an Autoreactive T Cell Receptor Provokes Autoimmunity in an Immunologically Privileged Site. Immunity. 43, 343-353 (2015).
- Chen, J., et al. Comparative analysis of induced vs. spontaneous models of autoimmune uveitis targeting the interphotoreceptor retinoid binding protein. PLoS One. 8, 72161 (2013).
- Chen, J., Qian, H., Horai, R., Chan, C. C., Caspi, R. R. Use of optical coherence tomography and electroretinography to evaluate retinal pathology in a mouse model of autoimmune uveitis. PLoS One. 8, 63904 (2013).
- Harry, R., et al. Suppression of autoimmune retinal disease by lovastatin does not require Th2 cytokine induction. Journal of Immunology. 174, 2327-2335 (2005).
