Summary
Hier stellen wir ein detailliertes, schrittweises Protokoll für die CRISPR/Cas9-basierte Genom-Engineering von primären menschlichen B-Zellen für Gen Knockout (KO) und Knock-in (KI) zur Untersuchung der biologischen Funktionen von Genen in B-Zellen und der Entwicklung von B-Zell-Therapeutika zur Verfügung.
Abstract
B-Zellen sind Lymphozyten, die aus hämatopoetischen Stammzellen gewonnen werden und ein wichtiger Bestandteil des humoralen Arms des adaptiven Immunsystems sind. Sie machen attraktive Kandidaten für zellbasierte Therapien wegen ihrer einfachen Isolation von peripherem Blut, ihrer Fähigkeit, sich in vitro auszudehnen, und ihrer Langlebigkeit in vivo. Darüber hinaus kann ihre normale biologische Funktion – zur Produktion großer Mengen von Antikörpern – genutzt werden, um sehr große Mengen eines therapeutischen Proteins auszudrücken, wie z. B. einen rekombinanten Antikörper zur Bekämpfung von Infektionen oder ein Enzym zur Behandlung von Enzymopathien. Hier bieten wir detaillierte Methoden zur Isolierung primärer menschlicher B-Zellen aus peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) und zur Aktivierung/Erweiterung isolierter B-Zellen in vitro. Anschließend zeigen wir die Schritte zur Verwendung des CRISPR/Cas9-Systems für standortspezifische KO endogene Gene in B-Zellen. Diese Methode ermöglicht effizienteko verschiedener Gene, die verwendet werden können, um die biologischen Funktionen von Genen von Interesse zu studieren. Anschließend zeigen wir die Schritte zur Verwendung des CRISPR/Cas9-Systems zusammen mit einem rekombinanten, adeno-assoziierten, viralen (rAAV) Vektor für eine effiziente standortspezifische Integration einer transgenen Expressionskassette in B-Zellen. Zusammen bietet dieses Protokoll eine Schritt-für-Schritt-Engineering-Plattform, die in primären menschlichen B-Zellen verwendet werden kann, um biologische Funktionen von Genen sowie für die Entwicklung von B-Zell-Therapeutika zu untersuchen.
Introduction
B-Zellen sind eine Untergruppe der Lymphozytenlinie, die aus hämatopoetischen Stammzellen abgeleitet wird. Sie spielen eine entscheidende Rolle im adaptiven humoralen Immunsystem, indem sie große Mengen an Antikörpern als Reaktion auf Immunherausforderungen produzieren1. B-Zellen sind auch Vorläufer von Gedächtnis-B-Zellen und den endlos differenzierten, langlebigen Plasmazellen und bieten so eine dauerhafte humorale Immunität2. Insbesondere Plasmazellen sind einzigartig unter Immunzellen in ihrer Fähigkeit, große Mengen eines bestimmten Antikörpers zu produzieren, während sie über Jahre oder Jahrzehnte überleben3. Darüber hinaus macht die einfache Isolierung von peripherem Blut die B-Zell-Linie zu einem ausgezeichneten Kandidaten für neuartige zellbasierte Therapien4.
Bisher wurden zufällige Integrationsmethoden, wie z. B. mit lentiviralen Vektoren oder einem Sleeping Beauty-Transposon, verwendet, um B-Zellen für die Transgenabgabe und Expression5,6,7,8zu entwickeln. Die Unspezifische Natur dieser Ansätze erschwert jedoch die Untersuchung der biologischen Funktionen eines bestimmten Gens in den B-Zellen und birgt ein inhärentes Risiko einer Insertionsmutagenese und einer variablen Transgenexpression und/oder Silencing in der therapeutischen Umgebung.
Das CRISPR/Cas9-System ist ein leistungsfähiges Genom-Engineering-Tool, mit dem Forscher das Genom verschiedener Zellen in zahlreichen Arten präzise bearbeiten können. Kürzlich haben zwei Gruppen, darunter unsere eigene, erfolgreich Methoden zur Ex-vivo-Expansion und gezielte Genom-Engineering von primären menschlichen B-Zellen9,10entwickelt. Wir werden den Prozess der Reinigung primärer menschlicher B-Zellen aus einer Leukaphoreseprobe beschreiben. Danach beschreiben wir unser aktualisiertes Protokoll zur B-Zell-Erweiterung und Aktivierung isolierter B-Zellen. Wir beschreiben dann ein Verfahren zum Ausklopfen des Differenzierungsclusters 19 (CD19), eines spezifischen B-Zell-Rezeptors und eines Kennzeichens von B-Zellen, durch Elektroporation, um CRISPR/Cas9 mRNA zusammen mit CD19 sgRNA in aktivierte B-Zellen einzuführen.
Cas9 mRNA wird übersetzt und bindet an die CD19 sgRNA zu einem CRISPR/Cas9-sgRNA Ribonukleoprotein-Komplex (RNP). Anschließend führt sgRNA im Komplex Cas9 zu Doppelstrangbruch (DSB) an der Zielsequenz auf Exon 2 des Gens. Die Zellen reparieren das DSB durch "nicht-homologe Endverbindung" durch Die Einführung oder Löschung von Nukleotiden, was zu Frameshift-Mutationen führt und dazu führt, dass das Gen ausgeschlagen wird. Wir messen dann den Verlust von CD19 durch Strömungszytometrie und analysieren die Indelbildung, indem wir Indels durch Zersetzungsanalyse (TIDE) verfolgen.
Wir beschreiben dann den Prozess der Verwendung von CRISPR/Cas9 zusammen mit einem rekombinanten AAV6-Vektor (rAAV6, eine Spendervorlage für homologiegesteuerte Reparatur (HDR)), um die standortspezifische Einfügung von verbessertem grünem Fluoreszenzprotein(EGFP) an der adeno-assoziierten Virusintegrationsstelle 1 (AAVS1) zu vermitteln. Das AAVS1-Gen ist ein aktiver Ort ohne bekannte biologische Funktionen und eine AAV-Virusintegrationsstelle im menschlichen Genom; Daher gilt es als "sicherer Hafen" für die Genomtechnik. Hier berichten wir, dass die Erweiterung und Aktivierung von B-Zellen eine bis zu 44-fache Expansion in 7 Tagen Kultur ermöglichte (Abbildung 1). Die Elektroporation von B-Zellen zeigte eine leichte Reduktion der allgemeinen Zellgesundheit (Abbildung 2A) bei 24 h nach der Transfektion. Die Streudiagrammanalyse des CD19-Markers (Abbildung 2B) zeigte eine Reduktion der bearbeiteten Zellen um bis zu 83 % (Abbildung 2C).
Die TIDE-Analyse der Chromatographen (Abbildung 3A) ergab, dass die % indels dem % Proteinverlust durch Durchflusszytometrie ähnelten (Abbildung 3B). Die Durchflusszytometrie-Analyse des KI-Experiments zeigte, dass die Zellen, die den AAV-Vektor erhielten (Abbildung 4), zusammen mit RNP bis zu 64% EGFP-positive Zellen exprimierten (Abbildung 5A) und später eine erfolgreiche Integration durch Junction-Polymerase-Kettenreaktion (PCR) zeigten (Abbildung 5B). Die Anzahl der Zellen zeigte, dass sich alle Proben innerhalb von 3 Tagen nach dem Engineering schnell erholten (Abbildung 5C).
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Protocol
Leukapherese-Proben von gesunden Spendern wurden von einer lokalen Blutbank erhalten. Alle hier beschriebenen Experimente wurden vom Institutional Review Board (IRB) für die Forschung freigestellt und vom Institutional Biosafety Committee (IBC) der University of Minnesota genehmigt.
HINWEIS: Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit der universellen Vorsichtsmaßnahme für blutübertragene Krankheitserreger, mit sterilen/aseptischen Techniken und ordnungsgemäßen Geräten der Biosicherheitsstufe 2 durchgeführt.
1. Vorbereiten von Ergänzungen für B-Zell-Erweiterungsmedium
- CpG-Oligonukleotid auf eine Konzentration von 1 mg/ml rekonstituieren.
- CD40-Ligand (CD40L) auf eine Konzentration von 100 g/ml rekonstituieren.
- Rekonstituieren Sie rekombinantes humanes IL-10 (rhIL-10) auf eine Konzentration von 50 g/ml.
- Rekonstituieren Sie rekombinantes humanes IL-15 (rhIL-15) auf eine Konzentration von 10 g/ml.
HINWEIS: Bewahren Sie jeden Zuschlag in kleinen Aliquots bei -20 °C bis -80 °C für bis zu 6 Monate auf.
2. Vorbereiten von Basalmedium
- Kombinieren Sie B-Zell-Basalmedium mit 5% (v/v) Medienergänzung für in vitro Immunzellexpansion (z. B. CTS Immune Cell SR) und 1% (v/v) Penicillin und Streptomycin.
- Filtern Sie das Basalmedium mit einem 0,22 m Filteradapter in eine sterilisierte Flasche.
- Halten Sie das Basalmedium bis zu 1 Monat bei 4 °C.
3. Vorbereiten von B-Zell-Erweiterungsmedium
- Übertragen Sie die benötigte Menge des Basalmediums in einen sterilen Behälter, um die B-Zellen bei 5 × 105 Zellen/ml zu kultitoren.
- Ergänzen Sie das Basalmedium mit 1 g/ml CpG, 100 ng/mL CD40L, 50 ng/mL rhIL-10 und 10 ng/mL rhIL-15.
- Filtern Sie das B-Zell-Erweiterungsmedium mit einem 0,22-mm-Filter.
- Gleichgewichten Sie das B-Zell-Expansionsmedium im Gewebekultur-Inkubator bei 37 °C, 5%CO2 mit Feuchtigkeit für mindestens 30 min vor Gebrauch.
HINWEIS: Bereiten Sie frischeS B-Zell-Erweiterungsmedium für einen Tag vor. Bereiten Sie das B-Zell-Erweiterungsmedium nicht für mehrere Tage vor. Dieses Medienrezept fördert die Proliferation von Speicher-B-Zellen und aktivierten primären menschlichen B-Zellen.
4. Menschliche B-Zell-Reinigung und -Erweiterung
HINWEIS: Fügen Sie 99–100 % Isopropylalkohol nach Anweisung des Herstellers in einen temperaturgeregelten Gefrierbehälter ein, und kühlen Sie den Gefrierbehälter bei 4 °C, bevor Sie Schritt 4.1 starten.
- ISolieren von PBMCs aus einer Leukaphoreseprobe
- Eine Leukaphoreseprobe (ca. 8–10 ml) in ein steriles 50 ml konisches Rohr übertragen.
- Erhöhen Sie das Volumen auf 35 ml mit steriler 1x Phosphat-gepufferter Saline (PBS).
- Eine 35 ml Leukaphoreseprobe vorsichtig auf 15 ml Dichtegradientenmedium schichten.
- Zentrifuge bei 500 × g für 25 min ohne Bremse, entfernen Sie die Plasmaschicht, ohne die Buffy-Schicht (PBMC-Schicht) zu stören, sammeln Sie die PBMCs von der Schnittstelle und übertragen Sie auf ein neues steriles 50 ml konisches Rohr.
- Bringen Sie die PBMCs mit 1x PBS auf 50 ml hoch.
- Zentrifuge bei 500 × g für 5 min ohne Bremse. Entfernen Sie den Überstand, ohne das PBMC-Pellet zu stören, das rot erscheinen kann.
- 7 ml Ammonium-Chlorid-Kalium-Lyse-Puffer hinzufügen, Pipette 3 Mal gut mischen und bei Raumtemperatur (RT) 3 min inkubieren.
- Erhöhen Sie das Volumen auf 50 ml mit 1x PBS.
- Zentrifuge bei 400 × g für 5 min mit widerstandsarmer Bremse. Entfernen Sie den Überstand, ohne das Pellet zu stören. Das Pellet sollte rosa oder weiß aussehen.
HINWEIS: Um die frisch isolierten B-Zellen weiter zu kultivieren, bereiten Sie das B-Zell-Erweiterungsmedium vor, bevor Sie mit der B-Zell-Isolierung beginnen (Schritt 4.2).
- B-Zell-Isolierung von PBMCs mit humanen primären B-Zell-Negativ-Isolationskit
- PBMCs im Isolationspuffer auf eine Konzentration von 5 × 107 Zellen/ml aussetzen.
HINWEIS: Wenn die Gesamtzahl der PBMCs kleiner als 5 × 107 Zellen ist, skalieren Sie das Volumen des Isolationspuffers, um 5 × 107 Zellen/ml beizubehalten. Das Mindest- bzw. Höchstvolumen der Zellsuspension beträgt 0,25 ml bzw. 8 ml. - Bis zu 8 ml (5 × 107 Zellen/ml) in ein steriles, Polypropylen- und Rundbodenrohr mit Kappe geben.
- Fügen Sie den PBMCs 50 l/ml Cocktail Enhancer hinzu.
- Fügen Sie den PBMCs 50 l/ml Isolation Cocktail hinzu, verkappen Sie das Rohr und invertieren Sie 2–3 Mal, um sie zu mischen.
- Inkubieren bei RT für 5 min; in der4. Minute der Inkubation, Wirbel magnetische Mikroperlen für mindestens 30 s.
- Übertragen Sie 50 l magnetische Mikroperlen pro 1 ml PBMCs, kappen Sie das Rohr und invertieren Sie 2-3 Mal, um sie zu mischen.
- Auf- bis zu 10 ml mit Isolationspuffer auf- und sanft pipette auf und ab 2-3 mal auf- und abladen.
- Legen Sie das Rohr in eine Magnetstation und inkubieren Sie bei RT für 3 min.
- Halten Sie den Magneten und das Rohr zusammen und in einer Bewegung den Magneten und das Rohr zusammen, um die Zellsuspension in das neue Rohr zu gießen. Entsorgen Sie die alte Röhre.
- Wiederholen Sie Schritt 4.2.8 (reduzieren Sie die Inkubationszeit auf 2 min) und gießen Sie die B-Zellsuspension in ein sauberes konisches Rohr.
- Die angereicherten B-Zellen sind einsatzbereit. Wenn Zellen sofort verwendet werden, fahren Sie mit Abschnitt 4.3 (Menschliche B-Zell-Erweiterung) fort. Überprüfen Sie die Reinheit der isolierten B-Zellen durch Durchflusszytometrie (optional). Wenn Zellen vor der Verwendung eingefroren werden sollen, fahren Sie mit Schritt 4.2.12 fort.
- Um die B-Zellen einzufrieren, Zentrifuge bei 400 × g für 5 min, und entsorgen Sie den Überstand, ohne das Pellet zu stören.
- Setzen Sie die Zellen im Gefriermedium bei 107 Zellen/ml und aliquot 1 ml/kryovial aus.
- Den Kryovial in den gekühlten Gefrierbehälter geben und über Nacht bei -80 °C lagern; dann übertragen Sie die gefrorene kryovial in einen flüssigen Stickstofftank; gefroreneNZellen bis zu 1 Jahr aufbewahren.
HINWEIS: Die erwartete Ausbeute isolierter B-Zellen beträgt 2 % –8 % der gesamten PBMCs mit einer Lebensfähigkeit von 95 % bis 99 %.
- PBMCs im Isolationspuffer auf eine Konzentration von 5 × 107 Zellen/ml aussetzen.
- Menschliche B-Zell-Erweiterung
HINWEIS: Wenn Sie frisch isolierte B-Zellen verwenden, überspringen Sie die Schritte 4.3.1–4.3.5. Zählen Sie die Zellen und übertragen Sie die erforderliche Anzahl von Zellen in ein steriles konisches Rohr und fahren Sie mit Schritt 4.3.6 fort.- Vorwarmes fetales Rinderserum (FBS) in einem Wasserbad vor dem Auftauen der B-Zellen. 20 ml B-Zell-Expansionsmedium vorbereiten, vor Gebrauch mindestens 15 min in einen T25-Kolben übertragen und das Medium in einem Gewebekultur-Inkubator (bei 37 °C, 5%CO2, mit Feuchtigkeit) voraussetzen.
- B-Zellen in einem 37 °C-Wasserbad auftauen. Während des Wartens 2 ml vorgewärmter FBS in ein steriles 15 ml konisches Rohr übertragen.
- Nachdem die B-Zellen vollständig aufgetaut sind, fügen Sie sofort 1 ml vorgewärmtes FBS tropfenweise in die Probe ein. Bei RT für 1 min inkubieren.
- Sanfte Pipette, um die Probe wieder auszusetzen und das gesamte Volumen tropfenweise in ein konisches Rohr mit 2 ml vorgewärmtem FBS zu übertragen.
- Erhöhen Sie das Volumen auf 15 ml mit sterilem 1x PBS, Kappe, und invertieren Sie das Rohr vorsichtig 2-3 mal.
- Zentrifuge bei 400 × g für 5 min.
- Entsorgen Sie den Überstand, ohne das Zellpellet zu stören, setzen Sie das Zellpellet mit 1 ml vorädlibriertem B-Zell-Expansionsmedium wieder auf und zählen Sie die Zellen. Die Gesamtzellenzahl sollte etwa 107 Zellen betragen.
- Übertragen Sie die Zellen in einen Kolben, der 20 ml des vorädlibierten B-Zell-Ausdehnungsmediums enthält. Die Endkonzentration der Zellen sollte etwa 5 x 105 Zellen/ml betragen.
- Inkubieren Sie den Kolben vertikal in einem Gewebekultur-Inkubator.
- Erfrischen Sie das Expansionsmedium alle 2 Tage vollständig, indem Sie das gesamte Volumen der B-Zellen in ein steriles Konusrohr übertragen und die Schritte 4.3.6–4.3.9 wiederholen.
HINWEIS: T25-Kolben kann 10–20 ml Medium aufnehmen; Der T75-Kolben kann bis zu 20–60 ml Medium aufnehmen.
5. Primäres menschliches B-Zell-Engineering
- Engineer B-Zellen bei 48 ± 2 h nach Erweiterung/Aktivierung für optimale Ergebnisse. Bereiten Sie das B-Zell-Expansionsmedium, aliquot 1 ml des Mediums in eine 48-Well-Gewebekulturplatte vor und vor dem Einsetzen in einem Gewebekultur-Inkubator vor.
HINWEIS: Führen Sie beim Entwerfen einer CRISPR/Cas9 sgRNA für ein Gen von Interesse die unten beschriebenen Schritte aus.
- Entwerfen Sie sgRNAs mit einem Online-Tool11.
- Design sgRNAs auf einem Exon, das allen Isoformen des Proteins gemeinsam ist.
- Bestellen Sie chemisch modifizierte sgRNA von seriösen Unternehmen.
- sgRNA kommt in der Regel in lyophilisierter Form; rekonstituieren sgRNA im sterilen DNase/RNase-freien Tris-EDTA (TE)-Puffer bis zu einer Konzentration von 1 g/l. - Vorbereiten Sie das TRANSfizierungssubstrat CRISPR/Cas9, indem Sie 1 l (1 g/l) chemisch modifizierte sgRNA mit 1,5 l (1 g/l) chemisch modifizierten Streptococcus pyogenes Cas 9 (S.p. Cas9) Nuklease pro Transfektionsreaktion mischen. Verwenden Sie zur Steuerung 1 L TE-Puffer anstelle von sgRNA.
HINWEIS: Wenn CD19 sgRNA für ein Gen-KO-Experiment verwendet wird, siehe Abbildung 2 für Ergebnisse. Wenn AAVS1 sgRNA für ein Gen-KI-Experiment verwendet wird, siehe Abbildung 5 für Ergebnisse.- Halten Sie alle Komponenten auf Eis.
- Sanft mischen und 2,5 l CRISPR/Cas9 Transfecting Substrat pro Reaktion in ein Rohr eines 0,2 ml 8-Rohr-Streifens übertragen; bei RT beiseite gelegt werden.
- Schalten Sie einen Nukleofektor (Elektroporator) ein und bereiten Sie Transfektionsreagenzien wie in Tabelle 1dargestellt vor.
HINWEIS: Dies ist ein guter Schritt für eine Pause, falls erforderlich, indem alle Reagenzien auf Eis gelegt werden. Entfernen Sie alle Reagenzien vom Eis, wenn Sie bereit sind, das Experiment fortzusetzen. Bei der Verwendung von S.p. Cas9-Protein MUSS der Prüfer den vorkomplexen CRISPR/Cas9-sgRNA-Ribonucleoprotein durch Mischen von 1 g sgRNA mit 5 g S.p. Cas9-Protein, Vermeidung von Blasen und Inkubation der Mischung bei RT für mindestens 20 min vor dem Einsatz für optimale Ergebnisse. - Zählen und übertragen Sie 106 B Zellen pro Transfektionsreaktion in ein steriles konisches Rohr.
- Erhöhen Sie das Volumen auf 15 ml mit sterilem 1x PBS und Zentrifuge bei 400 × g für 5 min. Während des Wartens das primäre Zelltransfektionsreagenz (Tabelle 2) vorbereiten und bei RT beiseite stellen.
- Entsorgen Sie den Überstand, ohne das Zellpellet zu stören.
- Das Zellpellet mit 10 ml sterilem 1x PBS und Zentrifuge bei 400 × g für 5 min wieder aufsetzen.
- Entsorgen Sie den Überstand vollständig, ohne das Zellpellet zu stören.
- Übertragen Sie 0,5 g chemisch modifizierte GFP mRNA (als Transfektionsreporter) pro 106 B Zellen auf das Zellpellet (optional).
- Das Zellpellet mit einem Primärzelltransfektionsreagenz von 20 L pro 106 B-Zellen wieder aufsetzen; 5-6-mal sanft mischen. Übertragen Sie 20,5 l l pro Transfektionsreaktion in das 0,2 ml-Rohr des 8-Rohr-Streifens, der 2,5 l des CRISPR/Cas9-Transfektionssubstrats enthält.
- Einmal nach oben und unten pfeifen, um das gesamte Volumen (23 l) zu mischen und in eine Transfektionsküvette zu übertragen. Kappen und tippen Sie vorsichtig auf die Küvette auf der Bank, um sicherzustellen, dass die Flüssigkeit den Boden der Küvette bedeckt.
- Verwenden Sie menschliches primäres B-Zell-Protokoll auf dem Nukleofektor für die Transfektion.
HINWEIS: Der Nukleofektor (Elektroporator) kann platziert und außerhalb der Gewebekulturhaube verwendet werden. Kappen Sie die Küvette, um Sterilität zu gewährleisten. - Die elektropolierten Zellen in der Küvette bei RT 15 min ruhen.
- Übertragen Sie 80 l des vorädierten B-Zell-Expansionsmediums von der Gewebekulturplatte in die Transfektionsreaktion in der Küvette. Die Küvette 30 min im Inkubator der Gewebekultur unterbringen.
- Ein paar Mal sanft Pipette mischen und das gesamte Volumen der Probe von der Küvette in einen geeigneten Brunnen einer 48-Well-Gewebekulturplatte mit 1 ml des B-Zell-Expansionsmediums übertragen. Die Endkonzentration der Zellen sollte 106 Zellen/ml betragen.
- Wenn Sie ein Gen-KI-Experiment durchführen, übertragen Sie den rAAV6-Vektor bei 500.000 Infektionsvielfalt in den entsprechenden Brunnen, der elektroporated Zellen enthält (ca. 45 min nach der Elektroporation). Siehe Beispiel rAAV6 Vektorkonstrukt in Abbildung 4A.
HINWEIS: Zum Beispiel: Ein Steuermuster wird ohne CRISPR/Cas9 oder den rAAV6-Vektor elektropoiert. Eine reine Vektorprobe wird ohne CRISPR/Cas9 elektropoiert und dann mit dem rAAV6-Vektor transduziert. Eine KI-Probe wird mit CRISPR/Cas9 elektropoiert und dann mit dem rAAV6-Vektor transduziert. rAAV6 muss Homologiearme nach oben und unterhalb des Ziel-DSB-Standorts für HDR enthalten. - Legen Sie die Platte in einen Gewebekultur-Inkubator bei 37 °C und 5%CO2 mit Feuchtigkeit.
- Zählen Sie die Zellen und zeichnen Sie die Lebensfähigkeit am tag 1 nach dem Engineering auf.
- Erfrischen Sie das B-Zell-Expansionsmedium alle 2 Tage, indem Sie die Zellen zählen und dann das gesamte Volumen der Zellen in ein sauberes 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr übertragen. Zentrifugieren Sie bei 400 × g für 5 min, und entsorgen Sie den Überstand, ohne das Pellet zu stören. Setzen Sie die Zellen mit 100 l frischem B-Zell-Expansionsmedium aus und übertragen Sie sie auf einen Brunnen einer 24-Well-Gewebekulturplatte. Bringen Sie das mittlere Volumen auf, um eine endgültige Zellkonzentration bei 5 × 105 Zellen/ml zu erreichen.
HINWEIS: Eine 48-Well-Platte kann bis zu 1 ml Medium/Well aufnehmen; eine 24-Well-Platte kann bis zu 2 ml Mittel/Gut aufnehmen; eine 12-Well-Platte kann bis zu 4 ml Mittel/Well aufnehmen, und eine 6-Well-Platte kann bis zu 8 ml Medium/Well aufnehmen. - Erlauben Sie den entwickelten Zellen, sich für mindestens 5 Tage zu erweitern, bevor Sie nachgelagerte Analysen durchführen, z. B. für die Analyse der Durchflusszytometrie, die TIDE-Analyse und die Anschluss-PCR.
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Representative Results
Das aktualisierte Erweiterungs- und Aktivierungsprotokoll ermöglichte eine schnelle Expansion von B-Zellen bis zum 44-fachen in 7 Tagen(Abbildung 1; n =3 Spender). Im KO-Experiment zeigte die B-Zellzahl mit Trypan-Blaufärbung mehr als 80% lebensfähige Zellen mit einer leichten Reduktion der Zellrückgewinnung sowohl bei der Kontrolle als auch bei den CD19 KO-Proben bei 24 h Nachelektroporation(Abbildung 2A;p ≥ 0,05, n = 3 Spender). Dieses Ergebnis zeigt, dass die Elektroporation die allgemeine B-Zell-Gesundheit leicht beeinträchtigt. B-Zellen wurden am Tag 5 nach der Transfektion für Strömungszytometrie und TIDE-Analysen gesammelt. Repräsentative Streudiagramme der Kontroll- und KO-Probe zeigten 14% bzw. 95% CD19-negative Zellen (Abbildung 2B). Die Quantifizierung der Strömungsdiagramme zeigte eine signifikante Verringerung der CD19-Expression in den KO-Proben im Vergleich zur Kontrolle(Abbildung 2B;p ≤ 0,0001, n = 3 Spender). Chromatogramme der genomischen Sequenzierung (siehe Primersequenzen in Tabelle 3) zeigten doppelte Spitzen in den CD19 KO B-Zellen, was auf Einfügungen/Deletionen von Nukleotiden nach CRISPR/Cas9-vermitteltem DSB hindeutet, während bei der Kontrolle einzelne Spitzen beobachtet wurden, was darauf hindeutet, dass in dieser Stichprobe kein DSB aufgetreten ist (Abbildung 3A). Die Indel-Analyse der Chromatographen (mit Hilfe eines kostenlosen Online-TIDE-Analysetools) der KO-Proben zeigte einen hohen % der Indelbildung (>90%) am CD19-Lokus, der mit % CD19-Proteinverlust übereinstimmt, der durch Durchflusszytometrie nachgewiesen wird (Abbildung 3B; p ≥ 0,05, n = 3 Spender). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass CRISPR/Cas9 effizient eine CD19 KO in B-Zellen erzeugt hat. B-Zellen aus dem KI-Experiment wurden am Tag 12 nach dem Engineering für Durchflusszytometrie und Junction PCR-Analysen gesammelt (Tabelle 4). Streudiagramme zeigten 64 % der EGFP-positiven Zellen in der Stichprobe, die den rAAV6-Vektor erhielten (Abbildung 4) zusammen mit RNP, während bei der Kontrolle keine EGFP-positive Zelle beobachtet wurde; In der Stichprobe, die nur einen AAV-Vektor erhielt, wurde eine minimale EGFP-Positivität beobachtet (Abbildung 5A). Eine Knoten-PCR-Verstärkung (siehe Primersequenzen in Tabelle 3) zeigte 1,5 Kbit/s-Amplicons in der KI-Probe (Abbildung 5B), während weder in der Kontroll- noch in der Randstichprobe ein PCR-Produkt beobachtet wurde. Die Zellanzahl zeigte, dass der technische Prozess die Zellwiederherstellung in der KI-Probe stärker beeinflusst als die Kontroll- oder die reinen Vektorproben(Abbildung 5B). Alle Proben erholten sich jedoch innerhalb von 3 Tagen nach dem Engineering schnell (Abbildung 5B). Zusammen zeigen diese Ergebnisse, dass eine erfolgreiche Integration von EGFP in den AAVS1-Standort zu einer stabilen Expression von EGFP mindestens 12 Tage nach der Entwicklung führt.
Abbildung 1: B-Zellexpansion in vitro. B-Zellen wurden an Tag 0 (Null) mit einer Dichte von 5 × 105 pro ml mit 1 × 106 Zellen gesät und in 7 Tagen um das 44-fache erweitert (n=3 unabhängige Spender). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2A: Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2B: Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2C: CRISPR/Cas9-vermittelter CD19-Knockout (KO) in B-Zellen. (A) Balkendiagramm zeigt >70% Zellwiederherstellung (linkes Panel) und >80% Lebensfähigkeit (rechtes Panel) von Zellen nach der Transfektion wurden sowohl in der Kontrolle als auch in den CD19 KO-Proben bei 24 Stunden nach der Elektroporation beobachtet. (B) Repräsentative Durchflussdiagramme von CD19-Gating von lebenden Zellen zeigen 84,3% bzw. 3,43% CD19-positive Zellen in der Kontrollprobe bzw. der CD19 KO-Probe. (C) Die Balkengrafik zeigt eine signifikante Verringerung von CD19 in der CRISPR/Cas9-vermittelten CD19 KO-Gruppe (p ≤ 0,0001). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3A: Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3B: CD19-Proteinverlust vs. Indelbildung. (A) Chromatogramme zeigen Sequenzierungsspitzen des Kontroll- und CD19-Knockout-Beispiels (KO). Das graue Feld auf den Kontrollspitzen hebt die Zielsequenz von CD19 gRNA mit der vorhergesagten Schnittstelle hervor, die durch einen Pfeil angezeigt wird. CD19 KO zeigte "doppelte Spitzen" Sequenzierung um die vorhergesagte Schnittstelle, was auf das Einfügen/Löschen von Nukleotiden nach dem doppelsträngigen Bruch hindeutet. (B) Balkendiagramm mit konsistenten Ergebnissen zwischen % CD19-Proteinverlust und % Indelbildung am CD19-Lokus (p ≥ 0,05). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: rAAV6 AAVS1 MND-GFP Vektorkonstrukt. Die Expressionskassette enthält eine starke Sequenz des synthetischen Promotors (MND), unmittelbar gefolgt von einer verbesserten Kodierungssequenz (Green Fluorescence Protein( EGFP) und einer Polyadenylierungssequenz (Poly A). AAVS1 Homologiearme flankieren vor dem MND-Promotor und flussabwärts der Poly-A-Sequenzen. Das EGFP wird gemäß der Verordnung des MND-Projektträgers zum Ausdruck kommen. Sequenzlängen werden über jeder Komponente des Konstrukts angegeben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5A: Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5B: Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5C: CRISPR/Cas9- und rAAV6-vermittelte standortspezifische Integration der EGFP-Reporterkassette in B-Zellen am Tag 12 nach dem Engineering. (A) Repräsentatives Strömungsdiagramm zeigt keine EGFP-positiven B-Zellen in der Kontroll- oder Vektorprobe im Vergleich zu 64,4 % der EGFP-positiven B-Zellen aus der Knockin-Probe (KI). (B) Die Knotenpolymerase-Kettenreaktion der KI-Probe zeigt das vorhergesagte 1,5-Kbit/s-Band; In der Kontroll- oder Vektorprobe wurde kein Band gefunden. Wasser wurde verwendet, um keine Kontamination während des PCR-Prozesses zu gewährleisten. (C) Das Balkendiagramm zeigt das Zellwachstum der Steuerung, der reinen Vektor- und EGFP-KI-Proben über einen Zeitraum von 3 Tagen nach dem Engineering. Gebrochene Linie zeigt die 1 × 106 Zelleneingang an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Namen | gRNA-Sequenz |
| CD19 | 5'-GCTGTGCTGCAGTGCCTCAA-3' |
| AAVS1 | 5'-GTCACCAATCCTGTCCCTAG-3' |
Tabelle 1: gRNA-Sequenzen.
| Reagenzien | Volumen pro 1 Reaktion |
| P3 Primärzellenlösung | 16,4 ml |
| Beilage 1 | 3,6 ml |
| gesamt | 20 ml |
Tabelle 2: Herstellung der Nucleofection-Reagenzmischung.
| Beschreibung | Sequenz | Zweck |
| CD19 Vorwärtsprimer | 5'-AAATTCAGGAAAGGGTTGGAAG-3' | Verstärken Sie den CD19-Lokus für die Indel-Analyse |
| CD19 Reverse Primer | 5'-GCGGACCTCTCTGTCCATG-3' | Verstärken Sie den CD19-Lokus für die Indel-Analyse |
| Junction PCR Vorwärtsgrundierung | 5'-GGACGAGCTGTACAAGTAACG-3' | Junction PCR |
| Junction PCR Reverse Primer | 5'-GAGACAGTGACCAACCATCC-3 | Junction PCR |
Tabelle 3: Verwendete Grundierungen.
| Beschreibung | Fluorophor | Klon |
| Anti-human CD19 | PerCP | HIB19 |
| Viability Dye | eFlour 780 | - |
Tabelle 4: Durchflusszytometrie-Antikörper und Lebensfähigkeitsfarbstoff.
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Discussion
Präzise Genom-Engineering in primären menschlichen B-Zellen war bis vor kurzem eine Herausforderung9,10. Wir hatten zuvor Protokolle veröffentlicht, die CRISPR/Cas9 verwenden, um primäre menschliche B-Zellen9zu entwickeln. Hier skizzieren wir verbesserte Protokolle für B-Zell-Isolation, -Erweiterung und -Engineering, um eine effiziente KO von CD19 oder einKnock-in EGFPzu ermöglichen.
Hier zeigen wir, dass unser Erweiterungsprotokoll die schnelle Expansion von B-Zellen in Kultur für eine bis zu 44-fache Expansion in 7 Tagen ermöglicht (Abbildung 1). Dieses Protokoll zeigte eine schnellere Expansionsrate als die von Johnson et al.9 und Hung et al. 10 berichteten.10 Die entscheidenden Schritte, um eine gesunde und schnelle Expansion der primären B-Zellen zu gewährleisten, füllen das Medium alle zwei Tage mit frischen Aktivierungsfaktoren auf und stellen sicher, dass die Anzahl der gesamten B-Zellen in der Kultur 2 × 106 Zellen/ml nicht überschreitet.
Wir stellten außerdem fest, dass unser verbessertes Protokoll zur Transfizierung des CRISPR/Cas9-Systems für CD19 KO zu einer hohen CD19-KO-Effizienz führte (Abbildung 2 und Abbildung 3). Ähnlich wie in einer früheren Studie9beobachteten wir eine leichte Verringerung der Zellrückgewinnung und Lebensfähigkeit nach der Elektroporation bei 24 h. Dies deutet darauf hin, dass die Elektroporation die allgemeine Zellgesundheit von primären B-Zellen beeinflusst; Die Zellen erholen sich jedoch innerhalb von 48 h (Daten werden nicht angezeigt).
Der Vorteil dieses Elektroporatorprotokolls besteht darin, dass wir Proben mit einer viel schnelleren Rate (16 Reaktionen in weniger als 1 min) elektropoieren können, während frühere Protokolle9,10 etwa 10–12 min für 16 Reaktionen einnehmen. Darüber hinaus eliminiert dieses Transfektionssystem den potentiellen Lichtbogen des Elektroporators, der in früherenStudien9,10beobachtet wurde. Darüber hinaus kann diese Engineering-Methode für eine größere Anzahl von B-Zellen mit größeren, kommerziell erhältlichen Küvetten (Daten nicht dargestellt) skaliert werden.
Einige wichtige Schritte zur Gewährleistung einer optimalen Gesamtzellengesundheit und KO-Effizienz: Stellen Sie zunächst sicher, dass das B-Zell-Erweiterungsmedium vor Gebrauch für mindestens 15 min vorbereitet und vorausgeglichen wird. Zweitens sollte das Gesamtvolumen des Transfektionssubstrats 20 % (v/v) des Nukleofektionsreagenznichters nicht überschreiten. Drittens müssen die Zellen für 48 ± 2 h erweitert/aktiviert werden, um optimale Ergebnisse zu erzielen. Tippen Sie zunächst auf die Elektroporationsküvette, bevor Sie sie in den Elektroporator legen, um sicherzustellen, dass die Transfektionsreaktionslösung den Boden der Küvette abdeckt. Fünftens, achten Sie darauf, die elektroporated Zellen in der Küvette für nur 15 min bei RT ruhen; Zellen nach zu langer Elektroporation im Nukleofektionsreagenz zu verlassen, kann das Gesamtüberleben der Zelle beeinträchtigen. Sechstens, achten Sie darauf, die Zellen mit Medien in der Küvette für nicht länger als 30 min zu inkubieren. Siebtens, die Platzierung von 106 elektropoierten Zellen in 1 ml für die ersten 48 h neigt dazu, Zellen schneller zu erholen, als sie mit geringerer Dichte zu kultivieren (Daten nicht gezeigt). Schließlich führt die Verwendung von Cas9 mRNA oder Cas9-Protein zu ähnlichen Editing-Effizienzen (Daten werden nicht angezeigt); Jedoch haben wir Cas9 mRNA für Bequemlichkeit und Kosten verwendet.
Zwei Hauptprobleme bei der Verwendung von CRISPR/Cas9 sind Off-Target-Effekte und chromosomale Translokationen. Off-Target-Effekte, die durch nicht übereinstimmende Basenpaare von sgRNA zur Zielsequenz verursacht werden, führen zu zahlreichen möglichen Bindungsstellen im Genom und erzeugen mehrere, unerwünschte Gen-KOs. Daher sollte die vorhergesagte Wertausbeute außerhalb des Ziels zusammen mit dem Zielwert berücksichtigt werden, um dieses Problem zu minimieren. Chromosomale Translokation kann durch Off-Target-Effekte oder beim Auskundigen mehrerer Gene auftreten. Dies kann zu katastrophalen Ereignissen experimentell und klinisch führen. Basiseditoren 12 verändern ein einzelnes Nukleotid (zwei Klassen: Cytosin-Basiseditor und Adenin-Basiseditor), um das Spleißelement zu stören, ein vorzeitiges Stop-Codon zu erzeugen oder eine Punktmutation zu erzeugen, was zum Zielgen KO ohne DSB führt (an anderer Stelle ausführlich rezensiert12). Somit kann der Basis-Editing-Ansatz für Ein- oder Mehrgen-KOs verwendet werden, um chromosomale Translokationen zu umgehen.
Wir zeigen auch, dass CRISPR/Cas9 zusammen mit rAAV6 verwendet werden kann, um standortspezifisches KI und den Ausdruck von EGFP am AAVS1-Standort effizient zu vermitteln. Wir beobachteten EGFP-Expression für mindestens 12 Tage post-engineering. Wir beobachteten auch zwei EGFP-positive Populationen: eine Hoch- und eine Zwischen-EGFP-Expression in der KI-Probe am Tag 12 (Abbildung 5A), während die reine Vektorprobe einen minimalen Prozentsatz von Zellen mit mittlerer EGFP-Expression zeigte. Wir spekulieren, dass dieses Phänomen der "hohen und mittleren Populationen" auf die biallelic Integration des Vektors zurückzuführen ist. Zur Bestätigung dieser Hypothese können weitere Untersuchungen mit Spann-PCR13 der Zwischen- und Hoch-EGFP-Zellen durchgeführt werden. Zwei Vorbehalte bei der Verwendung von AAV als Vektor: Erstens haben AAV-Vektoren eine geringe Ladekapazität von bis zu 4,7 Kilobasen, was Probleme beim Einschlagen eines großen Gens verursacht. Die Verkleinerung der Homologiearme ermöglicht die Unterbringung eines größeren Gens, was wiederum die KI-Effizienz verringert (Daten werden nicht angezeigt). Alternativ kann die gleichzeitige oder sequenzielle Integration mehrerer Gen-Ladevektoren verwendet werden14,15. Studien haben eine Immunantwort und eine Clearance von AAV-transduced Zellen in immunkompetenten Tiermodellen16,17berichtet. Alternativ kann eine nicht-virale Spender-HDR-Vorlage untersucht werden, um dieses Problem zu umgehen.
Zusammenfassend haben wir umfassende, schrittweise Prozesse der Isolierung, Expansion und Engineering von B-Zellen gezeigt, die zu hohen Effizienzen bei der Genmodifikation geführt haben. Diese Engineering-Methode kann für das Gen KO verwendet werden und die Funktionen von Genen in B-Zellen untersuchen. Darüber hinaus kann diese Methode verwendet werden, um B-Zellen zu entwickeln, um einen rekombinanten Antikörper auszudrücken, um Infektionen zu bekämpfen. Schließlich kann diese Methode angewendet werden, um B-Zellen zu entwickeln, um therapeutische Enzyme auszudrücken und zu sezernieren, die als autologe zellbasierte Therapie zur Behandlung von Enzymopathien verwendet werden können.
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Disclosures
Es wurde ein Patent über die Methoden der Herstellung und Verwendung genombearbeiteter B-Zellen mit M.J.J,K.L. und B.S.M als Erfinder eingereicht. B.S.M ist Berater für immusoft Inc. Immusoft Inc. Immusoft Inc. hat Forschung im Labor von B.S.M gesponsert.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde vom Children es Cancer Research Fund (CCRF) und NIH R01 AI146009 an B.S.M finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3 protein, 500 ug | IDT | 1081059 | smaller size is also available |
| Amaxa P3 primary cell 4D- Nucleofector X Kit S (32 RCT) | Lonza | V4XP-3032 | |
| Ammonium-chloride-potassium (ACK) lysing buffer | Quality Biological | 118-156-101 | |
| CleanCap chemically modified Cas9 mRNA | Trilink Biotechnology | L-7206-1000 | |
| CpG ODN 2006 (ODN 7909) 5 mg | Invivogen | TLRL-2006-5 | different sizes available |
| Cryostor CS10, 100 mL | STEMCELL Technology | 7930 | |
| CTS Immune Cell SR | Thermo Fisher Scientific | A2596101 | |
| EasySep human B cells isolation kit | STEMCELL Technology | 17954 | |
| eBioscience fixable viability dye eFlour 780 | eBiosciences | 65-0865-14 | |
| Excellerate B cell media, Xeno-free | R&D Systems | CCM031 | B-cell basal medium |
| Falcon 14 mL Polypropylene Round-bottom Tube | Corning | 352059 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | R&D Systems | S11550 | For thawing B cells only |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-03 | |
| GeneMate SnapStrip® 8-Strip 0.2 mL PCR Tubes with Individual Attached Dome Caps | BioExpress | T-3035-1 / 490003-692 | |
| Hyclone 0.0067M PBS (No Ca, No Mg) or 1x PBS | GE lifesciences | SH30256.01 | |
| Lonza 4D Nucleofector core unit | Lonza | AAF-1002B | |
| Lonza 4D Nucleofector X unit | Lonza | AAF-1002X | |
| Mega CD40 Ligand | Enzo Life Sciences | ALX-522-110-C010 | |
| Mr. Frosty | Sigma-Aldrich | C1562-1EA | For freezing cells |
| Pen/Strep 100X | Sigma-Aldrich | TMS-AB2-C | |
| PerCP anti-human CD19 clone HIB19 | biolegend | 302228 | smaller size is also available |
| rAAV6 SA-GFP pakaging ( with our SA-GFP cassette see Figure 4.) | Vigene Biosciences | N/A | large scale packaging, 1e13 GC/mL, 500 mL |
| Recombinant human IL-10 protein 250 ug | R&D Systems | 217-IL-250 | different sizes available |
| Recombinant human IL-15 protein 25 ug | R&D Systems | 247-ILB-025 | different sizes available |
| The Big Easy EasySep Magnet | STEMCELL Technology | 18001 | different sizes available |
| Tris-EDTA (TE) buffer | Fisher Scientific | BP2476100 |
References
- LeBien, T. W., Thomas, T. F. B lymphocytes: how they develop and function. Blood. 112 (5), 1570-1580 (2008).
- Nutt, S. L., Hodgkin, P. D., Tarlinton, D. M., Corcoran, L. M. The generation of antibody-secreting plasma cells. Nature Reviews Immunology. 15, 160-171 (2015).
- Slifka, M. K., Antia, R., Whitmire, J. K., Ahmed, R. Humoral immunity due to long-lived plasma cells. Immunity. 8 (3), 363-372 (1998).
- Spriggs, M. K., et al. Recombinant human CD40 ligand stimulates B cell proliferation and immunoglobulin E secretion. Journal of Experimental Medicines. 176 (6), 1543-1550 (1992).
- Fusil, F., et al. A lentiviral vector allowing physiologically regulated membrane-anchored and secreted antibody expression depending on B-cell maturation status. Molecular Therapy. 23 (11), 1734-1747 (2015).
- Luo, X. M., et al. Engineering human hematopoietic stem/progenitor cells to produce a broadly neutralizing anti-HIV antibody after in vitro maturation to human B lymphocytes. Blood. 113 (7), 1422-1431 (2008).
- Mock, U., Thiele, R., Uhde, A., Fehse, B., Horn, S. Efficient lentiviral transduction and transgene expression in primary human B cells. Human Gene Therapy Methods. 23 (6), 408-415 (2012).
- Heltemes-Harris, L. M., et al. Sleeping Beauty transposon screen identifies signaling modules that cooperate with STAT5 activation to induce B-cell acute lymphoblastic leukemia. Oncogene. 35 (26), 3454-3464 (2016).
- Johnson, M. J., Laoharawee, K., Lahr, W. S., Webber, B. R., Moriarity, B. S. Engineering of primary human B cells with CRISPR/Cas9 targeted nuclease. Scientific Reports. 8, 12144 (2018).
- Hung, K. L., et al. Engineering protein-secreting plasma cells by homology-directed repair in primary human B cells. Molecular Therapy. 26 (2), 456-467 (2018).
- Cui, Y., Xu, J., Cheng, M., Liao, X., Peng, S. Review of CRISPR/Cas9 sgRNA design tools. Interdisciplinary Sciences. 10 (2), 455-465 (2018).
- Rees, H. A., Liu, D. R. Base editing: precision chemistry on the genome and transcriptome of living cells. Nature Reviews Genetics. 19 (12), 770-788 (2018).
- Spiegel, A., Bachmann, M., Jurado Jiménez, G., Sarov, M. CRISPR/Cas9-based knockout pipeline for reverse genetics in mammalian cell culture. Methods. 164-165, 49-58 (2019).
- Suzuki, T., Kazuki, Y., Oshimura, M., Hara, T. A novel system for simultaneous or sequential integration of multiple gene-loading vectors into a defined site of a human artificial chromosome. PLoS One. 9, 110404 (2014).
- Bak, R. O., Porteus, M. H. CRISPR-mediated integration of large gene cassettes using AAV donor vectors. Cell Reports. 20 (3), 750-756 (2017).
- Shirley, J. L., de Jong, Y. P., Terhorst, C., Herzog, R. W. Immune responses to viral gene therapy vectors. Molecular Therapy. 28 (3), 709-722 (2020).
- Martino, A. T., Markusic, D. M. Immune response mechanisms against AAV vectors in animal models. Molecular Therapy - Methods and Clinical Development. 17, 198-208 (2020).
