Summary
여기서 우리는 B 세포에서 유전자의 생물학적 기능을 연구하고 B 세포 치료제의 개발을 연구하기 위해 유전자 녹아웃 (KO) 및 노크 인 (KI)에 대한 1 차 인간 B 세포의 CRISPR / Cas9 기반 게놈 공학을위한 상세한 단계별 프로토콜을 제공합니다.
Abstract
B 세포는 조혈 줄기 세포에서 파생된 림프구이며 적응성 면역 계통의 유머 팔의 핵심 성분입니다. 그(것)들은 말초 혈액에서 고립의 그들의 용이성 때문에 세포 기지를 둔 치료를 위한 매력적인 후보자, 시험관에서 확장하는 그들의 기능 및 생체 내의 그들의 장수 때문에. 또한, 그들의 정상적인 생물학적 기능-많은 양의 항체를 생산 하는-감염 을 싸우는 재조합 항체 와 같은 치료 단백질의 매우 많은 금액을 표현 하기 위해 활용 될 수 있다, 또는 효소 의 치료를 위한 효소. 여기서, 우리는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)에서 1 차인간 B 세포를 격리하고 시험관 내에서 고립된 B 세포를 활성화/확장하는 상세한 방법을 제공합니다. 그런 다음 B 세포에서 내인성 유전자의 사이트 별 KO를 위해 CRISPR/Cas9 시스템을 사용하는 데 관련된 단계를 시연합니다. 이 방법은 관심있는 유전자의 생물학적 기능을 연구하는 데 사용할 수있는 다양한 유전자의 효율적인 KO를 허용합니다. 그런 다음 CrispR/Cas9 시스템을 B 세포에서 트랜스진 발현 카세트의 효율적인 현장 별 통합을 위한 재조합, 아데노 관련, 바이러스(rAAV) 벡터와 함께 사용하는 단계를 시연합니다. 이 프로토콜은 유전자의 생물학적 기능뿐만 아니라 B 세포 치료제의 개발을 연구하기 위해 1 차 인간 B 세포에서 사용할 수 있는 단계별 엔지니어링 플랫폼을 제공합니다.
Introduction
B 세포는 조혈 줄기 세포로부터 유래된 림프구 계보의 하위 그룹이다. 그(것)들은 면역 도전1에응하여 항체의 다량을 생성하여 적응성 유머 면역 계통에 있는 중요한 역할을 능력을 발휘합니다. B세포는 또한 기억 B 세포의 전구체이며 말단 분화되고 수명이 긴 혈장 세포로, 지속적인 유머 면역2를제공한다. 플라즈마 세포, 특히, 년 또는 수십 년 동안 생존하는 동안 특정 항체의 다량을 생산하는 능력에 면역 세포 중 고유3. 또한, 말초 혈액으로부터의 분리의 용이성은 B 세포 혈통을 새로운 세포 기반 치료에 대한 우수한 후보로 만든다4.
이전에는 렌티바이러스 벡터 또는 슬리핑 뷰티 트랜스포슨을 사용하는 것과 같은 임의의 통합 방법이 트랜스진 전달 및 발현5,6,7,8을위해 B 세포를 설계하는 데 사용되었습니다. 그러나, 이들 접근법의 비특이적 특성은 B 세포에서 특정 유전자의 생물학적 기능을 연구하기가 어렵게 만들고 치료 환경에서 삽입 돌연변이 발생 및 가변 적인 유전자 발현 및/또는 침묵의 본질적인 위험을 수반한다.
CRISPR/Cas9 시스템은 연구원이 수많은 종의 다양한 세포의 게놈을 정확하게 편집할 수 있는 강력한 게놈 엔지니어링 도구입니다. 최근에는 우리 자신을 포함한 두 그룹이 1차 인간 B 세포의 전 생체 확장 및 표적 게놈 공학을 위한 방법을 성공적으로 개발하였다9,10. 우리는 백혈구 샘플에서 1 차적인 인간 B 세포를 정화하는 과정을 설명할 것입니다. 그 후, 우리는 B 세포 확장 및 격리 된 B 세포의 활성화를위한 업데이트 된 프로토콜을 설명 합니다. 그런 다음 CD19 sgRNA와 함께 CRISPR/Cas9 mRNA를 활성화된 B 세포로 도입하기 위해 전기화에 의한 특정 B 세포 수용체 및 B 세포의 특징인 분화 19(CD19)의 클러스터를 노크하는 과정을 설명할 것입니다.
Cas9 mRNA는 변환되고 CRISPR/Cas9-sgRNA 리보뉴클레오단백질 복합체(RNP)를 형성하기 위해 CD19 sgRNA에 결합한다. 이어서, 복합체내의 sgRNA는 Cas9를 이끌고 유전자의 엑슨 2에 대한 표적 서열에서 이중 가닥 브레이크(DSB)를 생성한다. 세포는 뉴클레오티드를 도입하거나 삭제하여 "비 동종 종결합"에 의해 DSB를 복구하여 프레임 시프트 돌연변이로 이어지고 유전자가 기절하게 합니다. 그런 다음 유동 세포측정에 의한 CD19의 손실을 측정하고 분해(TIDE) 분석을 통해 인델 형성을 추적하여 인델 형성을 분석합니다.
그런 다음 CRISPR/Cas9를 재조합 AAV6 벡터(rAAV6, 상동성 지향 수리(HDR)를 위한 기증자 템플릿)을 사용하여 아데노 관련 바이러스 통합 사이트 1(AAVS1) 유전자에서 향상된 녹색형광단백질(EGFP)의 사이트별 삽입을 중재하는 과정을 설명합니다. AAVS1 유전자는 알려진 생물학적 기능 없이 활성 궤적이고 인간 게놈에 AAV 바이러스 통합 부위; 따라서 게놈 공학을 위한 "안전한 항구"로 간주됩니다. 여기서, B 세포의 팽창 및 활성화는 배양7일에서 최대 44배의 확장을 허용했다는 것을보고합니다(그림 1). B 세포의 전기기화는 24시간 후 형질전환에서 전체 세포건강(도 2A)의경미한 감소를 보였다. CD19마커(도 2B)의분산 플롯 분석은 편집된 셀(도2C)에서최대 83% 감소하는 것으로 나타났다.
크로마토그래프(도3A)의조류 분석은 %인델이 혈류 세포측정(도3B)에의한 %의 단백질 손실과 유사하다는 것을 밝혔다. KI 실험의 유동 세포 분석분석은 RNP와 함께 AAV벡터(도 4)를받은 세포가 최대 64% EGFP 양성 세포(도5A)까지표현되고 나중에 접합 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)(도5B)에의해 성공적인 통합을 표시한 것으로 나타났다. 셀 카운트는 모든 샘플이 엔지니어링 후 3일 이내에 신속하게 회수된 것으로나타났습니다(그림 5C).
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Protocol
건강한 기증자로부터 류카페레시스 샘플을 현지 혈액 은행에서 수득하였다. 여기에 설명된 모든 실험은 기관 검토 위원회 (IRB)에 의해 연구를 면제하기로 결정하고 미네소타 대학의 기관 생물 안전위원회 (IBC)에 의해 승인되었습니다.
참고: 모든 실험은 멸균/무균 기술과 적절한 생물안전 수준-2 장비로 혈중 병원체에 대한 보편적인 예방 조치에 따라 수행되었습니다.
1. B 세포 확장 매체에 대한 보충제 를 준비
- CpG 올리고뉴클레오티드를 1 mg/mL의 농도로 재구성합니다.
- CD40 리간드(CD40L)를 100 μg/mL의 농도로 재구성합니다.
- 재구성 인간 IL-10 (rhIL-10) 50 μg/mL의 농도.
- 재조합 인간 IL-15(rhIL-15)를 10 μg/mL의 농도로 재구성한다.
참고: 각 보충제를 -20°C ~ -80°C에서 최대 6개월 동안 작은 알리쿼트에 보관하십시오.
2. 기저 매질 준비
- B 세포 기저 배지를 체외 면역 세포 확장(예를 들어, CTS 면역 세포 SR) 및 1% (v/v) 페니실린 및 연쇄상 구균신을 위한 배지 보충제를 결합합니다.
- 0.22 μm 필터 어댑터를 사용하여 기저 배지를 살균 된 병에 필터 로 살균합니다.
- 기초 매체를 최대 1개월 동안 4°C로 유지합니다.
3. B 셀 팽창 매체 준비
- 5 × 105 세포/mL에서 B 세포를 배양하기 위해 기저 배지의 필요한 양을 멸균 용기로 이송한다.
- 1 μg/mL CpG, 100 ng/mL CD40L, 50 ng/mL rhIL-10, 및 10 ng/mL rhIL-15로 기저 배지를 보충합니다.
- 0.22 μm 필터를 사용하여 B 셀 팽창 매체를 필터링합니다.
- 37°C에서 조직 배양 인큐베이터에서 B 세포 팽창 배지를 평형화하고, 5%CO2를 사용 전에 최소 30분 동안 습도를 갖는다.
참고: 신선한 B셀 팽창 매체를 준비하여 하루 동안 사용할 수 있습니다. 며칠 동안 사용할 B 셀 팽창 매체를 준비하지 마십시오. 이 미디어 레시피는 메모리 B 세포의 증식과 1차 인간 B 세포의 활성을 장려합니다.
4. 인간 B 세포 정화 및 확장
참고: 제조업체의 지시에 따라 온도 조절 냉동 용기에 99-100% 이소프로필 알코올을 추가하고 4.1단계를 시작하기 전에 4°C에서 냉동 용기를 식힙니다.
- 백혈구 샘플에서 PBMC를 분리
- 백혈병 시료(약 8-10mL)를 멸균 50mL 원추형 튜브로 옮는다.
- 멸균 1x 인산염 완충식식염(PBS)으로 35mL로 볼륨을 키우십시오.
- 밀도 그라데이션 배지의 15mL에 35mL 백혈병 샘플을 조심스럽게 층.
- 500× g에서 25분 동안 브레이크없이 원심분리기, 버피 코트(PBMC 층)를 방해하지 않고 플라즈마 층을 제거하고, 인터페이스에서 PBMC를 수집하고, 새로운 멸균 50mL 원문 튜브로 이송한다.
- PBMC를 50mL로 1배 PBS로 키우세요.
- 500 × g의 원심분리기는 브레이크 없이 5분 동안. 빨간색으로 나타날 수 있는 PBMC 펠릿을 방해하지 않고 상체를 제거합니다.
- 7mL의 암모늄 염화물 칼륨 용해 버퍼, 파이펫3번을 넣고 잘 섞어 주며, 실온(RT)에서 3분 동안 배양합니다.
- 1배 PBS로 50mL로 볼륨을 올래세요.
- 400 × g의 원심분리기는 5분 동안 저저항 브레이크를 장착합니다. 펠릿을 방해하지 않고 상체를 제거합니다. 펠릿은 분홍빛이 도는 또는 흰색으로 보일 것입니다.
참고: 새로 분리된 B 세포를 계속 배양하려면 B 세포 분리(Step 4.2)를 시작하기 전에 B 세포 팽창 매체를 준비한다.
- 인간 1차 B세포 음성 격리 키트를 사용하여 PBMC로부터의 B세포 절연
- 격리 버퍼에서 PBMC를 5× 107 셀/mL의 농도로 재연한다.
참고: 총 PBMC 수가 5× 107셀 미만인 경우 격리 버퍼의 부피를 축소하여 5× 10 7셀/mL을 유지합니다. 셀 서스펜션의 최소 및 최대 볼륨은 각각 0.25 mL 및 8 mL입니다. - 최대 8mL(5 × 10 7셀/mL)을 캡이 있는 멸균, 폴리프로필렌, 라운드 하단 튜브로 옮길 수 있습니다.
- 50 μL/mL의 칵테일 인핸서를 PBMC에 추가합니다.
- 50 μL/mL의 격리 칵테일을 PBMC에 추가하고 튜브를 캡하고 혼합하려면 2-3번 반전합니다.
- 5 분 RT에서 인큐베이션; 인큐베이션의 4분에서, 적어도 30 s에 대한 소용돌이 자기 마이크로 비드.
- PBMC 1mL당 자기 마이크로비드 50μL을 옮기고 튜브를 캡하고 혼합하려면 2-3회 반전합니다.
- 격리 버퍼로 최대 10mL를 위로 하고 2~3회 위아래로 부드럽게 파이펫을 올로 합니다.
- 튜브를 자기 스테이션에 놓고 RT에서 3 분 동안 배양하십시오.
- 자석과 튜브를 함께 잡고 한 번의 동작으로 자석과 튜브를 함께 반전하여 세포 현탁액을 새로운 튜브에 붓습니다. 오래된 튜브를 폐기합니다.
- 4.2.8을 반복하고(잠복기 시간을 2분으로 줄이면) B세포 현탁액을 깨끗한 원문 튜브에 붓습니다.
- 농축된 B 셀은 사용할 준비가 되어 있습니다. 세포가 즉시 사용되는 경우 4.3(인간 B 세포 확장)을 계속합니다. 유동 세포측정(선택 사항)에 의해 격리된 B 세포의 순도를 확인합니다. 사용 전에 세포를 동결해야 하는 경우 4.2.12 단계를 계속합니다.
- B 세포를 동결하려면 원심분리기가 400 g에서 5분 동안 ×, 펠릿을 방해하지 않고 상퍼탄을 폐기한다.
- 107 세포/mL에서 동결 배지에서 세포를 다시 중단하고, 알리쿼트 1 mL/극저온.
- 냉장 냉동 용기에 냉동 을 놓고 하룻밤 -80 °C에 보관하십시오. 이어서, 냉동 극저온을 액체 질소 탱크로 이송; 냉동 셀을 최대 1년까지 유지합니다.
참고: 격리된 B 셀의 예상 수율은 총 PBMC의 2%-8%이며, 95%-99%의 생존율이 있습니다.
- 격리 버퍼에서 PBMC를 5× 107 셀/mL의 농도로 재연한다.
- 인간 B 세포 확장
참고: 새로 분리된 B 셀을 사용하는 경우 4.3.1-4.3.5 단계를 건너뜁니다. 세포를 계산하고 필요한 수의 세포를 멸균 원문 튜브로 옮기고 4.3.6 단계로 계속합니다.- B 세포를 해동하기 전에 수조에서 전따뜻한 태아 소 혈청 (FBS). B세포 팽창 배지 20mL를 준비하고, T25 플라스크로 이송하고, 조직 배양 인큐베이터(37°C, 5%CO2,습도)에서 배지를 미리 평형화하여 사용하기 최소 15분 전에 준비한다.
- 37°C 수조에서 B 세포를 해동합니다. 기다리는 동안, 멸균 15 mL 원문 튜브로 미리 따뜻워진 FBS의 2mL를 전송합니다.
- B 세포가 완전히 해동된 후 즉시 1mL의 미리 따뜻하게 된 FBS를 샘플에 드롭 와이즈로 추가합니다. 1 분 동안 RT에서 인큐베이션.
- 부드럽게 파이펫을 사용하여 시료를 다시 중단하고 전체 부피를 드롭와이즈로, 미리 데워진 FBS 2mL가 들어있는 원적 튜브로 옮킨다.
- 멸균 1x PBS, 캡으로 15mL로 볼륨을 가져와 튜브를 부드럽게 2-3번 반전시면 됩니다.
- 원심분리기 400 × g에서 5분 동안.
- 셀 펠릿을 방해하지 않고 상체를 버리고, 미리 평형된 B 세포 팽창 배지의 1mL로 세포 펠릿을 재보설하고, 세포를 계산한다. 총 세포 수는 약 107개의 세포여야 합니다.
- 미리 평형된 B-셀 팽창 배지의 20mL를 포함하는 플라스크로 세포를 전송한다. 세포의 최종 농도는 약 5 x 105 세포/mL이어야 한다.
- 플라스크를 조직 배양 인큐베이터에서 수직으로 배양합니다.
- B 세포의 전체 부피를 멸균 원성 튜브로 이송하고 4.3.6-4.3.9 단계를 반복하여 2일마다 확장 배지를 완전히 새로 고칩니다.
참고: T25 플라스크는 10~20mL의 매체를 보유할 수 있습니다. T75 플라스크는 최대 20-60mL의 매체를 보유할 수 있습니다.
5. 1차 인간 B 세포 공학
- 최적의 결과를 위해 확장/활성화 후 48 ± 2h의 엔지니어 B 셀. B세포 팽창 배지, 알리쿼트 1mL의 배지를 48웰 조직 배양 판으로 준비하고, 사용하기 최소 15분 전에 조직 배양 인큐베이터에서 미리 평형화한다.
참고: 관심 유전자에 대한 CRISPR/Cas9 sgRNA를 설계할 때 아래에 설명된 단계를 따르십시오.
- 온라인 도구(11)를사용하여 sgRNAs를 설계합니다.
- 단백질의 모든 동소 형태에 공통적인 엑폰에 sgRNA를 디자인합니다.
- 평판 좋은 회사에서 화학적으로 변형 된 sgRNA를 주문합니다.
- sgRNA는 일반적으로 lyophilized 형태로 온다; 멸균 DNase/RNase-free Tris-EDTA(TE) 버퍼에서 sgRNA를 1 μg/μL의 농도로 재구성합니다. - 화학적으로 변형된 연쇄상 구균 표진 Cas 9(S.p. Cas9) 핵을 트랜스페션 반응당 1.5 μL(1 μg/μL)로 화학적으로 변형한 sgRNA의 1μL(1 μg/μL)을 혼합하여 CRISPR/Cas9 횡단 기판을 준비한다. 제어를 위해 sgRNA 대신 TE 버퍼 1μL을 사용합니다.
참고: CD19 sgRNA유전자 KO 실험에 사용되는 경우, 결과에 대한 그림 2를 참조하십시오. AAVS1 sgRNA가 유전자 KI 실험에 사용되는 경우, 결과에 대한 그림 5를 참조하십시오.- 모든 구성 요소를 얼음 위에 보관하십시오.
- 부드럽게 혼합하고 0.2 mL 8 튜브 스트립의 튜브로 반응 당 기판을 변형 CRISPR / Cas9의 2.5 μL을 전송; RT에 따로 설정합니다.
- 핵포펙터(electroporator)를 켜고 표 1에도시된 바와 같이 형질 전환 시약을 준비한다.
참고: 필요한 경우 모든 시약을 얼음에 올려 놓음으로써 일시 중지를 위한 좋은 단계입니다. 실험을 다시 시작할 준비가 되면 모든 시약을 얼음에서 제거합니다. S.p. Cas9 단백질을 사용하는 경우, 조사관은 S.p. Cas9 단백질의 5 μg와 1 μg sgRNA를 혼합하여, 거품을 피하고, 최적의 결과를 사용하기 전에 RT에서 혼합물을 배양하여 사전 복합적인 CRISPR/Cas9-sgRNA 리보뉴클레오프로틴을 사용해야 합니다. - 수축 반응당 106B 세포를 멸균 원문 튜브로 카운트 및 이송한다.
- 멸균 1x PBS로 15mL로 볼륨을, 원심분리기는 400 × g에서 5분 동안 드물다. 기다리는 동안 1차 세포 형질 전환 시약을 준비하고(표 2)RT에 따로 둡니다.
- 셀 펠릿을 방해하지 않고 상체를 버리십시오.
- 멸균 10mL의 멸균 1x PBS및 원심분리기의 10mL로 세포 펠릿을 400 g에서 5분 동안 ×.
- 셀 펠릿을 방해하지 않고 상체를 완전히 버리십시오.
- 106B 세포당 화학적으로 변형된 GFP mRNA(transfection 리포터로서)의 0.5 μg를 세포 펠릿(선택 사항)으로 이송한다.
- 106 B 세포 당 20 μL 1 차 세포 형질 전환 시약으로 세포 펠릿을 다시 일시 중단; 5-6회 파이프팅으로 부드럽게 섞으세요. CRISPR/Cas9 경질 기판의 2.5 μL을 포함하는 8튜브 스트립의 0.2 mL 튜브로 경질 반응당 20.5 μL을 전송한다.
- 파이펫을 한 번 위아래로 위아래로 사용하여 전체 부피(23 μL)를 배분 큐벳으로 혼합하고 전송합니다. 뚜껑을 덮고 벤치에 있는 큐벳을 가볍게 눌러 액체가 큐벳 바닥을 덮도록 합니다.
- 형질 전환에 대한 핵혈에 인간 1 차 B 세포 프로토콜을 사용합니다.
참고: 핵포펙터(electroporator)를 배치하고 조직 배양 후드 외부에 사용할 수 있다. 큐벳을 캡하여 멸균을 보장합니다. - 15 분 동안 RT에서 큐벳에 전기 폴레이션 된 세포를 휴식.
- 조직 배양 판에서 구형 B세포 팽창 배지의 80 μL을 큐벳내의 형질 반응으로 옮기다. 조직 배양 인큐베이터에 큐벳을 30분 동안 배치합니다.
- 큐벳으로부터 샘플의 전체 부피를 혼합하여 B-세포 팽창 배지의 1mL를 포함하는 48웰 조직 배양 플레이트의 적절한 우물로 몇 번 부드럽게 파이펫을 한다. 세포의 최종 농도는 106 세포/mL이어야 한다.
- 유전자 KI 실험을 수행하는 경우, 500,000개의 복합감염에서 rAAV6 벡터를 전기화 세포를 적절히 함유하는 적절한 우물으로 이송(약 45분 전극 후 전자기분). 도 4A에서예제 rAAV6 벡터 구문 어를 참조하십시오.
참고: 예를 들어, 제어 샘플은 CRISPR/Cas9 또는 rAAV6 벡터 없이 전기포게됩니다. 벡터 전용 샘플은 CRISPR/Cas9 없이 전극된 다음 rAAV6 벡터로 변환됩니다. KI 샘플은 CRISPR/Cas9로 전포된 다음 rAAV6 벡터로 변환됩니다. rAAV6에는 HDR용 대상 DSB 사이트의 상류 및 하류에 동생병 이 포함되어야 합니다. - 플레이트를 37°C, 습도가 5%CO2에 조직 배양 인큐베이터에 놓습니다.
- 셀을 계산하고 1 일째 에 생존력을 기록합니다.
- 세포를 계산한 다음 세포의 전체 부피를 깨끗한 1.5 mL 미세 원심 분리튜브로 이송하여 2 일마다 B 세포 팽창 배지를 새로 고칩니다. 원심분리기 는 400 × g에서 5 분 동안, 펠릿을 방해하지 않고 상퍼를 폐기하십시오. 신선한 B 세포 팽창 배지의 100 μL로 세포를 다시 중단하고 24웰 조직 배양 판의 우물로 옮김합니다. 5 × 105 세포/mL에서 최종 세포 농도를 달성하기 위해 중간 부피를 키우십시오.
참고 : 48 웰 플레이트는 최대 1 mL 중간 / 우물을 보유 할 수 있습니다; 24웰 플레이트는 최대 2mL 중간/웰을 보유할 수 있습니다. 12웰 플레이트는 최대 4mL 중간/웰을 보유할 수 있으며, 6웰 플레이트는 최대 8mL 중간/웰을 보유할 수 있습니다. - 유동 세포 분석, TIDE 분석 및 접합 PCR과 같은 다운스트림 분석을 수행하기 전에 엔지니어링 된 셀을 최소 5 일 동안 확장할 수 있습니다.
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Representative Results
업데이트된 확장 및 활성화 프로토콜은 7일 만에 최대 44배까지 B 셀의 급속한 확장을 가능하게하였다(그림 1;n=3 기증자). KO 실험에서, Trypan 블루 염색을 이용한 B 세포 수는 24시간 전기포화에서 대조군 과 CD19 KO 샘플 모두에서 세포 회수가 약간 감소하는 80% 이상의 실행 가능한 세포를보였다(도 2A;p ≥ 0.05, n=3 기증자). 이 결과는 전기기분해가 전반적인 B 세포 건강에 약간 영향을 미쳤다는 것을 나타냅니다. B 세포는 유동 세포측정 및 TIDE 분석을 위해 5일째 에 배혈 후 를 수집하였다. 대조군 및 KO 샘플의 대표적인 분산 플롯은 각각 14% 및 95% CD19-음수 세포를나타냈다(도 2B). 유동 플롯의 양은 대조군(도2B;p ≤ 0.0001, n=3 기증자)에 비해 KO 샘플에서 CD19 발현이 현저한 감소를 보였다. 게놈 시퀀싱의 크로마토그램(표 3의프라이머 서열 참조)은 CD19 KO B 세포에서 이중 피크를 보였으며, 이는 CRISPR/Cas9 매개 DSB 이후 뉴클레오티드의 삽입/삭제를 나타내는 반면, 단일 피크는 대조군에서 관찰된 반면, 이샘플(그림 3A)에서DSB가 발생하지 않는다는 것을 나타낸다. KO 샘플의 크로마토그래프(무료 온라인 TIDE 분석 도구 사용)의 인델 분석은 인델 형성(>90%)의 높은%를 나타냈다. CD19 궤적에서, 이는 유동 세포측정에 의해 검출된 % CD19 단백질 손실과 일치한다(도3B;p ≥ 0.05, n =3 기증자). 이러한 결과는 CRISPR/Cas9가 B 셀에서 CD19 KO를 효율적으로 생성했음을 나타냅니다. KI 실험으로부터의 B 세포는 유동 세포측정및 접합 PCR분석(표 4)을위한 12일째 엔지니어링 후 수집되었다. 분산 플롯은 RAAV6벡터(도 4)를RNP와 함께 수신한 샘플에서 EGFP 양성 세포의 64%를 보였지만, EGFP 양성 세포는 대조군에서 관찰되지 않았다. 최소 EGFP 양성도는 AAV 벡터만 수신한 샘플에서 관찰되었다(도5A). 접합 PCR 증폭(표 3의프라이머 서열 참조)은 KI 샘플(도5B)에서1.5Kbps 앰프를 보였지만, 제어 또는 벡터 전용 샘플에서 PCR 생성물이 관찰되지 않았다. 세포 수는 엔지니어링 과정이 제어 또는 벡터 전용샘플(도 5B)보다KI 샘플의 세포 회수에 더 많은 영향을 미치는 것으로 나타났다. 그러나 모든 샘플은엔지니어링(그림 5B)이끝난 후 3일 이내에 빠르게 반등했습니다. 이러한 결과는 AAVS1 궤적에서 EGFP를 성공적으로 통합하면 엔지니어링 후 최소 12일 이상 EGFP의 안정적인 발현이 이어진다는 것을 나타냅니다.
그림 1: 시험관 내의B 셀 팽창. B세포는 0일째 106세포1×0(0)에서 5× 105의 밀도로 종자하고 7일(n=3 독립적인 기증자)에서 44배 를 확장하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2A: 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2B: 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2C: CRISPR/Cas9 매개 CD19 녹아웃 (KO) B 셀. (A)바 그래프는 전세포 후 의 세포 회수(좌판)와 >80%의 생존력(오른쪽 패널)을 24시간 후 전기기에서 대조군 및 CD19 KO 샘플 모두에서 관찰하였다. (B)살아있는 세포의 CD19 게이팅의 대표적인 유동 플롯은 대조군 샘플 및 CD19 KO 샘플에서 각각 84.3% 및 3.43%의 CD19 양성 세포를 나타낸다. (C)바 그래프는 CRISPR/Cas9 매개 CD19 KO 그룹(p ≤ 0.0001)에서 CD19를 현저감한 감소를 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3A: 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3B: CD19 단백질 손실 대 인델 형성. (A)크로마토그램은 대조군 및 CD19 녹아웃(KO) 샘플의 시퀀싱 피크를 묘사한다. 컨트롤 피크의 회색 상자는 화살표로 표시된 예측 된 절단 부위와 CD19 gRNA의 대상 시퀀스를 강조 표시합니다. CD19 KO는 예측된 절단 부위 주위의 "이중 피크"를 시퀀싱하여 이중 좌초 후 뉴클레오티드의 삽입/삭제를 나타낸다. (B)CD19 궤적(p ≥ 0.05)에서 % CD19 단백질 손실과 %의 인델 형성 사이의 일관된 결과를 나타내는 바 그래프. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4: rAAV6 AAVS1 MND-GFP 벡터 구조. 발현 카세트는 강력한 합성 프로모터(MND) 서열을 포함하고 있으며, 그 다음에는 향상된 녹색 형광 단백질(EGFP) 코딩 서열 및 폴리 아데닐레이션(Poly A) 서열이 뒤따릅니다. AAVS1 호모로지 암은 국방부 프로모터의 상류와 폴리 A 시퀀스의 하류를 측면으로 합니다. EGFP는 국방부 프로모터의 규정에 따라 표현될 것입니다. 시퀀스 길이는 구문의 각 구성 요소 위에 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5A: 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5B: 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5C: CRISPR/Cas9- 및 rAAV6 매개 사이트 별 통합에 대한 EGFP 기자 카세트는 12일째에 B 셀에서 12일 후 엔지니어링. (A)대표적인 흐름 플롯은 녹핀(KI) 샘플로부터 EGFP 양성 B 세포의 64.4%에 비해 대조군 또는 벡터 전용 샘플에서 EGFP 양성 B 세포를 나타내지 않는다. (B)KI 샘플의 정션 폴리머라제 연쇄 반응은 예측된 1.5Kbps 대역을 나타낸다; 컨트롤 또는 벡터 전용 샘플에서 대역이 발견되지 않았습니다. 물은 PCR 공정 중에 오염을 방지하기 위해 사용되었습니다. (C)바 그래프는 엔지니어링 후 3일 동안 제어, 벡터 전용 및 EGFP-KI 샘플의 세포 성장을 나타낸다. 깨진 선은 1 × 106 셀 입력을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 이름 | gRNA 서열 |
| CD19 | 5'-GCTGTGCTGCAGTCTCAA-3' |
| AAVS1 | 5'-GTCACCAATCCTCCTTAG-3' |
표 1: gRNA 서열.
| 시약 | 반응 1회당 볼륨 |
| P3 기본 셀 솔루션 | 16.4 mL |
| 보충 1 | 3.6 mL |
| 합계 | 20mL |
표 2: 핵성 시약 혼합의 준비.
| 묘사 | 순서 | 목적 |
| CD19 포워드 프라이머 | 5'-AAATTCAGAAGGTGGAG-3' | 인델 분석을 위한 CD19 궤적 증폭 |
| CD19 역프라이머 | 5'-GCGGACCTCTCTCTCCATG-3' | 인델 분석을 위한 CD19 궤적 증폭 |
| 정션 PCR 포워드 프라이머 | 5'-GGACGAGCTGTGTAAAAAAAAAACG-3' | 정션 PCR |
| 정션 PCR 역 프라이머 | 5'-가가카그타카카아치타카-3 | 정션 PCR |
표 3: 프라이머사용.
| 묘사 | 플루오로포레 | 클론 |
| 반인간 CD19 | 퍼CP | HIB19 |
| 생존염료 | eFlour 780 | - |
표 4: 유동 세포측정 항체 및 생존성 염료.
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Discussion
1차 인간 B 세포에 있는 정확한 게놈 공학은 최근9,10까지도전적이고 있습니다. 우리는 이전에 CRISPR / Cas9를 사용하여 기본 인간 B 세포9을설계하는 프로토콜을 발표했습니다. 여기서는 CD19의 효율적인 KO 또는 노크인 EGFP를 위해 B-셀 격리, 확장 및 엔지니어링을 위한 향상된 프로토콜을 간략하게 설명합니다.
여기서 우리는 우리의 확장 프로토콜이 7 일(그림 1)에서최대 44 배 의 확장에 대한 배양B 세포의 급속한 확장을 허용한다는 것을 보여줍니다. 이 프로토콜은 Johnson 외9 및 Hung 외. 10에 의해 보고된 것보다 더 빠른 확장 속도를 보여주었습니다 ×.
또한 CD19 KO용 CRISPR/Cas9 시스템을 변형시키는 향상된 프로토콜이 CD19 KO효율(그림 2 및 그림 3)을높게 생성한 것으로 나타났습니다. 이전 연구9와유사하게, 우리는 24h에서 세포 회복 및 생존 후 전기화에 있는 약간 감소를 관찰했습니다. 이것은 전기기공이 1 차 B 세포의 전반적인 세포 건강에 영향을 미친다는 것을 나타냅니다; 그러나 셀은 결국 48 h (데이터가 표시되지 않음) 내에서 반등합니다.
이 전기포레이터 프로토콜을 사용하는 이점은 훨씬 더 빠른 속도(1분 미만의 반응 16개)로 샘플을 전기포전할 수 있는반면,이전 프로토콜9,10은 16개의 반응에 대해 약 10-12분 정도 걸릴 수 있다는 것입니다. 또한, 이러한 경화 시스템은 이전 연구에서 관찰된 전기포레이터의 잠재적 전기 아크를제거9,10. 또한, 이 엔지니어링 방법은 더 크고 시판되는 큐벳(데이터가 표시되지 않음)을 사용하여 더 많은 수의 B 셀에 대해 확장될 수 있다.
최적의 전반적인 세포 건강과 KO 효율성을 보장하기 위한 몇 가지 중요한 단계: 첫째, B-셀 확장 배지가 사용하기 전에 최소 15분 동안 준비되고 미리 평가되도록 하십시오. 둘째, 경질 기판의 총 부피는 핵시약의 20%(v/v)를 초과해서는 안 된다. 셋째, 최적의 결과를 얻으려면 셀을 48 ± 2h에 대해 확장/활성화해야 합니다. 넷째, 전기포레이터에 넣기 전에 전기기공큐벳을 부드럽게 탭하여 경질 반응 용액이 큐벳의 바닥을 덮도록 합니다. 다섯째, RT에서 만 15 분 동안 큐벳에서 전기 폴레이션 된 세포를 쉬게해야합니다. 너무 오래 전기 기화 후 핵 방출 시약에 세포를 떠나 전체 세포 생존에 해를 끼칠 수 있습니다. 여섯째, 30분 이상 큐벳에 있는 미디어로 세포를 배양해야 한다. 일곱 째, 첫 48h를 위해 1mL에106개의 전극세포를 배치하는 것은 세포가 낮은 밀도에서 배양하는 것보다 더 빨리 회복하는 것을 돕는 경향이 있다(데이터가 표시되지 않음). 마지막으로, Cas9 mRNA 또는 Cas9 단백질을 사용하면 유사한 편집 효율성(데이터가 표시되지 않음)이 발생합니다. 그러나 편리함과 비용을 위해 Cas9 mRNA를 사용했습니다.
CRISPR/Cas9를 사용할 때 두 가지 주요 관심사는 대상 불이익 및 염색체 전좌입니다. 대상 서열에 sgRNA의 불일치 기본 쌍에 의해 발생 하는 오프 표적 효과 게놈에 수많은 가능한 결합 사이트로 이어질 하 고 다중, 원치 않는 유전자 KO를 만들. 따라서 이 문제를 최소화하기 위해 목표 점수와 함께 예상 오프 타겟 점수를 고려해야 합니다. 염색체 전좌는 오프 타겟 효과 또는 여러 유전자를 노크 할 때 발생할 수 있습니다. 이것은 실험적으로 그리고 임상적으로 치명적인 사건을 일으키는 원인이 될 수 있습니다. 기본편집자(12)는 단일 뉴클레오티드(2개의 클래스: 시토신 베이스 에디터 및 아데닌 베이스 에디터)를 변경하여 접합 요소를 방해하고, 조기 정지 코동을 만들거나, 포인트 돌연변이를 생성하여 DSB 없이 표적 유전자KO(12)를대상으로 합니다. 따라서, 기저 편집 접근법은 염색체 전좌를 우회하기 위해 단일 또는 다중 유전자 KO에 사용될 수 있다.
또한 CRISPR/Cas9와 rAAV6을 사용하여 사이트별 KI 및 AAVS1 궤적에서 EGFP의 표현을 효율적으로 중재할 수 있음을 입증합니다. 우리는 적어도 12 일 동안 EGFP 표현을 관찰엔지니어링 후. 또한 12일째 KI 샘플에서 고-중간-EGFP 발현(그림5A)을관찰한 반면 벡터 전용 샘플은 중간 EGFP 발현을 가진 세포의 최소 비율을 보였다. 우리는 이 "높고 중간 인구" 현상이 벡터의 쌍경체 통합 때문이라고 추측합니다. 중간 및 고EGFP 세포의 PCR13을 아우르는 추가 조사는 이 가설을 확인하기 위해 수행될 수 있다. AAV를 벡터로 사용하는 데 대한 두 가지 주의 사항: 첫째, AAV 벡터는 최대 4.7킬로베이스의 작은 화물 용량을 가지며 큰 유전자를 노크할 때 문제를 일으킵니다. 상동성 팔의 크기를 줄이면 더 큰 유전자의 수용이 허용되며 KI 효율성 (표시되지 않은 데이터)이 감소합니다. 대안적으로, 다중 유전자 로딩 벡터의 동시 또는 순차적 통합을 사용할 수 있다14,15. 연구 결과는 면역 무능한 동물 모형에서 면역 반응 및 AAV 변환된 세포의 정리를 보고했습니다16,17. 또는 바이러스 에 기반하지 않은 기증자 HDR 템플릿을 탐색하여이 문제를 피할 수 있습니다.
요약하자면, 우리는 높은 유전자 변형 효율성을 초래한 B 세포의 격리, 확장 및 엔지니어링의 포괄적이고 단계별 프로세스를 입증했습니다. 이 엔지니어링 방법은 유전자 KO에 사용및 B 세포에서 유전자의 기능을 연구하기 위하여 이용될 수 있습니다. 또한, 이러한 방법은 감염에 맞서 싸우기 위해 재조합 항체를 발현하기 위해 B 세포를 설계하는 데 사용될 수 있다. 마지막으로, 이 방법은 효소를 치료하는 자가 세포 기반 치료로 사용될 수 있는 치료 효소를 발현하고 분비하기 위해 설계B 세포를 설계에 적용할 수 있다.
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Disclosures
M.J.J. K.L., B.S.M를 발명자로 사용하여 게놈 편집 B 세포를 만들고 사용하는 방법에 대한 특허가 출원되었습니다. B.S.M 는 임무소프트의 주식을 컨설턴트로 운영하고 있으며, B.S.M 연구소에서 연구를 후원하고 있습니다.
Acknowledgments
이 작품은 어린이 암 연구 기금 (CCRF)과 NIH R01 AI146009에서 B.S.M에 의해 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3 protein, 500 ug | IDT | 1081059 | smaller size is also available |
| Amaxa P3 primary cell 4D- Nucleofector X Kit S (32 RCT) | Lonza | V4XP-3032 | |
| Ammonium-chloride-potassium (ACK) lysing buffer | Quality Biological | 118-156-101 | |
| CleanCap chemically modified Cas9 mRNA | Trilink Biotechnology | L-7206-1000 | |
| CpG ODN 2006 (ODN 7909) 5 mg | Invivogen | TLRL-2006-5 | different sizes available |
| Cryostor CS10, 100 mL | STEMCELL Technology | 7930 | |
| CTS Immune Cell SR | Thermo Fisher Scientific | A2596101 | |
| EasySep human B cells isolation kit | STEMCELL Technology | 17954 | |
| eBioscience fixable viability dye eFlour 780 | eBiosciences | 65-0865-14 | |
| Excellerate B cell media, Xeno-free | R&D Systems | CCM031 | B-cell basal medium |
| Falcon 14 mL Polypropylene Round-bottom Tube | Corning | 352059 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | R&D Systems | S11550 | For thawing B cells only |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-03 | |
| GeneMate SnapStrip® 8-Strip 0.2 mL PCR Tubes with Individual Attached Dome Caps | BioExpress | T-3035-1 / 490003-692 | |
| Hyclone 0.0067M PBS (No Ca, No Mg) or 1x PBS | GE lifesciences | SH30256.01 | |
| Lonza 4D Nucleofector core unit | Lonza | AAF-1002B | |
| Lonza 4D Nucleofector X unit | Lonza | AAF-1002X | |
| Mega CD40 Ligand | Enzo Life Sciences | ALX-522-110-C010 | |
| Mr. Frosty | Sigma-Aldrich | C1562-1EA | For freezing cells |
| Pen/Strep 100X | Sigma-Aldrich | TMS-AB2-C | |
| PerCP anti-human CD19 clone HIB19 | biolegend | 302228 | smaller size is also available |
| rAAV6 SA-GFP pakaging ( with our SA-GFP cassette see Figure 4.) | Vigene Biosciences | N/A | large scale packaging, 1e13 GC/mL, 500 mL |
| Recombinant human IL-10 protein 250 ug | R&D Systems | 217-IL-250 | different sizes available |
| Recombinant human IL-15 protein 25 ug | R&D Systems | 247-ILB-025 | different sizes available |
| The Big Easy EasySep Magnet | STEMCELL Technology | 18001 | different sizes available |
| Tris-EDTA (TE) buffer | Fisher Scientific | BP2476100 |
References
- LeBien, T. W., Thomas, T. F. B lymphocytes: how they develop and function. Blood. 112 (5), 1570-1580 (2008).
- Nutt, S. L., Hodgkin, P. D., Tarlinton, D. M., Corcoran, L. M. The generation of antibody-secreting plasma cells. Nature Reviews Immunology. 15, 160-171 (2015).
- Slifka, M. K., Antia, R., Whitmire, J. K., Ahmed, R. Humoral immunity due to long-lived plasma cells. Immunity. 8 (3), 363-372 (1998).
- Spriggs, M. K., et al. Recombinant human CD40 ligand stimulates B cell proliferation and immunoglobulin E secretion. Journal of Experimental Medicines. 176 (6), 1543-1550 (1992).
- Fusil, F., et al. A lentiviral vector allowing physiologically regulated membrane-anchored and secreted antibody expression depending on B-cell maturation status. Molecular Therapy. 23 (11), 1734-1747 (2015).
- Luo, X. M., et al. Engineering human hematopoietic stem/progenitor cells to produce a broadly neutralizing anti-HIV antibody after in vitro maturation to human B lymphocytes. Blood. 113 (7), 1422-1431 (2008).
- Mock, U., Thiele, R., Uhde, A., Fehse, B., Horn, S. Efficient lentiviral transduction and transgene expression in primary human B cells. Human Gene Therapy Methods. 23 (6), 408-415 (2012).
- Heltemes-Harris, L. M., et al. Sleeping Beauty transposon screen identifies signaling modules that cooperate with STAT5 activation to induce B-cell acute lymphoblastic leukemia. Oncogene. 35 (26), 3454-3464 (2016).
- Johnson, M. J., Laoharawee, K., Lahr, W. S., Webber, B. R., Moriarity, B. S. Engineering of primary human B cells with CRISPR/Cas9 targeted nuclease. Scientific Reports. 8, 12144 (2018).
- Hung, K. L., et al. Engineering protein-secreting plasma cells by homology-directed repair in primary human B cells. Molecular Therapy. 26 (2), 456-467 (2018).
- Cui, Y., Xu, J., Cheng, M., Liao, X., Peng, S. Review of CRISPR/Cas9 sgRNA design tools. Interdisciplinary Sciences. 10 (2), 455-465 (2018).
- Rees, H. A., Liu, D. R. Base editing: precision chemistry on the genome and transcriptome of living cells. Nature Reviews Genetics. 19 (12), 770-788 (2018).
- Spiegel, A., Bachmann, M., Jurado Jiménez, G., Sarov, M. CRISPR/Cas9-based knockout pipeline for reverse genetics in mammalian cell culture. Methods. 164-165, 49-58 (2019).
- Suzuki, T., Kazuki, Y., Oshimura, M., Hara, T. A novel system for simultaneous or sequential integration of multiple gene-loading vectors into a defined site of a human artificial chromosome. PLoS One. 9, 110404 (2014).
- Bak, R. O., Porteus, M. H. CRISPR-mediated integration of large gene cassettes using AAV donor vectors. Cell Reports. 20 (3), 750-756 (2017).
- Shirley, J. L., de Jong, Y. P., Terhorst, C., Herzog, R. W. Immune responses to viral gene therapy vectors. Molecular Therapy. 28 (3), 709-722 (2020).
- Martino, A. T., Markusic, D. M. Immune response mechanisms against AAV vectors in animal models. Molecular Therapy - Methods and Clinical Development. 17, 198-208 (2020).
