Summary
Dieses Protokoll führt eine Methode zur Entwicklung eines Gerüsts mit dezellularisierten Rattennieren ein. Das Protokoll umfasst Dezellularisierungs- und Rezellularisierungsprozesse, um die Bioverfügbarkeit zu bestätigen. Die Dezellularisierung wird mit Triton X-100 und Natriumdodecylsulfat durchgeführt.
Abstract
Tissue Engineering ist eine Spitzendisziplin in der Biomedizin. Zellkulturtechniken können zur Regeneration von funktionellen Geweben und Organen angewendet werden, um kranke oder beschädigte Organe zu ersetzen. Gerüste werden benötigt, um die Erzeugung dreidimensionaler Organe oder Gewebe mit differenzierten Stammzellen in vivo zu erleichtern. In diesem Bericht beschreiben wir eine neuartige Methode zur Entwicklung vaskularisierter Gerüste mit dezellularisierten Rattennieren. Acht Wochen alte Sprague-Dawley-Ratten wurden in dieser Studie verwendet, und Heparin wurde in das Herz injiziert, um den Fluss in die Nierengefäße zu erleichtern, so dass Heparin in die Nierengefäße eindringen konnte. Die Bauchhöhle wurde geöffnet und die linke Niere wurde gesammelt. Die gesammelten Nieren wurden 9 h lang mit Reinigungsmitteln wie Triton X-100 und Natriumdodecylsulfat perfundiert, um das Gewebe zu dezellulieren. Dezellularisierte Nierengerüste wurden dann sanft mit 1% Penicillin / Streptomycin und Heparin gewaschen, um Zelltrümmer und chemische Rückstände zu entfernen. Die Transplantation von Stammzellen mit den dezellularisierten Gefäßgerüsten soll die Erzeugung neuer Organe erleichtern. So könnten die vaskularisierten Gerüste in Zukunft eine Grundlage für das Tissue Engineering von Organtransplantaten bilden.
Introduction
Zellkulturtechniken werden zur Regeneration von funktionellen Geweben und Organen eingesetzt, um kranke oder beschädigte Organe zu ersetzen. Allogene Organtransplantation ist derzeit die häufigste Behandlung für irreversible Organschäden; Dieser Ansatz erfordert jedoch die Verwendung von Immunsuppression, um eine Abstoßung des transplantierten Organs zu verhindern. Darüber hinaus können trotz Fortschritten in der Transplantimmunologie 20% der Transplantatempfänger innerhalb von 5 Jahren eine akute Abstoßung erfahren, und innerhalb von 10 Jahren nach der Transplantation können 40% der Empfänger ihr transplantiertes Transplantat verlieren oder sterben1.
Fortschritte in den Tissue-Engineering-Technologien haben zu einem neuen Paradigma für die Transplantation neuer Organe ohne Immunabstoßung mit differenzierten Stammzellen geführt. Nach der Stammzelldifferenzierung wird ein Gerüst, eine synthetische extrazelluläre Matrix genannt, benötigt, um die Erzeugung dreidimensionaler Organe zu erleichtern und das neue Gewebe im Empfänger gedeihen zu lassen. Gerüste aus dezellularisierten nativen Organen haben Vorteile, einschließlich einer effektiveren Umgebung für die Etablierung von Zellen und die Verbesserung der Stammzellproliferation, obwohl diese Mechanismen nicht vollständig aufgeklärt wurden2. Insbesondere die Niere ist ein geeignetes Organ für die Gerüstbildung, da sie eine reichliche Zirkulation und eine Nische für die Stammzellbildung aufs neuethält. Darüber hinaus ist es aufgrund der komplexen Struktur der Niere schwierig, Nieren für die Organtransplantation künstlich zu regenerieren.
In diesem Bericht stellen wir eine Methode zur Entwicklung vaskularisierter Gerüste unter Verwendung dezellularisierter Organe in einem Rattenmodell vor, um zukünftige Tierversuche für Tissue Engineering-Zwecke zu erleichtern.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Diese Studie wurde von der Verwaltung der Pusan National University of Medicine genehmigt und in Übereinstimmung mit ethischen Richtlinien für die Verwendung und Pflege von Tieren durchgeführt. (Zertifikat Nr. 2017-119). Vor jeder Tierstudie sollte eine institutionelle Genehmigung eingeholt werden.
HINWEIS: Alle chirurgischen und anästhetischen Instrumente/Geräte und Reagenzien, die für eine erfolgreiche chirurgische Präsentation und Bildgebung von Bauchorganen empfohlen werden, sind in Tabelle 1 aufgeführt.
1. Zubereitungsverfahren für die Ernte von Rattennieren
- Zur Vorbereitung auf die Operation legen Sie 8 Wochen alte Sprague-Dawley-Ratten (mit einem Gewicht von 200-250 g) auf ein Wärmekissen. Platzieren Sie eine rektale Thermometersonde im Rektum, um die Kerntemperatur zu überwachen.
- Betäubung der Ratte mit einem 5%igen Isoflurangasgemisch (Induktion: 5%, Erhaltung: 3%).
- Um die Operation zu beginnen, legen Sie die Ratte nach Verabreichung der Anästhesie in Rückenlage. Montieren Sie die vier Gliedmaßen der Ratte mit Klebeband auf dem Operationstisch.
- Rasieren und reinigen Sie den Bauch der Spenderratte mit keimtötender Seife. Tragen Sie 2% Betadin für mindestens 1-2 min auf und wischen Sie mit einer 70% igen Ethanollösung ab. Wiederholen Sie diese Sequenz dreimal.
- Decken Sie das Operationsfeld mit einem sterilen fenestrierten Vorhang ab.
- Machen Sie einen vertikalen Bauchschnitt und legen Sie die linke Niere, den Harnleiter, die Bauchaorta und die untere Hohlvene frei.
- Visualisieren und sezieren Sie die linke Niere, den Harnleiter, die Bauchaorta und die vena cava inferior kurz vor dem Schneiden des Pedikels.
2. Transkardialperfusion
- Bereiten Sie vor der Operation die Perfusionslösung vor.
- Machen Sie 50 ml Perfusionslösung pro Ratte.
- Mischen Sie 1x PBS mit ca. 10 U / ml Heparin (1 25 kU Durchstechflasche ert 2,5 L PBS + Hep).
- Mischen Sie gleiche Mengen von 8% Paraformaldehyd mit 1x PBS, um die 4% PFA / 1xPBS-Lösung herzustellen.
HINWEIS: 8% PFA aus Wasser können bei 4 °C bis zu 2 Monate gelagert werden. 4% PFA in PBS verdünnt ist jedoch nur für 1 Woche bei 4 °C stabil. Machen Sie die Verdünnung frisch.
- Verlängern Sie den vertikalen Bauchschnitt kranial. Achten Sie darauf, die Schere beim Schneiden von den Organen wegzuziehen, um die inneren Organe nicht zu beschädigen.
- Setzen Sie den Schnitt durch den Brustkorb fort und schneiden Sie dann durch das Zwerchfell, indem Sie das Brustbein anheben.
- Stecken Sie den losen Hautlappen aus dem Weg und befreien Sie das Herz, indem Sie mit der Pinzette bindegewebe reißen.
ACHTUNG: Verwenden Sie die Schere nicht, um das Herz zu befreien, und dies könnte zu unerwünschten Blutungen führen. - Öffnen Sie die phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) und stellen Sie sicher, dass die Leitung fließt, bevor Sie die Nadel in den linken Ventrikel legen. Halten Sie das Herz sanft mit einer stumpfen Zette und verwenden Sie einen Hämostat, um die Nadel zu kontrollieren. Die Nadel sollte nicht mehr als 1/4 Zoll eingeführt werden.
HINWEIS: Das Einsetzen von mehr als 1/4 Zoll kann zu einer Perforation auf die andere Seite des Gewebes führen. - Während Sie das Herz mit der Nadel und dem Hämostat unterstützen, lokalisieren Sie den rechten Vorhof und schneiden Sie ihn mit einer Iridektomieschere durch. Ruhen Sie den Hämostat auf den Körper der Ratte und stellen Sie sicher, dass die Nadel noch im Herzen positioniert ist.
HINWEIS: Wenn der Schnitt ausreichend ist, sollte Blut in der Körperhöhle vorhanden sein, da der Druck des PBS, der in die Ratte fließt, entlastet wird. - Die Vorderfüße und den Hautlappen vorsichtig ausknallen.
- Setzen Sie die Infusion von PBS für 4 Minuten oder länger fort, wenn noch Blut in Niere und Leber sichtbar ist.
3. Nierenernte und Dezellularisierung
- Ernten Sie die linke Niere mit der Bauchaorta und der unteren Hohlvene.
- Ligatieren Sie den Harnleiter, die thorakale Aorta, die obere Hohlvene und die Äste der Bauchaorta.
- Halten Sie das Organ in Dulbeccos PBS (DPBS) in einer 10 cm Großen Petrischale hydratisiert.
- Kanellieren Sie die Bauchaorta und die Vena cava inferior mit einem 23 Gauge Katheter. Um Restblut zu entfernen, verbinden Sie die Kanüle mit einer Peristaltikpumpe und waschen Sie sie mit DPBS (500 ml) und 16 U / ml Heparin für 90 min bei einer Geschwindigkeit von 5 U / min bei 37 ° C.
- Um die Niere zu dezellulieren, perfundieren Sie die Niere mit 1% Triton X-100 (1 L) für 3 h und dann mit 0,75% Natriumdodecylsulfat (SDS) Lösung (2 L) für 6 h bei einem konstanten Druck von 40 mmHg.
HINWEIS: Die Niere wird nach 8 h transparent. - Um Rest-SDS zu entfernen, perpergieren Sie die Probe mit 1% Penicillin in destilliertem Wasser (6 L) für 18 h (über Nacht) und dann mit sterilem DPBS (500 ml) und 16 U / ml Heparin für 90 min.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Die grobe Morphologie der Rattennieren war dunkelrot (Abbildung 1A). Nach der Dezellularisierung wurde die Niere blass und durchscheinend (Abbildung 1D). Restgenomische DNA wurde mit einem handelsüblichen Kit nach Herstellerangaben in dezellularisierten Nierengerüsten bewertet und mit denen in nativen Nieren verglichen (Kontrolle). Quantitative Analysen bestätigten, dass die genomische DNA des Gewebes nach der Dezellularisierung fast eliminiert wurde. Von 14 Fällen betrug der durchschnittliche DNA-Gehalt 115,05 ng/μL für die Kontrolle und 1,96 ng/μL für das dezellularisierte Gerüst. Insgesamt wurden 98,3% der DNA entfernt (Abbildung 2), obwohl die dreidimensionale Struktur beibehalten wurde und azelluläre Gromeruli im kortikalen Parenchym erhalten blieben (Abbildung 3).
Abbildung 1: Rattennieren, die einer renalen arteriellen Perfusionsdezellularisierung unterzogen wurden. (A) Unmittelbar nach Beginn der Dezellularisierung. (B) Nach Triton X-100 Behandlung. C)Nach SDS-Pufferbehandlung. (D) Nach nächtlichem Gerüstwaschen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: DNA-Konzentrationen in Kontroll- und dezellularisierten Rattennieren, die nach der Dezellularisierung einen reduzierten DNA-Gehalt zeigen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Hämatoxylin- und Eosinfärbung von Kontroll- und dezellularisierten Nierenproben. (A) Kontrollkortex (A') dezellularisierter Kortex (B) Kontroll medulla (B') dezellularisierte Medulla (C) Kontrollvene (C ') dezellularisierte Vene. Maßstabsleiste, 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Verschiedene Protokolle wurden für die Dezellularisierung von Organen und anderen Geweben verwendet. Das optimale Dezellularisierungsprotokoll sollte die dreidimensionale Architektur der extrazellulären Matrix (ECM) erhalten. Im Allgemeinen bestehen solche Protokolle darin, die Zellmembran durch physikalische Verarbeitung oder ionische Lösungen zu lysieren, das Zytoplasma und den Zellkern durch enzymatische Verarbeitung oder Reinigungsmittel aus dem ECM zu dissoziieren und dann Zelltrümmer aus dem Gewebe zu entfernen3. Physikalische Prozesse umfassen Scraping, Lösungsrühren, Druckgradienten, Schnappgefrieren, nichtthermische permanente Elektroporation und überkritische Flüssigkeiten2. Zellen auf der äußeren Oberfläche eines Gewebes oder Organs, wie der Haut oder des Dünndarms, können durch mechanische Prozesse in Kombination mit Enzymen effizient entfernt werden4. Ionische oder nichtionische Reinigungsmittel lösen DNA/Protein-Interaktionen, Lipide und Lipoproteine auf, können aber die ECM-Struktur schädigen5. Enzyme entfernen das dissoziierte Zytoplasma und das Kernmaterial, lassen diese Materialien jedoch im ECM, was eine Immunantwort verursachen kann6. Die optimalen Mittel zur Dezellularisierung werden durch Gewebedicke und -dichte oder die klinische Verwendung des dezellularisierten Gewebes bestimmt.
Für die Dezellularisierung verwendeten wir eine Kombination aus nichtionischen und ionischen Reinigungsmitteln: Triton X-100 und SDS. Triton X-100 stört als nichtionisches Reinigungsmittel effektiv die Interaktionen zwischen Lipiden und Lipiden und Proteinen. Triton X-100 kann jedoch auch die ECM-Ultrastruktur aufgrund des Verlusts von Glykosaminoglykan (GAG), Laminin und Fibronektin zerstören. SDS entfernt als ionisches Reinigungsmittel effektiv nukleare Reste und zytoplasmatische Proteine, stört aber auch die ECM-Ultrastruktur durch verlust von GAG und Kollagen3. Obwohl diese Wirkstoffe die Mikrostruktur des ECM zerstören, entfernen SDS und Triton X-100 erfolgreich alle DNA-Inhalte7,8. Dies ist wichtig, da der verbleibende DNA-Gehalt in einem Gerüst eine Immunabstoßung verursachen kann. In Gewebe, das ordnungsgemäß dezellularisiert wurde, sollte der DNA-Gehalt weniger als 50 ng / mg9,10 sein.
Bei der Methode betrug der Druck der Dezellularisierungsperfusion 40 mmHg. Für die Dezellularisierungsperfusion ist eine Druckkontrolle erforderlich. Der optimale Perfusionsdruck variiert von Organ zu Organ, und 60 mmHg ist der optimale Druck für die Nieren- oder Herzentzellulierung von Mensch und Schwein11. Bei Ratten gelten 40 mmHg als ausreichend für die Dezellularisierungsperfusion12.
Eine vielversprechende Behandlung zum Ersatz der Allotransplantattransplantation ist die Transplantation von Stammzellen mit einem vaskularisierten Gerüst. Wir hoffen, dass dieses Protokoll zur Organentzellulierung eine Grundlage für zukünftige Tissue-Engineering-Studien bilden kann.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.
Acknowledgments
Diese Studie wurde durch ein Biomedical Research Institute Grant des Pusan National University Hospital unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 cc syringe (inject probes and vehicle solutions | Becton Dickinson | 305217 | |
| 10-0 ethilon for vessel anastomosis | Ethicon | 9032G | |
| 25 gauge inch guide needle(for vascular catheters) | Becton Dickinson | 305145 | |
| 3-0 PDS incision closure rat | Ethicon | Z316H | |
| 3-0 Prolene incision closure rat | Ethicon | 8832H | |
| 3-0 silk spool vascular access/ligation in rat | Braintree Scientific | SUT-S 110 | |
| 4-0 PDS incision closure mouse | Ethicon | Z773D | |
| 4-0 Prolene incision closure mouse | Ethicon | 8831H | |
| 5-0 silk spool vascular access/ligation in mouse | Braintree Scientific | SUT-S 106 | |
| Fine Scissors to cut fascia/connective tissue | Fine Science Tools | 14058-09 | |
| Halsey needle holder | Fine Science Tools | 12001-13 | |
| Kelly Hemostat for rats: muscle clamp to minimize bleeding when cut | Fine Science Tools | 13018-14 | |
| Polyethelyne 50 tubing, catheter tubing 100 ft | Braintree Scientific | .023" × .038” | |
| Schwartz microserrefine vascular clamps | Fine Science Tools | 18052-01 (straight) | |
| 18052-03 (curved) | |||
| Surgical Scissors to cut skin | Fine Science Tools | 14002-12 | |
| Vannas-Tubingen Spring scissors for arteriotomy | Fine Science Tools | 15003-08 |
References
- Kawai, T., et al. Brief report: HLA-mismatched renal transplantation without maintenance immunosuppression. New England Journal of Medicine. 358 (4), 353-361 (2008).
- Rana, D., Zreiqat, H., Benkirane-Jessel, N., Ramakrishna, S., Ramalingam, M. Development of decellularized scaffolds for stem cell-driven tissue engineering. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 11 (4), 942-965 (2017).
- Fu, R. H., et al. Decellularization and recellularization technologies in tissue engineering. Cell Transplantation. 23 (4-5), 621-630 (2014).
- Hopkinson, A., et al. Optimization of amniotic membrane (AM) denuding for tissue engineering. Tissue Engineering. Part C, Methods. 14 (4), 371-381 (2008).
- Shupe, T., Williams, M., Brown, A., Willenberg, B., Petersen, B. E. Method for the decellularization of intact rat liver. Organogenesis. 6 (2), 134-136 (2010).
- Petersen, T. H., et al. Tissue-engineered lungs for in vivo implantation. Science. 329 (5991), 538-541 (2010).
- Fernandez-Perez, J., Ahearne, M. The impact of decellularization methods on extracellular matrix derived hydrogels. Scientific Reports. 9 (1), 14933 (2019).
- Naik, A., Griffin, M., Szarko, M., Butler, P. E. Optimizing the decellularization process of an upper limb skeletal muscle; implications for muscle tissue engineering. Artificial Organs. 44 (2), 178-183 (2020).
- Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
- Mason, C., Dunnill, P. A brief definition of regenerative medicine. Regenerative Medicine. 3 (1), 1-5 (2008).
- Guyette, J. P., et al.
- Song, J. J., et al. Regeneration and experimental orthotopic transplantation of a bioengineered kidney. Nature Medicine. 19 (5), 646-651 (2013).
