Summary
Ce protocole introduit une méthode pour développer un échafaudage utilisant les reins de rat décellulaires. Le protocole comprend des processus de décellularisation et de recellularisation pour confirmer la biodisponibilité. La décellularisation est réalisée à l’aide de Triton X-100 et de dodécyl sulfate de sodium.
Abstract
Le génie tissulaire est une discipline de pointe en biomédecine. Des techniques de culture cellulaire peuvent être appliquées pour la régénération des tissus et organes fonctionnels afin de remplacer les organes malades ou endommagés. Des échafaudages sont nécessaires pour faciliter la génération d’organes ou de tissus tridimensionnels à l’aide de cellules souches différenciées in vivo. Dans ce rapport, nous décrivons une méthode originale pour développer des échafaudages vascularisés utilisant les reins decellularized de rat. Huit semaines-vieux rats de Sprague-Dawley ont été utilisés dans cette étude, et l’héparine a été injectée dans le coeur pour faciliter l’écoulement dans les navires rénaux, permettant à l’héparine de perfuser dans les navires rénaux. La cavité abdominale a été ouverte, et le rein gauche a été rassemblé. Les reins collectés ont été perfusés pendant 9 h utilisant des détergents, tels que Triton X-100 et le sulfate de dodécyle de sodium, pour décellulariser le tissu. Des échafaudages décellulaires de rein ont été alors doucement lavés avec 1% de pénicilline/streptomycine et d’héparine pour enlever les débris cellulaires et les résidus chimiques. On s’attend à ce que la transplantation de cellules souches avec les échafaudages vasculaires décellulaires facilite la génération de nouveaux organes. Ainsi, les échafaudages vascularisés peuvent fournir une base pour l’ingénierie tissulaire des greffes d’organe à l’avenir.
Introduction
Les techniques de culture cellulaire sont appliquées pour la régénération des tissus et organes fonctionnels afin de remplacer les organes malades ou endommagés. La transplantation d’organes allogéniques est actuellement le traitement le plus courant pour les dommages irréversibles aux organes; cependant, cette approche exige l’utilisation de l’immunosuppression pour empêcher le rejet de l’organe transplanté. De plus, malgré les progrès de l’immunologie de la transplantation, 20% des greffés peuvent subir un rejet aigu dans les 5 ans, et dans les 10 ans suivant la transplantation, 40% des receveurs peuvent perdre leur greffe transplantée ou mourir1.
Les progrès des technologies d’ingénierie tissulaire ont donné lieu à un nouveau paradigme pour la transplantation de nouveaux organes sans rejet immunitaire à l’aide de cellules souches différenciées. Après la différenciation des cellules souches, un échafaudage, appelé matrice extracellulaire synthétique, est nécessaire pour faciliter la génération d’organes tridimensionnels et permettre au nouveau tissu de prospérer chez le receveur. Les échafaudages d’organes natifs décellulaires présentent des avantages, notamment un environnement plus efficace pour l’établissement de cellules et l’amélioration de la prolifération des cellules souches, bien que ces mécanismes n’aient pas été entièrement élucularisés2. En particulier, le rein est un organe approprié pour la génération d’échafaudages car il a une circulation abondante et une niche pour l’établissement de cellules souches. De plus, en raison de la structure complexe du rein, il est difficile de régénérer artificiellement les reins pour la transplantation d’organes.
Dans ce rapport, nous introduisons une méthode de développer des échafaudages vascularisés utilisant les organes decellularized dans un modèle de rat pour faciliter de futures études animales à des fins d’ingénierie tissulaire.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Cette étude a été approuvée par l’administration de l’Université nationale de médecine de Pusan et a été menée conformément aux directives éthiques pour l’utilisation et les soins des animaux. (certificat no 2017-119). Avant toute étude sur les animaux, l’approbation de l’établissement doit être obtenue.
NOTA : Tous les instruments, équipements et réactifs chirurgicaux et anesthésiques recommandés pour une présentation chirurgicale et une imagerie réussies des organes abdominaux sont détaillés dans le tableau 1.
1. Procédures de préparation pour la récolte des reins de rat
- En préparation à la chirurgie, placez des rats Sprague-Dawley âgés de 8 semaines (pesant de 200 à 250 g) sur un coussin chauffant. Placez une sonde de thermomètre rectal dans le rectum pour surveiller la température centrale.
- Anesthésier le rat avec un mélange à 5% d’isoflurane gazeux (induction: 5%, entretien: 3%).
- Pour commencer l’opération, placez le rat en décubitus dorsal après l’administration de l’anesthésie. Montez les quatre membres du rat sur la table d’opération avec du ruban adhésif.
- Rasez et nettoyez l’abdomen du rat donneur avec du savon germicide. Appliquer de la bétadine à 2 % pendant au moins 1 à 2 min et essuyer avec une solution d’éthanol à 70 %. Répétez cette séquence trois fois.
- Couvrir le champ opératoire avec un drapé fenêtré stérile.
- Faites une incision abdominale verticale et exposez le rein gauche, l’uretère, l’aorte abdominale et la veine cave inférieure.
- Visualisez et disséquez le rein gauche, l’uretère, l’aorte abdominale, et la veine cave inférieure juste avant de couper le pedicle.
2. Perfusion transcardique
- Avant la chirurgie, préparez la solution de perfusion.
- Faire 50 mL de solution de perfusion par rat.
- Mélanger 1x PBS avec environ 10 U/mL d’héparine (1 flacon de 25 kU fera 2,5 L de PBS+Hep).
- Mélanger des volumes égaux de paraformaldéhyde à 8 % avec 1x PBS pour obtenir la solution PFA/1xPBS à 4 %.
REMARQUE: 8% de PFA fabriqué dans l’eau peut être conservé à 4 ° C jusqu’à 2 mois. Cependant, 4 % de PFA dilué dans du PBS n’est stable que pendant 1 semaine à 4 °C. Rendre la dilution fraîche.
- Prolongez l’incision abdominale verticale crânienne. Assurez-vous de retirer les ciseaux des organes lors de la coupe pour éviter d’endommager les organes internes.
- Continuez l’incision à travers la cage thoracique, puis coupez à travers le diaphragme en soulevant le sternum.
- Épinglez le lambeau lâche de la peau à l’écart et libérez le cœur en déchirant tout tissu conjonctif avec la pince.
ATTENTION: N’utilisez pas les ciseaux pour libérer le cœur et cela pourrait entraîner des saignements indésirables. - Ouvrez la ligne saline tamponnée au phosphate (PBS) et assurez-vous que la ligne coule avant de placer l’aiguille dans le ventricule gauche. Tenez doucement le cœur avec une pince émoussée et utilisez un hémostatique pour contrôler l’aiguille. L’aiguille ne doit pas être insérée plus de 1/4 de pouce.
REMARQUE: Une insertion supérieure à 1/4 de pouce peut entraîner une perforation de l’autre côté du tissu. - Tout en soutenant le cœur avec l’aiguille et l’hémostatique, localisez l’oreillette droite et passez-y un coup de ciseaux iridectomy. Reposez l’hémostatique sur le corps du rat et assurez-vous que l’aiguille est toujours positionnée à l’intérieur du cœur.
REMARQUE: Si la coupure est suffisante, il devrait y avoir du sang dans la cavité corporelle car la pression du PBS qui s’écoule dans le rat est soulagée. - Détachez soigneusement les pieds avant et le lambeau de peau.
- Continuer à perfuser le PBS pendant 4 min ou plus s’il y a encore du sang visible dans les reins et le foie.
3. Récolte et décellularisation des reins
- Récoltez le rein gauche avec l’aorte abdominale et la veine cave inférieure.
- Ligate l’uretère, l’aorte thoracique, la veine cave supérieure, et les branches de l’aorte abdominale.
- Gardez l’organe hydraté dans le PBS de Dulbecco (DPBS) dans une boîte de Petri de 10 cm.
- Canule l’aorte abdominale et la veine cave inférieure avec un cathéter de calibre 23. Pour éliminer le sang résiduel, raccorder la canule à une pompe péristaltique et laver avec du DPBS (500 mL) et 16 U/mL d’héparine pendant 90 min à raison de 5 tr/min à 37 °C.
- Pour décellulariser le rein, perfuser le rein avec 1% Triton X-100 (1 L) pendant 3 h, puis avec 0,75% de solution de dodécyl sulfate de sodium (SDS) (2 L) pendant 6 h à une pression constante de 40 mmHg.
REMARQUE: Le rein deviendra transparent après 8 h. - Pour éliminer les FDS résiduelles, perfuser l’échantillon avec 1 % de pénicilline dans de l’eau distillée (6 L) pendant 18 h (nuit) puis avec du DPBS stérile (500 mL) et 16 U/mL d’héparine pendant 90 min.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
La morphologie brute des reins de rat était rouge foncé (figure 1A). Après la décellularisation, le rein est devenu pâle et translucide(figure 1D). L’ADN génomique résiduel a été évalué à l’utilisation d’une trousse commerciale conformément aux instructions du fabricant, dans des échafaudages rénaux décellulaires et comparé à celui des reins natifs (témoins). L’analyse quantitative a confirmé que l’ADN génomique des tissus était presque éliminé après la décellularisation. Sur 14 cas, la teneur moyenne en ADN était de 115,05 ng/μL pour le témoin et de 1,96 ng/μL pour l’échafaudage décellulaire. Au total, 98,3 % de l’ADN a été retiré(figure 2),bien que la structure tridimensionnelle ait été maintenue, et des gromérules acellulaires ont été préservés dans le parenchyme cortical(figure 3).
Ill. 1 : Reins de rat soumis à une décellularisation de la perfusion artérielle rénale. (A) Immédiatement après le début de la décellularisation. (B) Après traitement Triton X-100. (C) Après traitement tampon de la FDS. (D)Après le lavage d’échafaudage de nuit. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2 : Concentrations d’ADN dans les reins témoins et les reins de rat décellulaires, montrant une teneur réduite en ADN après la décellularisation. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Ill. 3 : Coloration à l’hématoxyline et à l’éosine des échantillons de rein témoins et décellulaires. (A) le cortex de contrôle (A') le cortex décellulaire (B) contrôle médulle (B') médulle décellulaire (C) veine de contrôle (C') veine décellulaire. Barre d’échelle, 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Divers protocoles ont été utilisés pour la décellularisation des organes et d’autres tissus. Le protocole de décellularisation optimal devrait préserver l’architecture tridimensionnelle de la matrice extracellulaire (ECM). En général, de tels protocoles consistent à lyser la membrane cellulaire par traitement physique ou par solutions ioniques, à dissocier le cytoplasme et le noyau de l’ECM par traitement enzymatique ou détergents, puis à éliminer les débris cellulaires du tissu3. Les processus physiques comprennent le grattage, l’agitation de la solution, les gradients de pression, le gel par pression, l’électroporation permanente non thermique et les fluides supercritiques2. Les cellules de la surface externe d’un tissu ou d’un organe, tels que la peau ou l’intestin grêle, peuvent être éliminées efficacement par des processus mécaniques combinés à des enzymes4. Les détergents ioniques ou non ioniques dissolvent les interactions ADN/protéines, les lipides et les lipoprotéines, mais peuvent endommager la structure ECM5. Les enzymes éliminent le cytoplasme dissocié et la matière nucléaire, mais laissent ces matières dans l’ECM, ce qui peut provoquer une réponse immunitaire6. Les agents optimaux pour la décellularisation sont déterminés par l’épaisseur et la densité du tissu ou l’utilisation clinique du tissu décellulaire.
Pour la décellularisation, nous avons utilisé une combinaison de détergents non ioniques et ioniques: Triton X-100 et SDS. Triton X-100, en tant que détergent non ionique, perturbe efficacement les interactions lipides/lipides et lipides/protéines. Cependant, Triton X-100 peut également détruire l’ultrastructure d’ECM due à la perte de glycosaminoglycan (GAG), de laminine, et de contenu de fibronectin. La FDS, en tant que détergent ionique, élimine efficacement les restes nucléaires et les protéines cytoplasmiques, mais perturbe également l’ultrastructure ECM par perte de GAG et de collagène3. Bien que ces agents détruisent la microstructure de l’ECM, sds et Triton X-100 avec succès éliminer tous les contenus d’ADN7,8. Ceci est essentiel parce que la teneur restante en ADN dans un échafaudage peut causer le rejet immunitaire. Dans les tissus qui ont été correctement décellulaires, la teneur en ADN doit être inférieure à 50 ng/mg9,10.
Dans la méthode, la pression de la perfusion de decellularization était 40 mmHg. Le contrôle de pression est exigé pour la perfusion de décellularisation. La pression de perfusion optimale varie d’un organe à l’autre, et 60 mmHg est la pression optimale pour la décellularisation des reins ou du cœur humains et porcins11. Chez le rat, 40 mmHg est considéré comme suffisant pour la perfusion de décellularisation12.
Un traitement prometteur pour remplacer la transplantation d’allogreffe est la transplantation des cellules de tige utilisant un échafaudage vascularisé. Nous espérons que ce protocole pour la décellularisation d’organe peut fournir une base pour de futures études d’ingénierie tissulaire.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.
Acknowledgments
Cette étude a été soutenue par une subvention de l’Institut de recherche biomédicale de l’hôpital universitaire national de Pusan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 cc syringe (inject probes and vehicle solutions | Becton Dickinson | 305217 | |
| 10-0 ethilon for vessel anastomosis | Ethicon | 9032G | |
| 25 gauge inch guide needle(for vascular catheters) | Becton Dickinson | 305145 | |
| 3-0 PDS incision closure rat | Ethicon | Z316H | |
| 3-0 Prolene incision closure rat | Ethicon | 8832H | |
| 3-0 silk spool vascular access/ligation in rat | Braintree Scientific | SUT-S 110 | |
| 4-0 PDS incision closure mouse | Ethicon | Z773D | |
| 4-0 Prolene incision closure mouse | Ethicon | 8831H | |
| 5-0 silk spool vascular access/ligation in mouse | Braintree Scientific | SUT-S 106 | |
| Fine Scissors to cut fascia/connective tissue | Fine Science Tools | 14058-09 | |
| Halsey needle holder | Fine Science Tools | 12001-13 | |
| Kelly Hemostat for rats: muscle clamp to minimize bleeding when cut | Fine Science Tools | 13018-14 | |
| Polyethelyne 50 tubing, catheter tubing 100 ft | Braintree Scientific | .023" × .038” | |
| Schwartz microserrefine vascular clamps | Fine Science Tools | 18052-01 (straight) | |
| 18052-03 (curved) | |||
| Surgical Scissors to cut skin | Fine Science Tools | 14002-12 | |
| Vannas-Tubingen Spring scissors for arteriotomy | Fine Science Tools | 15003-08 |
References
- Kawai, T., et al. Brief report: HLA-mismatched renal transplantation without maintenance immunosuppression. New England Journal of Medicine. 358 (4), 353-361 (2008).
- Rana, D., Zreiqat, H., Benkirane-Jessel, N., Ramakrishna, S., Ramalingam, M. Development of decellularized scaffolds for stem cell-driven tissue engineering. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 11 (4), 942-965 (2017).
- Fu, R. H., et al. Decellularization and recellularization technologies in tissue engineering. Cell Transplantation. 23 (4-5), 621-630 (2014).
- Hopkinson, A., et al. Optimization of amniotic membrane (AM) denuding for tissue engineering. Tissue Engineering. Part C, Methods. 14 (4), 371-381 (2008).
- Shupe, T., Williams, M., Brown, A., Willenberg, B., Petersen, B. E. Method for the decellularization of intact rat liver. Organogenesis. 6 (2), 134-136 (2010).
- Petersen, T. H., et al. Tissue-engineered lungs for in vivo implantation. Science. 329 (5991), 538-541 (2010).
- Fernandez-Perez, J., Ahearne, M. The impact of decellularization methods on extracellular matrix derived hydrogels. Scientific Reports. 9 (1), 14933 (2019).
- Naik, A., Griffin, M., Szarko, M., Butler, P. E. Optimizing the decellularization process of an upper limb skeletal muscle; implications for muscle tissue engineering. Artificial Organs. 44 (2), 178-183 (2020).
- Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
- Mason, C., Dunnill, P. A brief definition of regenerative medicine. Regenerative Medicine. 3 (1), 1-5 (2008).
- Guyette, J. P., et al.
- Song, J. J., et al. Regeneration and experimental orthotopic transplantation of a bioengineered kidney. Nature Medicine. 19 (5), 646-651 (2013).
