Summary
Vi utviklet en simple-metode for å isolere individuelle musehjerteceller av høy kvalitet ved antegrad perfusjonsteknikken. Denne metoden er Langendorff-fri og nyttig for å isolere ventrikulære og atrie-myocytter eller interstitiale celler, for eksempel hjertefibroblaster eller forfedre.
Abstract
I grunnleggende forskning ved hjelp av musehjerte er det å isolere levedyktige individuelle kardiomyocytter et avgjørende teknisk skritt å overvinne. Tradisjonelt har isolerende kardiomyocytter fra kaniner, marsvin eller rotter blitt utført via retrograd perfusjon av hjertet med enzymer ved hjelp av et Langendorff-apparat. Imidlertid er det nødvendig med en høy grad av dyktighet når denne metoden brukes med et lite musehjerte. En antegrad perfusjonsmetode som ikke bruker et Langendorff-apparat ble nylig rapportert for isolering av muskardiomyocytter. Vi rapporterer heri en komplett protokoll for forbedret antegrad perfusjon av det utskilte hjertet for å isolere individuelle hjerteceller fra voksne mus (8 - 108 uker gammel). Antegrad perfusjon utføres ved å injisere perfusat nær toppen av venstre ventrikel av det utskilte hjertet, hvor aorta ble klemt, ved hjelp av en infusjonspumpe. Alle prosedyrer utføres på en forvarmet varmematte under et mikroskop, noe som gjør at injeksjons- og perfusjonsprosessene kan overvåkes. Resultatene tyder på at ventrikulære og atrie-myocytter og fibroblaster kan isoleres godt fra en enkelt voksen mus samtidig.
Introduction
Generelt innebærer det første trinnet i enkeltcelleisolasjonen av dissekert vev å blande vevet i små biter, etterfulgt av fordøyelsen av bindevevet og ekstracellulær matrise med enzymer. Kardiomyocytter kan imidlertid ikke isoleres med en slik hakkemetode, som berikelse med ekstracellulære matrisekomponenter, inkludert kollagen- og elastinfibre, gjør myokardiet for tøft å hakke, og kardiomyocyttene er svært følsomme for hypoksi og andre endringer i mikromiljøet. Således, ved hjelp av Langendorff-baserte retrograd perfusjonssystem1, er det utviklet en metode for å fordøye den ekstracellulære matrisen med enzymer for å isolere individuelle kardiomyocytter fra hjertet2,3,4.
I musemodeller brukes Langendorff-basert retrograd perfusjon av hjertet med enzymer også til isolering av individuelle kardiomyocytter5,6,7,8. Imidlertid krever kannasjonen av den lille og tynne musen aorta og dens montering på Langendorff-apparatet for å utføre retrograd perfusjon en høy grad av dyktighet, siden diameteren på aorta i voksenhjertet er ca. 1,2 mm. Videre tar det tid å utføre flere eksperimenter, da Langendorff-apparatet skal rengjøres før det neste hjertet forvrenges.
Som et alternativ til retrograd perfusjon ble det utviklet en ny metode for å isolere kardiomyocytter fra et voksent musehjerte uten et Langendorff-apparat. Denne epoke-making metoden var basert på antegrad perfusjon av koronararteriene9. Vi har nylig forbedret hvert trinn i denne antegrade protokollen, for eksempel klemming av aorta, nålinnsetting og temperaturkontroll, og overvåket alle perfusjonsprosedyrer med et mikroskop10. Vi rapporterer heri i detalj raffinement av denne antegrade perfusjonsmetoden for å forkorte tiden for isolasjon og gi en supplerende video. I denne metoden tar perfusjonen av hjertet ca 7 min med 10 ml enzymer, og denne korte fordøyelsesperioden øker levedyktigheten til cellene. Dette er en enkel metode for å isolere enkelt hjerteceller i høy kvalitet uten å kreve tilsetning av kjemikalier, for eksempel 2,3-butanedione monoksime (BDM)6,11 eller taurin5,8. Vi tror at denne metoden vil senke ferdighetsterskelen til teknikken og forbedre nytten av muskardiomyocytter i grunnleggende forskning.
Protocol
Alle dyreforsøk i samsvar med Guide for the Care and Use of Laboratory Animals publisert av US National Institutes of Health (NIH Publication No. 85-23, revidert 1996) og ble godkjent av det institusjonelle review board ved Shiga University of Medical Science Animal Care and Use Committee (godkjent nr. 2019-3-7). Metodene ble utført i henhold til godkjente retningslinjer.
1. Instrumenter og løsning
MERK: En oversikt over den eksperimentelle prosedyren er illustrert i et flytskjema (Supplerende figur 1). En infusjonspumpe (eller sprøytepumpe) skal brukes til antegrad perfusjon av hjertet med en enveis strømning. En peristaltisk pumpe som skaper en pulserende strømning anbefales ikke.
- Før den eksperimentelle
- Merk injeksjonsnålen på et sted ca. 3 mm fra spissen med neglelakk. Etter å ha tillatt det luften tørr, hold den i beholderen ved romtemperatur. En rød eller lys farge er ønskelig å bekrefte dybden av innsetting i myokardiet under perfusjon.
- Få hjertet til å stå ved å kutte lokkene av 1,5-, 0,5- og 0,2 ml prøverør og feste lokkene til bunnen av en 60 mm kulturrett med dobbeltsidig tape eller lim. Fiksering av tre lokk i forskjellige størrelser i en tallerken gjør det mulig å velge riktig i henhold til størrelsen på musehjertet. Dette hjertestativet kan gjenbrukes etter vask.
- Lag lagerløsning som vist i tabell 1. Oppbevar lagerløsningene ved 4 °C.
- På eksperimentdagen
MERK: Celleisolasjonsbuffer (CIB) inneholder (i mM) 130 NaCl, 5,4 KCl, 0,5 MgCl2,0,33 NaH2PO4,22 glukose, 40 enheter/ml insulin og 25 HEPES (pH justert til 7,4 med NaOH); og Tyrode-oppløsningen inneholder (i mM) 140 NaCl, 5,4 KCl, 1,8 CaCl2,0,5 MgCl2, 0,33 NaH2PO4, 5,5 glukose og 5,0 HEPES (pH justert til 7,4 med NaOH).- Klargjør CIB. Varm 160 ml destillert vann (DW) med en mikrobølgeovn til rundt 32 °C og tilsett deretter 20 ml 10X CIB. Etter tilsetning av 0,79 g glukose og 10 μL insulinoppløsning, juster pH ved hjelp av 1 M NaOH og ta med til 200 ml med DW.
- Forbered enzymblandingsløsningen (enzymblanding). Tilsett 30 mg kollagenase, 1,8 mg trypsin, 1,8 mg protease og 90 μL 100 mM CaCl2 lagerløsning til 30 ml CIB (endelig Ca2+ konsentrasjon er 0,3 mM), bland og hold den på is. Hos mus <4 uker gammel, reduser trypsin og protease til 0,9 mg10. Varm ved 37 °C i et vannbad før bruk.
- Klargjør CIB-Ca2+-BSA-løsningen. Tilsett 30 mg BSA og 90 μL 100 mM CaCl2 lagerløsning til 15 ml CIB (endelig Ca2+ konsentrasjon er 1,2 mM), bland, filtrer gjennom et 20-μm filter, og hold det på is.
- Klargjør CIB-EGTA-løsningen. Etter å ha laget løsningene beskrevet i trinn 1.2.2 og 1.2.3, tilsett 400 mM EGTA lagerløsning til gjenværende CIB ved en 1:1000 fortynning (endelig EGTA-konsentrasjon er 0,4 mM), og bland. Fyll 35 mm kulturrett og hjertestativrett med CIB-EGTA og hold dem på is.
- Hell ca. 20 ml CIB-EGTA i et 30 ml glassbeger og stå en plastoverføringspipette i begeret, og hold den på is.
- Forbered Tyrode-løsningen. Tilsett 100 ml 10X Tyrode til 800 ml DW og varm den opp med en mikrobølgeovn til rundt 32 °C. Etter å ha tilsetter 0,99 g glukose og 1,8 ml 1 M CaCl2, juster pH ved hjelp av 1 M NaOH og ta med til 1000 ml med DW.
- Forbered cellerefusjonsløsningen. Tilsett 30 mg BSA og 300 μL 50X antibiotika til 15 ml Tyrode-oppløsning.
- Forbered sprøyter. Fyll 20 ml sprøyten som er koblet til det fleksible forlengelsesrøret og den markerte injeksjonsnålen med CIB-EGTA. Fyll 30 ml sprøyten med den oppvarmede enzymblandingen. Hold dem begge ved 37 °C til like før bruk.
- Forbered perfusjonsplaten. Forvarm varmematten under et stereoskopisk mikroskop. Plasser perfusjonsplaten (lokket på en kulturplate med flere brønner) på den forhåndsvarmede varmematten. Forvarm den vaskulære klemmen ved å plassere den i perfusjonsplaten til bruk. Plasser 60 mm kulturfatet for pipettering og cellesil på den forhåndsvarmede varmematten også.
2. Antegrad perfusjon av musehjertet
MERK: Plastoverføringspipetten som brukes til å suge hjertet, skal være myk og ikke være skarpt avsmalnet mot spissen. Velg en liten vaskulær klemme med serrasjon. De anbefalte instrumentene er oppført i Materiallisten.
- Eksisjon av musehjertet og klemming av aorta
MERK: De voksne musene (>8 uker gamle) bør avlives ved en overdose natrium pentobarbital (>300 mg/kg, intraperitoneal [i.p.] injeksjon) med heparin (8000 enhet/kg).- Slukt musehjertet raskt ved å suge.
- Åpne thoraxhulen raskt for å eksponere hjertet. Klipp plastoverføringspipetten, hvis spiss er omtrent like stor som, eller litt mindre enn, det eksponerte hjertet (vanligvis på et sted ca. 1 cm fra 0,5 ml-merket mot spissen, men det avhenger av hjertestørrelsen).
- Suge hjertet inn i pipetten, heve pipetten for å skape nok plass til å sette inn saks, og utskille hjertet med buet saks fra dorsalsiden, unngå å skade atriene.
- Overfør straks det utskilte hjertet til 30 ml glassbegeret som inneholder iskjølt CIB-EGTA for å stoppe sammentrekningen. Denne prosedyren tar vanligvis <1 min.
- Rengjøring rundt aorta
- Overfør hjertet til en 35 mm kulturrett fylt med iskjølt CIB-EGTA og fjern lungen og andre synlige vev, og overfør deretter det grovt rensede hjertet til hjertestativet fylt med kjølt CIB-EGTA og plasser det med toppen ned.
- Under det stereoskopiske mikroskopet fjerner du fett- og bindevevet for å rengjøre rundt aorta. Hvis lengden på kuttet aorta er for lang, inkludert brachiocephalic arterien, venstre vanlig halspulsåre eller venstre subklave arterie, kutt av aorta like under brachiocephalic arterien for å forkorte den for å fortsette til neste trinn. Denne prosedyren tar vanligvis ca. 4 min.
- Klem aorta og plasser det klemte hjertet på perfusjonsplaten
- Plasser hjertet i hjertestativet under mikroskopet. Operatøren skal møte den fremre overflaten av hjertet, plukke opp enden av aorta med pinsett, og klemme aorta nær atriene med en liten vaskulær klemme mens du forsiktig skyver ned på aorta litt.
- Plasser det klemte hjertet på perfusjonsplaten med den fremre siden opp, og dekk det deretter med noen dråper CIB-EGTA for å hindre at det tørker ut. Denne prosedyren tar vanligvis <20 s.
- Slukt musehjertet raskt ved å suge.
- Antegrad perfusjon av hjertet
MERK: Først parfymerer du hjertet med CIB-EGTA for å slippe ut blod og forhindre koagulering.- Sett inn injeksjonsnålen og start perfusjon for å slippe ut blod
- Sett den 20 ml sprøyten fylt med forhåndsvarslet CIB-EGTA koblet til det fleksible forlengelsesrøret og en merket injeksjonsnål på infusjonspumpen. Start pumpen med en langsom hastighet på 0,5 ml/min for å fylle nålen og røret forsiktig med CIB-EGTA og sørg for å forhindre at luft kommer inn i røret.
- Plasser injeksjonsnålen på perfusjonsplaten med den kortere siden av diagonalformen foran. Skyv nålen mot toppen av hjertet til den berører den, og sett deretter nålen forsiktig nær toppen av venstre ventrikel inn i ventrikkelkammeret uten å vri. Ikke løsne kanylen fra platen mens du utfører innsetting.
- Se på det røde merket for å beregne dybden på nåleinnsettingen. Når nåleinnsettingen er fullført, skal blod som strømmer fra koronararterien begynne å bli utladet.
- Fest injeksjonsnålen på platen med tape, og øk pumpehastigheten til 1 ml/min. Denne prosedyren tar vanligvis ca. 30 s. Hvis hjertet er perfundert vellykket, kan strømmen av CIB-EGTA i kapillæren like under epikardiet ses under mikroskopet.
- Perfusjon av hjertet med enzymblanding
MERK: Under enzymatisk perfusjon kan dybden på den innsatte kanylen overvåkes ved å kontrollere det røde merket på kanylen.- Etter å ha parfymert 2-3 ml CIB-EGTA for å fullstendig slippe ut blod fra koronararterien, bytt perfusate til enzymblanding. Unngå å la luftbobler komme inn i røret. Kontroller strømmen av enzymblandingen, og sørg for at injeksjonsnålen ikke har kommet ut ved å sjekke posisjonen til det røde merket.
- Etter at 1-2 ml er perfusert, øker du pumpehastigheten til 1,5 ml/min. Fjern det akkumulerte perfusatet som inneholder blod som har strømmet ut av hjertet med en pipette fra tid til annen.
MERK: Over tid vil myokardveggen bli gjennomsiktig noen steder og vises flettet, noe som er et tegn på fordøyelsen av den ekstracellulære matrisen etter vellykket perfusjon. Et annet tegn er omstart av atrieslag forårsaket av tilstedeværelsen av Ca2 + i enzymblandingen. - Stopp perfusjon når det totale volumet av enzymblandingen perfundert er 10 ml.
- Sett inn injeksjonsnålen og start perfusjon for å slippe ut blod
3. Isolering av individuelle hjerteceller
- Dissosierende hjerteceller
- Etter perfusjon med enzymblandingen, overfør 10 ml av enzymblandingen som gjenstår i sprøyten til en 60 mm kulturrett plassert på varmematten og tilsett 20 mg BSA (0,2% BSA i enzymblanding). Det fallne BSA-pulveret skal oppløses umiddelbart ved å virvle forsiktig med en hånd. Fjern injeksjonsnålen og den vaskulære klemmen fra hjertet.
- Skill ventriklene og atriene og overfør hver i enzymblandingen supplert med 0,2% BSA på varmematten.
- Isolering av ventrikulære myocytter
- Ta tak i epikardiet med to pinsett, og riv forsiktig og trekk ventriklene fra side til side i enzymblandingen supplert med 0,2% BSA i små biter. Disperger cellene med skånsom pipettering (ca. 30 ganger).
- Filtrer det ufordøyde avfallet gjennom en 100-μm nettingcellesil, og overfør filtratet til et 15 ml sentrifugerør for sentrifugering ved 50 × g i 3 min. Resuspend pelleted cardiomyocytes i prewarmed CIB-Ca2 +-BSA løsning, inkuber den i 5 min ved 37 °C, og sentrifuger den deretter ved 14 × g i 3 minutter.
- Resuspend den endelige utfelte kardiomyocytter i celle resuspension løsning (sammensetningen er oppført i tabell 2) og hold den ved 37 °C.
- Isolering av atrie-myocytter
- Under den siste sentrifugeringen for den ventrikulære myocyttfraksjonen i trinn 3.2, begynn å isolere atrie-myocyttene. Overfør atrien, lagret som i trinn 3.1, til den forhåndsvarmede CIB-Ca2+-BSA-løsningen, riv den i stykker og fjern cellene ved å pipettere med pipettespiss ved 10 μL på varmematten.
- Sentrifuger celleblandingen ved 14 × g i 3 min og resuspender de pelleterte atriecellene med celle resuspension løsning.
- Isolasjon og kultur av hjertefibroblaster
- Overfør supernatanten fra den første sentrifugeringen i trinn 3,2 til et annet 15 ml sentrifugerør, og sentrifuger ved 190 × g i 5 minutter. Vask de utfelte cellene to ganger med sentrifugering i Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM), og suspender deretter cellene med DMEM supplert med 10% fosterbovint albumin (FBS) og antibiotika.
- Plate den endelige cellefraksjonen i en kulturflaske (25 cm2) og la cellene holde seg til bunnen av kolben i en fuktet atmosfære på 95% luft og 5% CO2. Etter 90 min inkubasjon, kast de uattrerte cellene og legg til friskt kulturmedium. Celler bør nærme seg samløp etter ca 4 dager, og da bør de forsterkes ved trypsinisering og frø til nye kulturretter.
4. Høsting av proteiner fra atria og ventrikler
- Etter perfusjon, skille atria og ventrikler, og homogenisere dem i lysis buffer i et forhold på 10 mg vev vekt til 100 μL buffer ved hjelp av en liten grinder i en 1,5 ml prøverør.
- Hold homogenatet i is i 40 min med virvelblanding hver 10 min for å trekke ut proteiner, og sentrifuger deretter røret ved 15000 × g i 20 min ved 4 °C. Oppbevar den supernatante fraksjonen ved -80 °C som en proteinprøve.
5. Immunstaining av isolerte hjerteceller
MERK: Immobilisering av ikke-tilhenger kardiomyocytter til bunnen av celleavbildningsfatet ved hjelp av biologisk lim er nødvendig.
- Vedheft av isolerte kardiomyocytter til en glassbunnskulturrett
- Før du starter celleisolasjon, må du belegge glassbunnskulturretten med biologisk lim (f.eks. cell-tak) i henhold til produsentens instruksjon, skyll med DW og lufttørk ved romtemperatur.
- Etter resuspensjon av de isolerte kardiomyocyttene i CIB-Ca2 +-BSA-løsningen, slipp cellefjæringen på bunnen av limbelagte retter, og inkuber i 20 minutter ved romtemperatur uten agitasjon.
- Immunstaining
- Tallerken de isolerte kardiomyocyttene på en glassbunnsfat forlakkert med biologisk lim og hold den ved romtemperatur i 40 minutter slik at cellene kan feste seg til parabolen. Kultur hjertefibroblaster i bunnglasskulturretter.
- Skyll celler med fosfatbufret saltvann (PBS), og fest dem med 4% paraformaldehyd (PFA) i 5 minutter med risting. Vask de faste cellene med PBS i 10 min tre ganger, og inkuber dem i blokkeringspermeabiliseringsløsning i 60 minutter ved romtemperatur med risting.
- Sondeceller med primært antistoff fortynnet i blokkeringspermeabiliseringsløsning i 60 min ved romtemperatur eller over natten ved 4 °C. Vask cellene med PBS i 10 min tre ganger, og inkuber deretter med fluorescensmerket sekundært antistoff i 60 minutter ved romtemperatur.
- Etter å ha vasket dem tre ganger med PBS i 10 min, flekk kjernen med DAPI (1:10000 fortynning i PBS). Analyser fluorescerende signaler ved hjelp av et konfokalt laserskanningsmikroskop.
6. Klemmeopptak i hele celler
- Fabriker patchelektrodene fra en glasskapillær ved hjelp av en horisontal mikroelektrodtrekker. Elektrodens motstand varierte fra 2 til 4 MΩ når den var fylt med en K+-rik pipetteløsning (tabell 2). Overfør en aliquot av isolerte kardiomyocytter til et opptakskammer montert på scenen til et invertert mikroskop superfused med Tyrode med en hastighet på 1 ml / min ved 36-37 ° C.
- Registrer handlingspotensialer ved hjelp av den perforerte patch-clamp-metoden med K+-rik pipetteløsning som inneholder 30 mg / ml amfotericin B ved å bruke strømpulser på 5-10 ms i varighet med en hastighet på 1 Hz via patchelektroden.
7. Vestlige blotanalyser
- I denne studien, utfør en vestlig blot analyse av småmolekylære vektproteiner, som atriemarkør atrie natriuretisk peptid (ANP).
- Løs opp proteinprøven i den endelige konsentrasjonen av 1X Prøvebuffer, 2% 2' mercaptoetanol, og denaturer proteinene i 60 min ved 37 °C. Last 20 μg protein inn i hver brønn, og utfør elektroforese i løpebuffer med 20 mA per gel i 120 min.
- Overfør proteinet til en PVDF-membran i overføringsbuffer ved 10 V i 40 min. Vask den overførte membranen to ganger med TBST i 5 min, blokker deretter med 5 % skummet melk i TBST i 60 minutter ved romtemperatur, og sonde med det primære antistoffet oppløst i TBST over natten ved 4 °C.
- Vask membranen 5 ganger med TBST i 7 min, og inkuber den med det sekundære antistoffet fortynnet i TBST i 120 minutter ved romtemperatur.
- Etter å ha vasket membranen 5 ganger med TBST i 7 minutter, visualiser signalene med en chemi-luminescensanalyse og analyser dem med en lumino-bildeanalysator.
Representative Results
Prinsippet om denne metoden er enkelt: perfusate strømmer fra venstre kammer, aortaventilen åpnes, og perfusatet løper inn i koronararterien i samme retning som blodløpet, siden aorta er lukket ved klemming, noe som muliggjør dyp perfusjon av myokardiet for å fordøye den ekstracellulære matrisen.
Ventrikulære myocytter som er fersk isolert med den nåværende metoden, er vist i figur 1A. Figur 1B viser forstørrede bilder av ventrikulære og atrie-myocytter. Denne isolasjonsprosedyren resulterte i et høyt utbytte (70% -80%) av stangformede quiescent ventrikulære myocytter fra voksne mus (8-10 uker), som var tilgjengelige innen omtrent 5 timer etter isolasjon (Figur 1C), et lignende intervall som når du bruker den tradisjonelle Langendorff-baserte prosedyren7. Forholdet mellom nyisolerte levedyktige celler var imidlertid lavere hos eldre mus av >2 år (Figur 1C). Totalt antall ventrikulære myocytter oppnådd per voksen hjerte ved hjelp av denne protokollen var ca. 3 x 106 celler, som var lik verdien som tidligere ble rapportert7,12. Handlingspotensialene som er registrert i ventrikulære og atriemessige myocytter (figur 1D) var lik de i celler oppnådd ved den Langendorff-baserte metoden10. En immunsendende analyse bekreftet at den sarkomeriske strukturen til ventrikulære myocytter var godt organisert med en tydelig synlig cellemembran (figur 2A). De enkelte kardiomyocyttene som er isolert med denne metoden, kan brukes direkte i eksperimenter, for eksempel en elektrofysiologisk analyse10 eller immunsende eksperiment.
Hjertefibroblaster finnes i interstitielle rom. Tilstrekkelig fordøyelse av den ekstracellulære matrisen resulterer i isolasjon av disse cellene. De isolerte hjertefibroblaster sprer seg under kulturforhold og kan passeres flere ganger eller lagres i flytende nitrogen i en passende cellereservoarløsning. Figur 2B viser at de fleste av de kultiverte hjertefibroblaster hadde forvandlet seg til myofibroblaster under subkultur, som bekreftet av det økte uttrykket for α glatt muskelhandling i13,14. Også hjerteforfedrene kan isoleres med dagens metode og dyrkes i passende kulturmedium, som begynner å slå automatisk10,15.
Homogenisering av det robuste myokardiet er ikke lett, spesielt for hjertevev fra eldre mus, som har en stor mengde ekstracellulære fibre. Etter antegrad perfusjon kan protein fra atri og ventrikler lett homogeniseres i lysisbufferen med lyskraft for å trekke ut proteiner. En vestlig blotanalyse viste det spesifikke uttrykket for ANP i atria, men ikke i ventrikler fra voksne (20 uker gamle) og eldre (108 uker gamle) mus (Figur 3).
Figur 1. Isolerte kardiomyocytter fra mus. A. Ventrikulære myocytter nyisolert med antegrad perfusjon, med bilder ervervet med lav forstørrelse. Etter den endelige vasken ble kardiomyocyttene resuspendert med 2 ml celle resuspension løsning, hvorav 100 μL ble droppet på glassbunnens kulturrett og celleoppgjør ventet. Bar, 100 μm.B. Forstørrede bilder av isolerte ventrikulære myocytter (øvre) og atrie-myocytter (lavere). Bar, 100 μm.C. Isolerte celler ble suspendert i celle resuspension løsning og lagret ved 37°C i ønsket periode, og antall levende ventrikulære myocytter ble telt i 10-15 felt under et mikroskop. Avrundede celler ble ansett å ha blitt irreversibelt skadet eller døde16. Grønne, blå og røde symboler ble hentet fra 3 mus ved 8-10 uker gamle, og svarte symboler var fra 106 uker gammel mus. Gult symbol angir gjennomsnittet for hver gruppe. D. Representative handlingspotensialer registrert fra ventrikulære (svarte) og atrie (røde) myocytter av 8-10 mus. Dataene ble hentet fra cellene ca. 3 timer etter isolasjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2. Immunostaining for α-aktinin i isolerte mus ventrikulære myocytter og α glatt muskel actin i dyrket mus hjertefibroblaster. A. Konfokal laserskanning mikroskopi av immunostaining for α-aktinin (grønn), DAPI-farging for kjerner (blå) og et DIC-bilde av ventrikulære myocytter isolert fra musehjerte med antegrad perfusjon. Bar, 50 μm.B. Immunostaining for α glatt muskel aktin (grønn), DAPI farging for kjerner (blå) og et DIC-bilde av hjertefibroblaster isolert fra musehjerte med antegrad perfusjon. Hjertefibroblaster ble dyrket i fire dager. Bar, 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3. Vestlige flekkanalyser av ANP i atrier og ventrikler. Vestlige blotteranalyser for atriemarkøren atrie natriuretisk peptid (ANP) i atria (A) og ventrikler (V) fremstilt fra voksne (20 uker) og i alderen (108 uker) hjerter. ANP er til stede i atriene, men fraværende i ventriklene. Bruk glyseraldehyd 3-fosfat dehydrogenase (GAPDH) som et kontrollhusholdende protein. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Lagerløsninger for isolering av hjerteceller | |
| 10X CIB (500 ml) | |
| NaCl | 37,99 g |
| KCI | 2,01 g |
| 1 M MgCl2 | 2,5 ml |
| NaH2Po4 | 0,23 g |
| HEPES | 29,79 g |
| Dw | Fyll opptil 500 ml |
| 100 mM CaCl2 lager soution | |
| CaCl2 | 100 mM |
| 400 mM EGTA lagerløsning | |
| EGTA | 400 mM |
| Insulinoppløsning | |
| insulin | 1 enhet/ml i 0,1 M HCl |
| 50X antibiotika lagerløsning (20 ml) | |
| penicillin | 100 mg |
| Streptomycin | 100 mg |
| Fenol rød | 1,5 g |
| Dw | 20 ml og steriliser med filtrering |
| 10X Tyrode-oppløsning (1000 ml) | |
| NaCl | 81,82 g |
| KCl | 4,03 g |
| 1 M MgCl2 | 5 ml |
| NaH2Po4 | 0,47 g |
| HEPES | 11,92 g |
| NaOH | 0,8 g |
| Dw | Fyll opptil 1000 ml |
| Lagerløsningin for immunstaining | |
| DAPI-aksjer | |
| DAPI | 2 mg/ml i metanol |
| Lagerløsninger for vestlige flekker | |
| HEPES-buffer (100 ml) | |
| NaCl | 0,88 g |
| 400 mM EGTA | 0,25 ml |
| HEPES | 0,24 g |
| 1M NaOH | justere pH til 7,4 |
| Dw | Fyll opptil 500 ml |
| Protease hemmere cocktail | |
| Komplett mini | 1 nettbrett |
| Dw | 0,4 ml |
Tabell 1. Beskrivelse av lagerløsningene. Oppbevar lagerløsninger ved 4 °C. Aliquot protease hemmere cocktail for lagring ved -20 °C.
| Løsninger for isoltaing av hjerteceller | |
| CIB (200 ml) | |
| 10X CIB | 20 ml |
| Insulinoppløsning | 0,01 ml |
| glukose | 0,79 g |
| 1M NaOH | pH justeres til 7,4 |
| Dw | Fyll opptil 200 ml |
| Enzymblandingsløsning (30 ml) | |
| Kollagenaliser type 2 | 30 mg |
| Trypsin | 1,8 mg |
| Protease | 1,8 mg |
| 100 mM CaCl2 lagerløsning | 0,09 ml |
| CIB | 30 ml |
| CIB-Ca2+-BSA (15 ml) | |
| Bsa | 30 mg |
| 100 mM CaCl2 lagerløsning | 0,18 ml |
| CIB | 15 ml |
| CIB-EGTA (150 ml) | |
| 400 mM EGTA lagerløsning | 0,150 ml |
| CIB | 150 ml |
| Tyrode-oppløsning (1000 ml) | |
| 10X Tyrode lagerløsning | 100 ml |
| glukose | 0,99 g |
| 1M CaCl2 | 1,8 ml |
| 1M NaOH | pH justeres til 7,4 |
| Dw | Fyll opptil 1000 ml |
| Celle resuspension løsning (15 ml) | |
| Bsa | 30 mg |
| 50X Antibiotika lagerløsning | 0,3 ml |
| Tyrode-løsning | 15 ml |
| Løsninger for immunoppfatning | |
| Celletilknytende løsning (0,3 ml) | |
| Celle-Tak | 0,01 ml |
| 0,1 M NaHCO3 (pH8.0) | 0,285 ml |
| 0,1 M NaOH | 0,005 ml |
| Blokkering-permeabilizatin løsning (10 ml) | |
| Fetal bovin serum | 1 ml |
| Triton X-100 | 1 ml |
| 10X PBS | 1 ml |
| Dw | 7 ml |
| K+ rik pipetteløsning | |
| Kalium aspartat | 70 mM |
| KCl | 50 mM |
| KH2Po4 | 10 mM |
| MgSO4 | 1 mM |
| ATP disodium salt | 3 mM |
| GTP litiumsalt | 0,1 mM |
| EGTA | 5 mM |
| HEPES | 5 mM |
| Koh | pH justeres til 7,2 |
| Løsninger for vestlige flekker | |
| Lysis buffer (1 ml) | |
| HEPES-buffer | 0,86 ml |
| Ikke-idet-P40 | 0,1 ml |
| Protease hemmere cocktail | 0,04 ml |
| Runnning buffer (1000 ml) | |
| 10X TG (0,25 M Tris og 1,92 M Glycin) | 100 ml |
| Sds | 1 g |
| Dw | 900 ml |
| Overføringsbuffer (1000 ml) | |
| 10X TG | 100 ml |
| metanol | 200 ml |
| Dw | 700 ml |
| Blotting buffer (TBST) (1000 ml) | |
| 5m nacl | 20 ml |
| 2M Tris-HCl (pH 7.5) | 5 ml |
| 10% Tween 20 | 10 ml |
| Dw | 965 ml |
Tabell 2. Beskrivelse av arbeidsløsningene for isolering av hjerteceller, immunstaining og vestlig blotting. Forbered alle arbeidsløsninger rett før eksperimentene.
Supplerende figur 1. Omrisset av celleisolasjonen. Strømningsdiagram over isolering av ventrikulære og atrie-myocytter og hjertefibroblaster fra et enkelt hjerte. Klikk her for å laste ned denne figuren.
Discussion
Siden hjertet er svært utsatt for iskemi, bør tiden det tar å utskille hjertet og fordype det i iskald CIB-EGTA for å stoppe sammentrekning holdes kort som mulig (<1 min). Dette er det første kritiske trinnet i denne metoden. Det andre kritiske trinnet gjelder hjertets retning. Den spesielle orienteringen av det utskilte hjertet i trinn 2.1.2 gjør det lettere å se og fjerne fett- og bindevevet rundt aorta. Etter rengjøring rundt aorta, plasser det klemte hjertet med fremre overflateside opp på perfusjonsplaten. Det siste kritiske trinnet innebærer innsetting av injeksjonsnålen. Når nålen beveger seg mot hjertet, bør injeksjonsnålen ikke løsnes fra perfusjonsplaten for å opprettholde en konstant avstand fra platen. Innsettingsposisjonen er nær toppen av venstre ventrikel. Sett nålen forsiktig uten vridning, siden slik vridning kan forstørre hullet. Dybden av innsetting av nålen kan estimeres ved å se på det røde merket. Hvis nålen er satt inn for dypt, kan spissen trenge gjennom ventrikulær septum og gå inn i høyre ventrikel eller gjennom mitralventilen og gå inn i venstre atrium. Etter å ha bekreftet blodets forsvinning fra koronararterien, bør nålen festes med tape til perfusjonsplaten.
En lengre aorta lengde gjør det vanskelig å klemme aorta i riktig posisjon. Hvis klemmen er for fjern fra atriene, kan hjertet rotere etter perfusat infusjon. For å forhindre dette, kutt av aorta like under brachiocephalic arterien for å forkorte aorta før klemming.
Hvis blodet ikke begynner å slippe ut etter perfusjon med en starthastighet på 0,5 ml/min, øker du hastigheten til 1 ml/min. Hvis det ikke hjelper, kan injeksjonsnålen plasseres feil, for eksempel i høyre ventrikel, ventrikulær septum eller venstre myokardvegg. I et slikt tilfelle, fjern nålen umiddelbart og prøv å sette den inn i nærheten av toppen av venstre ventrikel. Når du setter inn nålen flere ganger, kan fordøyde celler strømme ut fra de åpne hullene. Vær oppmerksom på at dette vanligvis ikke påvirker celleisolasjonen alvorlig.
Operatørene kan overvåke hele prosessen med antegrad perfusjon av hjertet ved hjelp av et stereoskopisk mikroskop for å observere endringene i farge og gjennomsiktighet og starte bankingen av atriene sammen med fordøyelsen. Totalt 10 ml enzymblanding bør være det maksimale som kreves, selv for et gammelt hjerte. I yngre hjerter (5-7 uker gamle) reduserer vi volumet til 9 ml, som ligner tilnærmingen via retrograd perfusjon med samme enzymblanding.
Supernatanten ved den endelige sentrifugeringen inneholder rusk, blodceller og ikke-myokytter, mens pelletsen hovedsakelig inneholder kardiomyocytter og forurensende ikke-myocytter, som fibroblaster og endotelceller. For å rense kardiomyocyttene er det nødvendig med flere trinn. Generelt bør pelletsen resuspenderes i riktig cellekulturmedium og forhåndsbelagt i 2 timer ved 37 °C på en vevscellekulturfat, og deretter forsiktig fjerne kardiomyocyttene ved pipettering og preplating for kultur.
Enzymblandingen inneholder en lav konsentrasjon på Ca2+ (0,3 mM). Vi inkuberer derfor fordøyde celler i CIB-Ca2+-BSA (1,2 mM Ca2+) før den endelige resuspensionen med cellerespenseringsløsningen (1,8 mM Ca2+), og den gradvise økningen i Ca2+ unngår å forårsake celleskade7. Så lenge de isolerte kardiomyocyttene er intakte (passivitetsceller uten sammentrekning) påvirker denne Ca2+-tilpasningsprosedyren ikke celle levedyktighet hos mus. Når de skadede cellene dør under denne inkubasjonen, får vi følgelig en sunn cellegruppe. På samme måte kan isolerte intakte atrie-myocytter (passiviserende celler uten uregelmessig sammentrekning) lagres i samme celleresuspensasjonsløsning. Imidlertid har atrie-myocyttene en tendens til å være mer delikate å bli lagret i forhold til ventrikulære myocytter.
I laboratoriet er denne isolasjonsmetoden nesten alltid vellykket med mindre nålen innsetting i venstre ventrikel mislykkes. Vi har også lyktes i å isolere celler fra det hypertrofierte hjertet fremstilt av kirurgisk tverrgående aorta innsnevring. Men hos eldre mus, som ofte har små hjerteinfarkt, opphører perfusjon noen steder, noe som resulterer i ufullstendig fordøyelse og dermed et lavt utbytte (figur 1C), som ligner på den Langendorff-baserte retrograde metoden. I slike tilfeller kan den forvrengte formen på hjertet observeres selv ved begynnelsen av perfusjon.
Denne antegrade perfusjonsmetoden er nyttig for å isolere hjerteceller fra mus i ulike aldre, men ikke større dyr, som kaniner og marsvin. Det kan være mulig å bruke denne metoden på nyfødte eller juvenile rotter før avvenning.
En av fordelene med denne antegrade perfusjonsmetoden er at den reduserer de tekniske hindringene forbundet med å bruke den Langendorff-baserte retrograde perfusjonsmetoden for små musehjerter. Tiden som kreves for perfusjon er ca. 7 min med 10 ml enzymer, denne korte fordøyelsesperioden øker levedyktigheten til cellene. I tillegg gjør det mulig å utføre perfusjon gjennom hjertets koronarsirkulasjon, selv etter at aortaventilene er fordøyd. Isolering av atrie myocytter krever vanligvis Langendorff-basert retrograd perfusjon og videre inkubasjon med enzymer17. Denne antegrade perfusjonsmetoden kan imidlertid dypt parfyme vevet med enzymet for å isolere atrie myocytter.
I eksperimenter som bruker flere mus, bør Langendorff-apparatet rengjøres før det perfuserer neste hjerte. Men i den nåværende antegrade metoden, så lenge ønsket antall instrumentsett (f.eks. sprøyter nåler og perfusjonsplater) fremstilles på forhånd, kan perfusjon utføres kontinuerlig.
Vi rapporterer heri den grunnleggende metodikken for antegrad perfusjon av musehjertet ved hjelp av de samme løsningene som langendorff-basert retrograd perfusjonsmetode uten ekstra kjemikalier. Sammensetningen av perfusatet kan endres for å passe til formålet med eksperimentet, for eksempel å bruke et vaskemiddel som inneholder EGTA i stedet for enzymene for å lage et decellularisert hjerte18.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takker T. Yamamoto og Y. Mori for deres hjelp i de morfologiske eksperimentene. Dette arbeidet ble støttet av en Grant-in-Aid for Scientific Research (C) fra Japan Society for the Promotion of Science (18K06871 til M.O.K. og 17K08536 til H.M.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amphotericin B | Wako Pure Chemical Industries, Japan | ||
| Alexa Fluor 488 anti-mouse IgG antibody | Molecular Probes, USA | A11001 | Fluorescent-labeled secondary antibody. (1:400 dilution for immunostaining) |
| Anti-α-actinin (ACTN) | Sigma-Aldrich, USA | A7811 | Mouse monoclonal antibody (clone EA-53). (1:400 dilution for immunostaining) |
| Anti-atrial natriuretic peptide (ANP) | Merck-Millipore, USA | AB5490-I | Rabbit polyclonal antibody (1:2000 dilution for Western blots) |
| Anti-Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) | Cell Signaling Technology, USA | 2118 | Mouse monoclonal antibody (1:10000 dilution for Western blots) |
| Anti-smooth muscle actin (SMA) | Dako, Denmark | M0851 | Mouse monoclonal antibody (clone 1A4) (1:400 for immunostaining) |
| Anti-rabbit IgG antibody | Amersham, GE Healthcare, USA | NA934 | Secondary antibody (1:10000 dilution for Western blots) |
| ATP disodium salt | Sigma-Aldrich, USA | A26209 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich, USA | A9418 | |
| Cell-Tak | Corning | 354240 | Biological material for adhesion of the cell or tissues |
| Chemi-Lumi One Super | Nacalai Tesque, Japan | 02230-14 | Chemiluminescent reagent used for western blotting. |
| Collagenase Type 2 | Worthington Biochemicals, USA | LS004176 | Choose the activity guaranteed to be greater than 300 unit/mg. |
| Complete Mini | Roche, Germany | 11836153001 | A mixture of several protease inhibitors. |
| 4'6'diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Nacalai Tesque, Japan | 11034-56 | Used for cell-impermeant nuclear stainig |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Nacalai Tesque, Japan | 08458-45 | including 4.5 g/L gluose |
| Extension tube | Top, Japan | X1-50 | Connect with syringe and injection needle for antegrade perfusion. |
| EPC-8 patch-clamp amplifier | HEKA, Germany | ||
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich, USA | F7524-500ML | |
| Glass capillaries | Narishige Scientific Instrument Lab., Japan | outside diameter 1.5 mm, inside diameter 0.9 mm | |
| GTP lithium salt | Sigma-Aldrich, USA | G5884 | |
| Horizontal microelectrode puller | Germany) | P-97 | |
| Heater mat | Natsume Seisakusho, Japan | KN-475-3-40 | Equipment to warm the perfusion plate. |
| Infusion pump | TERUMO, Japan | TE-311 | Infusion syringe pump for antegrade perfusion. |
| Injeciton needle (27 gauge) | TERUMO, Japan | NN-2719S | Needle for insertion into the left ventricle. |
| Insulin (from bovine pancrease) | Sigma-Aldrich, USA | I5500 | Dissolve in 0.1 M HCl. |
| Mini cordless grinder | Funakoshi, Japan | cG-4A | Small grinder for homogenizing tissue in 1.5 mL sample tube. |
| 4%-Paraformaldehyde Phosphate Buffer solution (4% PFA) | Nacalai Tesque, Japan | 09154-85 | |
| Penicillin G potassium | Nacalai Tesque, Japan | 26239-84 | |
| Phenol Red | Nacalai Tesque, Japan | 26807-21 | |
| 10X Phosphate Buffered Saline (pH7.4) (10X PBS) | Nacalai Tesque, Japan | 27575-31 | |
| Plastic multi-well culture plate | Falcon, USA | 353226 | Use the lid of the multi-well culture plate as the perfusion plate. |
| Plastic syringe (20 mL) | TERUMO, Japan | SS-20ES | Use for infusion of CIB-EGTA. |
| Plastic syringe (30 mL) | TERUMO, Japan | SS-30ES | Use for infusion of Enzyme-mix |
| Plastic transfer pipette | Sarstedt, Germany | 86.1171 | Cut the tip just before sucking mouse heart into the pipette. |
| Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane | Merck-Millipore, USA | IPVH00010 | Immobilin-P membrane (Transfer membrane for protein blotting) |
| Protease | Sigma-Aldrich, USA | P5147 | A mixture of three or more proteases including extracellular serine protease. |
| 4X Sample buffer solution | Fuji Film, Japan | 198-13282 | Contains 0.25 M Tris-HCl (pH 6.8), 8 w/v% SDS,40 w/v% Glyceroland 0.02 w/v% BPB |
| SDS polyacrylamide gel (15%) | Fuji Film, Japan | 193-14991 | |
| Streptomycin sulfate | Nacalai Tesque, Japan | 32237-14 | |
| 10X Tris-Glycine buffer solution (10X TG) | Nacalai Tesque, Japan | 09422-81 | Contains 0.25 M-Tris and 1.92 M-Glycine, (pH 8.3) |
| Trypsin | Sigma-Aldrich, USA | T8003 | Trypsin from bovine Type 1. |
| Vascular clamp | Karl Hammacher GmbH, Germany | HSE 004-35 | Small straight vascular clamp used for clamping aorta. |
| All other reagents | Nacalai Tesque, Japan |
References
- Langendorff, O. Untersuchungen am überlebenden Säugethierherzen. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 61, 291-332 (1898).
- Berry, M. N., Friend, D. S., Scheuer, J. Morphology and metabolism of intact muscle cells isolated from adult rat heart. Circulation Research. 26 (6), 679-687 (1970).
- Powell, T., Terrar, D. A., Twist, V. W. Electrical properties of individual cells isolated from adult rat ventricular myocardium. Journal of Physiology. 302, 131-153 (1980).
- Joshi-Mukherjee, R., et al. Structural and functional plasticity in long-term cultures of adult ventricular myocytes. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 65, 76-87 (2013).
- Benndorf, K., Boldt, W., Nilius, B. Sodium current in single myocardial mouse cells. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 404 (2), 190-196 (1985).
- Zhou, Y. Y., et al. Culture and adenoviral infection of adult mouse cardiac myocytes: methods for cellular genetic physiology. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 279 (1), 429-436 (2000).
- Shioya, T. A simple technique for isolating healthy heart cells from mouse models. Journal of Physiological Sciences. 57 (6), 327-335 (2007).
- Fiset, C., Clark, R. B., Larsen, T. S., Giles, W. R. A rapidly activating sustained K+ current modulates repolarization and excitation-contraction coupling in adult mouse ventricle. Journal of Physiology. 504, Pt 3 557-563 (1997).
- Ackers-Johnson, M., et al. A Simplified, Langendorff-Free Method for Concomitant Isolation of Viable Cardiac Myocytes and Nonmyocytes From the Adult Mouse Heart. Circulation Research. 119 (8), 909-920 (2016).
- Omatsu-Kanbe, M., Yoshioka, K., Fukunaga, R., Sagawa, H., Matsuura, H. A simple antegrade perfusion method for isolating viable single cardiomyocytes from neonatal to aged mice. Physiological Reports. 6 (9), 13688 (2018).
- Sambrano, G. R., et al. Navigating the signalling network in mouse cardiac myocytes. Nature. 420 (6916), 712-714 (2002).
- Limana, F., et al. bcl-2 overexpression promotes myocyte proliferation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (9), 6257-6262 (2002).
- Santiago, J. J., et al. Cardiac fibroblast to myofibroblast differentiation in vivo and in vitro: expression of focal adhesion components in neonatal and adult rat ventricular myofibroblasts. Developmental Dynamics. 239 (6), 1573-1584 (2010).
- Chistiakov, D. A., Orekhov, A. N., Bobryshev, Y. V. The role of cardiac fibroblasts in post-myocardial heart tissue repair. Experimental and Molecular Pathology. 101 (2), 231-240 (2016).
- Omatsu-Kanbe, M., Matsuura, H. A novel type of self-beating cardiomyocytes in adult mouse ventricles. Biochemical and Biophysical Research Communications. 381 (3), 361-366 (2009).
- Shan, D., Marchase, R. B., Chatham, J. C. Overexpression of TRPC3 increases apoptosis but not necrosis in response to ischemia-reperfusion in adult mouse cardiomyocytes. American Journal of Physiology. 294 (3), 833-841 (2008).
- Nakamura, H., et al. Presence and functional role of the rapidly activating delayed rectifier K(+) current in left and right atria of adult mice. European Journal of Pharmacology. 649 (1-3), 14-22 (2010).
- Milgroom, A., Ralston, E. Clearing skeletal muscle with CLARITY for light microscopy imaging. Cell Biology International. 40 (4), 478-483 (2016).
