En antegrad perfusionsmetod för kardiomyocytisolering från möss

Summary

Vi utvecklade enförenklad e-metod för att isolera högkvalitativa enskilda mushjärtaceller med antegrad perfusionstekniken. Denna metod är Langendorff-fri och användbar för att isolera ventrikulära och förmaksflimmer myocyter eller interstitiella celler, såsom hjärtfibroblaster eller stamceller.

Abstract

I grundforskning med hjälp av mushjärta är isolerande livskraftiga individuella kardiomyocyter ett avgörande tekniskt steg att övervinna. Traditionellt har isolerande kardiomyocyter från kaniner, marsvin eller råttor utförts via retrograd perfusion av hjärtat med enzymer med hjälp av en Langendorff-apparat. En hög grad av skicklighet krävs dock när denna metod används med ett litet mushjärta. En antegrad perfusion metod som inte använder en Langendorff apparat rapporterades nyligen för isolering av mus kardiomyocyter. Vi häri rapportera ett komplett protokoll för förbättrad antegrad perfusion av det strukna hjärtat att isolera enskilda hjärtceller från vuxna möss (8-108 veckor gammal). Antegrad perfusion utförs genom att injicera perfusat nära toppen av den vänstra ventrikeln i det strukna hjärtat, vars aorta klämdes fast med hjälp av en infusionspump. Alla procedurer utförs på en förvärmd värmematta under ett mikroskop, vilket gör det möjligt att övervaka injektions- och perfusionsprocesserna. Resultaten tyder på att Ventrikulärt och förmaksflimmer myocyter och fibroblaster kan vara väl isolerade från en enda vuxen mus samtidigt.

Introduction

I allmänhet innebär det första steget i isoleringen av dissekerad vävnad att vävnaden mals i små bitar, följt av matsmältningen av bindväven och extracellulär matris med enzymer. Kardiomyocyter kan dock inte isoleras med en sådan hackningsmetod, eftersom berikning med extracellulära matriskomponenter, inklusive kollagen och elastinfibrer, gör hjärtmuskeln för svår att hacka, och kardiomyocyterna är mycket känsliga för hypoxi och andra förändringar i mikromiljön. Således, med hjälp av Langendorff-baserade retrograd perfusionssystem¹, har en metod för att smälta den extracellulära matrisen med enzymer utvecklats för att isolera enskilda kardiomyocyter från hjärtat^2,3,4.

I musmodeller används Langendorff-baserad retrograd perfusion av hjärtat med enzymer också för isolering av enskilda kardiomyocyter^5,6,7,8. Cannulation av den lilla och tunna musaortan och dess montering på Langendorff-apparaten för att utföra bakåtsträvande perfusion kräver dock en hög grad av skicklighet, eftersom aortans diameter i det vuxna hjärtat är cirka 1,2 mm. Dessutom tar det tid att utföra flera experiment eftersom Langendorff-apparaten bör rengöras innan nästa hjärta perfuseras.

Som ett alternativ till bakåtsträvande perfusion utvecklades en ny metod för att isolera kardiomyocyter från ett vuxenmushjärta utan en Langendorff-apparat. Denna epokgörande metod baserades på antegrad perfusion av kranskärlen⁹. Vi förbättrade nyligen varje steg i detta antegrade protokoll, såsom fastspänning av stora kroppskort, nål insättningspunkten och temperaturkontroll, och övervakade alla perfusion förfaranden med ett mikroskop¹⁰. Vi häri rapportera i detalj förfining av denna antegrade perfusion metod för att förkorta tiden för isolering och ge en kompletterande video. I denna metod tar perfusionen av hjärtat cirka 7 min med 10 ml enzymer, och denna korta matsmältningsperiod ökar cellernas livskraft. Detta är en enkel metod för att isolera enstaka hjärtceller med hög kvalitet utan att kräva tillsats av kemikalier, såsom 2,3-butanedione monoxime (BDM)^6,11 eller taurin^5,8. Vi tror att denna metod kommer att sänka teknikens färdighetströskel och förbättra nyttan av muskardiomyocyter i grundforskningen.

Protocol

Alla djurförsök överensstämde med guiden för vård och användning av laboratoriedjur som publicerats av US National Institutes of Health (NIH Publication Nr. 85-23, reviderad 1996) och godkändes av den institutionella granskningsnämnden vid Shiga University of Medical Science Animal Care and Use Committee (godkänd nr 2019-3-7). Metoderna utfördes i enlighet med godkända riktlinjer.

1. Instrument och lösning

OBS: En översikt över försöksförfarandet illustreras i ett flödesdiagram(kompletterande figur 1). En infusionspump (eller sprutpump) ska användas för hjärtats antegradperfusion med ett enkelvägsflöde. En peristaltisk pump som skapar ett pulserande flöde rekommenderas inte.

1. Före den experimentella
   1. Märk injektionsnålen på en plats ca 3 mm från spetsen med nagellack. Efter att ha tillåtit det lufttorka, håll den i behållaren vid rumstemperatur. En röd eller ljus färg är önskvärd för att bekräfta djupet av införing i myokardiet under perfusion.
   2. Få hjärtat att stå genom att skära av locken på 1,5-, 0,5- och 0,2 ml provrör och fästa locken på botten av en 60 mm kulturrätt med dubbelhäftande tejp eller lim. Fixering av tre olika storlekslock i en maträtt gör det möjligt att välja lämplig enligt mushjärtas storlek. Detta hjärtstativ kan återanvändas efter tvätt.
   3. Gör lagerlösning enligt tabell 1. Förvara lagerlösningarna vid 4 °C.
2. På experimentdagen
   OBS: Cellisoleringsbuffert (CIB) innehåller (i mM) 130 NaCl, 5,4 KCl, 0,5 MgCl_2,0,33 NaH₂PO_4,22 glukos, 40 enheter/ml insulin och 25 HEPES (pH justerat till 7,4 med NaOH); och Tyrodlösning innehåller (i mM) 140 NaCl, 5,4 KCl, 1,8 CaCl_2,0,5 MgCl_2,0,33 NaH₂PO_4, 5,5 glukos och 5,0 HEPES (pH justerat till 7,4 med NaOH).
   1. Förbered CIB. Värm 160 ml destillerat vatten (DW) med en mikrovågsugn till cirka 32 °C och tillsätt sedan 20 ml 10X CIB. Efter tillsats av 0,79 g glukos och 10 μL insulinlösning justerar du pH med 1 M NaOH och ger 200 ml med DW.
   2. Förbered enzymblandningslösningen (enzymblandning). Tillsätt 30 mg kollagenas, 1,8 mg trypsin, 1, 8 mg proteas och 90 μL 100 mM CaCl_{2 stamlösning} till 30 ml CIB (slutlig Ca²⁺ koncentration är 0, 3 mM), blanda och håll den på is. Hos möss <4 veckor gamla, minska trypsin och proteas till 0,9 mg¹⁰. Värm vid 37 °C i ett vattenbad före användning.
   3. Förbered CIB-Ca²⁺-BSA-lösningen. Tillsätt 30 mg BSA och 90 μL 100 mM CaCl₂ stamlösning till 15 ml CIB (slutlig Ca²⁺ koncentration är 1,2 mM), blanda, filtrera genom ett 20-μm filter och håll det på is.
   4. Förbered CIB-EGTA-lösningen. Efter att ha gjort de lösningar som beskrivs i steg 1.2.2 och 1.2.3, tillsätt 400 mM EGTA-lagerlösning till den återstående CIB vid en utspädning på 1:1000 (slutlig EGTA-koncentration är 0,4 mM) och blanda. Fyll 35 mm kulturrätt och hjärtstativ med CIB-EGTA och håll dem på is.
      1. Häll cirka 20 ml CIB-EGTA i en 30 ml glasbägare och ställ en plastöverföringspipett i bägaren och håll den på is.
   5. Förbered Tyrodlösningen. Tillsätt 100 ml 10X tyrod till 800 ml DW och värm den med en mikrovågsugn till cirka 32 °C. Efter att ha tillstärt 0,99 g glukos och 1,8 ml 1 M CaCl₂, justera pH med 1 M NaOH och ta till 1000 mL med DW.
   6. Förbered cellens återsuspensionslösning. Tillsätt 30 mg BSA och 300 μL 50X antibiotika till 15 ml tyrodlösning.
   7. Förbered sprutor. Fyll sprutan på 20 ml som är ansluten till det flexibla förlängningsröret och den markerade injektionsnålen med CIB-EGTA. Fyll 30 ml sprutan med den uppvärmda enzymblandningen. Håll dem båda vid 37 °C tills strax före användning.
   8. Förbered perfusionsplattan. Förvärm värmarmattan under ett stereoskopiskt mikroskop. Placera perfusionsplattan (locket på en kulturplatta med flera brunnar) på den förvärmde värmemattan. Förvärm kärlklämman genom att placera den i perfusionsplattan tills den används. Placera 60 mm odlingsformen för pipetting och cellsilen på den förvärmde värmemattan också.

2. Antegrad perfusion av mushjärtat

OBS: Plastöverföringspipetten som används för att suga hjärtat ska vara mjuk och inte vara kraftigt avsmalnande mot spetsen. Välj en liten kärlklämma med serration. De rekommenderade instrumenten anges i materialförteckningen.

1. Excision av mushjärtat och klämning av aortan
   OBS: De vuxna mössen (>8 veckor gamla) ska avlivas genom en överdos av natriumpentobarbital (>300 mg/kg, intraperitoneal [i.p.] injektion) med heparin (8000 enhet/kg).
   1. Punktskatt mushjärtat snabbt genom att suga.
      1. Öppna brösthålan snabbt för att exponera hjärtat. Skär plastöverföringspipetten, vars spets är ungefär lika stor som, eller något mindre än, det exponerade hjärtat (vanligtvis på en plats cirka 1 cm från 0,5-mL-märket mot spetsen, men det beror på hjärtstorleken).
      2. Sug hjärtat i pipetten, lyft pipetten för att skapa tillräckligt med utrymme för att sätta in sax och punktskatt hjärtat med böjd sax från dorsalsidan, undvik att skada atria.
      3. Överför omedelbart det strukna hjärtat till den 30 ml glasbägare som innehåller iskyld CIB-EGTA för att stoppa sammandragningen. Denna procedur tar vanligtvis <1 min.
   2. Rengöring runt aortan
      1. Överför hjärtat till en 35 mm odlingsfat fylld med iskyld CIB-EGTA och ta bort lungan och andra synliga vävnader och överför sedan det grovt rengjorda hjärtat till hjärtstativet fyllt med kyld CIB-EGTA och placera den med toppen nere.
      2. Under det stereoskopiska mikroskopet, ta bort fettet och bindväven för att rengöra runt aortan. Om längden på den skurna aortan är för lång inklusive brachiocephalic gatan, den vänstra gemensamma halsartären eller den vänstra subclavian gatan, skära av aortan strax under brachiocephalic gatan för att förkorta den för att gå vidare till nästa steg. Denna procedur tar vanligtvis cirka 4 minuter.
   3. Spänna fast aortan och placera det fastklämda hjärtat på perfusionsplattan
      1. Placera hjärtat i hjärtstativen under mikroskopet. Operatören bör möta hjärtats främre yta, plocka upp änden av aortan med pincett och klämma in aortan nära atria med en liten vaskulär klämma samtidigt som du försiktigt trycker ner aortan lite.
      2. Placera det fastklämda hjärtat på perfusionsplattan med den främre sidan uppåt och täck det sedan med några droppar CIB-EGTA för att hindra det från att torka ut. Denna procedur tar vanligtvis <20-talet.
2. Antegrad perfusion av hjärtat
   OBS: Läs först in hjärtat med CIB-EGTA för att ladda ut blod och förhindra koagulering.
   1. Sätt in injektionsnålen och starta perfusion för att skriva ut blod
      1. Ställ in sprutan på 20 ml fylld med förvärmd CIB-EGTA ansluten till det flexibla förlängningsröret och en markerad injektionsnål på infusionspumpen. Starta pumpen med en långsam hastighet av 0,5 ml/min för att försiktigt fylla nålen och röret med CIB-EGTA och se till att förhindra att luft kommer in i röret.
      2. Placera injektionsnålen på perfusionsplattan med den kortare sidan av den diagonala formen framför. Skjut nålen mot hjärtats spets tills den vidrör den och sätt sedan försiktigt in nålen nära toppen av vänster ventrikel i ventrikulära kammaren utan att vrida. Lossa inte nålen från plattan när du sätter in den.
      3. Titta på det röda märket för att uppskatta djupet på nålinsättningen. När nålinsättningen är klar ska blod som strömmar från kranskärlen börja släppas ut.
      4. Fäst injektionsnålen på plattan med tejp och öka pumphastigheten till 1 ml/min. Denna procedur tar vanligtvis cirka 30 s. Om hjärtat perfused framgångsrikt, kan flödet av CIB-EGTA i kapillären strax under epicardium ses under mikroskopet.
   2. Perfusion hjärtat med enzymblandning
      OBS: Vid enzymatisk perfusion kan djupet på den insatta nålen övervakas genom att kontrollera det röda märket på nålen.
      1. Efter att ha perfuserat 2-3 ml CIB-EGTA för att helt släppa ut blod från kranskärlen, ändra perfusate till enzymblandning. Undvik att låta luftbubblor komma in i röret. Kontrollera flödet av enzymblandningen och se till att injektionsnålen inte har kommit ut genom att kontrollera det röda märkets position.
      2. När 1-2 ml har perfused, öka pumphastigheten till 1,5 ml/min. Ta bort det ackumulerade perfusatet som innehåller blod som har flödat ut ur hjärtat med en pipett då och då.
         OBS: Med tiden kommer myokardväggen att bli genomskinlig på vissa ställen och visas fläckig, vilket är ett tecken på matsmältning av den extracellulära matrisen efter framgångsrik perfusion. Ett annat tecken är omstarten av förmaksflimmer som orsakas av närvaron av Ca^{2 +} i enzymblandningen.
      3. Stoppa perfusion när den totala volymen av enzymblandningen perfused är 10 ml.

3. Isolering av enskilda hjärtceller

1. Dissociera hjärtceller
   1. Efter perfusion med enzymblandningen, överför 10 ml av enzymblandningen kvar i sprutan till en 60 mm odlingsform placerad på värmarmattan och tillsätt 20 mg BSA (0, 2% BSA i enzymblandning). Det tappade BSA-pulvret ska lösas upp omedelbart genom att försiktigt virvla med en hand. Ta bort injektionsnålen och kärlklämman från hjärtat.
   2. Separera ventriklarna och atria och överför var och en till enzymblandningen kompletterad med 0,2% BSA på värmemattan.
2. Isolering av ventrikulära myocyter
   1. Ta epicardiumet med två pincett och riv försiktigt ventriklarna från sida till sida i enzymblandningen kompletterad med 0,2% BSA i små bitar. Sprid cellerna med skonsam pipetting (cirka 30 gånger).
   2. Filtrera det osmälta skräpet genom en 100-μm nätcellssil och överför filtratet till ett 15 mL centrifugeringsrör för centrifugering vid 50 × g i 3 min. Återanvänd de pelleterade kardiomyocyterna i förvärmd CIB-Ca²⁺-BSA-lösning, inkubera den i 5 minuter vid 37 °C och centrifugera den sedan vid 14 × g i 3 min.
   3. Återanvänd de slutliga utfällda kardiomyocyterna i cellresuspensionslösning (kompositionen anges i tabell 2)och håll den vid 37 °C.
3. Isolering av förmaksflimmer myocyter
   1. Under den slutliga centrifugering för ventrikulär myocytfraktion i steg 3.2, börja isolera de förmaksflimmer myocyterna. Överför atria, lagrad enligt steg 3.1, till den förvärmda CIB-Ca²⁺-BSA-lösningen, riv den i bitar och dissociera cellerna genom att pipettera med pipettspets vid 10 μL på värmemattan.
   2. Centrifugera cellblandningen vid 14 × g i 3 min och återanvänd de pelleterade förmakscellerna med cellresuspensionslösning.
4. Isolering och odling av hjärtfibroblaster
   1. Överför supernatanten från den första centrifugering i steg 3,2 till ett annat 15 mL centrifugeringsrör och centrifugera vid 190 × g i 5 min. Tvätta de fällda cellerna två gånger med centrifugation i Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) och suspendera sedan cellerna med DMEM kompletterat med 10% fetala nötkreatur albumin (FBS) och antibiotika.
   2. Plätera den sista cellfraktionen i en odlingskolv⁽²⁵cm 2 ) och låt cellerna fästa på kolvens botten i en fuktad atmosfär av 95 % luft och 5 % CO₂. Efter 90 min inkubation, kassera de obundna cellerna och tillsätt färskt odlingsmedium. Celler bör nära confluency efter cirka 4 dagar, då de bör förstärkas genom trypsinization och sås till nya kulturrätter.

4. Skörda proteiner från atria och ventriklar

1. Efter perfusion, separera atria och ventriklarna och homogenisera dem i lysbuffert med ett förhållande av 10 mg vävnadsvikt till 100 μL buffert med en liten kvarn i ett 1,5 mL provrör.
2. Håll homogenatet i is i 40 minuter med virvelblandning var 10:e minut för att extrahera proteiner och centrifugera sedan röret vid 15000 × g i 20 min vid 4 °C. Förvara den övernaturliga fraktionen vid -80 °C som ett proteinprov.

5. Immunostaining av isolerade hjärtceller

OBS: Immobilisering av icke-vidhäftande kardiomyocyter till botten av celltomografin med biologiskt lim är nödvändig.

1. Vidhäftning av isolerade kardiomyocyter till en kulturrätt med glasbotten
   1. Innan cellisolering påbörjas, täck kulturrätten med glasbotten med biologiskt lim (t.ex. Cell-Tak) enligt tillverkarens anvisning, skölj med DW och lufttorka vid rumstemperatur.
   2. Efter återupplivning av isolerade kardiomyocyter i CIB-Ca^{2 +}-BSA-lösning, släpp cellupphängningen på botten av de limbelagda diskarna och inkubera i 20 minuter vid rumstemperatur utan agitation.
2. Immunostaining
   1. Plätera de isolerade kardiomyocyterna på en skål med glasbotten förbelagd med biologiskt lim och håll den vid rumstemperatur i 40 minuter så att cellerna kan fästa på skålen. Kultur hjärtfibroblaster i bottenglas kulturrätter.
   2. Skölj celler med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och fixera dem med 4% paraformaldehyd (PFA) i 5 minuter med skakningar. Tvätta de fasta cellerna med PBS i 10 min tre gånger och inkubera dem i blockerande permeabiliseringslösning i 60 minuter vid rumstemperatur med skakningar.
   3. Sondceller med primär antikropp utspädd i blockeringspermeabiliseringslösning i 60 minuter vid rumstemperatur eller över natten vid 4 °C. Tvätta cellerna med PBS i 10 min tre gånger och inkubera sedan med fluorescensmärkt sekundär antikropp i 60 min vid rumstemperatur.
   4. Efter att ha tvättat dem tre gånger med PBS i 10 min, färga kärnan med DAPI (1:10000 utspädning i PBS). Analysera fluorescerande signaler med hjälp av ett konfokalt laserskanningsmikroskop.

6. Inspelningar av plåsterklämma i hela cellen

1. Tillverka patchelektroderna från en glaskeillär med hjälp av en horisontell mikroelektroddragare. Elektrodens motstånd varierade från 2 till 4 MΩ när den fylldes med en K⁺-rik pipettlösning (tabell 2). Överför en alikvot isolerade kardiomyocyter till en inspelningskammare monterad på scenen i ett inverterat mikroskop som är superfuserat med tyrod med en hastighet av 1 ml/min vid 36–37 °C.
2. Registrera verkningspotentialer med den perforerade patchklämman med K⁺-rik pipettlösning som innehåller 30 mg/mL amphotericin B genom att applicera strömpulser på 5-10 ms i varaktighet med en hastighet av 1 Hz via patchelektroden.

7. Västerländska fläckar

1. I denna studie, utför en västerländsk fläck analys av små-molekylvikt proteiner, såsom förmaksflimmer markör förmaksflimmer natriuretic peptid (ANP).
2. Lös upp proteinprovet i den slutliga koncentrationen av 1X provbuffert, 2 % 2' merkaptoethanol, och denaturera proteinerna i 60 minuter vid 37 °C. Ladda 20 μg protein i varje brunn och utför elektrofores i löpbuffert med 20 mA per gel i 120 min.
3. Överför proteinet till ett PVDF-membran i överföringsbuffert vid 10 V i 40 min. Tvätta det överförda membranet två gånger med TBST i 5 min, blockera sedan med 5 % skummjölk i TBST i 60 minuter vid rumstemperatur och sond med den primära antikroppen upplöst i TBST över natten vid 4 °C.
4. Tvätta membranet 5 gånger med TBST i 7 min och inkubera det med den sekundära antikroppen utspädd i TBST i 120 min vid rumstemperatur.
5. Efter att ha tvättat membranet 5 gånger med TBST i 7 min, visualisera signalerna med en chemi-luminescence-analys och analysera dem med en lumino-bildanalysator.

Representative Results

Principen för denna metod är enkel: perfusatet strömmar från den vänstra kammaren, aortaventilen öppnas och perfusatet rinner in i kranskärlen i samma riktning som blodkörningen, eftersom aortan stängs av fastspänning, vilket möjliggör den djupa perfusionen av myokardiet för att smälta den extracellulära matrisen.

Ventrikulära myocyter som nyligen isolerats med denna metod visas i figur 1A. Figur 1B visar förstorade bilder av ventrikulära och förmaksflimmer myocyter. Denna isolering förfarande resulterade i en hög avkastning (70%-80%) av stavformade quiescenta ventrikulära myocyter från vuxna möss (8-10 veckor), som fanns tillgängliga inom ungefär 5 timmar efter isolering (figur 1C), ett liknande intervall som vid användning av det traditionella Langendorff-baserade förfarandet⁷. Förhållandet mellan nyligen isolerade livskraftiga celler var dock lägre hos åldrade möss med >2 år (figur 1C). Det totala antalet ventrikulära myocyter som erhållits per vuxenhjärta med detta protokoll var cirka 3 x 10⁶ celler, vilket liknade det värde som tidigare^{rapporterats 7,12}. De åtgärdspotentialer som registrerats i ventrikulära och förmaksflimmer myocyter (figur 1D) liknade dem i celler som erhållits med den Langendorff-baserade metoden¹⁰. En immunostaining analys bekräftade att den sarkomiska strukturen i ventrikulära myocyter var välorganiserad med ett tydligt synligt cellmembran (Figur 2A). De enskilda kardiomyocyter som isoleras med denna metod kan användas direkt i experiment, såsom en elektrofysiologisk^{analys 10} eller immunostaining experiment.

Hjärtfibroblaster finns i interstitiella utrymmen. Tillräcklig matsmältning av den extracellulära matrisen resulterar i isolering av dessa celler. De isolerade hjärtfibroblasterna förökar sig under odlingsförhållanden och kan passages flera gånger eller lagras i flytande kväve i en lämplig cellreservoarlösning. Figur 2B visar att de flesta av de odlade hjärtfibroblasterna hade omvandlats till myofibroblaster under subkulturen, vilket bekräftas av det ökade uttrycket av α-smooth muskelaktin^13,14. Hjärtprogenitorerna kan också isoleras med den nuvarande metoden och odlas i lämpligt odlingsmedium, som börjar slå^{automatiskt 10,15}.

Homogenisering av det robusta hjärtmuskeln är inte lätt, särskilt för hjärtvävnad från åldrade möss, som har en stor mängd extracellulära fibrer. Efter antegrad perfusion kan protein från atria och ventriklar lätt homogeniseras i lysbufferten med ljuskraft för att extrahera proteiner. En västerländsk fläckanalys visade det specifika uttrycket av ANP i atria men inte i ventriklar från vuxna (20 veckor gamla) och åldrade (108 veckor gamla) möss (Figur 3).

Figur 1. Isolerade kardiomyocyter från möss. A. Ventrikulära myocyter nyligen isolerade med antegrade perfusion, med bilder förvärvade med låg förstoring. Efter den slutliga tvättningen återanvändes kardiomyocyterna med 2 ml cell resuspension lösning, varav 100 μL släpptes på glasbotten kultur skålen och cell bosättning väntade. Bar, 100 μm.B. Förstorade bilder av isolerade ventrikulära myocyter (övre) och förmaksflimmer myocyter (lägre). Bar, 100 μm.C. Isolerade celler suspenderades i cellen återsuspension lösning och lagras vid 37°C under önskad period, och antalet levande Ventrikulärt myocyter räknades i 10-15 fält under ett mikroskop. Rundade celler ansågs ha varit irreversibelt skadade eller döda¹⁶. Gröna, blå och röda symboler erhölls från 3 möss vid 8-10 veckors ålder, och svarta symboler var från 106 veckor gammal mus. Gul symbol anger medelvärdet för varje grupp. D. Representativa åtgärdspotentialer registrerade från ventrikulära (svarta) och förmaksflimmer (röda) myocyter på 8-10 möss. Data erhölls från cellerna cirka 3 h efter isolering. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figur 2. Immunostaining för α-aktinin i isolerade mus ventrikulära myocyter och α-smooth muskel aktin i odlade mus hjärt fibroblaster. A. Konfokal laser scanning mikroskopi av immunostaining för α-aktinin (grön), DAPI färgning för atomkärnor (blå) och en DIC bild av Ventrikulärt myocyter isolerade från mus hjärtat med antegrade perfusion. Bar, 50 μm.B. Immunostaining för α-smooth muskel aktin (grön), DAPI färgning för atomkärnor (blå) och en DIC bild av hjärt fibroblaster isolerade från mus hjärta med antegrade perfusion. Hjärt fibroblaster odlades i fyra dagar. Bar, 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3. Västerländska fläckar analyser av ANP i atria och ventriklarna. Västerländska fläckar för förmaksmarkören för förmaksflimmer natriuretisk peptid (ANP) i atria (A) och ventriklarna (V) beredda från vuxna (20 veckor) och äldre (108 veckor) hjärtan. ANP är närvarande i atria men saknas i ventriklarna. Använd glyceraldehyd 3-fosfatdehydrogenas (GAPDH) som kontrollhushållningsprotein. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Stamlösningar för isolering av hjärtceller
10X CIB (500 ml)
NaCl (NaCl)	37,99 g
Kci	2,01 g
1 M MgCl2	2,5 ml
NaH2PO4	0,23 g
HEPES (HEPES)	29,79 g
Dw	Fyll upp till 500 ml
100 mM CaCl2 lager soution
CaCl2	100 mM
400 mM EGTA-lagerlösning
EGTA (egta)	400 mM
Insulinlösning
insulin	1 enhet/ml i 0,1 M HCl
50X Antibiotika stamlösning (20 ml)
penicillin	100 mg
Streptomycin	100 mg
Fenol röd	1,5 g
Dw	20 ml och sterilisera med filtrering
10X tyrodlösning (1000 ml)
NaCl (NaCl)	81,82 g
KCl (kcl)	4,03 g
1 M MgCl2	5 ml
NaH2PO4	0,47 g
HEPES (HEPES)	11,92 g
NaOH (naoh)	0,8 g
Dw	Fyll upp till 1000 ml
Lagersolutin för immunostaining
DAPI-aktier
DAPI (dapi)	2 mg/ml i metanol
Aktielösningar för västerländska blots
HEPES-buffert (100 ml)
NaCl (NaCl)	0,88 g
Egta på 400 mM	0,25 ml
HEPES (HEPES)	0,24 g
1M NaOH	justera pH till 7,4
Dw	Fyll upp till 500 ml
Proteashämmare cocktail
Komplett mini	1 tablett
Dw	0,4 ml

Tabell 1. Beskrivning av lagerlösningarna. Håll lagerlösningarna på 4 °C. Aliquot protease inhibitorer cocktail för lagring vid -20 °C.

Lösningar för isolering av hjärtceller
CIB (200 ml)
10X CIB	20 ml
Insulinlösning	0,01 ml
glukos	0,79 g
1M NaOH	pH-justering till 7,4
Dw	Fyll upp till 200 ml
Enzymblandningslösning (30 ml)
Kollagenas typ2	30 mg
trypsin	1,8 mg
proteas	1,8 mg
100 mM CaCl2 lagerlösning	0,09 ml
Cib	30 ml
CIB-Ca2+-BSA (15 ml)
Bsa	30 mg
100 mM CaCl2 lagerlösning	0,18 ml
Cib	15 ml
CIB-EGTA (150 ml)
400 mM EGTA-lagerlösning	0.150 ml
Cib	150 ml
Tyrodlösning (1000 ml)
10X Tyrod lagerlösning	100 ml
glukos	0,99 g
1M CaCl2	1,8 ml
1M NaOH	pH-justering till 7,4
Dw	Fyll upp till 1000 ml
Cell resuspension lösning (15 mL)
Bsa	30 mg
50X Antibiotika lagerlösning	0,3 ml
Tyrod lösning	15 ml
Lösningar för immunstaining
Cell vidhäftande lösning (0,3 ml)
Cell-Tak	0,01 ml
0,1 M NaHCO3 (pH8,0)	0,285 ml
0,1 M NaOH	0,005 ml
Blockeringspermeabinzatinlösning (10 ml)
Fetala nötkreatur serum	1 ml
Triton X-100	1 ml
10X PBS	1 ml
Dw	7 ml
K+ rik pipettlösning
Kalium aspartat	70 mM
KCl (kcl)	50 mM
KH2PO4	10 mM
MgSO4 (olika)	1 mM
ATP disodiumsalt	3 mM
GTP litiumsalt	0,1 mM
EGTA (egta)	5 mM
HEPES (HEPES)	5 mM
Koh	pH-justering till 7,2
Lösningar för västerländska blots
Lysis buffert (1 ml)
HEPES buffert	0,86 ml
Nonidet-P40	0,1 ml
Proteashämmare cocktail	0,04 ml
Runnning buffert (1000 mL)
10X TG (0,25 M Tris och 1,92 M glycin)	100 ml
Sds	1 g
Dw	900 ml
Överföringsbuffert (1000 ml)
10X TG	100 ml
metanol	200 ml
Dw	700 ml
Blotting buffert (TBST) (1000 mL)
5M NaCl	20 ml
2M Tris-HCl (pH 7.5)	5 ml
10% Interpolering 20	10 ml
Dw	965 ml

Tabell 2. Beskrivning av arbetslösningarna för isolering av hjärtceller, immunostaining och western blotting. Förbered alla arbetslösningar precis innan experimenten.

Kompletterande figur 1. Disposition av cellisoleringen. Flöde diagram över isolering av Ventrikulärt och förmaksflimmer myocyter och hjärt fibroblaster från ett enda hjärta. Klicka här för att ladda ner den här siffran.

Discussion

Eftersom hjärtat är mycket mottagligt för ischemi bör den tid det tar att ta bort hjärtat och fördjupa det i iskallt CIB-EGTA för att stoppa sammandragningen hållas kort som möjligt (<1 min). Detta är det första kritiska steget i den här metoden. Det andra kritiska steget gäller hjärtats riktning. Det strukna hjärtats särskilda orientering i steg 2.1.2 gör det lättare att se och ta bort fettet och bindväven runt aortan. Efter rengöring runt aortan, placera det klämda hjärtat med främre ytan sida upp på perfusionsplattan. Det sista kritiska steget innebär införandet av injektionsnålen. När nålen förs framåt mot hjärtat ska injektionsnålen inte lossna från perfusionsplattan för att hålla ett konstant avstånd från plattan. Insättningspositionen är nära toppen av den vänstra ventrikeln. Sätt försiktigt in nålen utan vridning, eftersom sådan vridning kan förstora hålet. Djupet av infogningen av nålen kan uppskattas genom att titta på det röda märket. Om nålen sätts in för djupt kan spetsen genomborra ventrikulär septum och komma in i den högra ventrikeln eller genom mitralventilen och gå in i vänster atrium. Efter att ha bekräftat blodets försvinnande från kranskärlen ska nålen fixeras med tejp till perfusionsplattan.

En längre aortalängd gör det svårt att klämma in aortan i rätt läge. Om klämman är för avlägsen från atria kan hjärtat rotera efter perfusatinfusion. För att förhindra detta, skär av aortan strax under den brachiocephalic artären för att förkorta aortan före fastspänning.

Om blodet inte börjar släppas ut efter perfusion vid en initial hastighet av 0,5 ml/min, öka hastigheten till 1 ml/min. Om det inte hjälper kan injektionsnålen placeras felaktigt, till exempel i höger ventrikel, ventrikulär septum eller vänster myokardvägg. I ett sådant fall, ta bort nålen omedelbart och försök att sätta in den igen nära toppen av den vänstra ventrikeln. När nålen sätts in flera gånger kan smälta celler strömma ut från de öppnade hålen. Observera att detta vanligtvis inte allvarligt påverkar cellisoleringen.

Operatörerna kan övervaka hela processen med antegrad perfusion av hjärtat med hjälp av ett stereoskopiskt mikroskop för att observera förändringarna i färg och transparens och starta om atrias slag tillsammans med matsmältningen. Totalt 10 ml enzymblandning bör vara det maximala som krävs, även för ett gammalt hjärta. I yngre hjärtan (5-7 veckor gamla) minskar vi volymen till 9 ml, vilket liknar tillvägagångssättet via retrograd perfusion med samma enzymblandning.

Supernatanten vid den slutliga centrifugationen innehåller skräp, blodkroppar och icke-myocyter medan pelleten huvudsakligen innehåller kardiomyocyter och förorenar icke-myocyter, såsom fibroblaster och endotelceller. För att rena kardiomyocyterna behövs fler steg. I allmänhet bör pelleten återanvändas i lämpligt cellkulturmedium och förberedas i 2 timmar vid 37 °C på en vävnadscellkulturrätt och sedan försiktigt avlägsna kardiomyocyterna genom pipettering och förberedelse för kultur.

Enzymblandningen innehåller en låg koncentration på Ca²⁺ (0,3 mM). Vi inkuberar därför smälta celler i CIB-Ca²⁺-BSA (1,2 mM Ca^{2 +}) innan den slutliga återsuspensionen med cellen återsuspension lösning (1,8 mM Ca^{2 +}), och den gradvisa ökningen av Ca^{2 +} undviker att orsaka cellskador⁷. Så länge de isolerade kardiomyocyterna är intakta (quiescenta celler utan sammandragning) påverkar detta Ca^{2 +}-anpassningsförfarande inte cellens livskraft hos möss. Eftersom de skadade cellerna dör under denna inkubation får vi följaktligen en hälsosam cellgrupp. På samma sätt kan isolerade intakta förmaksflimmer myocyter (quiescent celler utan oregelbunden sammandragning) lagras i samma cell resuspension lösning. Förmaksflimmer myocyter tenderar dock att vara mer känsliga att lagras jämför med ventrikulära myocyter.

I laboratoriet är denna isoleringsmetod nästan alltid framgångsrik om inte nålinsättningen i vänster ventrikel misslyckas. Vi har också lyckats isolera celler från det hypertrofierade hjärtat som framställs av kirurgiska tvärgående aorta förträngning. Men hos åldrade möss, som ofta har små hjärtinfarkter, upphör perfusion på vissa ställen, vilket resulterar i ofullständig matsmältning och därmed ett lågt utbyte (Figur 1C), liknande den Langendorff-baserade bakåtsträvande metoden. I sådana fall kan hjärtats förvrängda form observeras även i början av perfusionen.

Denna antegrad perfusionsmetod är användbar för att isolera hjärtceller från möss i olika åldrar men inte större djur, såsom kaniner och marsvin. Det kan vara möjligt att tillämpa denna metod på neonatala eller juvenila råttor före avrutning.

En av fördelarna med denna antegrade perfusionsmetod är att den minskar de tekniska hindren i samband med att använda Den Langendorff-baserade retrograda perfusionsmetoden för små mushjärtan. Den tid som krävs för perfusion är cirka 7 min med 10 ml enzymer, denna korta matsmältningsperiod ökar cellernas livskraft. Dessutom gör det det möjligt att utföra perfusion genom hjärtats kranskärlscirkulation, även efter att aortaventilerna har smälts. Isolering av förmaksflimmer myocyter kräver vanligtvis Langendorff-baserade retrograd perfusion och ytterligare inkubation med enzymer¹⁷. Denna antegrade perfusion strategi, dock, kan djupt granska vävnaden med enzymet att isolera förmaksflimmer myocyter.

I experiment med flera möss bör Langendorff-apparaten rengöras innan nästa hjärta perfuseras. I den nuvarande antegrademetoden bereds dock perfusion kontinuerligt så länge som önskat antal instrumentuppsättningar (t.ex. sprutor och perfusionsplattor) framställs i förväg.

Vi häri rapportera den grundläggande metoden för antegrad perfusion av mushjärtat med samma lösningar som Langendorff-baserade retrograd perfusion metod utan ytterligare kemikalier. Sammansättningen av perfusatet kan ändras för att passa syftet med experimentet, till exempel att använda ett tvättmedel som innehåller EGTA istället för enzymerna för att göra ett decellulärt hjärta¹⁸.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amphotericin B	Wako Pure Chemical Industries, Japan
Alexa Fluor 488 anti-mouse IgG antibody	Molecular Probes, USA	A11001	Fluorescent-labeled secondary antibody. (1:400 dilution for immunostaining)
Anti-α-actinin (ACTN)	Sigma-Aldrich, USA	A7811	Mouse monoclonal antibody (clone EA-53). (1:400 dilution for immunostaining)
Anti-atrial natriuretic peptide (ANP)	Merck-Millipore, USA	AB5490-I	Rabbit polyclonal antibody (1:2000 dilution for Western blots)
Anti-Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH)	Cell Signaling Technology, USA	2118	Mouse monoclonal antibody (1:10000 dilution for Western blots)
Anti-smooth muscle actin (SMA)	Dako, Denmark	M0851	Mouse monoclonal antibody (clone 1A4) (1:400 for immunostaining)
Anti-rabbit IgG antibody	Amersham, GE Healthcare, USA	NA934	Secondary antibody (1:10000 dilution for Western blots)
ATP disodium salt	Sigma-Aldrich, USA	A26209
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich, USA	A9418
Cell-Tak	Corning	354240	Biological material for adhesion of the cell or tissues
Chemi-Lumi One Super	Nacalai Tesque, Japan	02230-14	Chemiluminescent reagent used for western blotting.
Collagenase Type 2	Worthington Biochemicals, USA	LS004176	Choose the activity guaranteed to be greater than 300 unit/mg.
Complete Mini	Roche, Germany	11836153001	A mixture of several protease inhibitors.
4'6'diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Nacalai Tesque, Japan	11034-56	Used for cell-impermeant nuclear stainig
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	Nacalai Tesque, Japan	08458-45	including 4.5 g/L gluose
Extension tube	Top, Japan	X1-50	Connect with syringe and injection needle for antegrade perfusion.
EPC-8 patch-clamp amplifier	HEKA, Germany
Fetal bovine serum (FBS)	Sigma-Aldrich, USA	F7524-500ML
Glass capillaries	Narishige Scientific Instrument Lab., Japan		outside diameter 1.5 mm, inside diameter 0.9 mm
GTP lithium salt	Sigma-Aldrich, USA	G5884
Horizontal microelectrode puller	Germany)	P-97
Heater mat	Natsume Seisakusho, Japan	KN-475-3-40	Equipment to warm the perfusion plate.
Infusion pump	TERUMO, Japan	TE-311	Infusion syringe pump for antegrade perfusion.
Injeciton needle (27 gauge)	TERUMO, Japan	NN-2719S	Needle for insertion into the left ventricle.
Insulin (from bovine pancrease)	Sigma-Aldrich, USA	I5500	Dissolve in 0.1 M HCl.
Mini cordless grinder	Funakoshi, Japan	cG-4A	Small grinder for homogenizing tissue in 1.5 mL sample tube.
4%-Paraformaldehyde Phosphate Buffer solution (4% PFA)	Nacalai Tesque, Japan	09154-85
Penicillin G potassium	Nacalai Tesque, Japan	26239-84
Phenol Red	Nacalai Tesque, Japan	26807-21
10X Phosphate Buffered Saline (pH7.4) (10X PBS)	Nacalai Tesque, Japan	27575-31
Plastic multi-well culture plate	Falcon, USA	353226	Use the lid of the multi-well culture plate as the perfusion plate.
Plastic syringe (20 mL)	TERUMO, Japan	SS-20ES	Use for infusion of CIB-EGTA.
Plastic syringe (30 mL)	TERUMO, Japan	SS-30ES	Use for infusion of Enzyme-mix
Plastic transfer pipette	Sarstedt, Germany	86.1171	Cut the tip just before sucking mouse heart into the pipette.
Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane	Merck-Millipore, USA	IPVH00010	Immobilin-P membrane (Transfer membrane for protein blotting)
Protease	Sigma-Aldrich, USA	P5147	A mixture of three or more proteases including extracellular serine protease.
4X Sample buffer solution	Fuji Film, Japan	198-13282	Contains 0.25 M Tris-HCl (pH 6.8), 8 w/v% SDS,40 w/v% Glyceroland 0.02 w/v% BPB
SDS polyacrylamide gel  (15%)	Fuji Film, Japan	193-14991
Streptomycin sulfate	Nacalai Tesque, Japan	32237-14
10X Tris-Glycine buffer solution (10X TG)	Nacalai Tesque, Japan	09422-81	Contains 0.25 M-Tris and 1.92 M-Glycine, (pH 8.3)
Trypsin	Sigma-Aldrich, USA	T8003	Trypsin from bovine Type 1.
Vascular clamp	Karl Hammacher GmbH, Germany	HSE 004-35	Small straight vascular clamp used for clamping aorta.
All other reagents	Nacalai Tesque, Japan