Summary
Vi udviklede enforenklet metode til isolering af individuelle musehjerteceller af høj kvalitet ved antegrade perfusionsteknikken. Denne metode er Langendorff-fri og nyttig til isolering af ventrikulære og atrie myocytter eller interstitielle celler, såsom hjertefibroblaster eller forfædre.
Abstract
I grundforskning ved hjælp af musehjerte er isolering af levedygtige individuelle kardiomyocytter et afgørende teknisk skridt at overvinde. Traditionelt er isolerende kardiomyocytter fra kaniner, marsvin eller rotter blevet udført via retrograd perfusion af hjertet med enzymer ved hjælp af et Langendorff-apparat. Der kræves dog en høj grad af dygtighed, når denne metode bruges med et lille musehjerte. En antegrade perfusionsmetode, der ikke bruger et Langendorff-apparat, blev for nylig rapporteret til isolering af musdiomyocytter. Vi rapporterer heri en komplet protokol for forbedret antegrade perfusion af det punkterede hjerte for at isolere individuelle hjerteceller fra voksne mus (8 - 108 uger gamle). Antegrade perfusion udføres ved at injicere perfusate nær toppen af venstre hjertekammer af det punkterede hjerte, hvis aorta blev fastspændt ved hjælp af en infusionspumpe. Alle procedurer udføres på en forvarmet varmemåtte under et mikroskop, hvilket gør det muligt at overvåge injektions- og perfusionsprocesserne. Resultaterne tyder på, at ventrikulær og atrie myocytter, og fibroblaster kan være godt isoleret fra en enkelt voksen mus samtidigt.
Introduction
Generelt indebærer det første trin i enkeltcelleisoleringen af dissekeret væv at hakke vævet i små stykker efterfulgt af fordøjelsen af bindevævet og ekstracellulær matrix med enzymer. Kardiomyocytter kan dog ikke isoleres med en sådan snitningsmetode, da berigelse med ekstracellulære matrixkomponenter, herunder kollagen- og elastinfibre, gør myokardiet for svært at hakke, og kardiomyocytterne er meget følsomme over for hypoxi og andre ændringer i mikromiljøet. Ved hjælp af langendorff-baseret retrograd perfusionssystem1er der således udviklet en metode til at fordøje den ekstracellulære matrix med enzymer for at isolere individuelle kardiomyocytter fra hjertet2,3,4.
I musemodeller anvendes Langendorff-baseret retrograd perfusion af hjertet med enzymer også til isolering af individuelle kardiomyocytter5,6,7,8. Imidlertid kræver kannulationen af den lille og tynde museorta og dens montering på Langendorff-apparatet for at udføre retrograd perfusion en høj grad af dygtighed, da aortaens diameter i voksenhjertet er ca. 1,2 mm. Desuden tager det tid at udføre flere eksperimenter, da Langendorff-apparatet skal rengøres, før det næste hjerte gennemsyres.
Som et alternativ til retrograd perfusion blev der udviklet en ny metode til isolering af kardiomyocytter fra et voksent musehjerte uden et Langendorff-apparat. Denne epokegørende metode var baseret på antegrade perfusion af kranspulsårerne9. Vi har for nylig forbedret hvert trin i denne antegrade protokol, såsom fastspænding af aorta, nåleindføring og temperaturkontrol og overvåget alle perfusionsprocedurer med et mikroskop10. Vi heri rapporterer detaljeret om forfinelsen af denne antegrade perfusionsmetode for at forkorte tiden for isolation og give en supplerende video. I denne metode tager perfusionen af hjertet ca. 7 minutter med 10 mL enzymer, og denne korte fordøjelsesperiode øger cellernes levedygtighed. Dette er en simpel metode til isolering af enkelthjerteceller i høj kvalitet uden at kræve tilsætning af kemikalier, såsom 2,3-butanedion monoxime (BDM)6,11 eller taurin5,8. Vi mener, at denne metode vil sænke færdighedsgrænsen for teknikken og øge nytten af mus cardiomyocytes i grundforskning.
Protocol
Alle dyreforsøg var i overensstemmelse med vejledningen for pleje og brug af laboratoriedyr offentliggjort af US National Institutes of Health (NIH Publikation nr. 85-23, revideret 1996) og blev godkendt af det institutionelle review board for Shiga University of Medical Science Animal Care and Use Committee (godkendt nr. 2019-3-7). Metoderne blev udført i overensstemmelse med godkendte retningslinjer.
1. Instrumenter og løsning
BEMÆRK: En oversigt over forsøgsproceduren er illustreret i et rutediagram (Supplerende figur 1). En infusionspumpe (eller sprøjtepumpe) skal bruges til antegrade perfusion af hjertet med en envejsstrøm. En peristaltisk pumpe, der skaber et pulserende flow, anbefales ikke.
- Før den eksperimentelle
- Marker injektionsnålen på et sted ca. 3 mm fra spidsen med neglelak. Når du har ladet luften tørre, skal du holde den i beholderen ved stuetemperatur. En rød eller lys farve er ønskelig for at bekræfte dybden af indsættelsen i myokardiet under perfusion.
- Få hjertet til at stå ved at skære lågene af på 1,5-, 0,5- og 0,2 mL prøverør og fastgør lågene til bunden af en 60 mm kulturskål med dobbeltsidet tape eller klæbemiddel. Fiksering af tre forskellige størrelser låg i en skål gør det muligt at vælge den rigtige i henhold til størrelsen af musehjertet. Dette hjertestativ kan genbruges efter vask.
- Gør lagerløsningen som vist i tabel 1. Lagerløsningerne opbevares ved 4 °C.
- På eksperimentdagen
BEMÆRK: Celleisolationsbuffer (CIB) indeholder (i mM) 130 NaCl, 5,4 KCl, 0,5 MgCl2, 0,33 NaH2PO4, 22 glukose, 40 enheder/mL insulin og 25 HEPES (pH justeret til 7,4 med NaOH); og Tyrode opløsning indeholder (i mM) 140 NaCl, 5,4 KCl, 1,8 CaCl2, 0,5 MgCl2, 0,33 NaH2PO4, 5,5 glukose og 5,0 HEPES (pH justeret til 7,4 med NaOH).- Gør CIB klar. Varm 160 mL destilleret vand (DW) ved hjælp af en mikrobølgeovn til omkring 32 °C og tilsæt derefter 20 mL 10X CIB. Efter tilsætning af 0,79 g glukose og 10 μL insulinopløsning justeres pH-opløsningen ved hjælp af 1 M NaOH og bringes til 200 ml med DW.
- Forbered enzymblandingsopløsningen (enzymblanding). Der tilsættes 30 mg kollagen, 1,8 mg trypsin, 1,8 mg protease og 90 μL 100 mM CaCl2-stamopløsning til 30 ml CIB (endelig Ca2+ koncentration er 0,3 mM), bland og hold den på is. Hos mus <4 uger gamle, reducer trypsin og protease til 0,9 mg10. Varm ved 37 °C i et vandbad før brug.
- Forbered CIB-Ca2+-BSA-løsningen. Der tilsættes 30 mg BSA og 90 μL 100 mM CaCl2-stamopløsning til 15 ml CIB (den endelige Ca2+-koncentration er 1,2 mM), blandes, filtreres gennem et 20-μm filter og holdes på is.
- Forbered CIB-EGTA-løsningen. Efter at have fremstillet de løsninger, der er beskrevet i trin 1.2.2 og 1.2.3, tilsættes 400 mM EGTA-stamopløsning til den resterende CIB ved en 1:1000 fortynding (endelig EGTA-koncentration er 0,4 mM) og blandes. Fyld 35 mm kulturret og hjertestativret med CIB-EGTA og hold dem på is.
- Hæld ca. 20 mL CIB-EGTA i et 30 mL glasbæger og stå en plastoverførselspipette i bægeret og hold det på is.
- Forbered Tyrode løsning. Der tilsættes 100 mL 10X Tyrode til 800 mL DW, og den opvarmes med mikrobølgeovn til ca. 32 °C. Efter tilsætning af 0,99 g glucose og 1,8 mL 1 M CaCl2, justere pH ved hjælp af 1 M NaOH og bringe til 1000 mL med DW.
- Forbered cellerepensionsopløsningen. Der tilsættes 30 mg BSA og 300 μL 50X antibiotika til 15 ml Tyrodeopløsning.
- Gør sprøjter klar. Fyld den 20 mL sprøjte, der er forbundet med det fleksible forlængerrør og den markerede injektionsnål med CIB-EGTA. Fyld 30-mL sprøjten med den opvarmede enzymblanding. Hold dem begge ved 37 °C indtil lige før brug.
- Forbered perfusionspladen. Forvarm varmemåtten under et stereoskopisk mikroskop. Placer perfusionspladen (låget på en multi-well kulturplade) på den forvarmede varmemåtte. Før den vaskulære klemme før krigen ved at placere den i perfusionspladen, indtil den bruges. Placer 60 mm kulturretten til pipetter og cellesien på den forvarmede varmemåtte.
2. Antegrade perfusion af musehjertet
BEMÆRK: Plastoverførselspipetten, der bruges til at suge hjertet, skal være blød og ikke være skarpt tilspidset mod spidsen. Vælg en lille vaskulær klemme med serration. De anbefalede instrumenter er anført i materialeoversigten.
- Udskæring af musehjertet og fastspænding af aorta
BEMÆRK: De voksne mus (>8 uger gamle) bør aflives ved en overdosis natriumpentobarbital (>300 mg/kg intraperitoneal [i.p.] injektion) med heparin (8000 enhed/kg).- Punktafgift musen hjertet hurtigt ved at sutte.
- Åbn brysthulen hurtigt for at udsætte hjertet. Skær plastoverførselspipetten, hvis spids er omtrent samme størrelse som eller lidt mindre end det udsatte hjerte (normalt på et sted ca. 1 cm fra 0,5 mL-mærket mod spidsen, men det afhænger af hjertestørrelsen).
- Suge hjertet ind i pipetten, hæve pipetten til at skabe plads nok til at indsætte en saks, og punktafgifter hjertet med buet saks fra dorsal side, undgå at beskadige atrierne.
- Overfør straks det fjernede hjerte til det 30 mL glasbægerglas, der indeholder iskølet CIB-EGTA, for at stoppe sammentrækning. Denne procedure tager normalt <1 min.
- Rengøring omkring aorta
- Overfør hjertet til en 35 mm kulturret fyldt med iskølet CIB-EGTA og fjern lungerne og andet synligt væv, og overfør derefter det groft rensede hjerte til hjertestanden fyldt med kølet CIB-EGTA og læg det med toppen nedad.
- Under det stereoskopiske mikroskop skal du fjerne fedt- og bindevævet for at rengøre omkring aortaen. Hvis længden af den afskårne aorta er for lang, herunder brachiocephalic arterie, venstre fælles halspulsåren eller venstre subclavian arterie, afbrød aorta lige under brachiocephalic arterie at forkorte det for at gå videre til næste trin. Denne procedure tager normalt ca. 4 minutter.
- Fastspænding af aorta og placering af det fastspændte hjerte på perfusionspladen
- Under mikroskopet skal du placere hjertet i hjertestanden. Operatøren skal vende mod hjertets forreste overflade, afhente enden af aortaen med pincet og klemme aorta nær atrierne med en lille vaskulær klemme, mens den forsigtigt skubber ned på aortaen lidt.
- Placer det fastspændte hjerte på perfusionspladen med den forreste side op, og dæk det derefter med et par dråber CIB-EGTA for at forhindre det i at tørre ud. Denne procedure tager normalt <20 s.
- Punktafgift musen hjertet hurtigt ved at sutte.
- Antegrade perfusion af hjertet
BEMÆRK: For det første, perfuse hjertet med CIB-EGTA at udlede blod og forhindre koagulation.- Sæt injektionsnålen i, og start perfusionen for at udlede blod
- Indstil 20 mL sprøjten fyldt med forvarmet CIB-EGTA forbundet til det fleksible forlængerrør og en mærket injektionsnål på infusionspumpen. Start pumpen med en langsom hastighed på 0,5 mL/min for forsigtigt at fylde nålen og røret med CIB-EGTA og sørg for at forhindre luft i at trænge ind i røret.
- Placer injektionsnålen på perfusionspladen med den kortere side af den diagonale form foran. Skub nålen mod toppen af hjertet, indtil den rører ved den, og indsæt derefter forsigtigt nålen nær spidsen af venstre ventrikel ind i ventrikulært kammer uden at vride. Tag ikke kanylen af pladen, mens du udfører indsættelse.
- Se det røde mærke for at estimere dybden af nåleindsættelsen. Når nåleindføringen er afsluttet, skal blod, der strømmer fra kranspulsåren, begynde at blive udledt.
- Fastgør injektionsnålen på pladen med tape, og øg pumpehastigheden til 1 mL/min. Denne procedure tager normalt ca. 30 s. Hvis hjertet er perfunderet med succes, strømmen af CIB-EGTA i kapillær lige under epicardium kan ses under mikroskopet.
- Perfusion hjertet med enzym mix
BEMÆRK: Under enzymatisk perfusion kan dybden af den indsatte nål overvåges ved at kontrollere det røde mærke på nålen.- Efter perfusing 2-3 mL CIB-EGTA til helt udledning blod fra kranspulsåren, ændre perfusate til enzym mix. Undgå at lade luftbobler komme ind i røret. Kontroller strømmen af enzymblandingen, og sørg for, at injektionsnålen ikke er kommet ud ved at kontrollere placeringen af det røde mærke.
- Når 1-2 mL er blevet perfunderet, skal pumpehastigheden øges til 1,5 mL/min. Fjern det akkumulerede perfusate indeholdende blod, der er strømmet ud af hjertet med en pipette fra tid til anden.
BEMÆRK: Over tid vil den myokardievæg blive gennemskinnelig nogle steder og fremstå spraglet, hvilket er et tegn på fordøjelsen af den ekstracellulære matrix efter vellykket perfusion. Et andet tegn er genstart af atrie slå forårsaget af tilstedeværelsen af Ca2 + i enzym mix. - Stop perfusion, når det samlede volumen af enzymblandingen pr. smeltet er 10 mL.
- Sæt injektionsnålen i, og start perfusionen for at udlede blod
3. Isolering af individuelle hjerteceller
- Dissociering af hjerteceller
- Efter perfusion med enzymblandingen overføres 10 mL af enzymblandingen, der forbliver i sprøjten, til en 60 mm dyrkningsskål placeret på varmemåtten og tilsættes 20 mg BSA (0,2% BSA i enzymblanding). Det tabte BSA-pulver skal opløses straks ved forsigtigt at hvirvle med en hånd. Fjern injektionsnålen og den vaskulære klemme fra hjertet.
- Adskil hjertekamrene og atrierne og overfør hver i enzymblandingen suppleret med 0,2% BSA på varmemåtten.
- Isolering af ventrikulære myocytter
- Grib epicardium med to pincet, og forsigtigt rive og trække hjertekamrene fra side til side i enzymet mix suppleret med 0,2% BSA i små stykker. Cellerne spredes med skånsom pipetter (ca. 30 gange).
- De ufordøjede affald filtreres gennem en 100-μm maskecellefumist, og filtrat overføres til et 15 mL centrifugerør til centrifugering ved 50 × g i 3 min. De pelleterede kardiomyocytter opsuges igen i cib-ca2+-BSA-opløsningen, den inkuberes i 5 min. ved 37 °C, og centrifuger den derefter ved 14 × g i 3 min.
- De endelige udfældede kardiomyocytter i cellegenpensionsopløsning (sammensætning er anført i tabel 2)opsættes igen, og den holdes ved 37 °C.
- Isolation af atrie myocytter
- Under den endelige centrifugering for ventrikulær myocyt fraktion i trin 3,2, begynde at isolere atrie myocytter. Atrierne, der opbevares som i trin 3.1, overføres til den forvarmede CIB-Ca2+-BSA-opløsning, rives i stykker og adskilles af cellerne ved pipettering med pipettespids ved 10 μL på varmemåtten.
- Centrifuge celleblandingen ved 14 × g i 3 min. og genbruge de pelleterede atrieceller med cellegenpensionsopløsning.
- Isolation og kultur af hjertefibroblaster
- Supernatanten overføres fra den første centrifugering i trin 3.2 til et andet centrifugerør på 15 mL og centrifuge ved 190 × g i 5 min. Vask de udfældede celler to gange med centrifugering i Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), og suspendere derefter cellerne med DMEM suppleret med 10% føtal kvæg albumin (FBS) og antibiotika.
- Den endelige cellefraktion anbringes i en dyrkningskolbe (25 cm2),og cellerne kan klæbe til bunden af kolben i en befugtet atmosfære på 95 % luft og 5 % CO2. Efter 90 minutters inkubation kasseres de ikke-vedhæftede celler, og der tilsættes friskkulturmedium. Celler bør nær sammenløb efter ca 4 dage, hvorefter de skal forstærkes ved trypsinisering og sås i nye kulturretter.
4. Høst af proteiner fra atri og hjertekamre
- Efter perfusion adskilles atrierne og hjertekamrene, og de homogeniseres i lysisbuffer i et forhold på 10 mg vævsvægt til 100 μL buffer ved hjælp af en lille kværn i et 1,5 mL prøveglas.
- Homogenatet opbevares i is i 40 minutter med vortexblanding hvert 10. minut for at udvinde proteiner og derefter centrifuge røret ved 15000 × g i 20 minutter ved 4 °C. Supernatantfraktionen opbevares ved -80 °C som proteinprøve.
5. Immunostaining af isolerede hjerteceller
BEMÆRK: Immobilisering af ikke-klæbende kardiomyocytter til bunden af cellebilledskålen ved hjælp af biologisk lim er nødvendig.
- Vedhæftning af isolerede kardiomyocytter til en glasbundet kulturret
- Før du starter celleisolering, skal du belægge glasbundskulturretten med biologisk lim (f.eks. Celle-Tak) i henhold til producentens instruktion, skylles med DW og lufttørres ved stuetemperatur.
- Efter genopstømmelse af de isolerede kardiomyocytter i CIB-Ca2+-BSA-opløsning skal du droppe celleophænget på bunden af de limbelagte retter og inkubere i 20 minutter ved stuetemperatur uden omrøring.
- Immunostaining
- Plade de isolerede kardiomyocytter på en glasbundsskål, der er forlakeret med biologisk lim, og hold den ved stuetemperatur i 40 minutter, så cellerne kan klæbe til skålen. Kultur hjerte fibroblaster i bundglas kultur retter.
- Skyl celler med fosfat-buffered saltvand (PBS), og fastgør dem med 4% paraformaldehyd (PFA) i 5 minutter med rysten. Vask de faste celler med PBS i 10 min. tre gange, og inkuber dem i blokerings-permeabiliseringsopløsning i 60 minutter ved stuetemperatur med rysten.
- Sondeceller med primært antistof fortyndet i blokerende permeabiliseringsopløsning i 60 minutter ved stuetemperatur eller natten over ved 4 °C. Vask cellerne med PBS i 10 min tre gange, og inkuber derefter med fluorescens-mærket sekundært antistof i 60 minutter ved stuetemperatur.
- Efter vask dem tre gange med PBS i 10 min, plette kernerne med DAPI (1:10000 fortynding i PBS). Analyser lysstofrørene ved hjælp af et konfokalt laserscanningsmikroskop.
6. Helcellede klemmeoptagelser
- Fremstille plasteret elektroder fra et glas kapillærer ved hjælp af en vandret microelectrode puller. Elektrodens modstand varierede fra 2 til 4 MΩ, når den blev fyldt med en K+-rig pipetteopløsning (Tabel 2). Der overføres en aliquot af isolerede kardiomyocytter til et optagekammer monteret på scenen i et omvendt mikroskop, der er oversvaret af Tyrode med en hastighed på 1 mL/min ved 36-37 °C.
- Optag handlingspotentialer ved hjælp af den perforerede patch-clamp-metode med K+-rich pipetteopløsning, der indeholder 30 mg/mL amphotericin B ved at anvende strømimpulser på 5-10 ms i varighed med en hastighed på 1 Hz via plasterelektroden.
7. Western blot analyser
- I denne undersøgelse skal du udføre en vestlig blot-analyse af små-molekylære vægtproteiner, såsom atriemarkør atrie natriuretic peptid (ANP).
- Proteinprøven opløses i den endelige koncentration af 1X Prøvebuffer, 2% 2' mercaptoethanol, og proteinerne denatureres i 60 minutter ved 37 °C. 20 μg protein indlæses i hver brønd, og elektroforese i løbebuffer med 20 mA pr. gel i 120 min.
- Overfør proteinet til en PVDF-membran i overførselsbuffer ved 10 V i 40 min. Den overførte membran vaskes to gange med TBST i 5 min. blokeres derefter med 5 % skummetmælk i TBST i 60 minutter ved stuetemperatur og sonderes med det primære antistof opløst i TBST natten over ved 4 °C.
- Vask membranen 5 gange med TBST i 7 min, og inkuber den med det sekundære antistof fortyndet i TBST i 120 minutter ved stuetemperatur.
- Efter vask membranen 5 gange med TBST i 7 min, visualiser signalerne med en chemi-luminescensanalyse og analysér dem med en lumino-billedanalysator.
Representative Results
Princippet om denne metode er simpelt: perfusate strømmer fra venstre kammer, aortaklappen åbnes, og perfusate løber ind i kranspulsåren i samme retning som blodkørslen, da aortaen lukkes ved fastspænding, hvilket muliggør den dybe perfusion af myokardiet for at fordøje den ekstracellulære matrix.
Ventrikelfocytter, der er frisk isoleret med den nuværende metode, er vist i figur 1A. Figur 1B viser forstørrede billeder af ventrikulære og atrie myocytter. Denne isolationsprocedure resulterede i et højt udbytte (70%-80%) af stangformede hvilende ventrikulære myocytter fra voksne mus (8-10 uger), som var tilgængelige inden for ca. 5 timer efter isolation (Figur 1C), et lignende interval som ved brug af den traditionelle Langendorff-baserede procedure7. Forholdet mellem frisk isolerede levedygtige celler var imidlertid lavere hos ældre mus på >2 år (Figur 1C). Det samlede antal ventrikelfocytter opnået pr. voksent hjerte ved hjælp af denne protokol var ca. 3 x 106 celler, hvilket svarede til den værdi, der tidligere blev rapporteret7,12. De handlingspotentialer, der blev registreret i ventrikulære og atrie-myocytter(figur 1D),svarede til dem i celler, der blev opnået ved den Langendorff-baserede metode10. En immundæmpende analyse bekræftede, at den sarkomeriske struktur af ventrikulær myocytter var velorganiseret med en klart synlig cellemembran (Figur 2A). De enkelte kardiomyocytter, der er isoleret med denne metode, kan anvendes direkte i forsøg, såsom en elektrofysiologisk analyse10 eller immundæmpende eksperiment.
Hjertefibroblaster findes i interstitielle rum. Tilstrækkelig fordøjelse af den ekstracellulære matrix resulterer i isolering af disse celler. De isolerede hjertefibroblaster formerer sig under kulturforhold og kan passeres flere gange eller opbevares i flydende nitrogen i en passende cellebeholderopløsning. Figur 2B viser, at de fleste af de kultiverede hjertefibroblaster var omdannet til myofibroblaster under subkultur, som bekræftet af det øgede udtryk for α-glat muskel actin13,14. Hjerte forfædrene kan også isoleres med den nuværende metode og dyrkes i passende kulturmedium, som begynder at slå automatisk10,15.
Homogenisering af det robuste myokardie er ikke let, især for hjertevæv fra gamle mus, som besidder en stor mængde ekstracellulære fibre. Efter antegrade perfusion kan protein fra atrierne og hjertekamrene let homogeniseres i lysisbufferen med let kraft for at udtrække proteiner. En western blot-analyse viste anp's specifikke udtryk i atrierne, men ikke hos hjertekamre fra voksne (20 uger gamle) og ældre (108 uger gamle) mus (figur 3).
Figur 1. Isolerede kardiomyocytter fra mus. A. Ventrikulær myocytter frisk isoleret med antegrade perfusion, med billeder erhvervet med lav forstørrelse. Efter den endelige vask blev kardiomyocytterne genbrugt med 2 ml cellerepensionsopløsning, hvoraf 100 μL blev droppet på glasbundskulturen, og der ventede celleafregning. Bar, 100 μm.B. Forstørrede billeder af isolerede ventrikulære myocytter (øvre) og atrie myocytter (lavere). Bar, 100 μm.C. Isolerede celler blev suspenderet i cellerepensionsopløsningen og opbevaret ved 37 °C i den ønskede periode, og antallet af levende ventrikulære myocytter blev talt i 10-15 felter under et mikroskop. Afrundede celler blev anset for at være blevet uigenkaldeligt såret eller døde16. Grønne, blå og røde symboler blev opnået fra 3 mus på 8-10 uger gamle, og sorte symboler var fra 106 uger gamle mus. Gult symbol angiver middelværdi for hver gruppe. D. Repræsentative aktionspotentialer registreret fra ventrikulær (sort) og atrie (rød) myocytter på 8-10 mus. Dataene blev indhentet fra cellerne ca. 3 timer efter isolation. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Immunostaining for α-actinin i isolerede mus ventrikulær myocytter og α-glat muskel actin i kulturperler mus hjerte fibroblaster. A. Confocal laserscanning mikroskopi af immunostaining for α-actinin (grøn), DAPI farvning for kerner (blå) og en DIC billede af ventrikulær myocytter isoleret fra musehjerte med antegrade perfusion. Bar, 50 μm.B. Immunostaining for α-glat muskel actin (grøn), DAPI farvning for kerner (blå) og en DIC billede af hjerte fibroblaster isoleret fra musehjerte med antegrade perfusion. Hjertefibroblaster blev dyrket i fire dage. Bar, 100 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Western blot analyser af ANP i atri og hjertekamrene. Western blot analyserer for atriemarkøren atrie natriuretic peptid (ANP) i atria (A) og hjertekamre (V) fremstillet af voksne (20 uger) og i alderen (108 uger) hjerter. ANP er til stede i atrierne, men fraværende i hjertekamrene. Brug glyceraldehyd 3-fosfat dehydrogenase (GAPDH) som et kontrolhusholdende protein. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Stamløsninger til isolering af hjerteceller | |
| 10X CIB (500 mL) | |
| NaCl | 37,99 g |
| KCI | 2,01 g |
| 1 M MgCl2 | 2,5 mL |
| NaH2PO4 | 0,23 g |
| HEPES | 29,79 g |
| Dw | Fyld op til 500 mL |
| 100 mM CaCl2 lageropløsning | |
| CaCl2 | 100 mM |
| 400 mM EGTA lagerløsning | |
| EGTA | 400 mM |
| Insulinopløsning | |
| insulin | 1 enhed/mL i 0,1 M HCl |
| 50X Antibiotika lageropløsning (20 ml) | |
| penicillin | 100 mg |
| Streptomycin | 100 mg |
| Phenol rød | 1,5 g |
| Dw | 20 mL og steriliseres med filtrering |
| 10X Tyrode opløsning (1000 ml) | |
| NaCl | 81,82 g |
| KCl | 4,03 g |
| 1 M MgCl2 | 5 mL |
| NaH2PO4 | 0,47 g |
| HEPES | 11,92 g |
| NaOH | 0,8 g |
| Dw | Fyld op til 1000 mL |
| Stock solutin til immunostaining | |
| DAPI-lager | |
| DAPI | 2 mg/mL i methanol |
| Lagerløsninger til vestlige blots | |
| HEPES-buffer (100 mL) | |
| NaCl | 0,88 g |
| 400 mM EGTA | 0,25 mL |
| HEPES | 0,24 g |
| 1M NaOH | justere pH til 7,4 |
| Dw | Fyld op til 500 mL |
| Protease hæmmer cocktail | |
| Komplet mini | 1 tablet |
| Dw | 0,4 mL |
Tabel 1. Beskrivelse af lagerløsningerne. Lageropløsningerne skal opbevares ved 4 °C. Aliquot protease-hæmmercocktail til opbevaring ved -20 °C.
| Løsninger til isoltaing af hjerteceller | |
| CIB (200 mL) | |
| 10X CIB | 20 mL |
| Insulinopløsning | 0,01 mL |
| glukose | 0,79 g |
| 1M NaOH | pH-justering til 7,4 |
| Dw | Fyld op til 200 mL |
| Enzymblandingsopløsning (30 ml) | |
| Kollagen type2 | 30 mg |
| Trypsin | 1,8 mg |
| protease | 1,8 mg |
| 100 mM CaCl2 lagerløsning | 0,09 mL |
| CIB | 30 mL |
| CIB-Ca2+-BSA (15 mL) | |
| Bsa | 30 mg |
| 100 mM CaCl2 lagerløsning | 0,18 mL |
| CIB | 15 mL |
| CIB-EGTA (150 mL) | |
| 400 mM EGTA lagerløsning | 0,150 mL |
| CIB | 150 mL |
| Tyrodeopløsning (1000 ml) | |
| 10X Tyrode lagerløsning | 100 mL |
| glukose | 0,99 g |
| 1M CaCl2 | 1,8 mL |
| 1M NaOH | pH-justering til 7,4 |
| Dw | Fyld op til 1000 mL |
| Opløsning af cellerepension (15 ml) | |
| Bsa | 30 mg |
| 50X Antibiotika lagerløsning | 0,3 mL |
| Tyrode løsning | 15 mL |
| Løsninger til immunostaining | |
| Celleopfyldende opløsning (0,3 ml) | |
| Celle-Tak | 0,01 mL |
| 0,1 M NaHCO3 (pH8.0) | 0,285 mL |
| 0,1 M NaOH | 0,005 mL |
| Blokerings-permeabilizatin løsning (10 ml) | |
| Føtalt kvægserum | 1 mL |
| Triton X-100 | 1 mL |
| 10X PBS | 1 mL |
| Dw | 7 mL |
| K+ rig pipette løsning | |
| Kalium aspartate | 70 mM |
| KCl | 50 mM |
| KH2PO4 | 10 mM |
| MgSO4 | 1 mM |
| ATP-afattet salt | 3 mM |
| GTP lithiumsalt | 0,1 mM |
| EGTA | 5 mM |
| HEPES | 5 mM |
| Koh | pH-justering til 7,2 |
| Løsninger til vestlige blots | |
| Lysis buffer (1 mL) | |
| HEPES-buffer | 0,86 mL |
| Ikke-idet-P40 | 0,1 mL |
| Protease hæmmer cocktail | 0,04 mL |
| Kørselsbuffer (1000 mL) | |
| 10X TG (0,25 M Tris og 1,92 M Glycine) | 100 mL |
| Sds | 1 g |
| Dw | 900 mL |
| Overførselsbuffer (1000 mL) | |
| 10X TG | 100 mL |
| methanol | 200 mL |
| Dw | 700 mL |
| Blotting buffer (TBST) (1000 mL) | |
| 5M NaCl | 20 mL |
| 2M Tris-HCl (pH 7,5) | 5 mL |
| 10% Mellem 20 | 10 mL |
| Dw | 965 mL |
Tabel 2. Beskrivelse af arbejdsopløsningerne til isolering af hjerteceller, immunostaining og vestlig blotting. Forbered alle arbejdsløsninger lige før eksperimenterne.
Supplerende figur 1. Kontur af celleisolationen. Flow diagram over isolering af ventrikulær og atrie myocytter og hjerte fibroblaster fra et enkelt hjerte. Klik her for at downloade dette tal.
Discussion
Da hjertet er meget modtageligt for iskæmi, bør den tid, det tager at fjerne hjertet og nedsænke det i iskold CIB-EGTA for at stoppe sammentrækning, holdes kort som muligt (<1 min). Dette er det første kritiske skridt i denne metode. Det andet kritiske skridt vedrører hjertets retning. Den særlige orientering af det punkterede hjerte i trin 2.1.2 gør det lettere at se og fjerne fedt og bindevæv omkring aorta. Efter rengøring omkring aorta, placere fastspændt hjerte med forreste overflade side op på perfusion plade. Det sidste kritiske trin indebærer indsættelse af injektionsnålen. Når kanylen føres mod hjertet, bør injektionsnålen ikke løsnes fra perfusionspladen for at opretholde en konstant afstand fra pladen. Placeringen af indsættelsen er nær toppen af venstre hjertekammer. Sæt nålen forsigtigt uden at vride, da en sådan vridning kan forstørre hullet. Dybden af indføringen af nålen kan estimeres ved at se det røde mærke. Hvis nålen er indsat for dybt, kan spidsen gennembore gennem ventrikulær septum og ind i højre ventrikel eller om mitralklap og ind i venstre atrium. Efter at have bekræftet blodets forsvinden fra kranspulsåren, skal nålen fastgøres med tape til perfusionspladen.
En længere aorta længde gør det vanskeligt at klemme aorta på den rigtige position. Hvis klemmen er for langt væk fra atrierne, kan hjertet rotere efter perfusate infusion. For at forhindre dette skal du afskære aorta lige under brachiocephalic arterien for at forkorte aorta før fastspænding.
Hvis blodet ikke begynder at aflade efter perfusion ved en starthastighed på 0,5 mL/min,skal hastigheden øges til 1 mL/min. Hvis det ikke hjælper, kan injektionsnålen placeres forkert, f.eks. I et sådant tilfælde skal du straks fjerne nålen og forsøge at indsætte den igen nær toppen af venstre ventrikel. Når nålen indsættes flere gange, kan fordøjede celler strømme ud fra de åbnede huller. Bemærk, at dette normalt ikke påvirker celleisolationen alvorligt.
Operatørerne kan overvåge hele processen med antegrade perfusion af hjertet ved hjælp af et stereoskopisk mikroskop for at observere ændringerne i farve og gennemsigtighed og genstart af atriernes slag sammen med fordøjelsen. I alt 10 mL enzymblanding bør være det maksimale, der kræves, selv for et gammelt hjerte. I yngre hjerter (5-7 uger gamle) reducerer vi volumenet til 9 mL, hvilket svarer til tilgangen via retrograd perfusion med samme enzymblanding.
Supernatanten ved den endelige centrifugering indeholder snavs, blodlegemer og ikke-myocytter, mens pellet hovedsageligt indeholder kardiomyocytter og forurener ikke-myokytter, såsom fibroblaster og endotelceller. For at rense kardiomyocytterne er der brug for flere trin. Generelt skal pelletpen genbruges i det relevante cellekulturmedium og forforstilles i 2 timer ved 37 °C på en vævscellekulturskål og derefter forsigtigt fjerne kardiomyocytterne ved pipettering og forberedelse til kultur.
Enzymet indeholder en lav koncentration på Ca2+ (0,3 mM). Vi inkuberer derfor fordøjede celler i CIB-Ca2+-BSA (1,2 mM Ca2+) før den endelige genopstpension med cellerepensionsopløsningen (1,8 mM Ca2+), og den gradvise stigning i Ca2+ undgår at forårsage celleskade7. Så længe de isolerede kardiomyocytter er intakte (hvilende celler uden sammentrækning) påvirker denne Ca2+-tilpasningsprocedure ikke celle levedygtighed hos mus. Da de beskadigede celler dør under denne inkubation, får vi derfor en sund cellegruppe. Tilsvarende kan isolerede intakte atrie myocytter (hvilende celler uden uregelmæssig sammentrækning) opbevares i samme cellerepensionsopløsning. Men atrie myocytter tendens til at være mere delikat at blive opbevaret sammenlignet med ventrikulær myocytter.
I laboratoriet er denne isolationsmetode næsten altid vellykket, medmindre nåleindføringen i venstre hjertekammer mislykkes. Det er også lykkedes os at isolere celler fra det hypertrophied hjerte udarbejdet af kirurgisk tværgående aorta indsnævring. Men hos ældre mus, som ofte har små myokardieinfarkter, ophører perfusion nogle steder, hvilket resulterer i ufuldstændig fordøjelse og dermed et lavt udbytte (figur 1C), svarende til den Langendorff-baserede retrograde metode. I sådanne tilfælde kan hjertets forvrængede form observeres selv i starten af perfusion.
Denne antegrade perfusionsmetode er nyttig til isolering af hjerteceller fra mus i forskellige aldre, men ikke større dyr, såsom kaniner og marsvin. Det kan være muligt at anvende denne metode på neonatal eller unge rotter før fravænning.
En af fordelene ved denne antegrade perfusionsmetode er, at den reducerer de tekniske hindringer, der er forbundet med at bruge langendorff-baseret retrograd perfusionsmetode til små musehjerter. Den tid, der kræves til perfusion, er ca. 7 minutter med 10 mL enzymer, denne korte fordøjelsesperiode øger cellernes levedygtighed. Derudover gør det det muligt at udføre perfusion gennem hjertets koronarcirkulation, selv efter at aortaklapperne er fordøjet. Isolering af atrie myocytter kræver normalt Langendorff-baseret retrograd perfusion og yderligere inkubation med enzymer17. Denne antegrade perfusion tilgang, dog, kan dybt gennemsyre vævet med enzymet til at isolere atrie myocytter.
I forsøg med flere mus skal Langendorff-apparatet rengøres, før det næste hjerte perfusing. I den nuværende antegrade-metode, så længe det ønskede antal instrumentsæt (f.eks. sprøjter nåle og perfusionsplader) fremstilles på forhånd, kan perfusion udføres kontinuerligt.
Vi heri rapporterer den grundlæggende metode til antegrade perfusion af musehjertet ved hjælp af de samme løsninger som langendorff-baseret retrograd perfusionsmetode uden yderligere kemikalier. Sammensætningen af perfusatet kan ændres, så den passer til formålet med forsøget, såsom at bruge et vaskemiddel, der indeholder EGTA i stedet for enzymerne til at lave et decellulariseret hjerte18.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takker T. Yamamoto og Y. Mori for deres hjælp i morfologiske eksperimenter. Dette arbejde blev støttet af en Grant-in-Aid for Scientific Research (C) fra Japan Society for the Promotion of Science (18K06871 til M.O.K. og 17K08536 til H.M.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amphotericin B | Wako Pure Chemical Industries, Japan | ||
| Alexa Fluor 488 anti-mouse IgG antibody | Molecular Probes, USA | A11001 | Fluorescent-labeled secondary antibody. (1:400 dilution for immunostaining) |
| Anti-α-actinin (ACTN) | Sigma-Aldrich, USA | A7811 | Mouse monoclonal antibody (clone EA-53). (1:400 dilution for immunostaining) |
| Anti-atrial natriuretic peptide (ANP) | Merck-Millipore, USA | AB5490-I | Rabbit polyclonal antibody (1:2000 dilution for Western blots) |
| Anti-Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) | Cell Signaling Technology, USA | 2118 | Mouse monoclonal antibody (1:10000 dilution for Western blots) |
| Anti-smooth muscle actin (SMA) | Dako, Denmark | M0851 | Mouse monoclonal antibody (clone 1A4) (1:400 for immunostaining) |
| Anti-rabbit IgG antibody | Amersham, GE Healthcare, USA | NA934 | Secondary antibody (1:10000 dilution for Western blots) |
| ATP disodium salt | Sigma-Aldrich, USA | A26209 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich, USA | A9418 | |
| Cell-Tak | Corning | 354240 | Biological material for adhesion of the cell or tissues |
| Chemi-Lumi One Super | Nacalai Tesque, Japan | 02230-14 | Chemiluminescent reagent used for western blotting. |
| Collagenase Type 2 | Worthington Biochemicals, USA | LS004176 | Choose the activity guaranteed to be greater than 300 unit/mg. |
| Complete Mini | Roche, Germany | 11836153001 | A mixture of several protease inhibitors. |
| 4'6'diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Nacalai Tesque, Japan | 11034-56 | Used for cell-impermeant nuclear stainig |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Nacalai Tesque, Japan | 08458-45 | including 4.5 g/L gluose |
| Extension tube | Top, Japan | X1-50 | Connect with syringe and injection needle for antegrade perfusion. |
| EPC-8 patch-clamp amplifier | HEKA, Germany | ||
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich, USA | F7524-500ML | |
| Glass capillaries | Narishige Scientific Instrument Lab., Japan | outside diameter 1.5 mm, inside diameter 0.9 mm | |
| GTP lithium salt | Sigma-Aldrich, USA | G5884 | |
| Horizontal microelectrode puller | Germany) | P-97 | |
| Heater mat | Natsume Seisakusho, Japan | KN-475-3-40 | Equipment to warm the perfusion plate. |
| Infusion pump | TERUMO, Japan | TE-311 | Infusion syringe pump for antegrade perfusion. |
| Injeciton needle (27 gauge) | TERUMO, Japan | NN-2719S | Needle for insertion into the left ventricle. |
| Insulin (from bovine pancrease) | Sigma-Aldrich, USA | I5500 | Dissolve in 0.1 M HCl. |
| Mini cordless grinder | Funakoshi, Japan | cG-4A | Small grinder for homogenizing tissue in 1.5 mL sample tube. |
| 4%-Paraformaldehyde Phosphate Buffer solution (4% PFA) | Nacalai Tesque, Japan | 09154-85 | |
| Penicillin G potassium | Nacalai Tesque, Japan | 26239-84 | |
| Phenol Red | Nacalai Tesque, Japan | 26807-21 | |
| 10X Phosphate Buffered Saline (pH7.4) (10X PBS) | Nacalai Tesque, Japan | 27575-31 | |
| Plastic multi-well culture plate | Falcon, USA | 353226 | Use the lid of the multi-well culture plate as the perfusion plate. |
| Plastic syringe (20 mL) | TERUMO, Japan | SS-20ES | Use for infusion of CIB-EGTA. |
| Plastic syringe (30 mL) | TERUMO, Japan | SS-30ES | Use for infusion of Enzyme-mix |
| Plastic transfer pipette | Sarstedt, Germany | 86.1171 | Cut the tip just before sucking mouse heart into the pipette. |
| Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane | Merck-Millipore, USA | IPVH00010 | Immobilin-P membrane (Transfer membrane for protein blotting) |
| Protease | Sigma-Aldrich, USA | P5147 | A mixture of three or more proteases including extracellular serine protease. |
| 4X Sample buffer solution | Fuji Film, Japan | 198-13282 | Contains 0.25 M Tris-HCl (pH 6.8), 8 w/v% SDS,40 w/v% Glyceroland 0.02 w/v% BPB |
| SDS polyacrylamide gel (15%) | Fuji Film, Japan | 193-14991 | |
| Streptomycin sulfate | Nacalai Tesque, Japan | 32237-14 | |
| 10X Tris-Glycine buffer solution (10X TG) | Nacalai Tesque, Japan | 09422-81 | Contains 0.25 M-Tris and 1.92 M-Glycine, (pH 8.3) |
| Trypsin | Sigma-Aldrich, USA | T8003 | Trypsin from bovine Type 1. |
| Vascular clamp | Karl Hammacher GmbH, Germany | HSE 004-35 | Small straight vascular clamp used for clamping aorta. |
| All other reagents | Nacalai Tesque, Japan |
References
- Langendorff, O. Untersuchungen am überlebenden Säugethierherzen. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 61, 291-332 (1898).
- Berry, M. N., Friend, D. S., Scheuer, J. Morphology and metabolism of intact muscle cells isolated from adult rat heart. Circulation Research. 26 (6), 679-687 (1970).
- Powell, T., Terrar, D. A., Twist, V. W. Electrical properties of individual cells isolated from adult rat ventricular myocardium. Journal of Physiology. 302, 131-153 (1980).
- Joshi-Mukherjee, R., et al. Structural and functional plasticity in long-term cultures of adult ventricular myocytes. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 65, 76-87 (2013).
- Benndorf, K., Boldt, W., Nilius, B. Sodium current in single myocardial mouse cells. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 404 (2), 190-196 (1985).
- Zhou, Y. Y., et al. Culture and adenoviral infection of adult mouse cardiac myocytes: methods for cellular genetic physiology. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 279 (1), 429-436 (2000).
- Shioya, T. A simple technique for isolating healthy heart cells from mouse models. Journal of Physiological Sciences. 57 (6), 327-335 (2007).
- Fiset, C., Clark, R. B., Larsen, T. S., Giles, W. R. A rapidly activating sustained K+ current modulates repolarization and excitation-contraction coupling in adult mouse ventricle. Journal of Physiology. 504, Pt 3 557-563 (1997).
- Ackers-Johnson, M., et al. A Simplified, Langendorff-Free Method for Concomitant Isolation of Viable Cardiac Myocytes and Nonmyocytes From the Adult Mouse Heart. Circulation Research. 119 (8), 909-920 (2016).
- Omatsu-Kanbe, M., Yoshioka, K., Fukunaga, R., Sagawa, H., Matsuura, H. A simple antegrade perfusion method for isolating viable single cardiomyocytes from neonatal to aged mice. Physiological Reports. 6 (9), 13688 (2018).
- Sambrano, G. R., et al. Navigating the signalling network in mouse cardiac myocytes. Nature. 420 (6916), 712-714 (2002).
- Limana, F., et al. bcl-2 overexpression promotes myocyte proliferation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (9), 6257-6262 (2002).
- Santiago, J. J., et al. Cardiac fibroblast to myofibroblast differentiation in vivo and in vitro: expression of focal adhesion components in neonatal and adult rat ventricular myofibroblasts. Developmental Dynamics. 239 (6), 1573-1584 (2010).
- Chistiakov, D. A., Orekhov, A. N., Bobryshev, Y. V. The role of cardiac fibroblasts in post-myocardial heart tissue repair. Experimental and Molecular Pathology. 101 (2), 231-240 (2016).
- Omatsu-Kanbe, M., Matsuura, H. A novel type of self-beating cardiomyocytes in adult mouse ventricles. Biochemical and Biophysical Research Communications. 381 (3), 361-366 (2009).
- Shan, D., Marchase, R. B., Chatham, J. C. Overexpression of TRPC3 increases apoptosis but not necrosis in response to ischemia-reperfusion in adult mouse cardiomyocytes. American Journal of Physiology. 294 (3), 833-841 (2008).
- Nakamura, H., et al. Presence and functional role of the rapidly activating delayed rectifier K(+) current in left and right atria of adult mice. European Journal of Pharmacology. 649 (1-3), 14-22 (2010).
- Milgroom, A., Ralston, E. Clearing skeletal muscle with CLARITY for light microscopy imaging. Cell Biology International. 40 (4), 478-483 (2016).
