We ontwikkelden een simple-methode voor het isoleren van hoogwaardige individuele muishartcellen door de antegrade perfusietechniek. Deze methode is Langendorff-vrij en nuttig voor het isoleren van ventriculaire en atriale myocyten of interstitiële cellen, zoals hartfibroseblasten of voorlopers.
In fundamenteel onderzoek met behulp van muishart is het isoleren van levensvatbare individuele cardiomyocyten een cruciale technische stap om te overwinnen. Traditioneel wordt het isoleren van cardiomyocyten van konijnen, cavia’s of ratten uitgevoerd via retrograde perfusie van het hart met enzymen met behulp van een Langendorff-apparaat. Een hoge mate van vaardigheid is echter vereist wanneer deze methode wordt gebruikt met een klein muishart. Een antegradeperfusiemethode die geen Langendorff-apparaat gebruikt, is onlangs gemeld voor de isolatie van cardiomyocyten van muizen. We rapporteren hierin een volledig protocol voor de verbeterde antegradeperfusie van het verwijderde hart om individuele hartcellen te isoleren van volwassen muizen (8 – 108 weken oud). Antegradeperfusie wordt uitgevoerd door perfusaat te injecteren in de buurt van de top van de linkerventrikel van het verwijderde hart, waarvan de aorta werd geklemd, met behulp van een infuuspomp. Alle procedures worden uitgevoerd op een voorverwarmde verwarmingsmat onder een microscoop, waardoor de injectie- en perfusieprocessen kunnen worden gecontroleerd. De resultaten suggereren dat ventriculaire en atriale myocyten en fibroblasten tegelijkertijd goed kunnen worden geïsoleerd van een enkele volwassen muis.
Over het algemeen omvat de eerste stap van de eencellige isolatie van ontleed weefsel het gehakt van het weefsel in kleine stukjes, gevolgd door de vertering van het bindweefsel en extracellulaire matrix met enzymen. Cardiomyocyten kunnen echter niet worden geïsoleerd met een dergelijke hakmethode, omdat verrijking met extracellulaire matrixcomponenten, waaronder collageen- en elastinevezels, het myocardium te moeilijk maakt om te hakken, en de cardiomyocyten zijn zeer gevoelig voor hypoxie en andere veranderingen in het micromilieu. Zo is met behulp van het op Langendorff gebaseerde retrograde perfusiesysteem1een methode ontwikkeld om de extracellulaire matrix met enzymen te verteren om individuele cardiomyocyten uit het hart te isoleren2,3,4.
In muismodellen wordt op Langendorff gebaseerde retrograde perfusie van het hart met enzymen ook gebruikt voor de isolatie van individuele cardiomyocyten5,6,7,8. De cannulatie van de kleine en dunne muisaorta en de montage ervan op het Langendorff-apparaat om retrograde perfusie uit te voeren, vereist echter een hoge mate van vaardigheid, omdat de diameter van de aorta in het volwassen hart ongeveer 1,2 mm is. Bovendien kost het tijd om meerdere experimenten uit te voeren, omdat het Langendorff-apparaat moet worden gereinigd voordat het volgende hart wordt doordrongen.
Als alternatief voor retrograde perfusie werd een nieuwe methode ontwikkeld voor het isoleren van cardiomyocyten uit een volwassen muizenhart zonder Langendorff-apparaat. Deze epoch-making methode was gebaseerd op de antegrade perfusie van de kransslagaders9. We hebben onlangs elke stap van dit antegradeprotocol verbeterd, zoals het klemmen van de aorta, het inbrengen van de naald en temperatuurregeling, en hebben alle perfusieprocedures met een microscoop gecontroleerd10. We rapporteren hierin in detail de verfijning van deze antegrade perfusiemethode om de tijd voor isolatie te verkorten en een aanvullende video te bieden. Bij deze methode duurt de perfusie van het hart ongeveer 7 minuten met 10 ml van de enzymen, en deze korte spijsverteringsperiode verhoogt de levensvatbaarheid van de cellen. Dit is een eenvoudige methode voor het isoleren van enkele hartcellen van hoge kwaliteit zonder toevoeging van chemicaliën, zoals 2,3-butanedion monoxime (BDM)6,11 of taurine5,8. Wij geloven dat deze methode de vaardigheidsdrempel van de techniek zal verlagen en het nut van muiscardymyocyten in fundamenteel onderzoek zal verbeteren.
Aangezien het hart zeer gevoelig is voor ischemie, moet de tijd die nodig is om het hart te verwijderen en onder te dompelen in ijskoude CIB-EGTA om de samentrekking te stoppen, zo kort mogelijk worden gehouden (<1 min). Dit is de eerste kritieke stap van deze methode. De tweede kritische stap betreft de richting van het hart. De bijzondere oriëntatie van het verwijderde hart in stap 2.1.2 maakt het gemakkelijker om het vet en bindweefsel rond de aorta te zien en te verwijderen. Plaats na het reinigen rond de aorta het geklemde hart met de voorste oppervlakzijde naar boven op de perfusieplaat. De laatste kritieke stap omvat het inbrengen van de injectienaald. Wanneer u de naald naar het hart opstuurt, mag de injectienaald niet van de perfusieplaat worden losgemaakt om een constante afstand tot de plaat te behouden. De positie van de invoeging bevindt zich in de buurt van de top van de linkerventrikel. Steek de naald voorzichtig in zonder te draaien, omdat een dergelijke verdraaiing het gat kan vergroten. De diepte van het inbrengen van de naald kan worden geschat door naar de rode markering te kijken. Als de naald te diep wordt ingebracht, kan de punt door het ventriculaire septum prikken en de rechterventrikel of de mitralisklep binnendringen en het linkeratrium binnendringen. Na bevestiging van het verdwijnen van het bloed uit de kransslagader, moet de naald met tape op de perfusieplaat worden bevestigd.
Een langere aortalengte maakt het moeilijk om de aorta op de juiste positie te klemmen. Als de klem te ver van de atria verwijderd is, kan het hart draaien na perfusaatinfusie. Om dit te voorkomen, snijdt u de aorta net onder de brachiocephalische slagader af om de aorta in te korten voordat u deze klemt.
Als het bloed niet begint te ontladen na perfusie bij een beginsnelheid van 0,5 ml/min, verhoog dan de snelheid tot 1 ml/min. Als dat niet helpt, kan de injectienaald verkeerd worden geplaatst, zoals in de rechterventrikel, het ventriculaire septum of de linker myocardwand. Verwijder in dat geval de naald onmiddellijk en probeer deze opnieuw in de buurt van de top van de linkerventrikel te plaatsen. Bij het meerdere keren inbrengen van de naald kunnen verteerd cellen uit de geopende gaten stromen. Merk op dat dit meestal geen ernstige invloed heeft op de celisolatie.
De operators kunnen het hele proces van antegradeperfusie van het hart volgen met behulp van een stereoscopische microscoop om de veranderingen in kleur en transparantie te observeren en het kloppen van de atria samen met de spijsvertering opnieuw op gang te brengen. In totaal moet 10 ml enzymmix het maximaal vereiste zijn, zelfs voor een oud hart. In jongere harten (5-7 weken oud) verminderen we het volume tot 9 ml, wat vergelijkbaar is met de aanpak via retrograde perfusie met dezelfde enzymmix.
Het supernatant bij de uiteindelijke centrifugeren bevat puin, bloedcellen en niet-myocyten, terwijl de pellet voornamelijk cardiomyocyten bevat en niet-myocyten verontreinigt, zoals fibroblasten en endotheelcellen. Om de cardiomyocyten te zuiveren, zijn meer stappen nodig. Over het algemeen moet de pellet worden geresuspendeerd in het juiste celkweekmedium en gedurende 2 uur bij 37 °C op een weefselcelkweekschaal worden gepreplateerd en vervolgens voorzichtig de cardiomyocyten verwijderen door pipetten en preplateren voor kweek.
Het enzymmengsel bevat een lage concentratie ca2+ (0,3 mM). Daarom incuberen we verteerd cellen in CIB-Ca2+-BSA (1,2 mM Ca2+) vóór de uiteindelijke resuspensie met de celresuspensieoplossing (1,8 mM Ca2+), en de geleidelijke toename van Ca2+ voorkomt het veroorzaken van celschade7. Zolang de geïsoleerde cardiomyocyten intact zijn (rustgevende cellen zonder samentrekking) heeft deze Ca2+aanpassingsprocedure geen invloed op de levensvatbaarheid van cellen bij muizen. Omdat de beschadigde cellen tijdens deze incubatie afsterven, verkrijgen we bijgevolg een gezonde celgroep. Evenzo kunnen geïsoleerde intacte atriale myocyten (rustgevende cellen zonder onregelmatige samentrekking) worden opgeslagen in dezelfde celreanissieoplossing. De atriale myocyten zijn echter meestal delicater om te worden opgeslagen in vergelijking met de ventriculaire myocyten.
In het laboratorium is deze isolatiemethode bijna altijd succesvol, tenzij het inbrengen van de naald in de linkerventrikel mislukt. We zijn er ook in geslaagd om cellen te isoleren van het hypertrofie hart, bereid door chirurgische transversale aortavernauwing. Bij oudere muizen, die vaak kleine myocardinfarcten hebben, stopt de perfusie echter op sommige plaatsen, wat resulteert in onvolledige spijsvertering en dus een lage opbrengst (figuur 1C), vergelijkbaar met de op Langendorff gebaseerde retrograde methode. In dergelijke gevallen kan de vervormde vorm van het hart zelfs aan het begin van de perfusie worden waargenomen.
Deze antegradeperfusiemethode is nuttig voor het isoleren van hartcellen van muizen van verschillende leeftijden, maar niet van grotere dieren, zoals konijnen en cavia’s. Het kan mogelijk zijn om deze methode toe te passen op neonatale of juveniele ratten voordat ze worden gespeend.
Een van de voordelen van deze antegradeperfusiemethode is dat het de technische obstakels vermindert die gepaard gaan met het gebruik van de op Langendorff gebaseerde retrograde perfusiemethode voor kleine muizenharten. De tijd die nodig is voor perfusie is ongeveer 7 minuten met 10 ml van de enzymen, deze korte spijsverteringsperiode verhoogt de levensvatbaarheid van de cellen. Bovendien maakt het perfusie mogelijk om door de coronaire circulatie van het hart te worden uitgevoerd, zelfs nadat de aortakleppen zijn verteerd. Isolatie van atriale myocyten vereist meestal op Langendorff gebaseerde retrograde perfusie en verdere incubatie met enzymen17. Deze antegrade perfusiebenadering kan het weefsel echter diep doordringen met het enzym om atriale myocyten te isoleren.
In experimenten met meerdere muizen moet het Langendorff-apparaat worden gereinigd voordat het volgende hart wordt doordrongen. In de huidige antegrademethode kan echter, zolang het gewenste aantal instrumentensets (bijv. injectienaalden en perfusieplaten) van tevoren wordt voorbereid, continu perfusie worden uitgevoerd.
Hierin rapporteren we de basismethodologie van de antegradeperfusie van het muizenhart met dezelfde oplossingen als de op Langendorff gebaseerde retrograde perfusiemethode zonder extra chemicaliën. De samenstelling van het perfusaat kan worden aangepast aan het doel van het experiment, zoals het gebruik van een wasmiddel dat EGTA bevat in plaats van de enzymen om een gedecelluliseerd hart te maken18.
The authors have nothing to disclose.
De auteurs danken T. Yamamoto en Y. Mori voor hun hulp bij de morfologische experimenten. Dit werk werd ondersteund door een Grant-in-Aid for Scientific Research (C) van de Japan Society for the Promotion of Science (18K06871 tot M.O.K. en 17K08536 tot H.M.).
Amphotericin B | Wako Pure Chemical Industries, Japan | ||
Alexa Fluor 488 anti-mouse IgG antibody | Molecular Probes, USA | A11001 | Fluorescent-labeled secondary antibody. (1:400 dilution for immunostaining) |
Anti-α-actinin (ACTN) | Sigma-Aldrich, USA | A7811 | Mouse monoclonal antibody (clone EA-53). (1:400 dilution for immunostaining) |
Anti-atrial natriuretic peptide (ANP) | Merck-Millipore, USA | AB5490-I | Rabbit polyclonal antibody (1:2000 dilution for Western blots) |
Anti-Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) | Cell Signaling Technology, USA | 2118 | Mouse monoclonal antibody (1:10000 dilution for Western blots) |
Anti-smooth muscle actin (SMA) | Dako, Denmark | M0851 | Mouse monoclonal antibody (clone 1A4) (1:400 for immunostaining) |
Anti-rabbit IgG antibody | Amersham, GE Healthcare, USA | NA934 | Secondary antibody (1:10000 dilution for Western blots) |
ATP disodium salt | Sigma-Aldrich, USA | A26209 | |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich, USA | A9418 | |
Cell-Tak | Corning | 354240 | Biological material for adhesion of the cell or tissues |
Chemi-Lumi One Super | Nacalai Tesque, Japan | 02230-14 | Chemiluminescent reagent used for western blotting. |
Collagenase Type 2 | Worthington Biochemicals, USA | LS004176 | Choose the activity guaranteed to be greater than 300 unit/mg. |
Complete Mini | Roche, Germany | 11836153001 | A mixture of several protease inhibitors. |
4'6'diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Nacalai Tesque, Japan | 11034-56 | Used for cell-impermeant nuclear stainig |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Nacalai Tesque, Japan | 08458-45 | including 4.5 g/L gluose |
Extension tube | Top, Japan | X1-50 | Connect with syringe and injection needle for antegrade perfusion. |
EPC-8 patch-clamp amplifier | HEKA, Germany | ||
Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich, USA | F7524-500ML | |
Glass capillaries | Narishige Scientific Instrument Lab., Japan | outside diameter 1.5 mm, inside diameter 0.9 mm | |
GTP lithium salt | Sigma-Aldrich, USA | G5884 | |
Horizontal microelectrode puller | Germany) | P-97 | |
Heater mat | Natsume Seisakusho, Japan | KN-475-3-40 | Equipment to warm the perfusion plate. |
Infusion pump | TERUMO, Japan | TE-311 | Infusion syringe pump for antegrade perfusion. |
Injeciton needle (27 gauge) | TERUMO, Japan | NN-2719S | Needle for insertion into the left ventricle. |
Insulin (from bovine pancrease) | Sigma-Aldrich, USA | I5500 | Dissolve in 0.1 M HCl. |
Mini cordless grinder | Funakoshi, Japan | cG-4A | Small grinder for homogenizing tissue in 1.5 mL sample tube. |
4%-Paraformaldehyde Phosphate Buffer solution (4% PFA) | Nacalai Tesque, Japan | 09154-85 | |
Penicillin G potassium | Nacalai Tesque, Japan | 26239-84 | |
Phenol Red | Nacalai Tesque, Japan | 26807-21 | |
10X Phosphate Buffered Saline (pH7.4) (10X PBS) | Nacalai Tesque, Japan | 27575-31 | |
Plastic multi-well culture plate | Falcon, USA | 353226 | Use the lid of the multi-well culture plate as the perfusion plate. |
Plastic syringe (20 mL) | TERUMO, Japan | SS-20ES | Use for infusion of CIB-EGTA. |
Plastic syringe (30 mL) | TERUMO, Japan | SS-30ES | Use for infusion of Enzyme-mix |
Plastic transfer pipette | Sarstedt, Germany | 86.1171 | Cut the tip just before sucking mouse heart into the pipette. |
Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane | Merck-Millipore, USA | IPVH00010 | Immobilin-P membrane (Transfer membrane for protein blotting) |
Protease | Sigma-Aldrich, USA | P5147 | A mixture of three or more proteases including extracellular serine protease. |
4X Sample buffer solution | Fuji Film, Japan | 198-13282 | Contains 0.25 M Tris-HCl (pH 6.8), 8 w/v% SDS,40 w/v% Glyceroland 0.02 w/v% BPB |
SDS polyacrylamide gel (15%) | Fuji Film, Japan | 193-14991 | |
Streptomycin sulfate | Nacalai Tesque, Japan | 32237-14 | |
10X Tris-Glycine buffer solution (10X TG) | Nacalai Tesque, Japan | 09422-81 | Contains 0.25 M-Tris and 1.92 M-Glycine, (pH 8.3) |
Trypsin | Sigma-Aldrich, USA | T8003 | Trypsin from bovine Type 1. |
Vascular clamp | Karl Hammacher GmbH, Germany | HSE 004-35 | Small straight vascular clamp used for clamping aorta. |
All other reagents | Nacalai Tesque, Japan |