Nous avons développé une méthode simple pour isoler les cellules individuelles de coeur de souris de haute qualité par la technique antegrade de perfusion. Cette méthode est sans Langendorff et utile pour isoler les myocytes ventriculaires et auriculaires ou les cellules interstitielles, telles que les fibroblastes cardiaques ou les progéniteurs.
Dans la recherche fondamentale utilisant le cœur de souris, l’isolement de cardiomyocytes individuels viables est une étape technique cruciale à surmonter. Traditionnellement, l’isolement des cardiomyocytes des lapins, des cobayes ou des rats a été effectué via une perfusion rétrograde du cœur avec des enzymes à l’aide d’un appareil de Langendorff. Cependant, un haut degré de compétence est requis lorsque cette méthode est utilisée avec un petit cœur de souris. Une méthode antegrade de perfusion qui n’utilise pas un appareil de Langendorff a été récemment rapportée pour l’isolement des cardiomyocytes de souris. Nous rapportons ci-dessus un protocole complet pour la perfusion antegrade améliorée du coeur excisé pour isoler les cellules individuelles de coeur des souris adultes (8 – 108 semaines). La perfusion antegrade est réalisée en injectant du perfusat près de l’apex du ventricule gauche du cœur excisé, dont l’aorte a été serrée, à l’aide d’une pompe à perfusion. Toutes les procédures sont effectuées sur un tapis chauffant préchauffé au microscope, ce qui permet de surveiller les processus d’injection et de perfusion. Les résultats suggèrent que les myocytes ventriculaires et atriculaires, et les fibroblastes puissent être bien isolés d’une souris adulte simple simultanément.
Généralement, la première étape de l’isolement unicellulaire du tissu disséqué consiste à miisser le tissu en petits morceaux, suivie de la digestion du tissu conjonctif et de la matrice extracellulaire avec des enzymes. Cependant, les cardiomyocytes ne peuvent pas être isolés avec une telle méthode de hachage, car l’enrichissement avec des composants de la matrice extracellulaire, y compris les fibres de collagène et d’élastine, rend le myocarde trop difficile à hacher, et les cardiomyocytes sont très sensibles à l’hypoxie et à d’autres changements dans le microenvironnement. Ainsi, en utilisant le système de perfusion rétrograde à base de Langendorff1,une méthode de digestion de la matrice extracellulaire avec des enzymes a été développée pour isoler les cardiomyocytes individuels du cœur2,3,4.
Dans les modèles murins, la perfusion rétrograde du cœur à base de Langendorff avec des enzymes est également utilisée pour l’isolement de cardiomyocytes individuels5,6,7,8. Cependant, l’ondulation de l’aorte de souris petite et mince et son montage sur l’appareil de Langendorff pour effectuer une perfusion rétrograde nécessitent un degré élevé de compétence, car le diamètre de l’aorte dans le cœur adulte est d’environ 1,2 mm. De plus, il faut du temps pour effectuer plusieurs expériences car l’appareil de Langendorff doit être nettoyé avant de perfuser le cœur suivant.
Comme alternative à la perfusion rétrograde, une nouvelle méthode pour isoler des cardiomyocytes d’un coeur adulte de souris sans appareil de Langendorff a été développée. Cette méthode de fabrication d’époque a été basée sur la perfusion antegrade des artères coronaires9. Nous avons récemment amélioré chaque étape de ce protocole antegrade, tel que le serrage de l’aorte, l’insertion d’aiguille, et le contrôle de température, et surveillé toutes les procédures de perfusion avec un microscope10. Nous rapportons ci-dessus en détail le raffinement de cette méthode antegrade de perfusion pour raccourcir le temps pour l’isolement et fournir un vidéo supplémentaire. Dans cette méthode, la perfusion du cœur prend environ 7 min avec 10 mL d’enzymes, et cette courte période de digestion augmente la viabilité des cellules. Il s’agit d’une méthode simple pour isoler les cellules à cœur unique à une haute qualité sans nécessiter l’ajout de produits chimiques, tels que la 2,3-butanedione monoxime (BDM)6,11 ou la taurine5,8. Nous croyons que cette méthode abaissera le seuil de compétence de la technique et améliorera l’utilité des cardiomyocytes de souris dans la recherche fondamentale.
Puisque le coeur est fortement sensible à l’ischémie, le temps nécessaire pour exciser le coeur et l’immerger dans le CIB-EGTA glacé pour arrêter la contraction devrait être maintenu court autant que possible (<1 min). Il s’agit de la première étape critique de cette méthode. La deuxième étape critique concerne la direction du cœur. L’orientation particulière du cœur excisé à l’étape 2.1.2 facilite la vue et l’enlever de la graisse et des tissus conjonctifs autour de l’aorte. Après le nettoyage autour de l’aorte, placez le cœur serré avec le côté de la surface antérieure vers le haut sur la plaque de perfusion. La dernière étape critique implique l’insertion de l’aiguille d’injection. Lors de l’avancement de l’aiguille vers le cœur, l’aiguille d’injection ne doit pas être détachée de la plaque de perfusion afin de maintenir une distance constante de la plaque. La position de l’insertion est près de l’apex du ventricule gauche. Insérez soigneusement l’aiguille sans torsion, car une telle torsion peut agrandir le trou. La profondeur de l’insertion de l’aiguille peut être estimée en regardant la marque rouge. Si l’aiguille est insérée trop profondément, la pointe peut percer à travers le septum ventriculaire et entrer dans le ventricule droit ou si la valvule mitrale et entrer dans l’oreillette gauche. Après avoir confirmé la disparition du sang de l’artère coronaire, l’aiguille doit être fixée avec du ruban adhésif sur la plaque de perfusion.
Une longueur d’aorte plus longue rend difficile le serrage de l’aorte à la bonne position. Si la pince est trop éloignée des oreillettes, le cœur peut tourner après perfusion de perfusat. Pour éviter cela, coupez l’aorte juste sous l’artère brachiocéphalique pour raccourcir l’aorte avant de la serrer.
Si le sang ne commence pas à s’extraire après la perfusion à une vitesse initiale de 0,5 mL/min, augmentez la vitesse à 1 mL/min. Si cela n’aide pas, l’aiguille d’injection peut être mal positionnée, comme dans le ventricule droit, le septum ventriculaire ou la paroi myocardique gauche. Dans un tel cas, retirez immédiatement l’aiguille et essayez de la réinsérer près de l’apex du ventricule gauche. Lors de l’insertion de l’aiguille plusieurs fois, les cellules digérées peuvent s’écouler des trous ouverts. Notez que cela n’affecte généralement pas sérieusement l’isolement cellulaire.
Les opérateurs peuvent surveiller l’ensemble du processus de perfusion antegrade du cœur à l’aide d’un microscope stéréoscopique pour observer les changements de couleur et de transparence et le redémarrage du battement des oreillettes avec la digestion. Un total de 10 mL de mélange d’enzymes devrait être le maximum requis, même pour un vieux cœur. Dans les coeurs plus jeunes (5-7 semaines), nous réduisons le volume à 9 ml, qui est semblable à l’approche par l’intermédiaire de la perfusion rétrograde avec le même mélange d’enzymes.
Le surnageant à la centrifugation finale contient des débris, des cellules sanguines et des non-myocytes tandis que le granule contient principalement des cardiomyocytes et des non-myocytes contaminants, tels que les fibroblastes et les cellules endothéliales. Pour purifier les cardiomyocytes, d’autres étapes sont nécessaires. En général, le culot doit être ressuscité dans le milieu de culture cellulaire approprié et préplaqué pendant 2 h à 37 °C sur un plat de culture cellulaire tissulaire, puis retirer délicatement les cardiomyocytes par pipetage et prélation pour la culture.
Le mélange d’enzymes contient une faible concentration deCa2+ (0,3 mM). Nous incubons donc les cellules digérées dansCIB-Ca2+-BSA (1,2 mMCa2+)avant la remise en suspension finale avec la solution de réuspension cellulaire (1,8 mMCa2+),et l’augmentation progressive deCa2+ évite de causer des dommages cellulaires7. Tant que les cardiomyocytes isolés sont intacts (cellules quiescentes sans contraction), cette procédure d’adaptation au Ca2+n’affecte pas la viabilité cellulaire chez la souris. Comme les cellules endommagées meurent pendant cette incubation, nous obtenons par conséquent un groupe cellulaire sain. De même, des myocytes auriculaires intacts isolés (cellules de repos sans contraction irrégulière) peuvent être stockés dans la même solution de remise en suspension cellulaire. Cependant, les myocytes auriculaires ont tendance à être plus délicats à stocker par rapport aux myocytes ventriculaires.
En laboratoire, cette méthode d’isolement est presque toujours réussie à moins que l’insertion de l’aiguille dans le ventricule gauche échoue. Nous avons également réussi à isoler des cellules du coeur hypertrophié préparé par constriction aortique transversale chirurgicale. Cependant, chez les souris âgées, qui ont souvent de petits infarctus du myocarde, la perfusion cesse à certains endroits, ce qui entraîne une digestion incomplète et donc un faible rendement (Figure 1C), similaire à la méthode rétrograde basée sur Langendorff. Dans de tels cas, la forme déformée du cœur peut être observée même au début de la perfusion.
Cette méthode de perfusion antegrade est utile pour isoler les cellules cardiaques de souris de différents âges, mais pas d’animaux plus gros, tels que les lapins et les cobayes. Il peut être possible d’appliquer cette méthode à des rats néonatals ou juvéniles avant le sevrage.
L’un des avantages de cette méthode de perfusion antegrade est qu’elle diminue les obstacles techniques associés à l’utilisation de la méthode de perfusion rétrograde à base de Langendorff pour les petits cœurs de souris. Le temps nécessaire à la perfusion est d’environ 7 min avec 10 mL d’enzymes, cette courte période de digestion augmente la viabilité des cellules. De plus, il permet d’effectuer la perfusion par la circulation coronaire du cœur, même après que les valves aortiques ont été digérées. L’isolement des myocytes auriculaires nécessite généralement une perfusion rétrograde à base de Langendorff et une incubation supplémentaire avec des enzymes17. Cette approche antegrade de perfusion, cependant, peut profondément perfuser le tissu avec l’enzyme pour isoler les myocytes atriaux.
Dans les expériences utilisant plusieurs souris, l’appareil de Langendorff doit être nettoyé avant de perfuser le cœur suivant. Cependant, dans la méthode antegrade actuelle, tant que le nombre souhaité de jeux d’instruments (par exemple, aiguilles de seringues et plaques de perfusion) sont préparés à l’avance, la perfusion peut être effectuée en continu.
Nous rapportons ci-dessus la méthodologie de base de la perfusion antegrade du coeur de souris utilisant les mêmes solutions que la méthode rétrograde Langendorff-basée de perfusion sans les produits chimiques additionnels. La composition du perfusat peut être modifiée en fonction du but de l’expérience, comme l’utilisation d’un détergent contenant de l’EGTA au lieu des enzymes pour fabriquer un cœur décellulaire18.
The authors have nothing to disclose.
Les auteurs remercient T. Yamamoto et Y. Mori pour leur aide dans les expériences morphologiques. Ce travail a été soutenu par une subvention pour la recherche scientifique (C) de la Société japonaise pour la promotion de la science (18K06871 à M.O.K. et 17K08536 à H.M.).
Amphotericin B | Wako Pure Chemical Industries, Japan | ||
Alexa Fluor 488 anti-mouse IgG antibody | Molecular Probes, USA | A11001 | Fluorescent-labeled secondary antibody. (1:400 dilution for immunostaining) |
Anti-α-actinin (ACTN) | Sigma-Aldrich, USA | A7811 | Mouse monoclonal antibody (clone EA-53). (1:400 dilution for immunostaining) |
Anti-atrial natriuretic peptide (ANP) | Merck-Millipore, USA | AB5490-I | Rabbit polyclonal antibody (1:2000 dilution for Western blots) |
Anti-Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) | Cell Signaling Technology, USA | 2118 | Mouse monoclonal antibody (1:10000 dilution for Western blots) |
Anti-smooth muscle actin (SMA) | Dako, Denmark | M0851 | Mouse monoclonal antibody (clone 1A4) (1:400 for immunostaining) |
Anti-rabbit IgG antibody | Amersham, GE Healthcare, USA | NA934 | Secondary antibody (1:10000 dilution for Western blots) |
ATP disodium salt | Sigma-Aldrich, USA | A26209 | |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich, USA | A9418 | |
Cell-Tak | Corning | 354240 | Biological material for adhesion of the cell or tissues |
Chemi-Lumi One Super | Nacalai Tesque, Japan | 02230-14 | Chemiluminescent reagent used for western blotting. |
Collagenase Type 2 | Worthington Biochemicals, USA | LS004176 | Choose the activity guaranteed to be greater than 300 unit/mg. |
Complete Mini | Roche, Germany | 11836153001 | A mixture of several protease inhibitors. |
4'6'diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Nacalai Tesque, Japan | 11034-56 | Used for cell-impermeant nuclear stainig |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Nacalai Tesque, Japan | 08458-45 | including 4.5 g/L gluose |
Extension tube | Top, Japan | X1-50 | Connect with syringe and injection needle for antegrade perfusion. |
EPC-8 patch-clamp amplifier | HEKA, Germany | ||
Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich, USA | F7524-500ML | |
Glass capillaries | Narishige Scientific Instrument Lab., Japan | outside diameter 1.5 mm, inside diameter 0.9 mm | |
GTP lithium salt | Sigma-Aldrich, USA | G5884 | |
Horizontal microelectrode puller | Germany) | P-97 | |
Heater mat | Natsume Seisakusho, Japan | KN-475-3-40 | Equipment to warm the perfusion plate. |
Infusion pump | TERUMO, Japan | TE-311 | Infusion syringe pump for antegrade perfusion. |
Injeciton needle (27 gauge) | TERUMO, Japan | NN-2719S | Needle for insertion into the left ventricle. |
Insulin (from bovine pancrease) | Sigma-Aldrich, USA | I5500 | Dissolve in 0.1 M HCl. |
Mini cordless grinder | Funakoshi, Japan | cG-4A | Small grinder for homogenizing tissue in 1.5 mL sample tube. |
4%-Paraformaldehyde Phosphate Buffer solution (4% PFA) | Nacalai Tesque, Japan | 09154-85 | |
Penicillin G potassium | Nacalai Tesque, Japan | 26239-84 | |
Phenol Red | Nacalai Tesque, Japan | 26807-21 | |
10X Phosphate Buffered Saline (pH7.4) (10X PBS) | Nacalai Tesque, Japan | 27575-31 | |
Plastic multi-well culture plate | Falcon, USA | 353226 | Use the lid of the multi-well culture plate as the perfusion plate. |
Plastic syringe (20 mL) | TERUMO, Japan | SS-20ES | Use for infusion of CIB-EGTA. |
Plastic syringe (30 mL) | TERUMO, Japan | SS-30ES | Use for infusion of Enzyme-mix |
Plastic transfer pipette | Sarstedt, Germany | 86.1171 | Cut the tip just before sucking mouse heart into the pipette. |
Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane | Merck-Millipore, USA | IPVH00010 | Immobilin-P membrane (Transfer membrane for protein blotting) |
Protease | Sigma-Aldrich, USA | P5147 | A mixture of three or more proteases including extracellular serine protease. |
4X Sample buffer solution | Fuji Film, Japan | 198-13282 | Contains 0.25 M Tris-HCl (pH 6.8), 8 w/v% SDS,40 w/v% Glyceroland 0.02 w/v% BPB |
SDS polyacrylamide gel (15%) | Fuji Film, Japan | 193-14991 | |
Streptomycin sulfate | Nacalai Tesque, Japan | 32237-14 | |
10X Tris-Glycine buffer solution (10X TG) | Nacalai Tesque, Japan | 09422-81 | Contains 0.25 M-Tris and 1.92 M-Glycine, (pH 8.3) |
Trypsin | Sigma-Aldrich, USA | T8003 | Trypsin from bovine Type 1. |
Vascular clamp | Karl Hammacher GmbH, Germany | HSE 004-35 | Small straight vascular clamp used for clamping aorta. |
All other reagents | Nacalai Tesque, Japan |