Wir entwickelten eine einfacheMethode zur Isolierung hochwertiger einzelner Mausherzzellen durch die antegrade Perfusionstechnik. Diese Methode ist Langendorff-frei und nützlich zur Isolierung von ventrikulären und vorhofialen Myozyten oder interstitiellen Zellen, wie Herzfibroblasten oder Vorläuferzellen.
In der Grundlagenforschung mit Mausherz ist die Isolierung lebensfähiger individueller Kardiomyozyten ein entscheidender technischer Schritt, den es zu überwinden gilt. Traditionell wurde die Isolierung von Kardiomyozyten von Kaninchen, Meerschweinchen oder Ratten durch retrograde Perfusion des Herzens mit Enzymen unter Verwendung eines Langendorff-Geräts durchgeführt. Ein hohes Maß an Geschick ist jedoch erforderlich, wenn diese Methode mit einem kleinen Mausherz angewendet wird. Für die Isolierung von Maus-Kardiomyozyten wurde kürzlich über eine antegrade Perfusionsmethode berichtet, bei der kein Langendorff-Gerät verwendet wird. Wir berichten hier über ein vollständiges Protokoll für die verbesserte antegrade Perfusion des herausgeschnittenen Herzens, um einzelne Herzzellen von erwachsenen Mäusen (8 – 108 Wochen alt) zu isolieren. Die antegrade Perfusion wird durch Injektion von Perfusat in der Nähe der Spitze des linken Ventrikels des herausgeschnittenen Herzens, dessen Aorta mit einer Infusionspumpe geklemmt wurde, durchgeführt. Alle Eingriffe werden auf einer vorgewärmten Heizmatte unter dem Mikroskop durchgeführt, wodurch die Injektions- und Perfusionsprozesse überwacht werden können. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass ventrikuläre und vorhofliche Myozyten und Fibroblasten gleichzeitig gut von einer einzigen erwachsenen Maus isoliert werden können.
Im Allgemeinen besteht der erste Schritt der Einzelzellisolierung von seziertem Gewebe darin, das Gewebe in kleine Stücke zu zerkleinern, gefolgt von der Verdauung des Bindegewebes und der extrazellulären Matrix mit Enzymen. Kardiomyozyten können jedoch nicht mit einer solchen Hackmethode isoliert werden, da die Anreicherung mit extrazellulären Matrixkomponenten, einschließlich Kollagen- und Elastinfasern, das Myokard zu zäh macht, um es zu hacken, und die Kardiomyozyten sind sehr empfindlich gegenüber Hypoxie und anderen Veränderungen in der Mikroumgebung. So wurde unter Verwendung des Langendorff-basierten retrograden Perfusionssystems1eine Methode zur Verdauung der extrazellulären Matrix mit Enzymen entwickelt, um einzelne Kardiomyozyten aus dem Herzen zu isolieren2,3,4.
In Mausmodellen wird die Langendorff-basierte retrograde Perfusion des Herzens mit Enzymen auch zur Isolierung einzelner Kardiomyozyten5,6,7,8verwendet. Die Kanulation der kleinen und dünnen Mausaorta und ihre Montage am Langendorff-Apparat zur Durchführung einer retrograden Perfusion erfordert jedoch ein hohes Maß an Geschicklichkeit, da der Durchmesser der Aorta im erwachsenen Herzen etwa 1,2 mm beträgt. Darüber hinaus braucht es Zeit, um mehrere Experimente durchzuführen, da das Langendorff-Gerät gereinigt werden sollte, bevor das nächste Herz durchsfundiert wird.
Als Alternative zur retrograden Perfusion wurde eine neuartige Methode zur Isolierung von Kardiomyozyten aus einem erwachsenen Mausherz ohne Langendorff-Apparat entwickelt. Diese epochale Methode basierte auf der antegraden Perfusion der Koronararterien9. Wir haben kürzlich jeden Schritt dieses antegraden Protokolls verbessert, wie das Klemmen der Aorta, das Einführen der Nadel und die Temperaturkontrolle, und alle Perfusionsverfahren miteinem Mikroskop überwacht 10. Wir berichten hier ausführlich über die Verfeinerung dieser antegraden Perfusionsmethode, um die Zeit für die Isolierung zu verkürzen und ein ergänzendes Video zur Verfügung zu stellen. Bei dieser Methode dauert die Perfusion des Herzens etwa 7 Minuten mit 10 ml der Enzyme, und diese kurze Verdauungszeit erhöht die Lebensfähigkeit der Zellen. Dies ist eine einfache Methode zur Isolierung einzelner Herzzellen in hoher Qualität, ohne dass die Zugabe von Chemikalien wie 2,3-Butanedionmonoxem (BDM)6,11 oder Taurin 5,8erforderlich ist. Wir glauben, dass diese Methode die Fähigkeitsschwelle der Technik senken und den Nutzen von Mauskardiomyozyten in der Grundlagenforschung verbessern wird.
Da das Herz sehr anfällig für Ischämie ist, sollte die Zeit, die erforderlich ist, um das Herz zu entfernen und es in eiskaltes CIB-EGTA zu tauchen, um die Kontraktion zu stoppen, so kurz wie möglich gehalten werden (<1 min). Dies ist der erste kritische Schritt dieser Methode. Der zweite kritische Schritt betrifft die Richtung des Herzens. Die besondere Ausrichtung des herausgeschnittenen Herzens in Schritt 2.1.2 erleichtert das Sehen und Entfernen des Fettes und des Bindegewebes um die Aorta. Nach der Reinigung um die Aorta herum das eingeklemmte Herz mit der vorderen Oberfläche seitlich nach oben auf die Perfusionsplatte legen. Der letzte kritische Schritt ist das Einführen der Injektionsnadel. Beim Vorrücken der Nadel in Richtung Herz sollte die Injektionsnadel nicht von der Perfusionsplatte gelöst werden, um einen konstanten Abstand zur Platte zu halten. Die Position des Einsetzens befindet sich in der Nähe der Spitze des linken Ventrikels. Führen Sie die Nadel vorsichtig ein, ohne sich zu verdrehen, da eine solche Verdrehung das Loch vergrößern kann. Die Tiefe des Einführens der Nadel kann durch Beobachten der roten Markierung abgeschätzet werden. Wenn die Nadel zu tief eingeführt wird, kann die Spitze durch das ventrikuläre Septum stechen und in den rechten Ventrikel oder durch die Mitralklappe gelangen und in den linken Vorhof gelangen. Nach der Bestätigung des Verschwindens des Blutes aus der Koronararterie sollte die Nadel mit Klebeband auf der Perfusionsplatte befestigt werden.
Eine längere Aortenlänge erschwert es, die Aorta an der richtigen Position zu klemmen. Wenn die Klemme zu weit von den Vorhöfen entfernt ist, kann sich das Herz nach der Perfusatinfusion drehen. Um dies zu verhindern, schneiden Sie die Aorta direkt unter der Brachiocephalusarterie ab, um die Aorta vor dem Klemmen zu verkürzen.
Wenn das Blut nach der Perfusion mit einer Anfangsgeschwindigkeit von 0,5 ml / min nicht zu entladen beginnt, erhöhen Sie die Geschwindigkeit auf 1 ml / min. Hilft das nicht, kann die Injektionsnadel falsch positioniert sein, etwa im rechten Ventrikel, im ventrikulären Septum oder in der linken Myokardwand. Entfernen Sie in einem solchen Fall die Nadel sofort und versuchen Sie, sie in der Nähe der Spitze des linken Ventrikels wieder einzuführen. Beim mehrmaligen Einführen der Nadel können verdaute Zellen aus den geöffneten Löchern herausfließen. Beachten Sie, dass dies die Zellisolierung normalerweise nicht ernsthaft beeinträchtigt.
Die Bediener können den gesamten Prozess der antegraden Perfusion des Herzens mit einem stereoskopischen Mikroskop überwachen, um die Veränderungen in Farbe und Transparenz und den Neustart des Schlagens der Vorhöfe zusammen mit der Verdauung zu beobachten. Insgesamt 10 ml Enzymmischung sollten das Maximum sein, das auch für ein altes Herz erforderlich ist. Bei jüngeren Herzen (5-7 Wochen alt) reduzieren wir das Volumen auf 9 ml, was dem Ansatz über retrograde Perfusion mit der gleichen Enzymmischung ähnelt.
Der Überstand bei der endgültigen Zentrifugation enthält Trümmer, Blutzellen und Nicht-Myozyten, während das Pellet hauptsächlich Kardiomyozyten und kontaminierende Nicht-Myozyten wie Fibroblasten und Endothelzellen enthält. Um die Kardiomyozyten zu reinigen, sind weitere Schritte erforderlich. Im Allgemeinen sollte das Pellet im entsprechenden Zellkulturmedium resuspendiert und für 2 h bei 37 ° C auf einer Gewebezellkulturschale vorplattiert werden, und dann die Kardiomyozyten vorsichtig durch Pipettieren und Vorplattieren für die Kultur entfernen.
Die Enzymmischung enthält eine geringe Konzentration von Ca2+ (0,3 mM). Wir inkubieren daher verdaute Zellen in CIB-Ca2+ -BSA (1,2 mMCa2+) vor der endgültigen Resuspension mit der Zellresuspensionslösung (1,8 mMCa2+), und der allmähliche Anstieg von Ca2+ vermeidet Zellschäden7. Solange die isolierten Kardiomyozyten intakt sind (Ruhezellen ohne Kontraktion), beeinträchtigt dieses Ca2+-Anpassungsverfahren die Zelllebensfähigkeit bei Mäusen nicht. Da die geschädigten Zellen während dieser Inkubation absterben, erhalten wir folglich eine gesunde Zellgruppe. In ähnlicher Weise können isolierte intakte Vorhoffyrozyten (Ruhezellen ohne unregelmäßige Kontraktion) in derselben Zellresuspensionslösung gespeichert werden. Die Vorhofmyozyten neigen jedoch dazu, im Vergleich zu den ventrikulären Myozyten empfindlicher zu speichern.
Im Labor ist diese Isolationsmethode fast immer erfolgreich, es sei denn, das Einführen der Nadel in den linken Ventrikel schlägt fehl. Es ist uns auch gelungen, Zellen aus dem hypertrophierten Herzen zu isolieren, das durch chirurgische transversale Aortenverengung hergestellt wurde. Bei gealterten Mäusen, die oft kleine Myokardinfarkte aufweisen, hört die Perfusion jedoch an einigen Stellen auf, was zu einer unvollständigen Verdauung und damit zu einer geringen Ausbeute führt (Abbildung 1C), ähnlich der Langendorff-basierten retrograden Methode. In solchen Fällen kann die verzerrte Form des Herzens bereits zu Beginn der Perfusion beobachtet werden.
Diese antegrade Perfusionsmethode ist nützlich, um Herzzellen von Mäusen unterschiedlichen Alters, aber nicht von größeren Tieren wie Kaninchen und Meerschweinchen zu isolieren. Es kann möglich sein, diese Methode vor dem Absetzen auf neonatale oder juvenile Ratten anzuwenden.
Einer der Vorteile dieser antegraden Perfusionsmethode besteht darin, dass sie die technischen Hindernisse verringert, die mit der Verwendung der Langendorff-basierten retrograden Perfusionsmethode für kleine Mausherzen verbunden sind. Die für die Perfusion erforderliche Zeit beträgt ca. 7 min mit 10 ml der Enzyme, diese kurze Verdauungszeit erhöht die Lebensfähigkeit der Zellen. Darüber hinaus ermöglicht es die Perfusion durch die Koronarzirkulation des Herzens, auch nachdem die Aortenklappen verdaut wurden. Die Isolierung von Vorhoffyozyten erfordert in der Regel eine retrograde Perfusion auf Langendorff-Basis und eine weitere Inkubation mit Enzymen17. Dieser antegrade Perfusionsansatz kann jedoch das Gewebe tief mit dem Enzym durchdringen, um Vorhoffyozyten zu isolieren.
In Experimenten mit mehreren Mäusen sollte das Langendorff-Gerät gereinigt werden, bevor das nächste Herz durchschnundt wird. Bei der vorliegenden antegraden Methode kann jedoch, solange die gewünschte Anzahl von Instrumentensätzen (z. B. Spritzennadeln und Perfusionsplatten) im Voraus vorbereitet wird, die Perfusion kontinuierlich durchgeführt werden.
Wir berichten hier über die grundlegende Methodik der antegraden Perfusion des Mausherzes mit den gleichen Lösungen wie die Langendorff-basierte retrograde Perfusionsmethode ohne zusätzliche Chemikalien. Die Zusammensetzung des Perfusat kann an den Zweck des Experiments angepasst werden, z. B. die Verwendung eines REINIGUNGSMITTELS, das EGTA anstelle der Enzyme enthält, um ein dezellularisiertes Herzherzustellen 18.
The authors have nothing to disclose.
Die Autoren danken T. Yamamoto und Y. Mori für ihre Unterstützung bei den morphologischen Experimenten. Diese Arbeit wurde durch einen Grant-in-Aid for Scientific Research (C) der Japan Society for the Promotion of Science (18K06871 bis M.O.K. und 17K08536 bis H.M.) unterstützt.
Amphotericin B | Wako Pure Chemical Industries, Japan | ||
Alexa Fluor 488 anti-mouse IgG antibody | Molecular Probes, USA | A11001 | Fluorescent-labeled secondary antibody. (1:400 dilution for immunostaining) |
Anti-α-actinin (ACTN) | Sigma-Aldrich, USA | A7811 | Mouse monoclonal antibody (clone EA-53). (1:400 dilution for immunostaining) |
Anti-atrial natriuretic peptide (ANP) | Merck-Millipore, USA | AB5490-I | Rabbit polyclonal antibody (1:2000 dilution for Western blots) |
Anti-Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) | Cell Signaling Technology, USA | 2118 | Mouse monoclonal antibody (1:10000 dilution for Western blots) |
Anti-smooth muscle actin (SMA) | Dako, Denmark | M0851 | Mouse monoclonal antibody (clone 1A4) (1:400 for immunostaining) |
Anti-rabbit IgG antibody | Amersham, GE Healthcare, USA | NA934 | Secondary antibody (1:10000 dilution for Western blots) |
ATP disodium salt | Sigma-Aldrich, USA | A26209 | |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich, USA | A9418 | |
Cell-Tak | Corning | 354240 | Biological material for adhesion of the cell or tissues |
Chemi-Lumi One Super | Nacalai Tesque, Japan | 02230-14 | Chemiluminescent reagent used for western blotting. |
Collagenase Type 2 | Worthington Biochemicals, USA | LS004176 | Choose the activity guaranteed to be greater than 300 unit/mg. |
Complete Mini | Roche, Germany | 11836153001 | A mixture of several protease inhibitors. |
4'6'diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Nacalai Tesque, Japan | 11034-56 | Used for cell-impermeant nuclear stainig |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Nacalai Tesque, Japan | 08458-45 | including 4.5 g/L gluose |
Extension tube | Top, Japan | X1-50 | Connect with syringe and injection needle for antegrade perfusion. |
EPC-8 patch-clamp amplifier | HEKA, Germany | ||
Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich, USA | F7524-500ML | |
Glass capillaries | Narishige Scientific Instrument Lab., Japan | outside diameter 1.5 mm, inside diameter 0.9 mm | |
GTP lithium salt | Sigma-Aldrich, USA | G5884 | |
Horizontal microelectrode puller | Germany) | P-97 | |
Heater mat | Natsume Seisakusho, Japan | KN-475-3-40 | Equipment to warm the perfusion plate. |
Infusion pump | TERUMO, Japan | TE-311 | Infusion syringe pump for antegrade perfusion. |
Injeciton needle (27 gauge) | TERUMO, Japan | NN-2719S | Needle for insertion into the left ventricle. |
Insulin (from bovine pancrease) | Sigma-Aldrich, USA | I5500 | Dissolve in 0.1 M HCl. |
Mini cordless grinder | Funakoshi, Japan | cG-4A | Small grinder for homogenizing tissue in 1.5 mL sample tube. |
4%-Paraformaldehyde Phosphate Buffer solution (4% PFA) | Nacalai Tesque, Japan | 09154-85 | |
Penicillin G potassium | Nacalai Tesque, Japan | 26239-84 | |
Phenol Red | Nacalai Tesque, Japan | 26807-21 | |
10X Phosphate Buffered Saline (pH7.4) (10X PBS) | Nacalai Tesque, Japan | 27575-31 | |
Plastic multi-well culture plate | Falcon, USA | 353226 | Use the lid of the multi-well culture plate as the perfusion plate. |
Plastic syringe (20 mL) | TERUMO, Japan | SS-20ES | Use for infusion of CIB-EGTA. |
Plastic syringe (30 mL) | TERUMO, Japan | SS-30ES | Use for infusion of Enzyme-mix |
Plastic transfer pipette | Sarstedt, Germany | 86.1171 | Cut the tip just before sucking mouse heart into the pipette. |
Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane | Merck-Millipore, USA | IPVH00010 | Immobilin-P membrane (Transfer membrane for protein blotting) |
Protease | Sigma-Aldrich, USA | P5147 | A mixture of three or more proteases including extracellular serine protease. |
4X Sample buffer solution | Fuji Film, Japan | 198-13282 | Contains 0.25 M Tris-HCl (pH 6.8), 8 w/v% SDS,40 w/v% Glyceroland 0.02 w/v% BPB |
SDS polyacrylamide gel (15%) | Fuji Film, Japan | 193-14991 | |
Streptomycin sulfate | Nacalai Tesque, Japan | 32237-14 | |
10X Tris-Glycine buffer solution (10X TG) | Nacalai Tesque, Japan | 09422-81 | Contains 0.25 M-Tris and 1.92 M-Glycine, (pH 8.3) |
Trypsin | Sigma-Aldrich, USA | T8003 | Trypsin from bovine Type 1. |
Vascular clamp | Karl Hammacher GmbH, Germany | HSE 004-35 | Small straight vascular clamp used for clamping aorta. |
All other reagents | Nacalai Tesque, Japan |