Vi utviklet en simple-metode for å isolere individuelle musehjerteceller av høy kvalitet ved antegrad perfusjonsteknikken. Denne metoden er Langendorff-fri og nyttig for å isolere ventrikulære og atrie-myocytter eller interstitiale celler, for eksempel hjertefibroblaster eller forfedre.
I grunnleggende forskning ved hjelp av musehjerte er det å isolere levedyktige individuelle kardiomyocytter et avgjørende teknisk skritt å overvinne. Tradisjonelt har isolerende kardiomyocytter fra kaniner, marsvin eller rotter blitt utført via retrograd perfusjon av hjertet med enzymer ved hjelp av et Langendorff-apparat. Imidlertid er det nødvendig med en høy grad av dyktighet når denne metoden brukes med et lite musehjerte. En antegrad perfusjonsmetode som ikke bruker et Langendorff-apparat ble nylig rapportert for isolering av muskardiomyocytter. Vi rapporterer heri en komplett protokoll for forbedret antegrad perfusjon av det utskilte hjertet for å isolere individuelle hjerteceller fra voksne mus (8 – 108 uker gammel). Antegrad perfusjon utføres ved å injisere perfusat nær toppen av venstre ventrikel av det utskilte hjertet, hvor aorta ble klemt, ved hjelp av en infusjonspumpe. Alle prosedyrer utføres på en forvarmet varmematte under et mikroskop, noe som gjør at injeksjons- og perfusjonsprosessene kan overvåkes. Resultatene tyder på at ventrikulære og atrie-myocytter og fibroblaster kan isoleres godt fra en enkelt voksen mus samtidig.
Generelt innebærer det første trinnet i enkeltcelleisolasjonen av dissekert vev å blande vevet i små biter, etterfulgt av fordøyelsen av bindevevet og ekstracellulær matrise med enzymer. Kardiomyocytter kan imidlertid ikke isoleres med en slik hakkemetode, som berikelse med ekstracellulære matrisekomponenter, inkludert kollagen- og elastinfibre, gjør myokardiet for tøft å hakke, og kardiomyocyttene er svært følsomme for hypoksi og andre endringer i mikromiljøet. Således, ved hjelp av Langendorff-baserte retrograd perfusjonssystem1, er det utviklet en metode for å fordøye den ekstracellulære matrisen med enzymer for å isolere individuelle kardiomyocytter fra hjertet2,3,4.
I musemodeller brukes Langendorff-basert retrograd perfusjon av hjertet med enzymer også til isolering av individuelle kardiomyocytter5,6,7,8. Imidlertid krever kannasjonen av den lille og tynne musen aorta og dens montering på Langendorff-apparatet for å utføre retrograd perfusjon en høy grad av dyktighet, siden diameteren på aorta i voksenhjertet er ca. 1,2 mm. Videre tar det tid å utføre flere eksperimenter, da Langendorff-apparatet skal rengjøres før det neste hjertet forvrenges.
Som et alternativ til retrograd perfusjon ble det utviklet en ny metode for å isolere kardiomyocytter fra et voksent musehjerte uten et Langendorff-apparat. Denne epoke-making metoden var basert på antegrad perfusjon av koronararteriene9. Vi har nylig forbedret hvert trinn i denne antegrade protokollen, for eksempel klemming av aorta, nålinnsetting og temperaturkontroll, og overvåket alle perfusjonsprosedyrer med et mikroskop10. Vi rapporterer heri i detalj raffinement av denne antegrade perfusjonsmetoden for å forkorte tiden for isolasjon og gi en supplerende video. I denne metoden tar perfusjonen av hjertet ca 7 min med 10 ml enzymer, og denne korte fordøyelsesperioden øker levedyktigheten til cellene. Dette er en enkel metode for å isolere enkelt hjerteceller i høy kvalitet uten å kreve tilsetning av kjemikalier, for eksempel 2,3-butanedione monoksime (BDM)6,11 eller taurin5,8. Vi tror at denne metoden vil senke ferdighetsterskelen til teknikken og forbedre nytten av muskardiomyocytter i grunnleggende forskning.
Siden hjertet er svært utsatt for iskemi, bør tiden det tar å utskille hjertet og fordype det i iskald CIB-EGTA for å stoppe sammentrekning holdes kort som mulig (<1 min). Dette er det første kritiske trinnet i denne metoden. Det andre kritiske trinnet gjelder hjertets retning. Den spesielle orienteringen av det utskilte hjertet i trinn 2.1.2 gjør det lettere å se og fjerne fett- og bindevevet rundt aorta. Etter rengjøring rundt aorta, plasser det klemte hjertet med fremre overflateside opp på perfusjonsplaten. Det siste kritiske trinnet innebærer innsetting av injeksjonsnålen. Når nålen beveger seg mot hjertet, bør injeksjonsnålen ikke løsnes fra perfusjonsplaten for å opprettholde en konstant avstand fra platen. Innsettingsposisjonen er nær toppen av venstre ventrikel. Sett nålen forsiktig uten vridning, siden slik vridning kan forstørre hullet. Dybden av innsetting av nålen kan estimeres ved å se på det røde merket. Hvis nålen er satt inn for dypt, kan spissen trenge gjennom ventrikulær septum og gå inn i høyre ventrikel eller gjennom mitralventilen og gå inn i venstre atrium. Etter å ha bekreftet blodets forsvinning fra koronararterien, bør nålen festes med tape til perfusjonsplaten.
En lengre aorta lengde gjør det vanskelig å klemme aorta i riktig posisjon. Hvis klemmen er for fjern fra atriene, kan hjertet rotere etter perfusat infusjon. For å forhindre dette, kutt av aorta like under brachiocephalic arterien for å forkorte aorta før klemming.
Hvis blodet ikke begynner å slippe ut etter perfusjon med en starthastighet på 0,5 ml/min, øker du hastigheten til 1 ml/min. Hvis det ikke hjelper, kan injeksjonsnålen plasseres feil, for eksempel i høyre ventrikel, ventrikulær septum eller venstre myokardvegg. I et slikt tilfelle, fjern nålen umiddelbart og prøv å sette den inn i nærheten av toppen av venstre ventrikel. Når du setter inn nålen flere ganger, kan fordøyde celler strømme ut fra de åpne hullene. Vær oppmerksom på at dette vanligvis ikke påvirker celleisolasjonen alvorlig.
Operatørene kan overvåke hele prosessen med antegrad perfusjon av hjertet ved hjelp av et stereoskopisk mikroskop for å observere endringene i farge og gjennomsiktighet og starte bankingen av atriene sammen med fordøyelsen. Totalt 10 ml enzymblanding bør være det maksimale som kreves, selv for et gammelt hjerte. I yngre hjerter (5-7 uker gamle) reduserer vi volumet til 9 ml, som ligner tilnærmingen via retrograd perfusjon med samme enzymblanding.
Supernatanten ved den endelige sentrifugeringen inneholder rusk, blodceller og ikke-myokytter, mens pelletsen hovedsakelig inneholder kardiomyocytter og forurensende ikke-myocytter, som fibroblaster og endotelceller. For å rense kardiomyocyttene er det nødvendig med flere trinn. Generelt bør pelletsen resuspenderes i riktig cellekulturmedium og forhåndsbelagt i 2 timer ved 37 °C på en vevscellekulturfat, og deretter forsiktig fjerne kardiomyocyttene ved pipettering og preplating for kultur.
Enzymblandingen inneholder en lav konsentrasjon på Ca2+ (0,3 mM). Vi inkuberer derfor fordøyde celler i CIB-Ca2+-BSA (1,2 mM Ca2+) før den endelige resuspensionen med cellerespenseringsløsningen (1,8 mM Ca2+), og den gradvise økningen i Ca2+ unngår å forårsake celleskade7. Så lenge de isolerte kardiomyocyttene er intakte (passivitetsceller uten sammentrekning) påvirker denne Ca2+-tilpasningsprosedyren ikke celle levedyktighet hos mus. Når de skadede cellene dør under denne inkubasjonen, får vi følgelig en sunn cellegruppe. På samme måte kan isolerte intakte atrie-myocytter (passiviserende celler uten uregelmessig sammentrekning) lagres i samme celleresuspensasjonsløsning. Imidlertid har atrie-myocyttene en tendens til å være mer delikate å bli lagret i forhold til ventrikulære myocytter.
I laboratoriet er denne isolasjonsmetoden nesten alltid vellykket med mindre nålen innsetting i venstre ventrikel mislykkes. Vi har også lyktes i å isolere celler fra det hypertrofierte hjertet fremstilt av kirurgisk tverrgående aorta innsnevring. Men hos eldre mus, som ofte har små hjerteinfarkt, opphører perfusjon noen steder, noe som resulterer i ufullstendig fordøyelse og dermed et lavt utbytte (figur 1C), som ligner på den Langendorff-baserte retrograde metoden. I slike tilfeller kan den forvrengte formen på hjertet observeres selv ved begynnelsen av perfusjon.
Denne antegrade perfusjonsmetoden er nyttig for å isolere hjerteceller fra mus i ulike aldre, men ikke større dyr, som kaniner og marsvin. Det kan være mulig å bruke denne metoden på nyfødte eller juvenile rotter før avvenning.
En av fordelene med denne antegrade perfusjonsmetoden er at den reduserer de tekniske hindringene forbundet med å bruke den Langendorff-baserte retrograde perfusjonsmetoden for små musehjerter. Tiden som kreves for perfusjon er ca. 7 min med 10 ml enzymer, denne korte fordøyelsesperioden øker levedyktigheten til cellene. I tillegg gjør det mulig å utføre perfusjon gjennom hjertets koronarsirkulasjon, selv etter at aortaventilene er fordøyd. Isolering av atrie myocytter krever vanligvis Langendorff-basert retrograd perfusjon og videre inkubasjon med enzymer17. Denne antegrade perfusjonsmetoden kan imidlertid dypt parfyme vevet med enzymet for å isolere atrie myocytter.
I eksperimenter som bruker flere mus, bør Langendorff-apparatet rengjøres før det perfuserer neste hjerte. Men i den nåværende antegrade metoden, så lenge ønsket antall instrumentsett (f.eks. sprøyter nåler og perfusjonsplater) fremstilles på forhånd, kan perfusjon utføres kontinuerlig.
Vi rapporterer heri den grunnleggende metodikken for antegrad perfusjon av musehjertet ved hjelp av de samme løsningene som langendorff-basert retrograd perfusjonsmetode uten ekstra kjemikalier. Sammensetningen av perfusatet kan endres for å passe til formålet med eksperimentet, for eksempel å bruke et vaskemiddel som inneholder EGTA i stedet for enzymene for å lage et decellularisert hjerte18.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker T. Yamamoto og Y. Mori for deres hjelp i de morfologiske eksperimentene. Dette arbeidet ble støttet av en Grant-in-Aid for Scientific Research (C) fra Japan Society for the Promotion of Science (18K06871 til M.O.K. og 17K08536 til H.M.).
Amphotericin B | Wako Pure Chemical Industries, Japan | ||
Alexa Fluor 488 anti-mouse IgG antibody | Molecular Probes, USA | A11001 | Fluorescent-labeled secondary antibody. (1:400 dilution for immunostaining) |
Anti-α-actinin (ACTN) | Sigma-Aldrich, USA | A7811 | Mouse monoclonal antibody (clone EA-53). (1:400 dilution for immunostaining) |
Anti-atrial natriuretic peptide (ANP) | Merck-Millipore, USA | AB5490-I | Rabbit polyclonal antibody (1:2000 dilution for Western blots) |
Anti-Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) | Cell Signaling Technology, USA | 2118 | Mouse monoclonal antibody (1:10000 dilution for Western blots) |
Anti-smooth muscle actin (SMA) | Dako, Denmark | M0851 | Mouse monoclonal antibody (clone 1A4) (1:400 for immunostaining) |
Anti-rabbit IgG antibody | Amersham, GE Healthcare, USA | NA934 | Secondary antibody (1:10000 dilution for Western blots) |
ATP disodium salt | Sigma-Aldrich, USA | A26209 | |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich, USA | A9418 | |
Cell-Tak | Corning | 354240 | Biological material for adhesion of the cell or tissues |
Chemi-Lumi One Super | Nacalai Tesque, Japan | 02230-14 | Chemiluminescent reagent used for western blotting. |
Collagenase Type 2 | Worthington Biochemicals, USA | LS004176 | Choose the activity guaranteed to be greater than 300 unit/mg. |
Complete Mini | Roche, Germany | 11836153001 | A mixture of several protease inhibitors. |
4'6'diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Nacalai Tesque, Japan | 11034-56 | Used for cell-impermeant nuclear stainig |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Nacalai Tesque, Japan | 08458-45 | including 4.5 g/L gluose |
Extension tube | Top, Japan | X1-50 | Connect with syringe and injection needle for antegrade perfusion. |
EPC-8 patch-clamp amplifier | HEKA, Germany | ||
Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich, USA | F7524-500ML | |
Glass capillaries | Narishige Scientific Instrument Lab., Japan | outside diameter 1.5 mm, inside diameter 0.9 mm | |
GTP lithium salt | Sigma-Aldrich, USA | G5884 | |
Horizontal microelectrode puller | Germany) | P-97 | |
Heater mat | Natsume Seisakusho, Japan | KN-475-3-40 | Equipment to warm the perfusion plate. |
Infusion pump | TERUMO, Japan | TE-311 | Infusion syringe pump for antegrade perfusion. |
Injeciton needle (27 gauge) | TERUMO, Japan | NN-2719S | Needle for insertion into the left ventricle. |
Insulin (from bovine pancrease) | Sigma-Aldrich, USA | I5500 | Dissolve in 0.1 M HCl. |
Mini cordless grinder | Funakoshi, Japan | cG-4A | Small grinder for homogenizing tissue in 1.5 mL sample tube. |
4%-Paraformaldehyde Phosphate Buffer solution (4% PFA) | Nacalai Tesque, Japan | 09154-85 | |
Penicillin G potassium | Nacalai Tesque, Japan | 26239-84 | |
Phenol Red | Nacalai Tesque, Japan | 26807-21 | |
10X Phosphate Buffered Saline (pH7.4) (10X PBS) | Nacalai Tesque, Japan | 27575-31 | |
Plastic multi-well culture plate | Falcon, USA | 353226 | Use the lid of the multi-well culture plate as the perfusion plate. |
Plastic syringe (20 mL) | TERUMO, Japan | SS-20ES | Use for infusion of CIB-EGTA. |
Plastic syringe (30 mL) | TERUMO, Japan | SS-30ES | Use for infusion of Enzyme-mix |
Plastic transfer pipette | Sarstedt, Germany | 86.1171 | Cut the tip just before sucking mouse heart into the pipette. |
Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane | Merck-Millipore, USA | IPVH00010 | Immobilin-P membrane (Transfer membrane for protein blotting) |
Protease | Sigma-Aldrich, USA | P5147 | A mixture of three or more proteases including extracellular serine protease. |
4X Sample buffer solution | Fuji Film, Japan | 198-13282 | Contains 0.25 M Tris-HCl (pH 6.8), 8 w/v% SDS,40 w/v% Glyceroland 0.02 w/v% BPB |
SDS polyacrylamide gel (15%) | Fuji Film, Japan | 193-14991 | |
Streptomycin sulfate | Nacalai Tesque, Japan | 32237-14 | |
10X Tris-Glycine buffer solution (10X TG) | Nacalai Tesque, Japan | 09422-81 | Contains 0.25 M-Tris and 1.92 M-Glycine, (pH 8.3) |
Trypsin | Sigma-Aldrich, USA | T8003 | Trypsin from bovine Type 1. |
Vascular clamp | Karl Hammacher GmbH, Germany | HSE 004-35 | Small straight vascular clamp used for clamping aorta. |
All other reagents | Nacalai Tesque, Japan |