Vi utvecklade enförenklad e-metod för att isolera högkvalitativa enskilda mushjärtaceller med antegrad perfusionstekniken. Denna metod är Langendorff-fri och användbar för att isolera ventrikulära och förmaksflimmer myocyter eller interstitiella celler, såsom hjärtfibroblaster eller stamceller.
I grundforskning med hjälp av mushjärta är isolerande livskraftiga individuella kardiomyocyter ett avgörande tekniskt steg att övervinna. Traditionellt har isolerande kardiomyocyter från kaniner, marsvin eller råttor utförts via retrograd perfusion av hjärtat med enzymer med hjälp av en Langendorff-apparat. En hög grad av skicklighet krävs dock när denna metod används med ett litet mushjärta. En antegrad perfusion metod som inte använder en Langendorff apparat rapporterades nyligen för isolering av mus kardiomyocyter. Vi häri rapportera ett komplett protokoll för förbättrad antegrad perfusion av det strukna hjärtat att isolera enskilda hjärtceller från vuxna möss (8-108 veckor gammal). Antegrad perfusion utförs genom att injicera perfusat nära toppen av den vänstra ventrikeln i det strukna hjärtat, vars aorta klämdes fast med hjälp av en infusionspump. Alla procedurer utförs på en förvärmd värmematta under ett mikroskop, vilket gör det möjligt att övervaka injektions- och perfusionsprocesserna. Resultaten tyder på att Ventrikulärt och förmaksflimmer myocyter och fibroblaster kan vara väl isolerade från en enda vuxen mus samtidigt.
I allmänhet innebär det första steget i isoleringen av dissekerad vävnad att vävnaden mals i små bitar, följt av matsmältningen av bindväven och extracellulär matris med enzymer. Kardiomyocyter kan dock inte isoleras med en sådan hackningsmetod, eftersom berikning med extracellulära matriskomponenter, inklusive kollagen och elastinfibrer, gör hjärtmuskeln för svår att hacka, och kardiomyocyterna är mycket känsliga för hypoxi och andra förändringar i mikromiljön. Således, med hjälp av Langendorff-baserade retrograd perfusionssystem1, har en metod för att smälta den extracellulära matrisen med enzymer utvecklats för att isolera enskilda kardiomyocyter från hjärtat2,3,4.
I musmodeller används Langendorff-baserad retrograd perfusion av hjärtat med enzymer också för isolering av enskilda kardiomyocyter5,6,7,8. Cannulation av den lilla och tunna musaortan och dess montering på Langendorff-apparaten för att utföra bakåtsträvande perfusion kräver dock en hög grad av skicklighet, eftersom aortans diameter i det vuxna hjärtat är cirka 1,2 mm. Dessutom tar det tid att utföra flera experiment eftersom Langendorff-apparaten bör rengöras innan nästa hjärta perfuseras.
Som ett alternativ till bakåtsträvande perfusion utvecklades en ny metod för att isolera kardiomyocyter från ett vuxenmushjärta utan en Langendorff-apparat. Denna epokgörande metod baserades på antegrad perfusion av kranskärlen9. Vi förbättrade nyligen varje steg i detta antegrade protokoll, såsom fastspänning av stora kroppskort, nål insättningspunkten och temperaturkontroll, och övervakade alla perfusion förfaranden med ett mikroskop10. Vi häri rapportera i detalj förfining av denna antegrade perfusion metod för att förkorta tiden för isolering och ge en kompletterande video. I denna metod tar perfusionen av hjärtat cirka 7 min med 10 ml enzymer, och denna korta matsmältningsperiod ökar cellernas livskraft. Detta är en enkel metod för att isolera enstaka hjärtceller med hög kvalitet utan att kräva tillsats av kemikalier, såsom 2,3-butanedione monoxime (BDM)6,11 eller taurin5,8. Vi tror att denna metod kommer att sänka teknikens färdighetströskel och förbättra nyttan av muskardiomyocyter i grundforskningen.
Eftersom hjärtat är mycket mottagligt för ischemi bör den tid det tar att ta bort hjärtat och fördjupa det i iskallt CIB-EGTA för att stoppa sammandragningen hållas kort som möjligt (<1 min). Detta är det första kritiska steget i den här metoden. Det andra kritiska steget gäller hjärtats riktning. Det strukna hjärtats särskilda orientering i steg 2.1.2 gör det lättare att se och ta bort fettet och bindväven runt aortan. Efter rengöring runt aortan, placera det klämda hjärtat med främre ytan sida upp på perfusionsplattan. Det sista kritiska steget innebär införandet av injektionsnålen. När nålen förs framåt mot hjärtat ska injektionsnålen inte lossna från perfusionsplattan för att hålla ett konstant avstånd från plattan. Insättningspositionen är nära toppen av den vänstra ventrikeln. Sätt försiktigt in nålen utan vridning, eftersom sådan vridning kan förstora hålet. Djupet av infogningen av nålen kan uppskattas genom att titta på det röda märket. Om nålen sätts in för djupt kan spetsen genomborra ventrikulär septum och komma in i den högra ventrikeln eller genom mitralventilen och gå in i vänster atrium. Efter att ha bekräftat blodets försvinnande från kranskärlen ska nålen fixeras med tejp till perfusionsplattan.
En längre aortalängd gör det svårt att klämma in aortan i rätt läge. Om klämman är för avlägsen från atria kan hjärtat rotera efter perfusatinfusion. För att förhindra detta, skär av aortan strax under den brachiocephalic artären för att förkorta aortan före fastspänning.
Om blodet inte börjar släppas ut efter perfusion vid en initial hastighet av 0,5 ml/min, öka hastigheten till 1 ml/min. Om det inte hjälper kan injektionsnålen placeras felaktigt, till exempel i höger ventrikel, ventrikulär septum eller vänster myokardvägg. I ett sådant fall, ta bort nålen omedelbart och försök att sätta in den igen nära toppen av den vänstra ventrikeln. När nålen sätts in flera gånger kan smälta celler strömma ut från de öppnade hålen. Observera att detta vanligtvis inte allvarligt påverkar cellisoleringen.
Operatörerna kan övervaka hela processen med antegrad perfusion av hjärtat med hjälp av ett stereoskopiskt mikroskop för att observera förändringarna i färg och transparens och starta om atrias slag tillsammans med matsmältningen. Totalt 10 ml enzymblandning bör vara det maximala som krävs, även för ett gammalt hjärta. I yngre hjärtan (5-7 veckor gamla) minskar vi volymen till 9 ml, vilket liknar tillvägagångssättet via retrograd perfusion med samma enzymblandning.
Supernatanten vid den slutliga centrifugationen innehåller skräp, blodkroppar och icke-myocyter medan pelleten huvudsakligen innehåller kardiomyocyter och förorenar icke-myocyter, såsom fibroblaster och endotelceller. För att rena kardiomyocyterna behövs fler steg. I allmänhet bör pelleten återanvändas i lämpligt cellkulturmedium och förberedas i 2 timmar vid 37 °C på en vävnadscellkulturrätt och sedan försiktigt avlägsna kardiomyocyterna genom pipettering och förberedelse för kultur.
Enzymblandningen innehåller en låg koncentration på Ca2+ (0,3 mM). Vi inkuberar därför smälta celler i CIB-Ca2+-BSA (1,2 mM Ca2 +) innan den slutliga återsuspensionen med cellen återsuspension lösning (1,8 mM Ca2 +), och den gradvisa ökningen av Ca2 + undviker att orsaka cellskador7. Så länge de isolerade kardiomyocyterna är intakta (quiescenta celler utan sammandragning) påverkar detta Ca2 +-anpassningsförfarande inte cellens livskraft hos möss. Eftersom de skadade cellerna dör under denna inkubation får vi följaktligen en hälsosam cellgrupp. På samma sätt kan isolerade intakta förmaksflimmer myocyter (quiescent celler utan oregelbunden sammandragning) lagras i samma cell resuspension lösning. Förmaksflimmer myocyter tenderar dock att vara mer känsliga att lagras jämför med ventrikulära myocyter.
I laboratoriet är denna isoleringsmetod nästan alltid framgångsrik om inte nålinsättningen i vänster ventrikel misslyckas. Vi har också lyckats isolera celler från det hypertrofierade hjärtat som framställs av kirurgiska tvärgående aorta förträngning. Men hos åldrade möss, som ofta har små hjärtinfarkter, upphör perfusion på vissa ställen, vilket resulterar i ofullständig matsmältning och därmed ett lågt utbyte (Figur 1C), liknande den Langendorff-baserade bakåtsträvande metoden. I sådana fall kan hjärtats förvrängda form observeras även i början av perfusionen.
Denna antegrad perfusionsmetod är användbar för att isolera hjärtceller från möss i olika åldrar men inte större djur, såsom kaniner och marsvin. Det kan vara möjligt att tillämpa denna metod på neonatala eller juvenila råttor före avrutning.
En av fördelarna med denna antegrade perfusionsmetod är att den minskar de tekniska hindren i samband med att använda Den Langendorff-baserade retrograda perfusionsmetoden för små mushjärtan. Den tid som krävs för perfusion är cirka 7 min med 10 ml enzymer, denna korta matsmältningsperiod ökar cellernas livskraft. Dessutom gör det det möjligt att utföra perfusion genom hjärtats kranskärlscirkulation, även efter att aortaventilerna har smälts. Isolering av förmaksflimmer myocyter kräver vanligtvis Langendorff-baserade retrograd perfusion och ytterligare inkubation med enzymer17. Denna antegrade perfusion strategi, dock, kan djupt granska vävnaden med enzymet att isolera förmaksflimmer myocyter.
I experiment med flera möss bör Langendorff-apparaten rengöras innan nästa hjärta perfuseras. I den nuvarande antegrademetoden bereds dock perfusion kontinuerligt så länge som önskat antal instrumentuppsättningar (t.ex. sprutor och perfusionsplattor) framställs i förväg.
Vi häri rapportera den grundläggande metoden för antegrad perfusion av mushjärtat med samma lösningar som Langendorff-baserade retrograd perfusion metod utan ytterligare kemikalier. Sammansättningen av perfusatet kan ändras för att passa syftet med experimentet, till exempel att använda ett tvättmedel som innehåller EGTA istället för enzymerna för att göra ett decellulärt hjärta18.
The authors have nothing to disclose.
Författarna tackar T. Yamamoto och Y. Mori för deras hjälp i de morfologiska experimenten. Detta arbete stöddes av ett anslag för vetenskaplig forskning (C) från Japan Society for the Promotion of Science (18K06871 till M.O.K. och 17K08536 till H.M.).
Amphotericin B | Wako Pure Chemical Industries, Japan | ||
Alexa Fluor 488 anti-mouse IgG antibody | Molecular Probes, USA | A11001 | Fluorescent-labeled secondary antibody. (1:400 dilution for immunostaining) |
Anti-α-actinin (ACTN) | Sigma-Aldrich, USA | A7811 | Mouse monoclonal antibody (clone EA-53). (1:400 dilution for immunostaining) |
Anti-atrial natriuretic peptide (ANP) | Merck-Millipore, USA | AB5490-I | Rabbit polyclonal antibody (1:2000 dilution for Western blots) |
Anti-Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) | Cell Signaling Technology, USA | 2118 | Mouse monoclonal antibody (1:10000 dilution for Western blots) |
Anti-smooth muscle actin (SMA) | Dako, Denmark | M0851 | Mouse monoclonal antibody (clone 1A4) (1:400 for immunostaining) |
Anti-rabbit IgG antibody | Amersham, GE Healthcare, USA | NA934 | Secondary antibody (1:10000 dilution for Western blots) |
ATP disodium salt | Sigma-Aldrich, USA | A26209 | |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich, USA | A9418 | |
Cell-Tak | Corning | 354240 | Biological material for adhesion of the cell or tissues |
Chemi-Lumi One Super | Nacalai Tesque, Japan | 02230-14 | Chemiluminescent reagent used for western blotting. |
Collagenase Type 2 | Worthington Biochemicals, USA | LS004176 | Choose the activity guaranteed to be greater than 300 unit/mg. |
Complete Mini | Roche, Germany | 11836153001 | A mixture of several protease inhibitors. |
4'6'diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Nacalai Tesque, Japan | 11034-56 | Used for cell-impermeant nuclear stainig |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Nacalai Tesque, Japan | 08458-45 | including 4.5 g/L gluose |
Extension tube | Top, Japan | X1-50 | Connect with syringe and injection needle for antegrade perfusion. |
EPC-8 patch-clamp amplifier | HEKA, Germany | ||
Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich, USA | F7524-500ML | |
Glass capillaries | Narishige Scientific Instrument Lab., Japan | outside diameter 1.5 mm, inside diameter 0.9 mm | |
GTP lithium salt | Sigma-Aldrich, USA | G5884 | |
Horizontal microelectrode puller | Germany) | P-97 | |
Heater mat | Natsume Seisakusho, Japan | KN-475-3-40 | Equipment to warm the perfusion plate. |
Infusion pump | TERUMO, Japan | TE-311 | Infusion syringe pump for antegrade perfusion. |
Injeciton needle (27 gauge) | TERUMO, Japan | NN-2719S | Needle for insertion into the left ventricle. |
Insulin (from bovine pancrease) | Sigma-Aldrich, USA | I5500 | Dissolve in 0.1 M HCl. |
Mini cordless grinder | Funakoshi, Japan | cG-4A | Small grinder for homogenizing tissue in 1.5 mL sample tube. |
4%-Paraformaldehyde Phosphate Buffer solution (4% PFA) | Nacalai Tesque, Japan | 09154-85 | |
Penicillin G potassium | Nacalai Tesque, Japan | 26239-84 | |
Phenol Red | Nacalai Tesque, Japan | 26807-21 | |
10X Phosphate Buffered Saline (pH7.4) (10X PBS) | Nacalai Tesque, Japan | 27575-31 | |
Plastic multi-well culture plate | Falcon, USA | 353226 | Use the lid of the multi-well culture plate as the perfusion plate. |
Plastic syringe (20 mL) | TERUMO, Japan | SS-20ES | Use for infusion of CIB-EGTA. |
Plastic syringe (30 mL) | TERUMO, Japan | SS-30ES | Use for infusion of Enzyme-mix |
Plastic transfer pipette | Sarstedt, Germany | 86.1171 | Cut the tip just before sucking mouse heart into the pipette. |
Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane | Merck-Millipore, USA | IPVH00010 | Immobilin-P membrane (Transfer membrane for protein blotting) |
Protease | Sigma-Aldrich, USA | P5147 | A mixture of three or more proteases including extracellular serine protease. |
4X Sample buffer solution | Fuji Film, Japan | 198-13282 | Contains 0.25 M Tris-HCl (pH 6.8), 8 w/v% SDS,40 w/v% Glyceroland 0.02 w/v% BPB |
SDS polyacrylamide gel (15%) | Fuji Film, Japan | 193-14991 | |
Streptomycin sulfate | Nacalai Tesque, Japan | 32237-14 | |
10X Tris-Glycine buffer solution (10X TG) | Nacalai Tesque, Japan | 09422-81 | Contains 0.25 M-Tris and 1.92 M-Glycine, (pH 8.3) |
Trypsin | Sigma-Aldrich, USA | T8003 | Trypsin from bovine Type 1. |
Vascular clamp | Karl Hammacher GmbH, Germany | HSE 004-35 | Small straight vascular clamp used for clamping aorta. |
All other reagents | Nacalai Tesque, Japan |