Summary
Stimulerad Raman-spridning (SRS) mikroskopi möjliggör selektiv, etikettfri avbildning av specifika kemiska moieties och det har använts effektivt för att avbilda lipidmolekyler in vivo. Här ger vi en kort introduktion till principen om SRS mikroskopi och beskriver metoder för dess användning i imaging lipid lagring i Caenorhabditis elegans.
Abstract
Lipidmetabolism är en grundläggande fysiologisk process som är nödvändig för cellulär och organismhälsa. Dysregulation av lipidmetabolism framkallar ofta fetma och många associerade sjukdomar inklusive hjärt-kärlsjukdomar, typ II-diabetes och cancer. För att främja den nuvarande förståelsen av lipidmetabolisk reglering har kvantitativa metoder för att exakt mäta in vivo lipidlagringsnivåer i tid och rum blivit allt viktigare och användbarare. Traditionella metoder för att analysera lipid lagring är semi-kvantitativa för mikroskopisk bedömning eller saknar spatio-temporal information för biokemisk mätning. Stimulerad Raman-sprutmikroskopi (SRS) är en etikettfri kemisk bildteknik som möjliggör snabb och kvantitativ detektion av lipider i levande celler med subcellulär upplösning. Eftersom kontrasten utnyttjas från inneboende molekylära vibrationer tillåter SRS-mikroskopi också fyrdimensionell spårning av lipider hos levande djur. Under det senaste decenniet har SRS-mikroskopi använts i stor utsträckning för små molekylers avbildning i biomedicinsk forskning och övervinner de stora begränsningarna i konventionella fluorescerande färgning och lipidextraktionsmetoder. I laboratoriet har vi kombinerat SRS-mikroskopi med de genetiska och biokemiska verktyg som finns tillgängliga för den kraftfulla modellorganismen Caenorhabditis elegans för att undersöka fördelningen och heterogeniteten hos lipiddroppar över olika celler och vävnader och i slutändan upptäcka nya bevarade signalvägar som modulerar lipidmetabolism. Här presenterar vi arbetsprinciperna och den detaljerade inställningen av SRS-mikroskopet och tillhandahåller metoder för dess användning för att kvantifiera lipidlagring vid distinkta utvecklingsidpunkter för vilda och insulinsignalerande bristfällig mutant C. elegans.
Introduction
Fetma har blivit ett globalt hälsoproblem som hotar en tredjedel av befolkningen runt om i världen, och det utgör ett allvarligt medicinskt problem, med tanke på dess koppling till dålig psykiskhälsa 1 och dödliga sjukdomar inklusive diabetes2, hjärt-kärlsjukdomar3 och vissa typer av cancer4. Studie av lipidmetabolism är avgörande för att bättre förstå de biologiska problemen bakom fetma. Snabb och specifik kvantifiering av lipidlagring innebär påvisande av fettsyror och deras derivat samt sterolhaltiga metaboliter, med hög känslighet och helst med rumslig information. Lipider utmanar mål att avbilda eftersom de saknar inneboende fluorescens och inte lätt kan fluorescerande taggas. De fluorescerande taggarna är ofta större än lipidmolekylerna och kan därför vara kemiskt invasiva och opraktiska för in vivo-applikationer. Etikettfri eller minimal märkningsstrategi är nödvändig för att bevara lipidmolekylens hydrofobiska struktur5. Den senaste utvecklingen inom bildteknik har skapat spännande möjligheter till etikettfri avbildning av lipider i levande celler, vävnader och organismer.
Traditionella metoder för lipidlagringsanalyser i biologiska prover inkluderar biokemiska analyser och färgningsprotokoll med lipofila färgämnen. Biokemiska kvantifieringsanalyser som involverar masspektrometri (MS) är oöverträffade i sin molekylära upplösning, men de kräver mycket stora provmängder och provberedning tar vanligtvis flera timmar, vilket begränsar deras tillämpning för realtidsavbildning av levande system5. En annan viktig begränsning av dessa analyser är bristen på rumslig information. Å andra sidan ger lipofila färgämnen som Oil Red O och Sudan Black vävnad och cellulär distribution av lipidlagringsorganeller och jämfört med MS-tekniker är dessa färgningsmetoder också låga i kostnad och lätta att utföra. Dessa färgningsprotokoll kräver dock fixering, vilket kan påverka lipiddroppornas hydrofobiska natur, generera konstgjorda förändringar i deras struktur och resultera i inkonsekvenser mellan experiment6. De tekniska svårigheterna i samband med biokemiska och färgning tekniker har lett till sökandet efter etikettfria metoder för att avbilda lipid molekyler och till den snabba ökningen av användningen av sammanhängande Raman spridning (CRS) mikroskopi i lipid imaging.
Raman-effekten erkändes först av Raman och Krishnan, där de rapporterade att när de interagerar med en foton kan en molekyl generera spridda ljus utan förändring i våglängd (kallad Rayleigh-spridning) eller sällan med en förändrad våglängd (kallad Raman-spridning) och denna förändring i våglängd är karakteristisk för de funktionella kemiska grupperna inommolekylen 7. När kemikaliebindningarna i en molekyl blir upphetsade till en högre vibrationsenerginivå av en incidentfoton, kallad pumpfoton, blir energin hos den spridda fotonen, kallad Stokes foton, lägre. Annars kan de kemiska bindningarna nå en lägre vibrationsenerginivå om de ursprungligen är på en högre nivå, och den spridda fotonen får energi för att vara anti-Stokes foton. Frekvensskillnaden mellan incidenten och spridda fotoner kallas Raman-skiftet. Varje kemisk bindning i en molekyl har ett karakteristiskt och kvantifierbart Raman-skifte. Till exempel har CH2-bindningen en Raman-förskjutning på 2 845 cm-1, vilket är rikligt i fettsyrakedjor8. Denna spontana Raman signal är i allmänhet mycket svag, vilket har kraftigt begränsat bildhastigheten i konventionella spontana Raman mikroskopi. Under årens lopp har olika tillvägagångssätt utvecklats för att öka bildhastigheten och känsligheten hos spontan Raman-mikroskopi. Sammanhängande Raman spridning mikroskopi, inklusive sammanhängande Anti-Stokes Raman Scattering (CARS) mikroskopi och stimulerad Raman Scattering (SRS) mikroskopi, är de senaste framstegen. CARS och SRS har lite olika arbetsprinciper, men båda är etikettfria tekniker som har levande bildkapacitet, kan ge rumslig och tidsmässig information om lipidlagringsdynamik och kräver endast liten provstorlek. CARS mikroskopi lider av icke-resonansbakgrund, som kommer från olika icke-linjära processer, och CARS-signaler har också icke-linjärt förhållande till molekylkoncentrationen, vilket tillsammans komplicerar kvantifieringsprocessen9. Till skillnad från CARS mikroskopi genererar SRS-mikroskopi inte icke-resonansfulla bakgrundssignaler och erbjuder linjärt beroende av koncentrationen av intressemolekylen. Således används för närvarande SRS mikroskopi mer allmänt för lipid imaging.
I SRS-mikroskopi kan de svaga spontana Raman-signalerna förstärkas när de upphetsades av två synkroniserade laserstrålar med deras frekvensskillnad som matchar den kemiska bindningsvibrationsfrekvensen. Molekylen kommer att uppleva en förbättrad övergång till ett upphetsad tillstånd på grund av sammanhängande excitation. Som ett resultat ökar andelen Stokes fotongeneration. Följaktligen ökar intensiteten hos den överförda "Stokes" -strålen (stimulerad Raman-förstärkning, SRG) och intensiteten hos den överförda "pump" -strålen minskar (stimulerad Raman-förlust, SRL). Detektion av SRG- eller SRL-signaler ligger till grund för SRS-mikroskopiavbildning (Stimulated Raman Scattering) med specifika kemiskabindningar 10. Om frekvensskillnaden mellan de två laserstrålarna inte matchar den kemiska bindningens vibrationsfrekvens inom en molekyl av intresse, kommer varken SRG- eller SRL-signaler att genereras. Bildhastigheten för SRS-mikroskopi är cirka 2 μsec per pixel eller 1 sekund per bildruta, vilket är mycket snabbare än spontan Raman-mikroskopi11. Typisk lateral upplösning för SRS mikroskopi är diffraktion begränsad och cirka 300 nm. Dessutom möjliggör de två-foton optiska processerna av SRS mikroskopi volymetrisk 3D-avbildning av relativa tjocka vävnadsprover och bilddjupet kan nå 300-500 μm. Sammantaget presenterar SRS-mikroskopi en effektiv, etikettfri bildteknik för att upptäcka specifika biomolekyler, särskilt lipider.
Lipiddroppar är enmembranorganeller, som är den huvudsakliga cellulära lagringsplatsen för neutrala lipider, inklusive triacylglyceroler (TAGs) och kolesterolestrar (CEs). CH2 bindningar i fettsyrakedjorna i dessa lipidmolekyler genererar starka SRS-signaler vid 2 845 cm-1 när de ärupphetsade 8, vilket möjliggör detektion och kvantifiering av lagringsfettnivåer i intakta celler, vävnadssektioner och till och med hela organismer12,13,14,15. I synnerhet C. elegans är användbara för lipid imaging studier på grund av deras öppenhet. Liksom däggdjur lagrar C. elegans också lipider i lipiddroppar och syntes- och nedbrytningsvägarna för lipidmolekyler är mycket bevarade16. I detta protokoll kommer vi att tillhandahålla arbetsprincipen för SRS mikroskopi, dess grundläggande inställning och beskriva metoderna för dess användning i lipid imaging i C. elegans.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Instrumentell inställning för stimulerad Raman Scattering Microscopy
OBS: SRS-mikroskopisystemet är byggt på en picosecondlaser med pumpintegrerad optisk parametrisk oscillator och ett konfokalt laserskanningsmikroskop. Oscillatorn tillhandahåller två picosecond pulståg, inklusive en Stokes-balk på 1 064 nm och en pumpstråle som kan finjusteras mellan 700-990 nm. Temporal och rumslig överlappning av de två strålarna uppnås inuti lasern. En inbyggd elektrooptisk modulator (EOM) är speciellt utformad för SRS-mikroskopi. Detta protokoll kommer att fokusera på att koppla lasern med mikroskopet och den dagliga driften av detta system (figur 1). Konfigurationen av ett SRS-mikroskopsystem utvecklas under det senaste decenniet. Det bör noteras att följande beskrivning endast representerar en av de flera konfigurationerna.
- Mata laserstrålar i mikroskopet
- Ställ in periskopet för att lyfta strålen från picosecond ljuskällans utgång till IR-laserinmatningsporten på mikroskopets skanner.
VARNING: Läs lasersystemhandboken före användning och vidta alla nödvändiga försiktighetsåtgärder eftersom nära infraröd strålning som genereras av detta klass IV-lasersystem kan orsaka allvarlig skada på ögon och hud. Slutför de utbildningar som krävs av de institutionella miljösäkerhetsavdelningarna. Använd skyddsglasögon och labbrock med ärmar med manschett. - Ställ först in pumpstrålen på 750 nm och sänk ner lasereffekten till 50 mW, vilket kan inspekteras visuellt, vilket affilierar justeringen. Använd sedan en strål expander(bild 1,L1 och L2) för att justera stråldiametern så att den passar den bakre bländaren av mikroskopmål. Använd två reläspeglar(figur 1,M1 och M2) för att styra laserstrålen till periskopet(figur 1,P1 och P2). Periskopet lyfter strålen till skanneröppningens höjd och fungerar även som styrspegel för justering.
- Ställ in rattarna på periskopet i mitten av inställningsområdet och välj den ursprungliga positionen och vinkeln för varje spegel så att laserstrålen träffar spegelns mitt, ungefär.
- Utför grovjusteringen med en tom port på objektivt torn och placera kraftmätarsonden för att mäta kraften hos det överförda ljuset. Ställ in mikroskopets skanner på högsta zoom (50x) och mät sedan kraften hos det överförda ljuset med den fokuserade laserstrålepunkten. Optimera rattarna på varje spegel, M1 och M2, iterativt för att uppnå högsta överförda lasereffekt.
- Utför den fina justeringen med justeringsverktyget. Sätt fluorescensmålets justeringslock på det tomma objektivsätet och justera M1:s rattar för att centrera platsen. Introducera sedan förlängningsröret för målet och justera M2:s rattar för att centrera platsen.
- Upprepa steg 1.1.4 och 1.1.5 tills strålen centrerar målet i båda positionerna.
- Ställ in periskopet för att lyfta strålen från picosecond ljuskällans utgång till IR-laserinmatningsporten på mikroskopets skanner.
- Ansluta detektering och elektronik
- Konfigurera SRS-detekteringsmodulen. Placera en strålklytare efter kondensorn för att rikta den överförda lasern till fotodiodmodulen. Modulen innehåller ett teleskop för att vidarebefordra och ändra strålstorleken så att den passar fotodiodens aktiva område, samt ett optiskt filter för att ta bort den modulerade Stokes-strålen och låta pumpstrålen gå igenom för demodulering.
- Ställ in elektronikanslutningen (bild 1). Intensiteten hos Stokes-strålen moduleras av en inbyggd EOM vid 20 MHz inuti picosecond tunable lasern. Moduleringsfrekvensutgången från lasern matas in i inlåsningsförstärkaren som referensfrekvens för demodulering. Mata in fotodiodens utgångssignal i låsförstärkaren för att avmodulera SRL.
OBS: Enboxlasersystemen kan uppgraderas och därför kan deras specifikationer variera beroende på olika produktionsdatum. Den tidigare versionen av picosecond tunable lasersystem, som används i detta protokoll, har en Stokes-stråle på 1 064 nm, men den senaste versionen har en Stokes-stråle på 1 031 nm. Moduleringsfrekvensen för EOM som används i detta protokoll är anpassad till 8 MHz, men standardmoduleringsfrekvensen för det senaste systemet kan vara 10 eller 20 MHz. - Slutligen matar du inlåsningsförstärkarens utgång i mikroskopets analoga låda för att konvertera elektrisk analog signal till digital signal. Systemet ska vara redo att bearbeta SRS-signalen.
- Optimera bildförhållanden
- Gör ett kemiskt prov för systeminriktning. Använd till exempel dodecane för att optimera mikroskopet, eftersom dodecane har en mycket stark SRS-signal från C-H-bindningarna. Använd en säker tätning för att göra en minikammare; sätt 5 μL dodekan och täck den med ett täckglas.
OBS: Byt ut dodecane-provet när det ser oklart ut eller presenterar skräp, med ett nytt prov som kan användas för justering i 2-3 månader. - Placera provet på mikroskopstadiet. Fokusera ordentligt på vätskedroppar. Det kan göras snabbare genom att leta efter kanten på dodecane pad. Justera kondensorn för Kohler-belysning.
- Ställ in avbildningsparametrarna. Kontrollera om fördröjningssteget är på rätt nummer. Ställ in pumpstrålens våglängd på 795,8 nm. Använd ett IR-sensorkort och IR-visningskontroll och kontrollera om pumpstrålens bana fortfarande är korrekt.
- Ställ pumpstrålens effekt på 200 mW och Stokes-balken till 400 mW på picosecond-systemets kontrollpanel.
OBS: Lasergenomströmningarna från laserutgång till postmål för de två balkarna är cirka 25% för pump och 14% för Stokes för denna systeminställning. Därför är en post objektiv effekt av pumpstrålen ca 50 mW och för Stokes balk är den cirka 56 mW. Pulsbredden för det senaste picosecondlasersystemet har ändrats från 6 ps till 2 ps, därför bör den applicerade lasereffekten vara ännu lägre. - Ställ in förstärkningen för inlåsningsförstärkaren till maximal. Öppna slutaren för både balkarna och laserns huvudlucka.
- Skanna exemplet och kontrollera bilden på datorskärmen. Ändra visningsläget till Hi-Lo i bildframställningsprogrammet. Justera intervallet för att se en ~50% mättnad. Kontrollera om mättnaden är centrerad i bilden. Om inte, justera försiktigt styrspeglarna, M1 och M2, för att maximera bildintensiteten och för att centrera toppintensiteten.
- Finjustera fördröjningssteget och hitta den maximala SRS-signalintensiteten från dodecane-provet. Systemet är sedan klart för användning.
- Gör ett kemiskt prov för systeminriktning. Använd till exempel dodecane för att optimera mikroskopet, eftersom dodecane har en mycket stark SRS-signal från C-H-bindningarna. Använd en säker tätning för att göra en minikammare; sätt 5 μL dodekan och täck den med ett täckglas.
2. Beredning av C. elegans-prover för SRS mikroskopiavbildning
OBS: Som modellorganismer har Caenorhabditis elegans visat sig vara mycket användbart för flera bildtekniker. De är helkroppstransparenta, därför kan olika vävnader avbildas i det intakta djuret utan behov av dissekering. I C. elegans lagras neutrala lipider i lipiddroppar i tarmen, som består av 20 epitelceller som ligger bisymmetriskt runt tarmlumen16. Hypodermala celler och äggceller lagrar också lipider. Huvudformen av lagringslipider i C. elegans lipiddroppar är triacylglycerolerna (TAGs)17, som genererar starka SRS-signaler på grund av det överflöd av CH2-bindningar som finns i deras fettsyrakedjor. Detta avsnitt kommer att fokusera på hur man förbereder C. elegans prover för SRS mikroskopi imaging och kvantifiering av deras totala intestinala lipid lagringsnivåer.
- Förberedelse av bildbilderna
- Förbered först 2% agaroslösning i destillerad H2O och se till att all agarosa smälter innan du förbereder agaroskuddarna.
- Tillsätt en droppe varm 2% agarose på en tom bild (cirka 100 μL) som placeras mellan stödbilder med två lager laboratorieband och placera snabbt en andra bild ovanpå den första bilden. Tryck försiktigt för att skapa en tunn, jämn agarose pad.
- Ställ dessa bilder åt sidan i stängt läge och separera dem inte förrän maskarna är redo att monteras. Förbered nya bilder före varje bildsession, eftersom kuddarna torkar efter 1 dag.
OBS: Använd multi-well imaging kammare, om avbildning flera maskar i hög genomströmning genetiska skärmar18. Använd live imaging inställningar för att avbilda spatio-temporal dynamik av lipid metabolism genom utveckling och åldrande19.
- Montera maskarna
- Förbered bedövningsmedlet genom att tillsätta natriumazid eller levamisole i M9-bufferten till den slutliga koncentrationen på 100 mM respektive 1 mM.
OBS: Använd levamisole om maskarna behöver återvinnas efter avbildning för genotypning efter genetiska skärmar.
VARNING: Flera bedövningsmedel, inklusive natriumazid och levamisole, är skadliga vid inandning. Använd skyddshandskar och kläder, samt använd en kemisk rökhuva när du förbereder dessa arbetslösningar. - Placera en droppe bedövningsmedel på ett täckskydd (ca 4–5 μL för 10–20 maskar).
OBS: Justera mängden bedövningsmedel enligt masknumret för att hålla maskarna så nära varandra som möjligt. Att använda för mycket vätska för få maskar kan orsaka att maskarna sprids på agarose pad. - Välj maskarna som ska avbildas under dissekeringsmikroskopin och överför dem till anestesimedlet droplet. När alla maskar har lagts till i droppen flyttar du dem med hjälp av maskväljaren och ser till att de inte överlappar varandra.
- Separera glasrutschbanorna (från steg 2.1) utan att stör agarosdynan.
- Täck maskdropparet med glasrutschbanan som har agarosplattan. Se till att agarose pad är vänd mot maskarna. Alternativt kan den bedövningsgivande åldrande droppen också läggas på agarosplattan och maskar kan täckas med täcket.
- Markera slutligen maskarnas placering med hjälp av en permanent markör på glasrutschbanan.
- Förbered bedövningsmedlet genom att tillsätta natriumazid eller levamisole i M9-bufferten till den slutliga koncentrationen på 100 mM respektive 1 mM.
3. Bildförvärv och analys
- Hämtar bilderna med hjälp av SRS-mikroskopsystemet.
- Innan du avbildar något prov, bestäm bildparametrarna och verifiera SRS-signaler (som förklaras i protokoll 1).
- Montera bilden med täckglaset mot objektivet. Slå på ljuskällan och rikta den mot okularet för att hitta maskarna.
OBS: Använd en 20x objektiv för att avbilda lipidförvaringen i hela tarmen. Överväg att använda en 60x objektiv för att avbilda hypodermal fett lagring eller för att kvantifiera lipid droppe storlek /nummer. - Sätt maskarna i fokus och justera kondensorns läge i enlighet därmed.
- Stäng av ljuskällan för det ljusa fältet och växla till laserskanningsenheten. Börja skanna den första masken med en snabb skanningshastighet (t.ex. 512 x 512 pixlar) och justera det fina fokuset för att hitta intresseområdet. För att det första provet ska avbildas justerar du laserkrafterna till den nivå där SRS-signaler inte är mättade.
- Växla till en långsammare skanningshastighet (t.ex. 2 μs/pixel) och högre upplösning (t.ex. 1024 x 1 024 pixlar) för att få SRS-bilden.
OBS: Håll laserkrafterna konstanta för att varje prov ska avbildas under bildsessionen. - Spara SRS-bilden i önskat format som möjliggör hög upplösning (till exempel en .tiff fil). Beroende på vilken bildframställningsprogramvara och installation som används sparar du platsen för den första masken innan du flyttar till nästa.
- Fullständig avbildning av alla maskar som monterades på bilden. Stäng av slutaren för att blockera laserstrålarna. Stäng inte av laserkällan förrän alla prover har avbildas.
- Ta bort bilden innan du placerar nästa exempelbild. Upprepa steg 3.1.2–3.1.7.
- När alla prover har avbildats, sätt laserkällan i vänteläge och stäng av tillhörande utrustning inklusive förstärkaren, detektorn, mikroskopet och datorn.
- Analys av bilder med ImageJ
- Öppna bildfilerna (vanligtvis .tiff) som ska kvantifieras i ImageJ genom att markera filerna och dra och släppa dem till ImageJ-fönstret. Hämta lämpliga ImageJ-plugin-program om du använder specifika Olympus-mikroskopformat (till exempel Oib-filer).
- Välj de egenskaper som ska analyseras( Analysera > set-mått). För total lipidlagringskvalifiering väljer du Område, Min och Max grått värde och Medelgrå värde.
- Använd polygonmarkeringsverktyget och skissera området i masktarmen som ska kvantifieras. Om du vill mäta de parametrar som valts i steg 3.2.2 klickar du på Analysera > mått. Ett nytt fönster med mätresultaten dyker upp. Upprepa det här steget för alla öppna bilder.
- Markera måtten för alla maskar i en viss genotyp och kopiera/klistra in resultaten i ett nytt kalkylblad. Upprepa stegen 3.2.1–3.2.4 för alla genotyper i samma bildsession.
- Välj ett område i närheten av masken som inte har någon SRS-signal för att kvantifiera som bakgrund. Se till att det område som valts för bakgrundsmätning inte innehåller några bakterier eller skräp som också kan ge en SRS-signal.
- Subtrahera bakgrundens medelvärde grå värde från mätningarna av varje enskild mask. Beräkna medelvärdet och standardavvikelsen för de subtraherade medelgrå värdena för bakgrunden från alla maskar i en viss genotyp/testgrupp. Normalisera det här värdet till medelvärdet för kontrollgruppen.
- Slutligen utför du lämplig statistisk analys med medelvärdet grå värde som mått för lipidnivåer i varje mask. Använd vanligtvis Deltagarens t-test för två grupper och använd enkelvägs-ANOVA med ett lämpligt multipla jämförelsetest för fler än två grupper.
Obs: När du väljer bilder för figurpresentation, se till att de valda bilderna har samma pixelintensitetsfördelning. Ställ in ljusstyrkan och kontrasten till samma värden för alla bilder i samma bild (Bild > Justera > ljusstyrka och kontrast).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Insulinsignalering är en viktig endokrin väg som påverkar utveckling, reproduktion, livslängd och ämnesomsättning. I maskar består insulinsignalering av cirka 40 insulinliknande peptidligands, insulinliknande tillväxtfaktorreceptor ortolog DAF-2, nedströms PI3K/ AKT kinas kaskad och FoxO transkription faktor ortolog, DAF-1620. daf-2 mutanter, som saknar insulinreceptorn, har fler lipiddroppar i tarmen, maskfettlagringsvävnaden21,22. Med hjälp av SRS mikroskopi kvantifierade vi tarm lipidnivåerna i ålderssynkronerade vilda maskar och daf-2 mutanter under vuxen ålder. I överensstämmelse med de tidigare resultaten fann vi att daf-2 mutanter har högre lipidnivåer23,24 (Figur 2A). Vi observerade en minskning av lipidnivåerna hos maskar av vildtyp från dag 1 till dag 9 i vuxen ålder (figur 2A). Lipidnivåerna i daf-2 mutanter ökade dock tills de var 5 dagar gamla och sedan var de konstanta runt nivån 2,5-3,0 gånger högre än den vilda typen (Figur 2A).
DAF-16, C. elegans FoxO transkription faktor ortholog, orkestrerar de flesta av nedströms funktioner i insulin signaleringsvägen. daf-16 null mutationer undertrycka flera fenotyper observeras i daf-2 mutanter, inklusive fett ackumulering. daf-16 genomisk locus kodar för 8 olika transkriptioner (daf-16a-h), som genereras av antingen alternativ transkription startplats, eller alternativskarvning 20. Bland dessa är daf-16a, daf-16b och daf-16d/f/h de vanligaste transkriptionerna och de kodar för proteiner med olika N termini. Studier med isoform-specifika mutationer och transgener föreslog att DAF-16A och DAF-16D/F/H isoforms reglerar dauer utveckling och livslängd24,25, medan DAF-16B är viktigt för faryngala ombyggnad under dauer bildandet26. I denna studie, med hjälp av SRS mikroskopi, undersökte vi isoform specificiteten för DAF-16 i reglering av intestinala lipid lagring. Vi fann att daf-16 inaktivering undertrycker ökningen av lipidnivåer av daf-2 mutanter(figur 2B, C). Uttrycker daf-16a eller daf-16b isoform i daf-2; daf-16 dubbla mutanter återställer inte lipidnivåerna. Uttrycket av daf-16d/f/h isoform är dock tillräckligt för att återställa lipidnivåerna i daf-2; daf-16 till de nivåer som observerats i daf-2 single mutants(figur 2B,C). Dessa resultat visade att specifikt DAF-16D/F/H isoforms modulerar lipid metabolism i daf-2 mutant maskar. Detta överensstämmer också med resultaten från en nyligen genomförd studie som visade att luktreglering av lipidlagring också förmedlas genom transkriptionsverksamheten i DAF-16D/F/H27.
Bild 1: Illustration av SRS-mikroskopsystemet. Allt-i-ett-lasern ger temporalt och rumsligt kombinerad pump och Stokes balkar, inbyggd elektrooptisk modulator (EOM) och referensfrekvens för inlåsningsförstärkare. Den kombinerade strålen utökas av teleskopet (L1 och L2), vidarebefordras av två reläspeglar (M1 och M2) och lyfts av periskopet (P1 och P2) och skickas sedan in i mikroskopets skanner. Den kombinerade strålen skannas av skanningsenheten (SU) i mikroskopet och fokuseras på provet. Överfört ljus samlas in av kondensorn. Ett filter tar bort Stokes-balken och lämnar pumpstrålen för att detekteras av fotodioden (PD). De grå streckade pilarna visar kopplingen mellan elektroniken. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2: Minskad insulinsignalering i C. elegans leder till ökad lipidlagring. (A) Med hjälp av SRS-mikroskopi kvantifieras tarmfettnivåer av vilda och daf-2 mutanter i vuxen ålder dag 1, 3, 5, 7 och 9. I vilda maskar minskar lipidnivåerna med tiden, medan daf-2-mutanter ackumulerar lipider fram till dag 5 och de har cirka 2,7 gånger fler lipider jämfört med vilda maskar. (B) daf-16 borttagning undertrycker de ökade lipidnivåerna i daf-2 mutanter. Återställande uttryck för daf-16d/f/h isoform i daf-2; daf-16 dubbelmutanter är tillräckliga för att öka lipidnivåerna till daf-2 mutanter nivåer, medan återställa uttryck av daf-16a eller daf-16b isoforms är inte. *** p < 0.001, n.s. inte signifikant genom enkelvägs ANOVA med Bonferronis flera jämförelser test. C)Representativa SRS-bilder. Gula pixlar indikerar högre lipidnivåer. Kvantifierat tarmområde visas i streckade linjer. Skalstången är 40 μm. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Kompletterande fil. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
För att skydda mot fetma och dess associerade metabola störningar har viktiga forskningsinsatser genomförts för att bättre förstå de regulatoriska mekanismerna för lipidhomeostas. För kvantitativ detektion av lipidmolekyler i biologiska prover har etikettfri avbildning genom SRS-mikroskopi visat sig vara ett tillförlitligt alternativ till biokemiska analyser och andra färgningsmetoder. Vår grupp och andra har avslöjat nya biologiska mekanismer i lipid metabolisk reglering genom att kombinera användningen av C. elegans och SRS mikroskopi12,18,28,29,30,31. I detta protokoll, med hjälp av SRS mikroskopi visade vi att nedreglering av insulin signalering i maskar leder till en ökning av totala intestinala lipidnivåer. Vi observerade att start dag 1 av vuxen ålder, lipider ackumuleras i tarmarna av daf-2 mutanter, som har förlust-av-funktion mutation i insulin receptor genen, medan i vilda typer maskar intestinala lipid nivåer minskar. Dessutom, i överensstämmelse med tidigarestudier 23,24, fann vi att daf-16 inaktivering fullt ut kan undertrycka lipidlagringsökningen i daf-2 mutanter och bland de olika daf-16 isoformerna, daf-16d / f / h isoform reglerar specifikt lipidhomeostas. Som tidigare studier föreslog beror skillnaden i totala intestinala lipidlagringsnivåer i daf-2 mutanter sannolikt på en kombination av faktorer: ökad de novo lipidsyntes32, minskad lipidutnyttjande33, samt minskad reproduktion och äggula ackumulering34. De senaste framstegen inom sammanhängande Raman spektroskopi tekniker (SRS och CARS) skulle bidra till att ytterligare klargöra mekanismerna för hur insulin signalering bidrar till reglering av olika lipid lagring typer i distinkta vävnader, inklusive tarmarna, hypodermis och oocyter.
SRS mikroskopi har använts för att avbilda inte bara lipider, men också andra biomolekyler, inklusive DNA35,RNA14,proteiner 13, och glukos36. Det har implementerats för att ge viktiga insikter om många aspekter av biologi som cellbiologi, mikrobiologi, cancerbiologi och utvecklingsbiologi11. På senare tid har användningen av bioorthogonala taggar (t.ex. alkyne- och deuteriumtaggar) för att minimalt märka molekyler av intresse ytterligare förbättrat detektionskänsligheten och specificiteten. Dessa minimala vibrationstaggar stör inte molekylens kemiska egenskaper, men ger specifik kemisk kontrast, eftersom deras Raman-signal är inom det "tysta fönstret" på Raman-spektrumet14,37. Förutom att förbättra känslighet och specificitet är uppnåendet av superupplösning SRS-avbildning också ett spännande forskningsområde. Flera forskargrupper har också insatser för att minimera utrustningens storlek genom att skapa handhållna SRS-mikroskop38. Tillämpningen av SRS-avbildning på biomedicinsk forskning har därför öppnat nya lokaler för tekniska och kemiska förbättringar för att främja lipidavbildning.
Jämfört med traditionella metoder för lipidk kvantifiering har SRS mikroskopi flera fördelar. Först och främst utförs den på ett etikettfritt sätt och även om en etikett måste användas kan etiketten vara så liten som två atomer. Därför lider det inte heller av fotobleachingproblemet som andra fluorescerande taggnings- och färgningsmetoder. För det andra möjliggör förmågan att levande avbildning med hela organismer att spåra dynamiken hos specifika metaboliter29,39,40. Slutligen tillåter SRS-mikroskopi högre grad av multiplexering och kan därför implementeras för att avbilda flera biomolekyler i distinkta cellulära fack samtidigt. Hyperspektrala SRS/CARS mikroskopi har en stor framtid när det gäller att utforska den metaboliska dynamiken hos flera distinkta biomolekyler, liksom olika typer av lipidlagringsfack som äggulapartiklar i C. elegans41 eller cholesterylester och TAG-rika lipiddroppar i olika däggdjurscelleroch vävnader 31. Å andra sidan står SRS-mikroskopi inför begränsningar som hög kostnad i hårdvara och brist på full kommersiell tillgänglighet. Dessutom kräver det expertis för att underhålla och driva systemet, vilket kan komplicera dess antagande. Utvecklingen av ljuskällan och systemintegrationen förbättrar situationen. Fiberbaserade lågkostnadslaserkälla och helt integrerade system erbjuder nya möjligheter inom kommersialisering och kommer att bidra till att minska kostnadeni framtiden 11,42,43. Dessutom, trots de nya tekniska metoderna för att förbättra bildframställningshastigheten och rumslig upplösning av SRS imaging, kan den begränsade detektionskänsligheten fortsätta att hindra förmågan att undersöka metaboliter med lågt överflöd. Sammantaget har användningen av SRS-mikroskopi i biomedicinsk forskning ökat enormt under det senaste decenniet. SRS imaging kommer ytterligare att dra nytta av de tekniska förbättringarna i detektionskänslighet, rumslig upplösning och multiplexeringsförmåga, och i slutändan utöka dess användning i kvantitativ övervakning av biomolekyler, särskilt lipider.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av NIH-bidrag R01AG045183 (M.C.W.), R01AT009050 (M.C.W.), R01AG062257 (M.C.W.), R01AG062257 (M.C.W.), DP1DK113644 (M.C.W.), March of Dimes Foundation (M.C.W.), Welch Foundation (M.C.W.) och av HHMI-utredare (M.C.W.). Vi tackar Caenorhabditis Genetics Center (CGC) för C. elegans stammar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A/D converter | Olympus | Analog Unit | |
| Agarose | GeneMate | 3119 | For making agarose pads |
| Alignment tool - adapter | Thorlabs | SM1A4 | For mounting the tool on scope |
| Alignment tool - target | Thorlabs | VRC2SM1 | For viewing IR laser |
| Alignment tool - tube | Thorlabs | SM1L40 | Length can vary |
| Autocorrelator (Optional) | APE | pulseCheck | |
| Bandpass filter | minicircuits | BBP-21.4+ if modulated at 20MHz or KR Electronics 2724 if modulated at 8 MHz | For signal with modulation frequency filtering |
| BNC cables | |||
| Dissection microscope | Nikon | SMZ800 | For handling and picking worms for imaging |
| Dodecane | Sigma-Aldrich | 44010 | Used for calibration of the SRS signal |
| Filter | Chroma Technology | 890/220 CARS | For removing Stokes beam |
| General purpose laboratory labeling tape | VWR | 89097 | For making agarose pads |
| Glass coverslips | VWR | 48393-106 | For covering worms for imaging |
| Glass microscope slide | VWR | 16004-422 | For making agarose pads |
| Laser scanning microscope | Olympus | FV3000 | |
| Lens | Thorlabs | L1: AC254-050-B L2: AC254-075-B |
For beam expander |
| Lock-in amplifier | Zurich | HF2LI | |
| Lowpass filter | minicircuits | BLP-1.9+ | For power supply noise suppression |
| Mirrors | Thorlabs | BB1-E03 | For relay and periscope |
| Objective | Olympus | UPlanSAPO 20x 0.75, UPlanSAPO 60XW 1.20 | |
| Photodiode | Thorlabs | FDS1010 | |
| Picosecond laser source | APE | picoEmerald | |
| Power supply | TEKPOWER | TP1342U | For photodiode, reversed 50V voltage |
| Sodium azide | Sigma | S2002 | For anaesthesizing the worms |
| Worm picker | WormStuff | 59-AWP |
References
- Luppino, F. S., et al. Overweight, obesity, and depression: a systematic review and meta-analysis of longitudinal studies. Archives of General Psychiatry. 67 (3), 220-229 (2010).
- Eckel, R. H., et al. Obesity and type 2 diabetes: what can be unified and what needs to be individualized. Diabetes Care. 34 (6), 1424-1430 (2011).
- Poirier, P., et al. Obesity and cardiovascular disease: pathophysiology, evaluation, and effect of weight loss. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 26 (5), 968-976 (2006).
- Bhaskaran, K., et al. Body-mass index and risk of 22 specific cancers: a population-based cohort study of 5.24 million UK adults. Lancet. 384 (9945), 755-765 (2014).
- Shen, Y., Hu, F., Min, W. Raman imaging of small biomolecules. Annual Review of Biophysics. 48, 347-369 (2019).
- Daemen, S., van Zandvoort, M., Parekh, S. H., Hesselink, M. K. C. Microscopy tools for the investigation of intracellular lipid storage and dynamics. Molecular Metabolism. 5 (3), 153-163 (2016).
- Syed, A., Smith, E. A. Raman imaging in cell membranes, lipid-rich organelles, and lipid bilayers. Annual Review of Analytical Chemistry. 10 (1), Palo Alto, Calif. 271-291 (2017).
- Thomas, G. J. Raman spectroscopy of protein and nucleic acid assemblies. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 28, 1-27 (1999).
- Evans, C. L., Xie, X. S. Coherent anti-stokes Raman scattering microscopy: chemical imaging for biology and medicine. Annual Review of Analytical Chemistry. 1, Palo Alto, Calif. 883-909 (2008).
- Freudiger, C. W., et al. Label-free biomedical imaging with high sensitivity by stimulated Raman scattering microscopy. Science. 322 (5909), 1857-1861 (2008).
- Hu, F., Shi, L., Min, W. Biological imaging of chemical bonds by stimulated Raman scattering microscopy. Nature Methods. 16 (9), 830-842 (2019).
- Wang, M. C., Min, W., Freudiger, C. W., Ruvkun, G., Xie, X. S. RNAi screening for fat regulatory genes with SRS microscopy. Nature Methods. 8 (2), 135-138 (2011).
- Wei, L., Yu, Y., Shen, Y., Wang, M. C., Min, W. Vibrational imaging of newly synthesized proteins in live cells by stimulated Raman scattering microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (28), 11226-11231 (2013).
- Wei, L., et al. Live-cell imaging of alkyne-tagged small biomolecules by stimulated Raman scattering. Nature Methods. 11 (4), 410-412 (2014).
- Ramachandran, P. V., Mutlu, A. S., Wang, M. C. Label-free biomedical imaging of lipids by stimulated Raman scattering microscopy. Current Protocols in Molecular Biology. 109, 31 (2015).
- Srinivasan, S. Regulation of body fat in Caenorhabditis elegans. Annual Review of Physiology. 77, 161-178 (2015).
- Vrablik, T. L., Petyuk, V. A., Larson, E. M., Smith, R. D., Watts, J. L. Lipidomic and proteomic analysis of Caenorhabditis elegans lipid droplets and identification of ACS-4 as a lipid droplet-associated protein. Biochimca Et Biophysica Acta. 1851 (10), 1337-1345 (2015).
- Yu, Y., Mutlu, A. S., Liu, H., Wang, M. C. High-throughput screens using photo-highlighting discover BMP signaling in mitochondrial lipid oxidation. Nature Communications. 8 (1), 865 (2017).
- Kelley, L. C., et al. Live-cell confocal microscopy and quantitative 4D image analysis of anchor-cell invasion through the basement membrane in Caenorhabditis elegans. Nature Protocols. 12 (10), 2081-2096 (2017).
- Murphy, C. T., Hu, P. J. Insulin/insulin-like growth factor signaling in C. elegans. WormBook. , 1-43 (2013).
- Shi, X., et al. Regulation of lipid droplet size and phospholipid composition by stearoyl-CoA desaturase. Journal of Lipid Research. 54 (9), 2504-2514 (2013).
- Watts, J. L., Ristow, M. Lipid and carbohydrate metabolism in Caenorhabditis elegans. Genetics. 207 (2), 413-446 (2017).
- Kimura, K. D., Tissenbaum, H. A., Liu, Y., Ruvkun, G. daf-2, an insulin receptor-like gene that regulates longevity and diapause in Caenorhabditis elegans. Science. 277 (5328), 942-946 (1997).
- Kwon, E. S., Narasimhan, S. D., Yen, K., Tissenbaum, H. A. A new DAF-16 isoform regulates longevity. Nature. 466 (7305), 498-502 (2010).
- Chen, A. T., et al. Longevity genes revealed by integrative analysis of isoform-specific daf-16/FoxO mutants of Caenorhabditis elegans. Genetics. 201 (2), 613-629 (2015).
- Lee, R. Y., Hench, J., Ruvkun, G. Regulation of C. elegans DAF-16 and its human ortholog FKHRL1 by the daf-2 insulin-like signaling pathway. Current Biology. 11 (24), 1950-1957 (2001).
- Mutlu, A. S., Gao, S. M., Zhang, H., Wang, M. C. Olfactory specificity regulates lipid metabolism through neuroendocrine signaling in Caenorhabditis elegans. Nature Communications. 11 (1), 1450 (2020).
- Chen, A. J., et al. Fingerprint Stimulated Raman Scattering imaging reveals retinoid coupling lipid metabolism and survival. Chemphyschem: a European Journal of Chemical Physics and Physical Chemistry. 19 (19), 2500-2506 (2018).
- Li, X., et al. Quantitative imaging of lipid synthesis and lipolysis dynamics in Caenorhabditis elegans by Stimulated Raman Scattering microscopy. Analytical Chemistry. 91 (3), 2279-2287 (2019).
- Lin, C. J., Wang, M. C. Microbial metabolites regulate host lipid metabolism through NR5A-Hedgehog signalling. Nature Cell Biology. 19 (5), 550-557 (2017).
- Fu, D., et al. In vivo metabolic fingerprinting of neutral lipids with hyperspectral stimulated Raman scattering microscopy. Journal of the American Chemical Society. 136 (24), 8820-8828 (2014).
- Perez, C. L., Van Gilst, M. R. A 13C isotope labeling strategy reveals the influence of insulin signaling on lipogenesis in C. elegans. Cell Metabolism. 8 (3), 266-274 (2008).
- Elle, I. C., Rodkaer, S. V., Fredens, J., Faergeman, N. J. A method for measuring fatty acid oxidation in C. elegans. Worm. 1 (1), 26-30 (2012).
- Ezcurra, M., et al. elegans eats its own intestine to make yolk leading to multiple senescent pathologies. Current Biology. 28 (16), 2544-2556 (2018).
- Lu, F. K., et al. Label-free DNA imaging in vivo with stimulated Raman scattering microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (37), 11624-11629 (2015).
- Long, R., et al. Two-color vibrational imaging of glucose metabolism using stimulated Raman scattering. Chemical Communications. 54 (2), Cambridge, England. 152-155 (2018).
- Zhao, Z., Shen, Y., Hu, F., Min, W. Applications of vibrational tags in biological imaging by Raman microscopy. Analyst. 142 (21), 4018-4029 (2017).
- Liao, C. S., et al. In vivo and in situ spectroscopic imaging by a handheld Stimulated Raman Scattering Microscope. ACS Photonics. 5 (3), 947-954 (2018).
- Lee, H. J., et al. Assessing cholesterol storage in live cells and C. elegans by stimulated Raman scattering imaging of phenyl-Diyne cholesterol. Scientific Reports. 5, 7930 (2015).
- Wang, P., et al. Imaging lipid metabolism in live Caenorhabditis elegans using fingerprint vibrations. Angewandte Chemie (International Edition in English). 53 (44), 11787-11792 (2014).
- Chen, W. W., et al. Spectroscopic coherent Raman imaging of Caenorhabditis elegans reveals lipid particle diversity. Nature Chemical Biology. 16 (10), 1087-1095 (2020).
- Freudiger, C. W., et al. Stimulated Raman Scattering microscopy with a robust fibre laser source. Nature Photonics. 8 (2), 153-159 (2014).
- Brinkmann, M., et al. Portable all-fiber dual-output widely tunable light source for coherent Raman imaging. Biomedical Optics Express. 10 (9), 4437-4449 (2019).
