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Biology

उत्तेजित रमन स्कैटरिंग माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके कैनोरहैब्डिटिस एलिगेंस में लिपिड स्टोरेज डायनेमिक्स की लेबल-फ्री इमेजिंग

Published: May 28, 2021 doi: 10.3791/61870
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2,3
1Huffington Center on Aging, Baylor College of Medicine, 2Department of Molecular and Human Genetics, Baylor College of Medicine, 3Howard Hughes Medical Institute, Baylor College of Medicine

Summary

उत्तेजित रमन बिखरने (एसआरएस) माइक्रोस्कोपी विशिष्ट रासायनिक moieties के चयनात्मक, लेबल मुक्त इमेजिंग की अनुमति देता है और यह प्रभावी ढंग से वीवो में लिपिड अणुओं छवि के लिए नियोजित किया गया है । यहां, हम एसआरएस माइक्रोस्कोपी के सिद्धांत का संक्षिप्त परिचय प्रदान करते हैं और कैनोरहैब्डिटिस एलिगेंसमें इमेजिंग लिपिड भंडारण में इसके उपयोग के तरीकों का वर्णन करते हैं।

Abstract

लिपिड चयापचय सेलुलर और जीव स्वास्थ्य के लिए आवश्यक एक मौलिक शारीरिक प्रक्रिया है। लिपिड चयापचय के Dysregulation अक्सर मोटापा और हृदय विकारों, प्रकार द्वितीय मधुमेह, और कैंसर सहित कई संबंधित रोगों प्रकाश में लाना । लिपिड मेटाबोलिक विनियमन की वर्तमान समझ को आगे बढ़ाने के लिए, समय और स्थान में वीवो लिपिड भंडारण स्तर में ठीक से मापने के लिए मात्रात्मक तरीके तेजी से महत्वपूर्ण और उपयोगी हो गए हैं। लिपिड भंडारण का विश्लेषण करने के लिए पारंपरिक दृष्टिकोण सूक्ष्म मूल्यांकन के लिए अर्ध-मात्रात्मक हैं या जैव रासायनिक माप के लिए स्थानिक-लौकिक जानकारी की कमी है। उत्तेजित रमन बिखरने (एसआरएस) माइक्रोस्कोपी एक लेबल मुक्त रासायनिक इमेजिंग तकनीक है जो एक उपकोशिक संकल्प के साथ जीवित कोशिकाओं में लिपिड का तेजी से और मात्रात्मक पता लगाने में सक्षम बनाती है। चूंकि आंतरिक आणविक कंपन से इसके विपरीत का शोषण किया जाता है, एसआरएस माइक्रोस्कोपी जीवित जानवरों में लिपिड की चार-आयामी ट्रैकिंग की अनुमति भी देता है। पिछले दशक में, एसआरएस माइक्रोस्कोपी का व्यापक रूप से जैव चिकित्सा अनुसंधान में छोटे अणु इमेजिंग के लिए उपयोग किया गया है और पारंपरिक फ्लोरोसेंट धुंधला और लिपिड निष्कर्षण विधियों की प्रमुख सीमाओं को दूर किया गया है। प्रयोगशाला में, हमने विभिन्न कोशिकाओं और ऊतकों में लिपिड बूंदों के वितरण और विषमता की जांच करने के लिए शक्तिशाली मॉडल जीव, कैनोरहैब्डिटिस एलिगेंस के लिए उपलब्ध आनुवंशिक और जैव रासायनिक उपकरणों के साथ एसआरएस माइक्रोस्कोपी को संयुक्त किया है और अंततः लिपिड मेटाबॉलिज्म को मिलाने वाले उपन्यास संरक्षित सिग्नलिंग मार्गों की खोज करने के लिए। यहां, हम काम करने वाले सिद्धांतों और एसआरएस माइक्रोस्कोप के विस्तृत सेटअप को प्रस्तुत करते हैं और जंगली-प्रकार और इंसुलिन सिग्नलिंग की कमी उत्परिवर्ती सी एलिगेंसके अलग-अलग विकासात्मक समय बिंदुओं पर लिपिड भंडारण की मात्रा निर्धारित करने में इसके उपयोग के तरीके प्रदान करते हैं।

Introduction

मोटापा एक वैश्विक स्वास्थ्य समस्या बन गया है जो दुनिया भर की आबादी के एक तिहाई लोगों को धमकी देता है, और यह एक गंभीर चिकित्सा चिंता प्रस्तुत करता है, जो मधुमेह2,हृदय रोग3 और कुछ प्रकार के कैंसर सहित खराब मानसिक स्वास्थ्य1 और घातक बीमारियों के साथ अपने संबंध को देखतेहुए 4। मोटापे के पीछे जैविक समस्याओं को बेहतर ढंग से समझने के लिए लिपिड मेटाबॉलिज्म का अध्ययन जरूरी है। लिपिड भंडारण के तेजी से और विशिष्ट मात्राकरण में फैटी एसिड और उनके डेरिवेटिव का पता लगाने के साथ-साथ उच्च संवेदनशीलता और अधिमानतः स्थानिक जानकारी के साथ स्टेरॉल युक्त मेटाबोलाइट्स की आवश्यकता होती है। लिपिड छवि के लिए लक्ष्य को चुनौती दे रहे हैं क्योंकि वे आंतरिक फ्लोरेसेंस की कमी है और आसानी से फ्लोरोसेंटी टैग नहीं किया जा सकता है । फ्लोरोसेंट टैग अक्सर लिपिड अणुओं की तुलना में बड़े होते हैं और इसलिए, वीवो अनुप्रयोगों में रासायनिक रूप से आक्रामक और अव्यावहारिक हो सकते हैं। लिपिड अणुओं5की हाइड्रोफोबिक संरचना को संरक्षित करने के लिए लेबल-मुक्त या न्यूनतम लेबलिंग रणनीति आवश्यक है। इमेजिंग प्रौद्योगिकियों में हाल के घटनाक्रमों ने जीवित कोशिकाओं, ऊतकों और जीवों में लिपिड के लेबल-मुक्त इमेजिंग के लिए रोमांचक अवसर पैदा किए हैं।

जैविक नमूनों में लिपिड भंडारण विश्लेषण के लिए पारंपरिक दृष्टिकोणों में बायोकेमिकल परख और लिपोफिलिक रंगों के साथ धुंधला प्रोटोकॉल शामिल हैं। बायोकेमिकल क्वांटिफिकेशन परिरूप मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) शामिल है उनके आणविक समाधान में बेजोड़ हैं, लेकिन उन्हें बहुत बड़ी नमूना मात्रा की आवश्यकता होती है और नमूना तैयारी में आमतौर पर कई घंटे लगते हैं, जो जीवित सिस्टम के वास्तविक समय इमेजिंग के लिए उनके आवेदन को सीमित करते हैं5। इन परख की एक और बड़ी सीमा स्थानिक जानकारी की कमी है । दूसरी ओर, तेल लाल ओ और सूडान ब्लैक जैसे लिपोफिलिक रंग लिपिड स्टोरेज ऑर्गेनेल्स के ऊतक और सेलुलर वितरण प्रदान करते हैं और एमएस तकनीकों की तुलना में, ये धुंधला तरीके लागत में भी कम हैं और प्रदर्शन करने में आसान हैं। हालांकि, इन धुंधला प्रोटोकॉल निर्धारण की आवश्यकता है, जो लिपिड बूंदों की हाइड्रोफोबिक प्रकृति को प्रभावित कर सकते हैं, उनकी संरचना में कृत्रिम परिवर्तन उत्पन्न करते हैं और परिणामस्वरूप6प्रयोगों के बीच विसंगतियां होती हैं। जैव रासायनिक और धुंधला तकनीकों के साथ जुड़े तकनीकी कठिनाइयों लिपिड अणुओं छवि और लिपिड इमेजिंग में सुसंगत रमन बिखरने (सीआरएस) माइक्रोस्कोपी के उपयोग में तेजी से वृद्धि करने के लिए लेबल मुक्त तरीकों के लिए खोज करने के लिए नेतृत्व किया है ।

रमन प्रभाव को पहले रमन और कृष्णन द्वारा पहचाना गया था, जहां उन्होंने बताया कि फोटॉन के साथ बातचीत करने पर, एक अणु तरंगदैर्ध्य (जिसे रेले बिखरने) में कोई परिवर्तन नहीं होता है, या शायद ही कभी एक परिवर्तित तरंगदैर्ध्य (जिसे रमन बिखरने कहा जाता है) के साथ बिखरे हुए प्रकाश उत्पन्न कर सकता है और तरंगदैर्ध्य में यह परिवर्तन अणु7के भीतर कार्यात्मक रासायनिक समूहों की विशेषता है। जब एक अणु के भीतर रासायनिक बांड एक घटना फोटॉन द्वारा एक उच्च कंपन ऊर्जा स्तर के लिए उत्साहित हो, पंप फोटॉन कहा जाता है, बिखरे हुए फोटॉन की ऊर्जा, स्टोक्स फोटॉन कहा जाता है, कम हो जाते हैं । अन्यथा, रासायनिक बांड एक कम कंपन ऊर्जा स्तर तक पहुंच सकते हैं यदि वे मूल रूप से उच्च स्तर पर हैं, और बिखरे हुए फोटॉन विरोधी स्टोक्स फोटॉन होने के लिए ऊर्जा प्राप्त करते हैं। घटना और बिखरे फोटॉनों के बीच आवृत्ति अंतर को रमन शिफ्ट के नाम से जाना जाता है। एक अणु के भीतर प्रत्येक रासायनिक बंधन एक विशेषता और मात्रात्मक रमन बदलाव है । उदाहरण के लिए, सीएच2 बॉन्ड में 2,845 सेमी-1का रमन शिफ्ट है, जो फैटी एसिड चेन8में प्रचुर मात्रा में है। यह सहज रमन संकेत आम तौर पर बहुत कमजोर है, जिसने पारंपरिक सहज रमन माइक्रोस्कोपी में इमेजिंग गति को काफी सीमित कर दिया है। इन वर्षों में, सहज रमन माइक्रोस्कोपी की इमेजिंग गति और संवेदनशीलता को बढ़ाने के लिए विभिन्न दृष्टिकोण विकसित किए गए हैं। सुसंगत रमन बिखरने वाली माइक्रोस्कोपी, जिसमें सुसंगत विरोधी स्टोक्स रमन बिखरने (कारें) माइक्रोस्कोपी और उत्तेजित रमन बिखरने (एसआरएस) माइक्रोस्कोपी शामिल हैं, सबसे हालिया प्रगति है । कारों और एसआरएस में थोड़ा अलग काम करने के सिद्धांत हैं, लेकिन दोनों लेबल-मुक्त तकनीकें हैं जिनमें लाइव इमेजिंग क्षमता है, लिपिड स्टोरेज गतिशीलता पर स्थानिक और लौकिक जानकारी प्राप्त कर सकती है, और केवल छोटे नमूना आकार की आवश्यकता होती है। कारें माइक्रोस्कोपी गैर-सुनाई देती पृष्ठभूमि से ग्रस्त है, जो विभिन्न गैर-रैखिक प्रक्रियाओं से आती है, और कारों के संकेतों में अणु एकाग्रता के साथ गैर-रैखिक संबंध भी होते हैं, जो एक साथ मात्राकरण प्रक्रिया9को जटिल बनाते हैं। कारों माइक्रोस्कोपी के विपरीत, एसआरएस माइक्रोस्कोपी गैर-सुनाई देती पृष्ठभूमि संकेतों को उत्पन्न नहीं करती है और ब्याज के अणु की एकाग्रता पर रैखिक निर्भरता प्रदान करती है। इस प्रकार, वर्तमान में एसआरएस माइक्रोस्कोपी लिपिड इमेजिंग के लिए अधिक व्यापक रूप से उपयोग की जाती है।

एसआरएस माइक्रोस्कोपी में, कमजोर सहज रमन संकेतों को तब परिलक्षित किया जा सकता है जब दो सिंक्रोनाइज्ड लेजर बीम से उत्साहित होते हैं, उनके आवृत्ति अंतर के साथ रासायनिक बांड कंपन आवृत्ति से मेल खाते हैं। अणु सुसंगत उत्तेजन के कारण एक उत्तेजित राज्य के लिए एक बढ़ाया संक्रमण का अनुभव होगा । नतीजतन स्टोक्स फोटॉन जेनरेशन के रेट को बूस्ट करते हैं । नतीजतन, प्रेषित "स्टोक्स" बीम की तीव्रता बढ़ जाती है (रमन लाभ, एसआरजी उत्तेजित) और प्रेषित "पंप" बीम की तीव्रता कम हो जाती है (रमन हानि, एसआरएल उत्तेजित)। एसआरजी या एसआरएल संकेतों का पता लगाने से विशिष्ट रासायनिक बांड10के साथ अणुओं की उत्तेजित रमन बिखरने (एसआरएस) माइक्रोस्कोपी इमेजिंग का आधार रेखांकित होता है । यदि दो लेजर बीम के बीच आवृत्ति अंतर ब्याज के अणु के भीतर रासायनिक बांड की कंपन आवृत्ति से मेल नहीं खाती है, तो न तो एसआरजी और न ही एसआरएल सिग्नल उत्पन्न होंगे। एसआरएस माइक्रोस्कोपी की इमेजिंग गति लगभग 2 माइक्रोसेक प्रति पिक्सेल या 1 सेकंड प्रति फ्रेम है, जो सहज रमन माइक्रोस्कोपी11की तुलना में बहुत तेज है। एसआरएस माइक्रोस्कोपी के लिए विशिष्ट पार्श्व संकल्प विवर्तन सीमित और लगभग 300 एनएम है। इसके अलावा, एसआरएस माइक्रोस्कोपी की दो-फोटॉन ऑप्टिकल प्रक्रियाएं सापेक्ष मोटे ऊतक नमूनों की वॉल्यूमेट्रिक 3 डी इमेजिंग के लिए अनुमति देती हैं और इमेजिंग गहराई 300-500 माइक्रोन तक पहुंच सकती है। कुल मिलाकर, एसआरएस माइक्रोस्कोपी विशिष्ट बायोमॉलिक्यूल्स, विशेष रूप से लिपिड का पता लगाने के लिए एक कुशल, लेबल-मुक्त इमेजिंग तकनीक प्रस्तुत करती है।

लिपिड बूंदें एकल झिल्ली ऑर्गेनेल्स हैं, जो तटस्थ लिपिड के लिए मुख्य सेलुलर भंडारण साइट हैं, जिनमें ट्राइसिलग्लिसॉल (TAGs) और कोलेस्ट्रॉल एस्टर (सीई) शामिल हैं। इन लिपिड अणुओं की फैटी एसिड चेन में सीएच2 बांड8उत्तेजित होने पर 2,845 सेमी-1 पर मजबूत एसआरएस संकेत उत्पन्न करते हैं, जिससे अक्षुण्ण कोशिकाओं, ऊतक वर्गों और यहां तक कि पूरे जीवों में भंडारण लिपिड के स्तर का पता लगाने और मात्रा में वृद्धि होती है12,13,14,15. विशेष रूप से, सी एलिगेंस अपनी पारदर्शिता के कारण लिपिड इमेजिंग अध्ययन के लिए उपयोगी हैं। स्तनधारियों की तरह, सी एलिगेंस लिपिड बूंदों में लिपिड भी स्टोर करते हैं और लिपिड अणुओं के संश्लेषण और क्षरण मार्गअत्यधिक संरक्षित हैं 16। इस प्रोटोकॉल में, हम एसआरएस माइक्रोस्कोपी, इसके मौलिक सेटअप के कार्य सिद्धांत प्रदान करेंगे और सी एलिगेंसमें लिपिड इमेजिंग में इसके उपयोग के तरीकों का वर्णन करेंगे।

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Protocol

1. उत्तेजित रमन बिखरने माइक्रोस्कोपी के लिए वाद्य सेटअप

नोट: एसआरएस माइक्रोस्कोपी सिस्टम पंप एकीकृत ऑप्टिकल पैरामेट्रिक ऑसिलेटर और एक कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप के साथ एक पिकोसेकंड लेजर पर बनाया गया है। ऑसिलेटर दो पिकोसेकंड पल्स गाड़ियां प्रदान करता है, जिसमें 1,064 एनएम पर स्टोक्स बीम और 700-990 एनएम के बीच एक पंप बीम ट्यूनकरना शामिल है। दो बीम के लौकिक और स्थानिक अतिव्यापी लेजर के अंदर प्राप्त कर रहे हैं। एक अंतर्निहित इलेक्ट्रो ऑप्टिक मॉड्यूलर (ईओएम) विशेष रूप से एसआरएस माइक्रोस्कोपी के लिए डिज़ाइन किया गया है। यह प्रोटोकॉल माइक्रोस्कोप के साथ लेजर युग्मन पर ध्यान केंद्रित करेगा, और इस प्रणाली के दैनिक संचालन(चित्रा 1)। एक एसआरएस माइक्रोस्कोप सिस्टम का विन्यास पिछले एक दशक में विकसित हो रहा है। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि निम्नलिखित विवरण केवल कई विन्यासों में से एक का प्रतिनिधित्व करता है।

  1. माइक्रोस्कोप में लेजर बीम खिला
    1. माइक्रोस्कोप के स्कैनर पर आईआर लेजर इनपुट पोर्ट के लिए picosecond प्रकाश स्रोत निकास से बीम उठाने के लिए पेरिस्कोप स्थापित करें।
      सावधानी: ऑपरेशन से पहले लेजर सिस्टम मैनुअल पढ़ें और सभी आवश्यक सावधानियां बरतें क्योंकि इस चतुर्थ श्रेणी लेजर सिस्टम द्वारा उत्पन्न अवरक्त विकिरण आंखों और त्वचा को गंभीर नुकसान पहुंचा सकता है। संस्थागत पर्यावरण सुरक्षा विभागों द्वारा आवश्यक प्रशिक्षणों को पूरा करें। कफ आस्तीन के साथ सुरक्षात्मक चश्मे और प्रयोगशाला कोट पहनें।
    2. सबसे पहले, पंप बीम को 750 एनएम पर सेट करें और लेजर पावर को 50 मिलियन तक कम करें, जिसे संरेखण से संबद्ध नेत्रहीन निरीक्षण किया जा सकता है। फिर, माइक्रोस्कोप उद्देश्यों के पीछे एपर्चर फिट करने के लिए बीम व्यास को समायोजित करने के लिए बीम विस्तारक(चित्रा 1,एल 1 और एल 2) का उपयोग करें। पेरिस्कोप(चित्रा 1,पी 1 और पी 2) के लिए लेजर बीम का मार्गदर्शन करने के लिए दो रिले दर्पण(चित्रा 1,एम 1 और एम 2) का उपयोग करें। पेरिस्कोप बीम को स्कैनर खोलने की ऊंचाई तक उठा देगा और संरेखण के लिए स्टीयरिंग मिरर के रूप में भी काम करेगा।
    3. ट्यूनिंग रेंज के केंद्र में पेरिस्कोप पर घुंडी सेट करें और प्रत्येक दर्पण की प्रारंभिक स्थिति और कोण चुनें जैसे कि लेजर बीम दर्पण के केंद्र से टकराता है, लगभग।
    4. उद्देश्य बुर्ज पर एक खाली बंदरगाह का उपयोग कर मोटे संरेखण प्रदर्शन और प्रेषित प्रकाश की शक्ति को मापने के लिए बिजली मीटर की जांच जगह है। उच्चतम ज़ूम (50x) पर माइक्रोस्कोप के स्कैनर सेट करें, और फिर केंद्रित लेजर बीम स्पॉट के साथ संचारित प्रकाश की शक्ति को मापें। उच्चतम संचारित लेजर शक्ति को प्राप्त करने के लिए प्रत्येक दर्पण, एम 1 और एम 2 पर घुंडी का अनुकूलन करें।
    5. संरेखण उपकरण के साथ ठीक संरेखण करें। खाली उद्देश्य सीट पर फ्लोरेसेंस लक्ष्य संरेखण टोपी रखो और जगह केंद्र के लिए M1 के घुंडी समायोजित करें । फिर, लक्ष्य के लिए एक्सटेंशन ट्यूब पेश करें और मौके को केंद्र में लाने के लिए एम 2 के घुंडी ट्यून करें।
    6. जब तक बीम दोनों पदों पर लक्ष्य को केंद्र नहीं बनाता तब तक चरण 1.1.4 और 1.1.5 दोहराएं।
  2. डिटेक्शन और इलेक्ट्रॉनिक्स को जोड़ना
    1. एसआरएस डिटेक्शन मॉड्यूल स्थापित करें। संचारित लेजर को फोटोडिओड मॉड्यूल पर निर्देशित करने के लिए कंडेनसर के बाद एक बीम स्प्लिटर क्यूबर रखें। मॉड्यूल में फोटोडिओड के सक्रिय क्षेत्र को फिट करने के लिए बीम आकार को रिले और बदलने के लिए एक दूरबीन शामिल है, साथ ही मॉड्यूलेड स्टोक्स बीम को हटाने के लिए एक ऑप्टिकल फिल्टर और पंप बीम को डेमोड्यूलेशन के लिए जाने देना है।
    2. इलेक्ट्रॉनिक्स कनेक्शन(चित्रा 1) सेटकरें। स्टोक्स बीम की तीव्रता को पिकोसेकंड ट्यूनेबल लेजर के अंदर 20 मेगाहर्ट्ज पर बिल्ट-इन ईओएम द्वारा संग्राहक किया जाता है । लेजर से मॉड्यूलेशन आवृत्ति आउटपुट डेमोडुलेशन के लिए संदर्भ आवृत्ति के रूप में लॉक-इन एम्पलीफायर में इनपुट है। एसआरएल को डिमोडल करने के लिए लॉक-इन एम्पलीफायर में फोटोडिओड के आउटपुट सिग्नल को खिलाएं।
      नोट: वन-बॉक्स लेजर सिस्टम को अपग्रेड किया जा सकता है और इस प्रकार विभिन्न उत्पादन तिथि के कारण उनके विनिर्देश भिन्न हो सकते हैं। इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल होने वाले पिकोसेकंड ट्यूनेबल लेजर सिस्टम के पिछले वर्जन में 1,064 एनएम की स्टोक्स बीम है, लेकिन हालिया वर्जन में 1,031 एनएम का स्टोक्स बीम है। इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले ईओएम की मॉड्यूलेशन आवृत्ति को 8 मेगाहर्ट्ज के लिए अनुकूलित किया गया है, लेकिन हालिया सिस्टम के लिए डिफ़ॉल्ट मॉड्यूलेशन आवृत्ति 10 या 20 मेगाहर्ट्ज हो सकती है।
    3. अंत में, इलेक्ट्रिकल एनालॉग सिग्नल को डिजिटल सिग्नल में बदलने के लिए लॉक-इन एम्पलीफायर आउटपुट को माइक्रोस्कोप के एनालॉग बॉक्स में खिलाएं। एसआरएस सिग्नल को प्रोसेस करने के लिए सिस्टम तैयार होना चाहिए।
  3. इमेजिंग शर्तों का अनुकूलन
    1. सिस्टम अलाइनमेंट के लिए केमिकल सैंपल लें। उदाहरण के लिए, माइक्रोस्कोप को अनुकूलित करने के लिए द्वादश का उपयोग करें, क्योंकि डोडेकेन में सी-एच बांड से एक बहुत मजबूत एसआरएस संकेत है। एक मिनी कक्ष बनाने के लिए एक सुरक्षित सील का उपयोग करें; 5 μL द्वादश डालें और इसे कवरस्लिप के साथ कवर करें।
      नोट: द्वादश नमूना की जगह एक बार यह अस्पष्ट लग रहा है या मलबे प्रस्तुत करता है, एक नया नमूना है जो संरेखण के लिए 2-3 महीने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है के साथ ।
    2. नमूना माइक्रोस्कोप स्टेज पर रखें। तरल बूंद पर ठीक से ध्यान केंद्रित करें। इसे डोरेकेने पैड के किनारे की तलाश करके तेजी से किया जा सकता है। कोहलर रोशनी के लिए कंडेनसर को समायोजित करें।
    3. इमेजिंग पैरामीटर सेट करें। जांच करें कि देरी का चरण सही नंबरों पर है या नहीं। पंप बीम तरंगदैर्ध्य 795.8 एनएम करने के लिए सेट करें। आईआर सेंसर कार्ड और आईआर दर्शक का उपयोग करके, जांच करें कि पंप बीम पथ अभी भी सही है या नहीं।
    4. पियोसेकंड सिस्टम कंट्रोल पैनल पर पंप बीम की पावर 200 एमडब्ल्यू और स्टोक्स बीम को 400 एमडब्ल्यू तक सेट करें।
      नोट: लेजर निकास से लेजर थ्रूपुट दो बीम के उद्देश्य के बाद पंप के लिए लगभग 25% और इस प्रणाली सेटअप के लिए स्टोक्स के लिए 14% हैं । इसलिए, पंप बीम की एक पोस्ट ऑब्जेक्टिव पावर लगभग 50 मिलियन है और स्टोक्स बीम के लिए यह लगभग 56 मिलियन है। हाल ही में पिकोसेकंड लेजर सिस्टम की पल्स चौड़ाई 6 पीएस से बदलकर 2 पीएस हो गई है, इसलिए एप्लाइड लेजर पावर भी कम होनी चाहिए।
    5. लॉक-इन एम्पलीफायर लाभ को अधिकतम करने के लिए सेट करें। दोनों बीम के लिए शटर खोलें, साथ ही लेजर का मुख्य शटर।
    6. सैंपल को स्कैन कर कंप्यूटर स्क्रीन पर इमेज चेक करें। इमेजिंग सॉफ्टवेयर में डिस्प्ले मोड को हाई-लो में बदलें। ~ 50% संतृप्ति देखने के लिए सीमा को समायोजित करें। जांच करें कि संतृप्ति छवि में केंद्रित है या नहीं। यदि नहीं, तो ध्यान से स्टीयरिंग दर्पण, M1 और M2 समायोजित, छवि तीव्रता को अधिकतम करने के लिए और पीक तीव्रता केंद्र के लिए ।
    7. देरी चरण को ठीक करें और द्वादक नमूने से अधिकतम एसआरएस सिग्नल तीव्रता ढूंढें। इसके बाद सिस्टम इस्तेमाल के लिए तैयार हो जाता है।

2. एसआरएस माइक्रोस्कोपी इमेजिंग के लिए सी एलिगेंस नमूनों की तैयारी

नोट: मॉडल जीवों के रूप में, कैनोरहैब्डिटिस एलिगेंस कई इमेजिंग तकनीकों के लिए बहुत उपयोगी साबित हुए हैं। वे पूरे शरीर पारदर्शी हैं, इसलिए विच्छेदन की आवश्यकता के बिना विभिन्न ऊतकों को बरकरार जानवर में चित्रित किया जा सकता है। सी एलिगेंस में, आंत में स्थित लिपिड बूंदों में तटस्थ लिपिड संग्रहीत किए जाते हैं, जिनमें आंतों के ल्यूमेन16के आसपास द्विमितीय रूप से स्थित 20 एपिथेलियल कोशिकाएं होती हैं। हाइपोडरमल कोशिकाएं और ओसाइट्स लिपिड भी स्टोर करते हैं। सी एलिगेंस लिपिड बूंदों में भंडारण लिपिड का मुख्य रूप ट्राइसिलग्लिसेरोल (TAGs)17हैं, जो अपने फैटी एसिड चेन में मौजूद सीएच2 बांड की बहुतायत के कारण मजबूत एसआरएस संकेत उत्पन्न करते हैं। यह खंड एसआरएस माइक्रोस्कोपी इमेजिंग और उनके कुल आंतों लिपिड भंडारण स्तर के मात्राकरण के लिए सी एलिगेंस नमूने तैयार करने के तरीके पर ध्यान केंद्रित करेगा।

  1. इमेजिंग स्लाइड्स की तैयारी
    1. सबसे पहले, आसुत एच 2 ओ में2%एगर उठे समाधान तैयार करें, और सुनिश्चित करें कि एगरेग्मेंट पैड तैयार करने से पहले सभी एगर उठे पिघल जाते हैं।
    2. एक खाली स्लाइड (लगभग 100 माइक्रोन) पर गर्म 2% की एक बूंद जोड़ें जो प्रयोगशाला टेप की दो परतों के साथ समर्थन स्लाइड के बीच रखा जाता है और पहली स्लाइड के शीर्ष पर एक दूसरी स्लाइड को जल्दी से रखें। धीरे से एक पतली, यहां तक कि agarose पैड बनाने के लिए प्रेस ।
    3. इन स्लाइडों को बंद स्थिति में अलग करें और उन्हें तब तक अलग न करें जब तक कि कीड़े चढ़कर तैयार न हो जाएं। प्रत्येक इमेजिंग सत्र से पहले ताजा स्लाइड तैयार करें, क्योंकि पैड 1 दिन के बाद सूख जाएंगे।
      नोट: मल्टी-वेल इमेजिंग कक्षों का उपयोग करें, यदि उच्च-थ्रूपुट जेनेटिक स्क्रीन18में कई कीड़े इमेजिंग करें। विकास और उम्र बढ़ने19के माध्यम से लिपिड मेटाबोलिज्म की छवि स्थानिक-लौकिक गतिशीलता के लिए लाइव इमेजिंग सेटअप का उपयोग करें।
  2. कीड़े बढ़ते
    1. एम 9 बफर में सोडियम एजाइड या लेविमिसोल जोड़कर क्रमशः 100 mm या 1 mM की अंतिम एकाग्रता में एनेस्थेटाइजिंग एजेंट तैयार करें।
      नोट: levamisole का उपयोग करें अगर कीड़े आनुवंशिक स्क्रीन के बाद जीनोटाइपिंग के लिए इमेजिंग के बाद बरामद करने की जरूरत है ।
      सावधानी: सोडियम एजाइड और लेविमिसोल सहित कई एनेस्थेटाइजिंग एजेंट, अगर साँस लेते हैं तो हानिकारक होते हैं। सुरक्षात्मक दस्ताने और कपड़े पहनें, साथ ही उन काम समाधानों को तैयार करते समय रासायनिक धुएं हुड का उपयोग करें।
    2. एक कवरलिप (10-20 कीड़े के लिए लगभग 4-5 माइक्रोन) में एनेस्थेटाइजिंग एजेंट की एक बूंद रखें।
      नोट: कीड़े को यथासंभव एक दूसरे के करीब रखने के लिए कीड़े संख्या के अनुसार एनेस्थेटाइजिंग एजेंट की मात्रा को समायोजित करें। कुछ कीड़े के लिए बहुत अधिक तरल का उपयोग करने से कीड़े एगर उठे पैड पर फैल सकते हैं।
    3. विच्छेदन माइक्रोस्कोपी के तहत इमेज किए जाने वाले कीड़े को चुनें और उन्हें एनेस्थेटाइजिंग एजेंट ड्रॉपलेट में स्थानांतरित करें। सभी कीड़े बूंद में जोड़े जाने के बाद, उन्हें कीड़ा बीनने का उपयोग करके चारों ओर ले जाएं और सुनिश्चित करें कि वे एक दूसरे के साथ ओवरलैप न करें।
    4. एगरेज़ पैड को परेशान किए बिना ग्लास स्लाइड (चरण 2.1 से) को अलग करें।
    5. कांच की स्लाइड के साथ कीड़ा बूंद को कवर करें जिसमें एगर उठे पैड हैं। सुनिश्चित करें कि एगर उठे पैड कीड़े की ओर सामना कर रहा है। वैकल्पिक रूप से, एनेस्थेटाइजिंग एजिंग ड्रॉपलेट को एगर उठे पैड पर भी जोड़ा जा सकता है और कीड़े को कवरस्लिप के साथ कवर किया जा सकता है।
    6. अंत में, ग्लास स्लाइड पर स्थायी मार्कर का उपयोग करके कीड़े के स्थान को चिह्नित करें।

3. छवि अधिग्रहण और विश्लेषण

  1. एसआरएस माइक्रोस्कोप सिस्टम का उपयोग कर छवियों को प्राप्त करना।
    1. किसी भी नमूने इमेजिंग से पहले, इमेजिंग मापदंडों का निर्धारण और एसआरएस संकेतों को सत्यापित (जैसा कि प्रोटोकॉल 1 में समझाया गया है)।
    2. उद्देश्य लेंस का सामना करना पड़ कवरस्लिप के साथ स्लाइड माउंट। उज्ज्वल क्षेत्र प्रकाश स्रोत चालू करें और कीड़े का पता लगाने के लिए इसे आईपीस पर निर्देशित करें।
      नोट: पूरी आंत में लिपिड भंडारण छवि के लिए एक 20x उद्देश्य लेंस का प्रयोग करें । इमेज हाइपोडरमल फैट स्टोरेज के लिए 60x ऑब्जेक्टिव लेंस का इस्तेमाल करने या लिपिड ड्रॉपलेट साइज/नंबर की मात्रा निर्धारित करने पर विचार करें ।
    3. कीड़े को ध्यान में लाएं और तदनुसार कंडेनसर स्थिति को समायोजित करें।
    4. ब्राइट फील्ड लाइट सोर्स को बंद कर दें और लेजर स्कैनिंग यूनिट में स्विच करें। एक तेज स्कैनिंग दर (जैसे, 512 x 512 पिक्सल) पर पहले कीड़े को स्कैन करना शुरू करें, और ब्याज के क्षेत्र को खोजने के लिए ठीक फोकस को समायोजित करें। पहले नमूने को इमेज करने के लिए, लेजर शक्तियों को उस स्तर पर समायोजित करें जहां एसआरएस सिग्नल संतृप्त नहीं हैं।
    5. एसआरएस इमेज प्राप्त करने के लिए धीमी स्कैनिंग दर (जैसे, 2 μs/pixel) और उच्च रिज़ॉल्यूशन (जैसे, 1024 x 1024 पिक्सल) पर स्विच करें।
      नोट: इमेजिंग सत्र के दौरान हर नमूने को इमेज करने के लिए लेजर शक्तियों को स्थिर रखें।
    6. वांछित प्रारूप में एसआरएस छवि को सहेजें जो उच्च रिज़ॉल्यूशन (जैसे .tiff फ़ाइल) को सक्षम बनाता है। इमेजिंग सॉफ्टवेयर और सेटअप का उपयोग किए जाने के आधार पर, अगले में जाने से पहले पहले कीड़ा के स्थान को बचाएं।
    7. स्लाइड पर घुड़सवार सभी कीड़े की पूरी इमेजिंग। लेजर बीम को ब्लॉक करने के लिए शटर बंद कर दें। लेजर स्रोत को तब तक बंद न करें जब तक कि सभी नमूनों को चित्रित न किया जाए।
    8. अगली स् लाइड स् लाइड में रखने से पहले स् लाइड निकालें। कदम दोहराएं 3.1.2-3.1.7।
    9. एक बार सभी नमूनों को इमेजकिया गया है, स्टैंडबाय पर लेजर स्रोत डाल दिया और एम्पलीफायर, डिटेक्टर, माइक्रोस्कोप और कंप्यूटर सहित संबंधित उपकरण बंद कर दें ।
  2. इमेजजे का उपयोग करके छवियों का विश्लेषण
    1. फ़ाइलों का चयन करके और उन्हें इमेजजे विंडो पर खींचकर और छोड़ने के लिए इमेजजे में मात्रा निर्धारित करने के लिए इमेज फाइल (आमतौर पर .tiff) खोलें। विशिष्ट ओलंपस माइक्रोस्कोप प्रारूपों (जैसे .oib फ़ाइलें) का उपयोग करते हुए उपयुक्त इमेजजे प्लग-इन डाउनलोड करें।
    2. विश्लेषण किए जाने वाले गुणों का चयन करें (सेट मापन>विश्लेषण करें)। कुल लिपिड भंडारण मात्रा के लिए, क्षेत्र, न्यूनतम और मैक्स ग्रे मूल्य, और मतलब ग्रे मूल्यका चयन करें ।
    3. बहुभुज चयन उपकरण का उपयोग करें और कृमि आंत के क्षेत्र को निर्धारित करने के लिए रेखांकित करें। चरण 3.2.2 में चयनित मापदंडों को मापने के लिए, विश्लेषण > उपायपर क्लिक करें। माप परिणामों के साथ एक नई खिड़की पॉप-अप होगा। सभी खुली छवियों के लिए इस कदम को दोहराएं।
    4. किसी दिए गए जीनोटाइप में सभी कीड़े के लिए माप का चयन करें और परिणामों को एक नई स्प्रेडशीट में कॉपी/पेस्ट करें । एक ही इमेजिंग सत्र में सभी जीनोटाइप के लिए चरण 3.2.1-3.2.4 दोहराएं।
    5. कीड़ा के आसपास के क्षेत्र का चयन करें जिसमें पृष्ठभूमि के रूप में मात्रा निर्धारित करने के लिए कोई एसआरएस सिग्नल नहीं है। सुनिश्चित करें कि पृष्ठभूमि माप के लिए चयनित क्षेत्र में कोई बैक्टीरिया या मलबा नहीं होता है जो एसआरएस सिग्नल भी दे सकता है।
    6. पृष्ठभूमि को घटाना प्रत्येक व्यक्ति कीड़े के माप से ग्रे मूल्य का मतलब है। पृष्ठभूमि के औसत और मानक विचलन की गणना करें किसी दिए गए जीनोटाइप/परीक्षण समूह में सभी कीड़े से मतलब ग्रे मूल्यों को घटाया जाता है । इस मूल्य को नियंत्रण समूह के औसत से सामान्य करें।
    7. अंत में, प्रत्येक कीड़े में लिपिड के स्तर के लिए एक उपाय के रूप में मतलब ग्रे मूल्य का उपयोग कर उचित सांख्यिकीय विश्लेषण प्रदर्शन करते हैं । आमतौर पर, दो समूहों के लिए छात्र के टी-टेस्टका उपयोग करें और दो से अधिक समूहों के लिए एक उपयुक्त कई तुलना परीक्षण के साथ एक-तरफा एनोवा का उपयोग करें।
      नोट: चित्र प्रस्तुति के लिए छवियों का चयन करते समय, सुनिश्चित करें कि उन चयनित छवियों में एक ही पिक्सेल तीव्रता वितरण है। एक ही आकृति में सभी छवियों के लिए एक ही मूल्यों के लिए चमक और विपरीत सेट करें(छवि > > चमक और विपरीत समायोजित करें)।

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Representative Results

इंसुलिन सिग्नलिंग एक महत्वपूर्ण एंडोक्राइन मार्ग है जो विकास, प्रजनन, उम्र और चयापचय को प्रभावित करता है। कीड़े में, इंसुलिन सिग्नलिंग में लगभग 40 इंसुलिन जैसे पेप्टाइड लिगांड, इंसुलिन जैसे ग्रोथ फैक्टर रिसेप्टर ऑर्थोलॉग डीएएफ-2, डाउनस्ट्रीम PI3K/AKT kinase झरना, और फॉक्सओ ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर ऑर्थोलॉग, डीएएफ-1620शामिल हैं। डैफ-2 म्यूटेंट, जिनमें इंसुलिन रिसेप्टर की कमी है, उनकी आंत में अधिक लिपिड बूंदें होती हैं, कृमि लिपिड भंडारण ऊतक21,22। एसआरएस माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके, हमने वयस्कता के दौरान उम्र-सिंक्रोनाइज्ड जंगली प्रकार के कीड़े और डीएएफ-2 म्यूटेंट में आंतों के लिपिड स्तरों की मात्रा निर्धारित की। पिछले परिणामों के अनुरूप, हमने पाया कि डीएएफ-2 म्यूटेंट में लिपिड का स्तर23,24 (चित्रा 2 ए) अधिक होता है। हमने वयस्कता के दिन 9(चित्रा 2 ए)तक 1 दिन से शुरू होने वाले जंगली प्रकार के कीड़े में लिपिड के स्तर में गिरावट देखी। हालांकि, डीएएफ-2 म्यूटेंट में लिपिड का स्तर तब तक बढ़ गया जब तक कि वे 5 दिन पुराने नहीं हो जाते और फिर वे जंगली प्रकार(चित्रा 2A)से अधिक 2.5-3.0 गुना के स्तर के आसपास स्थिर थे।

डीएएफ-16, सी एलिगेंस फॉक्स्टो ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर ऑर्थोलॉग, इंसुलिन सिग्नलिंग मार्ग के अधिकांश डाउनस्ट्रीम कार्यों को आर्केस्ट्रा करता है। डीएएफ-16 नल उत्परिवर्तन वसा संचय सहित डीएएफ-2 म्यूटेंट में देखे गए कई फेनोटाइप को दबा देते हैं। डीएएफ-16 जीनोमिक लोकस 8 विभिन्न प्रतिलिपियों(डीएएफ-16ए-एच)के लिए एन्कोड करता है, जो या तो वैकल्पिक ट्रांसक्रिप्शन स्टार्ट साइट, या वैकल्पिक स्प्लिसिंग20द्वारा उत्पन्न होते हैं। उन लोगों में, डीएएफ-16ए, डीएएफ-16बी और डीएएफ-16डी/एफ/एच सबसे प्रचुर मात्रा में टेप हैं और वे विभिन्न एन टर्मिनी के साथ प्रोटीन के लिए एन्कोड करते हैं । आइसोफॉर्म-स्पेसिफिक म्यूटेशन और ट्रांसजीन के साथ किए गए अध्ययनों में यह सुझाव दिया गया है कि डीएएफ-16ए और डीएएफ-16डी/एफ/एच आइसोफॉर्म ्स24, 25के डाउयर विकास और उम्र को विनियमित करते हैं, जबकि डीएएफ-16बी26के दौरान फेरींजियल रिमॉडलिंग के लिए महत्वपूर्ण है । इस अध्ययन में, एसआरएस माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके, हमने आंतों के लिपिड भंडारण को विनियमित करने में डीएएफ-16 की आइसोफॉर्म विशिष्टता की जांच की। हमने पाया कि डीएएफ-16 निष्क्रियता डीएएफ-2 म्यूटेंट(चित्रा 2बी, सी)के लिपिड स्तर में वृद्धि को दबाती है। डीएएफ-2 में डीएएफ-16ए या डीएएफ-16बी आइसोफॉर्म व्यक्त करना; डीएएफ-16 डबल म्यूटेंट लिपिड के स्तर को बहाल नहीं करता है । हालांकि, डीएएफ-16डी/एफ/एच आइसोफॉर्म की अभिव्यक्ति डीएएफ-2 में लिपिड के स्तर को बहाल करने के लिए पर्याप्त है; डीएएफ-16 डीएएफ-2 एकल म्यूटेंट(चित्रा 2बी, सी)में देखे गए स्तरों तक । इन परिणामों से पता चला है कि विशेष रूप से डीएएफ-16D/F/H आइसोफॉर्म daf-2 उत्परिवर्ती कीड़े में लिपिड मेटाबोलिज्म को modulates । यह हाल ही में हुए एक अध्ययन के परिणामों के अनुरूप भी है जिसमें लिपिड भंडारण के घ्राण नियमन को डीएएफ-16D/F/H27की ट्रांसक्रिप्शनल गतिविधियों के माध्यम से मध्यस्थता की गई है ।

Figure 1
चित्रा 1: एसआरएस माइक्रोस्कोप सिस्टम का चित्रण। ऑल-इन-वन लेजर अस्थायी और स्थानिक रूप से संयुक्त पंप और स्टोक्स बीम, बिल्ट-इन इलेक्ट्रो-ऑप्टिक मॉड्यूलर (ईओएम) और लॉक-इन एम्पलीफायर के लिए संदर्भ आवृत्ति प्रदान करता है। संयुक्त बीम दूरबीन (L1 और L2) द्वारा विस्तारित है, दो रिले दर्पण (M1 और M2) द्वारा रिले और पेरिस्कोप (P1 और P2) द्वारा उठाया, और फिर माइक्रोस्कोप के स्कैनर में भेजा । संयुक्त बीम माइक्रोस्कोप में स्कैनिंग इकाई (एसयू) द्वारा स्कैन किया जाता है और नमूने पर केंद्रित होता है। संचारित प्रकाश कंडेनसर द्वारा एकत्र किया जाता है। एक फिल्टर स्टोक्स बीम को हटा देगा और पंप बीम को फोटोडिओड (पीडी) द्वारा पता लगाने के लिए छोड़ देगा। ग्रे धराशायी तीर इलेक्ट्रॉनिक्स के बीच संबंध दिखाते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: सी एलिगेंस में कम इंसुलिन सिग्नलिंग लिपिड स्टोरेज में वृद्धि की ओर जाता है। (क)एसआरएस माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके, जंगली प्रकार के आंतों के लिपिड स्तर और डीएएफ-2 म्यूटेंट कीड़े वयस्कता के दिन 1, 3, 5, 7 और 9 में मात्रा निर्धारित कर रहे हैं । जंगली प्रकार के कीड़े में, लिपिड के स्तर में समय के साथ गिरावट आती है, जबकि डीएएफ-2 म्यूटेंट 5 दिन तक लिपिड जमा करते हैं और उनके पास जंगली प्रकार के कीड़े की तुलना में लगभग 2.7 गुना अधिक लिपिड होते हैं। (B) डीएएफ-16 हटाने से डीएएफ-2 म्यूटेंट में बढ़े हुए लिपिड के स्तर को दबा दिया जाता है । डीएएफ-2 में डीएएफ-16d/f/h आइसोफॉर्म की अभिव्यक्ति बहाल; डीएएफ-16 डबल म्यूटेंट डीएएफ-2 म्यूटेंट के स्तर तक लिपिड के स्तर को बढ़ाने के लिए पर्याप्त है, जबकि डीएएफ-16ए या डीएएफ-16बी आइसोफॉर्म की अभिव्यक्ति बहाल करना नहीं है। * * पी < 0.001, एन. एस बोनफेरोनी के कई तुलना परीक्षण के साथ एक तरफा एनोवा से महत्वपूर्ण नहीं है। (ग)प्रतिनिधि एसआरएस छवियां । पीले पिक्सल उच्च लिपिड स्तर का संकेत देते हैं। मात्रात्मक आंतों का क्षेत्र धराशायी लाइनों में दिखाया गया है। स्केल बार 40 माइक्रोन है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

अनुपूरक फाइल। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

मोटापे और उससे जुड़े मेटाबोलिक विकारों के खिलाफ रक्षा में, लिपिड होगोस्टेसिस के नियामक तंत्र को बेहतर ढंग से समझने के लिए महत्वपूर्ण अनुसंधान प्रयासों को लागू किया गया है। जैविक नमूनों में लिपिड अणुओं का मात्रात्मक पता लगाने के लिए, एसआरएस माइक्रोस्कोपी द्वारा लेबल-मुक्त इमेजिंग जैव रासायनिक परख और अन्य धुंधला तरीकों के लिए एक विश्वसनीय विकल्प साबित हुआ है। हमारे समूह और अन्य लोगों ने सी एलिगेंस औरएसआरएस माइक्रोस्कोपी 12 ,18, 28 ,29, 30 ,31केउपयोग को मिलाकर लिपिड मेटाबोलिक नियमन में उपन्यास जैविक तंत्र का खुलासा किया है । इस प्रोटोकॉल में, एसआरएस माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके हमने यह दर्शाया कि कीड़े में इंसुलिन सिग्नलिंग को कम करने से कुल आंतों के लिपिड स्तर में वृद्धि होती है। हमने देखा कि वयस्कता के शुरुआती दिन 1, लिपिड डीएएफ-2 म्यूटेंट की आंत में जमा होते हैं, जिनमें इंसुलिन रिसेप्टर जीन में नुकसान-कार्य उत्परिवर्तन होता है, जबकि जंगली प्रकार के कीड़े आंतों के लिपिड स्तर में गिरावट आती है। इसके अतिरिक्त, पिछले अध्ययनों के अनुरूप23,24,हमने पाया कि डीएएफ-16 निष्क्रियता डीएएफ-2 म्यूटेंट में लिपिड भंडारण वृद्धि को पूरी तरह से दबा सकती है और विभिन्न डीएएफ-16 आइसोफॉर्म के बीच, डीएएफ-16डी/एफ/एच आइसोफॉर्मेफॉर्मे विशेष रूप से लिपिड होमोसेस्टेसिस को नियंत्रित करता है । जैसा कि पिछले अध्ययनों में सुझाव दिया गया था, डीएएफ-2 म्यूटेंट में कुल आंतों के लिपिड भंडारण स्तर में अंतर कारकों के संयोजन के कारण होने की संभावना है: डी नोवो लिपिड संश्लेषण32,लिपिड उपयोग में कमीआई 33,साथ ही कम प्रजनन, और जर्दी संचय34। सुसंगत रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी तकनीकों (एसआरएस और कारों) में हाल की प्रगति से इस तंत्र को और स्पष्ट करने में मदद मिलेगी कि आंत, हाइपोडर्मिस और ओसाइट्स सहित अलग-अलग ऊतकों में विभिन्न लिपिड भंडारण प्रकारों के नियमन में इंसुलिन सिग्नलिंग कैसे योगदान देता है।

एसआरएस माइक्रोस्कोपी का उपयोग न केवल लिपिड, बल्कि डीएनए35,आरएनए14, प्रोटीन 13और ग्लूकोज36सहित अन्य जैवअणुओंकी छवि के लिए किया गया है। यह जीव विज्ञान के कई पहलुओं जैसे सेल जीव विज्ञान, माइक्रोबायोलॉजी, कैंसर जीव विज्ञान, और विकासात्मक जीव विज्ञान11में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान करने के लिए लागू किया गया है । हाल ही में, ब्याज के अणुओं को न्यूनतम रूप से लेबल करने के लिए बायोऑर्थोगोनल टैग (जैसे, एल्किने और ड्यूटेरियम टैग) का उपयोग, पता लगाने की संवेदनशीलता और विशिष्टता को और बढ़ाया। ये न्यूनतम कंपन टैग अणु के रासायनिक गुणों को बाधित नहीं करते हैं, बल्कि विशिष्ट रासायनिक विपरीत प्रदान करते हैं, क्योंकि उनका रमन संकेत रमन स्पेक्ट्रम14,37की "मूक खिड़की" के भीतर है। संवेदनशीलता और विशिष्टता में सुधार के अलावा, सुपर-रिज़ॉल्यूशन एसआरएस इमेजिंग को प्राप्त करना भी अनुसंधान का एक रोमांचक क्षेत्र है। कई शोध समूहों को भी हाथ से आयोजित एसआरएस माइक्रोस्कोप३८बनाकर उपकरणों के आकार को कम करने में प्रयास है । इस प्रकार, बायोमेडिकल अनुसंधान के लिए एसआरएस इमेजिंग के आवेदन ने लिपिड इमेजिंग को आगे बढ़ाने के लिए तकनीकी और रासायनिक सुधारों के लिए नए स्थानों को खोल दिया है।

लिपिड क्वांटिटेशन के पारंपरिक तरीकों की तुलना में, एसआरएस माइक्रोस्कोपी के कई फायदे हैं। सबसे पहले, यह एक लेबल मुक्त तरीके से किया जाता है और यहां तक कि अगर एक लेबल का उपयोग किया जाना है, लेबल के रूप में दो परमाणुओं के रूप में छोटे हो सकता है । इसलिए, यह अन्य फ्लोरोसेंट टैगिंग और धुंधला तरीकों के रूप में फोटोब्लैचिंग समस्या से भी पीड़ित नहीं है। दूसरे, संपूर्ण जीवों का उपयोग करके लाइव इमेजिंग की क्षमता विशिष्ट मेटाबोलाइट्स29 , 39,40की गतिशीलता को ट्रैक करने में सक्षम बनाती है। अंत में, एसआरएस माइक्रोस्कोपी मल्टीप्लेक्सिंग की उच्च डिग्री की अनुमति देता है और इसलिए एक साथ अलग सेलुलर डिब्बों में कई जैव अणुओं की छवि के लिए लागू किया जा सकता है । हाइपरस्पेक्ट्रल एसआरएस/कारें माइक्रोस्कोपी कई अलग-अलग बायोमॉलिक्यूल्स की मेटाबोलिक गतिशीलता की खोज में महान भविष्य रखती है, साथ ही विभिन्न प्रकार के लिपिड स्टोरेज डिब्बों जैसे सी एलिगेंस41 या कोलेस्टेरिल एस्टर में जर्दी कण और विभिन्न स्तनधारी कोशिकाओं और ऊतकों में टैग समृद्ध लिपिड ड्रॉप्स31। दूसरी ओर, एसआरएस माइक्रोस्कोपी हार्डवेयर में उच्च लागत और पूर्ण वाणिज्यिक उपलब्धता की कमी जैसी सीमाओं का सामना कर रही है। इसके अतिरिक्त, यह बनाए रखने और प्रणाली है, जो अपने गोद लेने को जटिल कर सकते है चलाने के लिए विशेषज्ञता की आवश्यकता है । प्रकाश स्रोत और प्रणाली एकीकरण में विकास स्थिति में सुधार कर रहे हैं । फाइबर आधारित कम लागत वाले लेजर स्रोत और पूरी तरह से एकीकृत प्रणालियां व्यावसायीकरण में नए अवसर प्रदान करती हैं और भविष्य में11,42, 43में लागत को कम करने में मददकरेंगी। इसके अलावा, एसआरएस इमेजिंग की इमेजिंग गति और स्थानिक संकल्प में सुधार करने के लिए नए तकनीकी दृष्टिकोणों के बावजूद, सीमित पहचान संवेदनशीलता कम बहुतायत के मेटाबोलाइट्स की जांच करने की क्षमता में बाधा जारी रख सकती है। कुल मिलाकर, जैव चिकित्सा अनुसंधान में एसआरएस माइक्रोस्कोपी का उपयोग पिछले दशक में काफी बढ़ा है। एसआरएस इमेजिंग का पता लगाने की संवेदनशीलता, स्थानिक संकल्प और मल्टीप्लेक्सिंग क्षमता में तकनीकी सुधारों से और अधिक लाभ होगा, और अंततः जैव अणुओं, विशेष रूप से लिपिड की मात्रात्मक निगरानी में इसके उपयोग का विस्तार होगा ।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को एनआईएच ग्रांट R01AG045183 (M.C.W.), R01AT009050 (M.C.W.), R01AG062257 (M.C.W.) द्वारा समर्थित किया गया था।), DP1DK113644 (M.C.W.), मार्च ऑफ डिम्स फाउंडेशन (एम.C डब्ल्यू), वेल्च फाउंडेशन (एम.C डब्ल्यू), और HHMI अन्वेषक (M..C.W.) द्वारा । हम सी एलिगेंस उपभेदों के लिए कैनोरहैब्डिटिस जेनेटिक्स सेंटर (सीजीसी) का शुक्रिया अदा करते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
A/D converter Olympus Analog Unit
Agarose GeneMate 3119 For making agarose pads
Alignment tool - adapter Thorlabs SM1A4 For mounting the tool on scope
Alignment tool - target Thorlabs VRC2SM1 For viewing IR laser
Alignment tool - tube Thorlabs SM1L40 Length can vary
Autocorrelator (Optional) APE pulseCheck
Bandpass filter minicircuits BBP-21.4+ if modulated at 20MHz or KR Electronics 2724 if modulated at 8 MHz For signal with modulation frequency filtering
BNC cables
Dissection microscope Nikon SMZ800 For handling and picking worms for imaging
Dodecane Sigma-Aldrich 44010 Used for calibration of the SRS signal
Filter Chroma Technology 890/220 CARS For removing Stokes beam
General purpose laboratory labeling tape VWR 89097 For making agarose pads
Glass coverslips VWR 48393-106 For covering worms for imaging
Glass microscope slide VWR 16004-422 For making agarose pads
Laser scanning microscope Olympus FV3000
Lens Thorlabs L1: AC254-050-B
L2: AC254-075-B		 For beam expander
Lock-in amplifier Zurich HF2LI
Lowpass filter minicircuits BLP-1.9+ For power supply noise suppression
Mirrors Thorlabs BB1-E03 For relay and periscope
Objective Olympus UPlanSAPO 20x 0.75, UPlanSAPO 60XW 1.20
Photodiode Thorlabs FDS1010
Picosecond laser source APE picoEmerald
Power supply TEKPOWER TP1342U For photodiode, reversed 50V voltage
Sodium azide Sigma S2002 For anaesthesizing the worms
Worm picker WormStuff 59-AWP

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References

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Mutlu, A. S., Chen, T., Deng, D., Wang, M. C. Label-Free Imaging of Lipid Storage Dynamics in Caenorhabditis elegans using Stimulated Raman Scattering Microscopy. J. Vis. Exp. (171), e61870, doi:10.3791/61870 (2021).

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