Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Etikettfri bildebehandling av Lipidlagringsdynamikk i Caenorhabditis elegans ved hjelp av stimulert Raman Scattering Microscopy

Published: May 28, 2021 doi: 10.3791/61870
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2,3
1Huffington Center on Aging, Baylor College of Medicine, 2Department of Molecular and Human Genetics, Baylor College of Medicine, 3Howard Hughes Medical Institute, Baylor College of Medicine

Summary

Stimulert Raman-spredning (SRS) mikroskopi tillater selektiv, etikettfri avbildning av spesifikke kjemiske moieties, og det har effektivt blitt brukt til å bilde lipidmolekyler in vivo. Her gir vi en kort introduksjon til prinsippet om SRS-mikroskopi og beskriver metoder for bruk i avbildning av lipidlagring i Caenorhabditis elegans.

Abstract

Lipidmetabolisme er en grunnleggende fysiologisk prosess som er nødvendig for cellulær og organismehelse. Dysregulering av lipidmetabolisme fremkaller ofte fedme og mange tilknyttede sykdommer, inkludert kardiovaskulære lidelser, type II diabetes og kreft. For å fremme den nåværende forståelsen av lipid metabolsk regulering, kvantitative metoder for å nøyaktig måle in vivo lipid lagringsnivåer i tid og rom har blitt stadig viktigere og nyttig. Tradisjonelle tilnærminger for å analysere lipidlagring er semi-kvantitative for mikroskopisk vurdering eller mangler romlig-temporal informasjon for biokjemisk måling. Stimulert Raman-spredning (SRS) mikroskopi er en etikettfri kjemisk bildeteknologi som muliggjør rask og kvantitativ deteksjon av lipider i levende celler med subcellulær oppløsning. Ettersom kontrasten utnyttes av indre molekylære vibrasjoner, tillater SRS-mikroskopi også firedimensjonal sporing av lipider hos levende dyr. I løpet av det siste tiåret har SRS-mikroskopi blitt mye brukt til små molekylavbildninger i biomedisinsk forskning og overvinne de store begrensningene ved konvensjonelle fluorescerende fargings- og lipidutvinningsmetoder. I laboratoriet har vi kombinert SRS-mikroskopi med de genetiske og biokjemiske verktøyene som er tilgjengelige for den kraftige modellorganismen, Caenorhabditis elegans, for å undersøke fordelingen og heterogeniteten til lipiddråper på tvers av forskjellige celler og vev og til slutt oppdage nye bevarte signalveier som modulerer lipidmetabolismen. Her presenterer vi arbeidsprinsippene og det detaljerte oppsettet av SRS-mikroskopet og gir metoder for bruk i kvantifisering av lipidlagring ved distinkte utviklingstidspunkter av villtype og insulinsignalering mangelfull mutant C. elegans.

Introduction

Fedme har blitt et globalt helseproblem som truer en tredjedel av befolkningen rundt om i verden, og det presenterer en alvorlig medisinsk bekymring, gitt sin tilknytning til dårlig psykisk helse1 og dødelige sykdommer, inkludert diabetes2, kardiovaskulære sykdommer3 og noen typer kreft4. Studie av lipidmetabolisme er viktig for å bedre forstå de biologiske problemene bak fedme. Rask og spesifikk kvantifisering av lipidlagring innebærer påvisning av fettsyrer og deres derivater, samt sterolholdige metabolitter, med høy følsomhet og helst med romlig informasjon. Lipider er utfordrende mål å bilde fordi de mangler egen fluorescens og kan ikke lett fluorescerende merket. De fluorescerende kodene er ofte større enn lipidmolekylene, og kan derfor være kjemisk invasive og upraktiske for in vivo-applikasjoner. Etikettfri eller minimal merkingsstrategi er nødvendig for å bevare den hydrofobe strukturen til lipidmolekylene5. Den siste tidens utvikling innen bildeteknologi har skapt spennende muligheter for etikettfri avbildning av lipider i levende celler, vev og organismer.

Tradisjonelle tilnærminger for lipidlagringsanalyser i biologiske prøver inkluderer biokjemiske analyser og fargingsprotokoller med lipofile fargestoffer. Biokjemiske kvantifiseringsanalyser som involverer massespektrometri (MS) er uovertruffen i deres molekylære løsbarhet, men de krever svært store prøvemengder, og prøvepreparering tar vanligvis flere timer, noe som begrenser søknaden om sanntidsavbildning av levende systemer5. En annen stor begrensning ved disse analysene er mangelen på romlig informasjon. På den annen side gir lipofile fargestoffer som Oil Red O og Sudan Black vev og cellulær distribusjon av lipidlagringsorganeller, og sammenlignet med MS-teknikker er disse fargingsmetodene også lave i pris og enkle å utføre. Imidlertid krever disse fargingsprotokollene fiksering, noe som kan påvirke lipiddråpens hydrofobe natur, generere kunstige endringer i strukturen og resultere i inkonsekvenser mellom eksperimenter6. De tekniske vanskelighetene forbundet med biokjemiske og fargingsteknikker har ført til søket etter etikettfrie metoder for å bilde lipidmolekyler og til den raske økningen i bruken av sammenhengende Raman-spredning (CRS) mikroskopi i lipidavbildning.

Raman-effekten ble først anerkjent av Raman og Krishnan, hvor de rapporterte at ved interaksjon med en foton kan et molekyl generere spredt lys uten endring i bølgelengde (kalt Rayleigh-spredning) eller sjelden med en endret bølgelengde (kalt Raman-spredning), og denne endringen i bølgelengde er karakteristisk for de funksjonelle kjemiske gruppene imolekylet 7. Når de kjemiske bindingene i et molekyl blir begeistret for et høyere vibrasjonsenerginivå av en hendelse foton, kalt pumpefoton, blir energien til den spredte fotonen, kalt Stokes photon, lavere. Ellers kan de kjemiske bindingene nå et lavere vibrasjonsenerginivå hvis de opprinnelig er på et høyere nivå, og den spredte fotonen får energi til å være anti-Stokes foton. Frekvensforskjellen mellom hendelsen og spredte fotoner er kjent som Raman-skiftet. Hver kjemisk binding i et molekyl har et karakteristisk og kvantifiserbart Raman-skift. For eksempel har CH2-bindingen et Raman-skifte på 2845 cm-1, som er rikelig i fettsyrekjeder8. Dette spontane Raman-signalet er generelt veldig svakt, noe som i stor grad har begrenset bildehastigheten i konvensjonell spontan Raman-mikroskopi. Gjennom årene har ulike tilnærminger blitt utviklet for å øke bildehastigheten og følsomheten til spontan Raman-mikroskopi. Sammenhengende Raman spredning mikroskopi, inkludert sammenhengende Anti-Stokes Raman Scattering (CARS) mikroskopi og Stimulert Raman Scattering (SRS) mikroskopi, er den nyeste fremgangen. CARS og SRS har litt forskjellige arbeidsprinsipper, men begge er etikettfrie teknikker som har live avbildningsevne, kan gi romlig og tidsmessig informasjon om lipidlagringsdynamikk, og krever bare liten prøvestørrelse. CARS mikroskopi lider av ikke-resonansbakgrunn, som kommer fra ulike ikke-lineære prosesser, og CARS-signaler har også ikke-lineær forhold til molekylkonsentrasjonen, som sammen kompliserer kvantifiseringsprosessen9. I motsetning til CARS mikroskopi genererer SRS-mikroskopi ikke ikke-resonante bakgrunnssignaler og tilbyr lineær avhengighet av konsentrasjonen av interessemolekylet. Dermed er for tiden SRS-mikroskopi mer brukt til lipidavbildning.

Ved SRS-mikroskopi kan de svake spontane Raman-signalene forsterkes når de forsterkes av to synkroniserte laserstråler med frekvensforskjellen som samsvarer med vibrasjonsfrekvensen for kjemisk binding. Molekylet vil oppleve en forbedret overgang til en spent tilstand på grunn av sammenhengende eksitasjon. Som et resultat økes frekvensen av Stokes fotongenerasjon. Følgelig øker intensiteten til den overførte "Stokes" strålen (stimulert Raman gain, SRG) og intensiteten til den overførte "pumpe" strålen minker (stimulert Raman tap, SRL). Påvisning av SRG- eller SRL-signaler ligger til grunn for SRS-mikroskopiavbildning av molekyler med spesifikke kjemiske bindinger10. Hvis frekvensforskjellen mellom de to laserstrålene ikke samsvarer med vibrasjonsfrekvensen til den kjemiske bindingen innenfor et molekyl av interesse, vil verken SRG- eller SRL-signaler bli generert. Bildehastigheten til SRS-mikroskopi er rundt 2 μsec per piksel eller 1 sekund per ramme, noe som er mye raskere enn spontan Raman-mikroskopi11. Typisk lateral oppløsning for SRS mikroskopi er diffraksjon begrenset og rundt 300 nm. I tillegg tillater de to-foton optiske prosessene til SRS-mikroskopi volumetrisk 3D-avbildning av relative tykke vevsprøver, og bildedybden kan nå 300-500 μm. Totalt sett presenterer SRS-mikroskopi en effektiv, etikettfri bildeteknikk for å oppdage spesifikke biomolekyler, spesielt lipider.

Lipiddråper er enkeltmembranorganeller, som er det viktigste cellulære lagringsstedet for nøytrale lipider, inkludert triacylglyseroler (TAG) og kolesterolestere (CE). CH2-bindinger i fettsyrekjedene til disse lipidmolekylene genererer sterke SRS-signaler på 2845 cm-1 når de er begeistret8, og muliggjør dermed deteksjon og kvantifisering av lagringslipidnivåer i intakte celler, vevsseksjoner og til og med hele organismer12,13,14,15. Spesielt er C. elegans nyttige for lipidavbildningsstudier på grunn av deres gjennomsiktighet. Som pattedyr lagrer C. elegans også lipider i lipiddråper, og syntesen og nedbrytningsveiene til lipidmolekyler er høyt bevart16. I denne protokollen vil vi gi arbeidsprinsippet for SRS-mikroskopi, det grunnleggende oppsettet og beskrive metodene for bruk i lipidavbildning i C. elegans.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Instrumental oppsett for stimulert Raman scattering mikroskopi

MERK: SRS-mikroskopisystemet er bygget på en picosecond-laser med pumpeintegrert optisk parametrisk oscillator og et konfokalt laserskanningsmikroskop. Oscillatoren gir to picosecond pulstog, inkludert en Stokes-stråle på 1064 nm og en pumpestråle som kan justeres mellom 700 og 990 nm. Tidsmessig og romlig overlapping av de to bjelkene oppnås inne i laseren. En innebygd elektrooptisk modulator (EOM) er designet spesielt for SRS-mikroskopi. Denne protokollen vil fokusere på å koble laseren til mikroskopet, og den daglige driften av dette systemet (Figur 1). Konfigurasjonen av et SRS-mikroskopsystem utvikler seg det siste tiåret. Det skal bemerkes at følgende beskrivelse bare representerer en av de flere konfigurasjonene.

  1. Fôring av laserstråler inn i mikroskopet
    1. Sett opp periskopet for å løfte strålen fra picosecond lyskildeutgang til IR laserinngangsport på skanneren til mikroskopet.
      FORSIKTIG: Les lasersystemhåndboken før bruk og ta alle nødvendige forholdsregler fordi nær infrarød stråling generert av dette klasse IV-lasersystemet kan forårsake alvorlig skade på øyne og hud. Fullfør opplæringene som kreves av de institusjonelle miljøsikkerhetsavdelingene. Bruk vernebriller og labjakke med mansjett ermer.
    2. Først setter du pumpestrålen på 750 nm og senker laserstrømmen til 50 mW, som kan inspiseres visuelt, noe som tilsier justeringen. Bruk deretter en bjelkeforsterking (figur 1, L1 og L2) for å justere strålediameteren slik at den passer til ryggåpningen til mikroskopmålene. Bruk to reléspeil (figur 1, M1 og M2) til å lede laserstrålen til periskopet (figur 1, P1 og P2). Periskopet vil løfte strålen til høyden på skanneråpningen og fungere som styrespeil for justering også.
    3. Still knottene på periskopet i midten av innstillingsområdet og velg startposisjon og vinkel på hvert speil slik at laserstrålen treffer midten av speilet, omtrent.
    4. Utfør den grove justeringen ved hjelp av en tom port på det objektive revolveren, og plasser kraftmålersonden for å måle kraften til det overførte lyset. Still inn skanneren på mikroskopet ved høyeste zoom (50x), og mål deretter kraften til det overførte lyset med det fokuserte laserstrålepunktet. Optimaliser knottene på hvert speil, M1 og M2, iterativt for å oppnå den høyeste overførte laserkraften.
    5. Utfør finjusteringen med justeringsverktøyet. Sett fluorescensmåljusteringshetten på det tomme objektivsetet og juster knottene på M1 for å midtstille stedet. Deretter introduserer du forlengelsesrøret for målet og justerer knottene på M2 for å midtstille stedet.
    6. Gjenta trinn 1.1.4 og 1.1.5 til bjelken sentrerer målet i begge posisjoner.
  2. Tilkobling av deteksjon og elektronikk
    1. Sett opp SRS-deteksjonsmodulen. Plasser en strålesplitterkuber etter kondensatoren for å lede den overførte laseren til fotodiodemodulen. Modulen inkluderer et teleskop for å videresende og endre strålestørrelsen slik at den passer til fotodiodens aktive område, samt et optisk filter for å fjerne den modulerte Stokes-strålen og la pumpestrålen gå gjennom for demodulering.
    2. Sett opp elektronikktilkoblingen (Figur 1). Intensiteten til Stokes-strålen er modulert av en innebygd EOM på 20 MHz inne i picosecond justerbar laser. Modulasjonsfrekvensutgangen fra laseren legges inn i låseforsterkeren som referansefrekvens for demodulering. Før fotodiodens utgangssignal inn i låseforsterkeren for demodulering av SRL.
      MERK: En-boks lasersystemer kan oppgraderes og dermed deres spesifikasjoner kan variere på grunn av ulike produksjonsdato. Den forrige versjonen av picosecond justerbart lasersystem, brukt i denne protokollen, har en Stokes-stråle på 1064 nm, men den nyeste versjonen har en Stokes-stråle på 1031 nm. Modulasjonsfrekvensen til EOM som brukes i denne protokollen er tilpasset 8 MHz, men standard modulasjonsfrekvens for det nylige systemet kan være 10 eller 20 MHz.
    3. Til slutt, mate innlåsingsforsterkerutgangen inn i mikroskopets analoge boks for å konvertere elektrisk analogt signal til digitalt signal. Systemet skal være klart til å behandle SRS-signalet.
  3. Optimalisere bildeforholdene
    1. Lag en kjemisk prøve for systemjustering. Bruk for eksempel dodecane for å optimalisere mikroskopet, fordi dodecane har et veldig sterkt SRS-signal fra C-H-bindingene. Bruk en sikker forsegling for å lage et minikammer; sett 5 μL dodecane og dekk den med en dekslelip.
      MERK: Bytt ut dodekanprøven når den ser uklar ut eller presenterer rusk, med en ny prøve som kan brukes til justering i 2–3 måneder.
    2. Plasser prøven på mikroskopstadiet. Fokuser riktig på væskedråpen. Det kan gjøres raskere ved å lete etter kanten av dodecane pad. Juster kondensatoren for Kohler-belysning.
    3. Angi bildeparameterne. Kontroller om forsinkelsesfasen er på de riktige tallene. Sett pumpestrålebølgelengden til 795,8 nm. Bruk et IR-sensorkort og en IR-visningør til å kontrollere om pumpestrålebanen fremdeles er riktig.
    4. Sett pumpstrålens kraft til 200 mW og Stokes-strålen til 400 mW på picosecond-systemets kontrollpanel.
      MERK: Lasergjennomstrømningene fra laserutgang til stolpemål for de to bjelkene er ca. 25 % for pumpen og 14 % for Stokes for dette systemoppsettet. Derfor er en post objektiv kraft av pumpestråle ca 50 mW og for Stokes stråle er den rundt 56 mW. Pulsbredden til det nylige picosecond-lasersystemet har endret seg fra 6 ps til 2 ps, derfor bør den påførte laserkraften være enda lavere.
    5. Sett låseforsterkerforsterkningen maksimalt. Åpne lukkeren for både bjelkene og hovedlukkeren på laseren.
    6. Skann eksemplet og kontroller bildet på dataskjermen. Endre visningsmodus til Hi-Lo i bildebehandlingsprogramvaren. Juster området for å se en metning på ~50 %. Kontroller om metningen er midtstilt i bildet. Hvis ikke, juster forsiktig styrespeilene, M1 og M2, for å maksimere bildeintensiteten og for å midtstille toppintensiteten.
    7. Finjuster forsinkelsesfasen og finn maksimal SRS-signalintensitet fra dodekanprøven. Systemet er da klart til bruk.

2. Fremstilling av C. elegansprøver for SRS mikroskopiavbildning

MERK: Som modellorganismer har Caenorhabditis elegans vist seg å være svært nyttig for flere avbildningsteknikker. De er hele kroppen gjennomsiktige, derfor kan ulike vev avbildes i det intakte dyret uten behov for disseksjon. I C. elegans lagres nøytrale lipider i lipiddråper som ligger i tarmen, som består av 20 epitelceller som ligger bisymmetrisk rundt tarmlumen16. Hypodermale celler og oocytter lagrer også lipider. Den viktigste formen for lagring lipider i C. elegans lipiddråper er triacylglyseroler (TAGs)17, som genererer sterke SRS-signaler på grunn av overflod av CH2-bindinger tilstede i fettsyrekjedene. Denne delen vil fokusere på hvordan du forbereder C. elegans prøver for SRS mikroskopi avbildning og kvantifisering av deres totale intestinal lipid lagringsnivåer.

  1. Forberedelse av bildelysbildene
    1. Først må du forberede 2% agarose løsning i destillert H2O, og sørg for at alle agarose smelter før du forbereder agarose pads.
    2. Legg til en dråpe varm 2 % agarose på et tomt lysbilde (ca. 100 μL) som plasseres mellom støttelysbilder med to lag laboratoriebånd, og plasser raskt et nytt lysbilde oppå det første lysbildet. Trykk forsiktig for å lage en tynn, til og med agarose pad.
    3. Sett disse lysbildene til side i lukket posisjon og ikke skill dem før ormer er klare til å monteres. Forbered nye lysbilder før hver bildeøkt, da padsene tørker etter 1 dag.
      MERK: Bruk flerbrønns bildekamre, hvis du forestiller deg flere ormer i genetiske skjermer med høy gjennomstrømning18. Bruk live bildeoppsett til å bilde romlig-temporal dynamikk av lipid metabolisme gjennom utvikling og aldring19.
  2. Montering av ormene
    1. Forbered bedøvelsesmiddelet ved å tilsette natriumazid eller levamisol i M9-bufferen til den endelige konsentrasjonen på henholdsvis 100 mM eller 1 mM.
      MERK: Bruk levamisol hvis ormene må gjenvinnes etter avbildning for genotyping etter genetiske skjermer.
      FORSIKTIG: Flere bedøvelsesmidler, inkludert natriumazid og levamisol, er skadelige ved innånding. Bruk vernehansker og klær, samt bruk en kjemisk avtrekkshette når du forbereder disse arbeidsløsningene.
    2. Plasser en dråpe bedøvelsesmiddel til en deksle (ca. 4–5 μL i 10–20 ormer).
      MERK: Juster mengden anestesimiddel i henhold til ormenummeret for å holde ormene så nær hverandre som mulig. Hvis du bruker for mye væske for få ormer, kan ormene spre seg på agaroseputen.
    3. Velg ormene som skal avbildes under disseksjonsmikroskopien og overfør dem til anestesimiddeldråpen. Når alle ormene er lagt til i dråpen, flytter du dem rundt ved hjelp av ormevelgeren og kontrollerer at de ikke overlapper hverandre.
    4. Skill glasssklier (fra trinn 2.1) uten å perturere agaroseputen.
    5. Dekk ormedråpen med glasssklie som har agaroseputen. Pass på at agaroseputen vender mot ormene. Alternativt kan den bedøvende aldringsdråpen også legges på agaroseputen, og ormer kan dekkes med dekslene.
    6. Til slutt markerer du plasseringen av ormene ved hjelp av en permanent markør på glasssklie.

3. Bildeanskaffelse og analyse

  1. Henter bildene ved hjelp av SRS-mikroskopsystemet.
    1. Før du ser på et eksempel, må du bestemme bildeparameterne og bekrefte SRS-signaler (som forklart i protokoll 1).
    2. Monter gliden med dekslene vendt mot objektivet. Slå på den lyse feltlyskilden og rett den til okularet for å finne ormene.
      MERK: Bruk en 20x objektiv linse for å avbilde lipidlagringen i hele tarmen. Vurder å bruke en 60x objektiv for å bilde hypodermal fett lagring eller å kvantifisere lipid dråpe størrelse / tall.
    3. Sett ormene i fokus og juster kondensatorposisjonen tilsvarende.
    4. Slå av den lyse feltlyskilden og bytt til laserskanningsenheten. Begynn å skanne den første ormen med rask skannehastighet (f.eks. 512 x 512 piksler), og juster det fine fokuset for å finne interesseområdet. For at den første prøven skal avbildes, justerer du laserkraftene til nivået der SRS-signaler ikke er mettet.
    5. Bytt til en lavere skannehastighet (f.eks. 2 μs/pixel) og høyere oppløsning (f.eks. 1024 x 1024 piksler) for å få SRS-bildet.
      MERK: Hold laserkreftene konstante for hver prøve som skal avbildes under bildebehandlingsøkten.
    6. Lagre SRS-bildet i ønsket format som muliggjør høy oppløsning (for eksempel en .tiff fil). Avhengig av bildeprogramvaren og oppsettet som brukes, lagrer du plasseringen til den første ormen før du går videre til neste.
    7. Fullstendig bildebehandling av alle ormer som ble montert på lysbildet. Slå av lukkeren for å blokkere laserstrålene. Ikke slå av laserkilden før alle prøvene er avbildet.
    8. Fjern lysbildet før du plasserer neste eksempellysbilde. Gjenta trinn 3.1.2–3.1.7.
    9. Når alle prøvene er avbildet, setter du laserkilden i standby og slår av det tilknyttede utstyret, inkludert forsterkeren, detektoren, mikroskopet og datamaskinen.
  2. Analyse av bilder ved hjelp av ImageJ
    1. Åpne bildefilene (vanligvis .tiff) som skal kvantifiseres i ImageJ, ved å merke filene og dra og slippe dem i ImageJ-vinduet. Last ned de riktige ImageJ-plugin-modulene hvis du bruker bestemte Olympus-mikroskopformater (for eksempel OIB-filer).
    2. Velg egenskapene som skal analyseres (Analyser > Angi mål). Hvis du vil ha totalt lagringsantall for lipid, velger du Areal- og Maksimumsgrå verdi og Middelverdi (grå).
    3. Bruk markeringsverktøyet for mangekant og omrisset området i ormetarmen som skal kvantifiseres. Hvis du vil måle parameterne som er valgt i trinn 3.2.2, klikker du Analyser > mål. Et nytt vindu med måleresultatene dukker opp. Gjenta dette trinnet for alle åpne bilder.
    4. Velg målene for alle ormene i en gitt genotype, og kopier/lim inn resultatene i et nytt regneark. Gjenta trinn 3.2.1–3.2.4 for alle genotypene i samme bildeøkt.
    5. Velg et område i nærheten av ormen som ikke har noe SRS-signal, for å kvantifisere som bakgrunn. Pass på at området som er valgt for bakgrunnsmåling, ikke inneholder bakterier eller rusk som også kan gi et SRS-signal.
    6. Trekk den gjennomsnittlige grå verdien i bakgrunnen fra målene for hver enkelt orm. Beregn gjennomsnitts- og standardavviket for bakgrunnen trukket gjennomsnittlige gråverdier fra alle ormene i en gitt genotype/testgruppe. Normaliser denne verdien til gjennomsnittet av kontrollgruppen.
    7. Til slutt utfører du riktig statistisk analyse ved hjelp av den gjennomsnittlige grå verdien som et mål for lipidnivåer i hver orm. Bruk vanligvis Student t-test for to grupper og bruk enveis ANOVA med en passende multisammenligningstest for mer enn to grupper.
      MERK: Når du velger bilder for figurpresentasjon, må du sørge for at de valgte bildene har samme pikselintensitetsfordeling. Angi lysstyrken og kontrasten til de samme verdiene for alle bildene i samme figur (Bilde > Juster > Lysstyrke og kontrast).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Insulinsignalering er en viktig endokrine vei som påvirker utvikling, reproduksjon, levetid og metabolisme. I ormer består insulinsignalering av ca. 40 insulinlignende peptidligaler, insulinlignende vekstfaktorreseptor ortolog DAF-2, nedstrøms PI3K/AKT kinase kaskade og FoxO transkripsjonsfaktor ortholog, DAF-1620. daf-2 mutanter, som mangler insulinreseptoren, har flere lipiddråper i tarmen, ormen lipid lagringsvev21,22. Ved hjelp av SRS-mikroskopi kvantifiserte vi tarmlipidnivåene i alderssynkroniserte wild-type ormer og daf-2 mutanter under voksen alder. I samsvar med de forrige resultatene fant vi ut at daf-2 mutanter har høyere lipidnivåer23,24 (figur 2A). Vi observerte en nedgang i lipidnivåer i ville ormer som starter dag 1 til dag 9 i voksen alder (figur 2A). Imidlertid økte lipidnivåene i daf-2 mutanter til de var 5 dager gamle, og da var de konstante rundt nivået på 2,5-3,0 ganger høyere enn wild-typen (Figur 2A).

DAF-16, C. elegans FoxO transkripsjonsfaktor ortholog, orkestrerer de fleste nedstrømsfunksjonene til insulinsignaleringsveien. daf-16 nullmutasjoner undertrykker flere fenotyper observert hos daf-2 mutanter, inkludert fettakkumulering. daf-16 genomiske locus koder for 8 forskjellige transkripsjoner (daf-16a-h), som genereres av enten alternativ transkripsjon startside, eller alternativ skjøting20. Blant disse er daf-16a, daf-16b og daf-16d / f / t de mest tallrike transkripsjonene, og de koder for proteiner med forskjellige N termini. Studier med isoformspesifikke mutasjoner og transgenes antydet at DAF-16A og DAF-16D / F / H isoformer regulerer dauerutvikling og levetid24,25, mens DAF-16B er viktig for farynngeal ombygging under dauerformasjonen26. I denne studien, ved hjelp av SRS-mikroskopi, undersøkte vi isoformspesifisiteten til DAF-16 i regulering av intestinal lipidlagring. Vi fant at daf-16 inaktivering undertrykker økningen i lipidnivåer av daf-2 mutanter (Figur 2B, C). Uttrykker daf-16a eller daf-16b isoform i daf-2; daf-16 doble mutanter gjenoppretter ikke lipidnivåene. Uttrykket av daf-16d/f/h isoform er imidlertid tilstrekkelig til å gjenopprette lipidnivåene i daf-2; daf-16 til nivåene observert i daf-2 enkeltmutanter (Figur 2B, C). Disse resultatene viste at spesielt DAF-16D / F / H isoformer modulerer lipidmetabolisme i daf-2 mutant ormer. Dette er også i samsvar med resultatene fra en nylig studie som viste olfaktorisk regulering av lipidlagring, formidles også gjennom transkripsjonsaktivitetene til DAF-16D / F / H27.

Figure 1
Figur 1: Illustrasjon av SRS-mikroskopsystemet. Alt-i-ett-laseren gir timelig og romlig kombinert pumpe- og Stokes-bjelker, innebygd elektrooptisk modulator (EOM) og referansefrekvens for innlåsingsforsterker. Den kombinerte strålen utvides av teleskopet (L1 og L2), videreformidlet av to reléspeil (M1 og M2) og løftes av periskopet (P1 og P2), og sendes deretter inn i mikroskopets skanner. Den kombinerte strålen skannes av skanneenheten (SU) i mikroskopet og fokuserer på prøven. Det overførte lyset samles opp av kondensatoren. Et filter vil fjerne Stokes-strålen og la pumpestrålen bli oppdaget av fotodioden (PD). De grå stiplede pilene viser forbindelsen mellom elektronikken. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Redusert insulinsignalering i C. elegans fører til økt lipidlagring. (A) Bruk av SRS-mikroskopi, intestinal lipidnivåer av villtype og daf-2 mutanter ormer kvantifiseres i dag 1, 3, 5, 7 og 9 i voksen alder. I ville ormer avtar lipidnivåene over tid, mens daf-2 mutanter akkumulerer lipider til dag 5 og de har ca 2,7 ganger flere lipider sammenlignet med wild-type ormer. (B) daf-16 sletting undertrykker de økte lipidnivåene i daf-2 mutanter. Gjenopprette uttrykk for daf-16d / f / t isoform i daf-2; daf-16 doble mutanter er tilstrekkelig til å øke lipidnivået til daf-2 mutanter nivåer, mens gjenopprette uttrykk for daf-16a eller daf-16b isoforms er ikke. *** p < 0.001, n.s. ikke signifikant av enveis ANOVA med Bonferronis flere sammenligningstest. (C) Representative SRS-bilder. Gule bildepunkter angir høyere lipidnivåer. Kvantifisert tarmområde er vist i stiplede linjer. Skala bar er 40 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tilleggsfil. Klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Til forsvar mot fedme og tilhørende metabolske forstyrrelser, har viktig forskningsinnsats blitt implementert for bedre å forstå reguleringsmekanismene til lipid homeostase. For kvantitativ deteksjon av lipidmolekyler i biologiske prøver har etikettfri avbildning av SRS-mikroskopi vist seg å være et pålitelig alternativ til biokjemiske analyser og andre fargingsmetoder. Vår gruppe og andre har avslørt nye biologiske mekanismer i lipid metabolsk regulering ved å kombinere bruk av C. elegans og SRS mikroskopi12,18,28,29,30,31. I denne protokollen, ved hjelp av SRS-mikroskopi, viste vi at nedregulerende insulinsignalering i ormer fører til en økning i totale intestinale lipidnivåer. Vi observerte at fra og med dag 1 av voksen alder akkumuleres lipider i tarmen til daf-2 mutanter, som har tap av funksjonmutasjon i insulinreseptorgenet, mens i ville ormer faller tarmlipidnivåene. I tillegg, i samsvar med tidligere studier23,24, fant vi at daf-16 inaktivering fullt ut kan undertrykke lipidlagringsøkningen i daf-2 mutanter og blant de forskjellige daf-16 isoformene, daf-16d / f / h isoform regulerer spesielt lipid homeostase. Som tidligere studier antydet, er forskjellen i totale tarmlipidlagringsnivåer i daf-2 mutanter sannsynligvis på grunn av en kombinasjon av faktorer: økt de novo lipidsyntese32, redusert lipidutnyttelse33, samt redusert reproduksjon og eggeplommeakkumulering34. Nylige fremskritt innen sammenhengende Raman spektroskopi teknikker (SRS og CARS) ville bidra til å ytterligere belyse mekanismene for hvordan insulin signalering bidrar til regulering av ulike lipid lagringstyper i distinkte vev, inkludert tarmen, hypodermis og oocytter.

SRS-mikroskopi har blitt brukt til å avbilde ikke bare lipider, men også andre biomolekyler, inkludert DNA35, RNA14, proteiner13og glukose36. Det er implementert for å gi viktig innsikt i mange aspekter av biologi som cellebiologi, mikrobiologi, kreftbiologi og utviklingsbiologi11. Mer nylig, bruk av bioortogonale koder (f.eks. alkyne- og deuteriumkoder), for minimalt å merke molekylene av interesse, ytterligere forbedret deteksjonsfølsomheten og spesifisiteten. Disse minimale vibrasjonsmerkene forstyrrer ikke molekylets kjemiske egenskaper, men gir spesifikk kjemisk kontrast, da deres Raman-signal er innenfor det "stille vinduet" iRaman-spekteret 14,37. I tillegg til å forbedre følsomhet og spesifisitet, er det også et spennende forskningsområde å oppnå SRS-bildebehandling med superoppløsning. Flere forskningsgrupper har også en innsats for å minimere utstyrsstørrelsen ved å lage håndholdt SRS mikroskop38. Dermed har anvendelsen av SRS-avbildning til biomedisinsk forskning åpnet nye arenaer for teknologiske og kjemiske forbedringer for å fremme lipidavbildning.

Sammenlignet med tradisjonelle metoder for lipidmengde, har SRS mikroskopi flere fordeler. Først av alt utføres den på en etikettfri måte, og selv om en etikett må brukes, kan etiketten være så liten som to atomer. Derfor lider det heller ikke av fotobleaching problemet som andre fluorescerende merking og farging metoder. For det andre gjør evnen til levende avbildning ved hjelp av hele organismer det mulig å spore dynamikken i spesifikke metabolitter29,39,40. Til slutt tillater SRS-mikroskopi høyere grad av multipleksing og kan derfor implementeres for å avbilde flere biomolekyler i forskjellige cellulære rom samtidig. Hyperspektral SRS / CARS mikroskopi har stor fremtid i å utforske metabolsk dynamikk i flere distinkte biomolekyler, samt forskjellige typer lipidlagringsrom som eggeplommepartikler i C. elegans41 eller kolesterylstere og TAG rike lipiddråper i forskjellige pattedyrceller og vev31. På den annen side står SRS-mikroskopi overfor begrensninger som høye kostnader i maskinvare og mangel på full kommersiell tilgjengelighet. I tillegg krever det ekspertise for å vedlikeholde og kjøre systemet, noe som kan komplisere innføringen. Utviklingen i lyskilde- og systemintegrasjon forbedrer situasjonen. Fiberbasert lavkostnads laserkilde og fullt integrerte systemer gir nye muligheter innen kommersialisering og vil bidra til å redusere kostnadene i fremtiden11,42,43. I tillegg, til tross for de nye teknologiske tilnærmingene for å forbedre bildehastigheten og romlige oppløsningen av SRS-avbildning, kan den begrensede deteksjonsfølsomheten fortsette å hindre evnen til å sondere metabolitter med lav overflod. Samlet sett har bruken av SRS-mikroskopi i biomedisinsk forskning vokst enormt det siste tiåret. SRS-avbildning vil ytterligere dra nytte av de teknologiske forbedringene i deteksjonsfølsomhet, romlig oppløsning og multipleksingsevne, og til slutt utvide bruken i kvantitativ overvåking av biomolekyler, spesielt lipider.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av NIH tilskudd R01AG045183 (M.C.W.), R01AT009050 (M.C.W.), R01AG062257 (M.C.W.), R01AG062257 (M.C.W.), DP1DK113644 (M.C.W.), March of Dimes Foundation (M.C.W.), Welch Foundation (M.C.W.), og av HHMI-etterforsker (M.C.W.). Vi takker Caenorhabditis Genetics Center (CGC) for C. elegans stammer.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
A/D converter Olympus Analog Unit
Agarose GeneMate 3119 For making agarose pads
Alignment tool - adapter Thorlabs SM1A4 For mounting the tool on scope
Alignment tool - target Thorlabs VRC2SM1 For viewing IR laser
Alignment tool - tube Thorlabs SM1L40 Length can vary
Autocorrelator (Optional) APE pulseCheck
Bandpass filter minicircuits BBP-21.4+ if modulated at 20MHz or KR Electronics 2724 if modulated at 8 MHz For signal with modulation frequency filtering
BNC cables
Dissection microscope Nikon SMZ800 For handling and picking worms for imaging
Dodecane Sigma-Aldrich 44010 Used for calibration of the SRS signal
Filter Chroma Technology 890/220 CARS For removing Stokes beam
General purpose laboratory labeling tape VWR 89097 For making agarose pads
Glass coverslips VWR 48393-106 For covering worms for imaging
Glass microscope slide VWR 16004-422 For making agarose pads
Laser scanning microscope Olympus FV3000
Lens Thorlabs L1: AC254-050-B
L2: AC254-075-B		 For beam expander
Lock-in amplifier Zurich HF2LI
Lowpass filter minicircuits BLP-1.9+ For power supply noise suppression
Mirrors Thorlabs BB1-E03 For relay and periscope
Objective Olympus UPlanSAPO 20x 0.75, UPlanSAPO 60XW 1.20
Photodiode Thorlabs FDS1010
Picosecond laser source APE picoEmerald
Power supply TEKPOWER TP1342U For photodiode, reversed 50V voltage
Sodium azide Sigma S2002 For anaesthesizing the worms
Worm picker WormStuff 59-AWP

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Luppino, F. S., et al. Overweight, obesity, and depression: a systematic review and meta-analysis of longitudinal studies. Archives of General Psychiatry. 67 (3), 220-229 (2010).
  2. Eckel, R. H., et al. Obesity and type 2 diabetes: what can be unified and what needs to be individualized. Diabetes Care. 34 (6), 1424-1430 (2011).
  3. Poirier, P., et al. Obesity and cardiovascular disease: pathophysiology, evaluation, and effect of weight loss. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 26 (5), 968-976 (2006).
  4. Bhaskaran, K., et al. Body-mass index and risk of 22 specific cancers: a population-based cohort study of 5.24 million UK adults. Lancet. 384 (9945), 755-765 (2014).
  5. Shen, Y., Hu, F., Min, W. Raman imaging of small biomolecules. Annual Review of Biophysics. 48, 347-369 (2019).
  6. Daemen, S., van Zandvoort, M., Parekh, S. H., Hesselink, M. K. C. Microscopy tools for the investigation of intracellular lipid storage and dynamics. Molecular Metabolism. 5 (3), 153-163 (2016).
  7. Syed, A., Smith, E. A. Raman imaging in cell membranes, lipid-rich organelles, and lipid bilayers. Annual Review of Analytical Chemistry. 10 (1), Palo Alto, Calif. 271-291 (2017).
  8. Thomas, G. J. Raman spectroscopy of protein and nucleic acid assemblies. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 28, 1-27 (1999).
  9. Evans, C. L., Xie, X. S. Coherent anti-stokes Raman scattering microscopy: chemical imaging for biology and medicine. Annual Review of Analytical Chemistry. 1, Palo Alto, Calif. 883-909 (2008).
  10. Freudiger, C. W., et al. Label-free biomedical imaging with high sensitivity by stimulated Raman scattering microscopy. Science. 322 (5909), 1857-1861 (2008).
  11. Hu, F., Shi, L., Min, W. Biological imaging of chemical bonds by stimulated Raman scattering microscopy. Nature Methods. 16 (9), 830-842 (2019).
  12. Wang, M. C., Min, W., Freudiger, C. W., Ruvkun, G., Xie, X. S. RNAi screening for fat regulatory genes with SRS microscopy. Nature Methods. 8 (2), 135-138 (2011).
  13. Wei, L., Yu, Y., Shen, Y., Wang, M. C., Min, W. Vibrational imaging of newly synthesized proteins in live cells by stimulated Raman scattering microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (28), 11226-11231 (2013).
  14. Wei, L., et al. Live-cell imaging of alkyne-tagged small biomolecules by stimulated Raman scattering. Nature Methods. 11 (4), 410-412 (2014).
  15. Ramachandran, P. V., Mutlu, A. S., Wang, M. C. Label-free biomedical imaging of lipids by stimulated Raman scattering microscopy. Current Protocols in Molecular Biology. 109, 31 (2015).
  16. Srinivasan, S. Regulation of body fat in Caenorhabditis elegans. Annual Review of Physiology. 77, 161-178 (2015).
  17. Vrablik, T. L., Petyuk, V. A., Larson, E. M., Smith, R. D., Watts, J. L. Lipidomic and proteomic analysis of Caenorhabditis elegans lipid droplets and identification of ACS-4 as a lipid droplet-associated protein. Biochimca Et Biophysica Acta. 1851 (10), 1337-1345 (2015).
  18. Yu, Y., Mutlu, A. S., Liu, H., Wang, M. C. High-throughput screens using photo-highlighting discover BMP signaling in mitochondrial lipid oxidation. Nature Communications. 8 (1), 865 (2017).
  19. Kelley, L. C., et al. Live-cell confocal microscopy and quantitative 4D image analysis of anchor-cell invasion through the basement membrane in Caenorhabditis elegans. Nature Protocols. 12 (10), 2081-2096 (2017).
  20. Murphy, C. T., Hu, P. J. Insulin/insulin-like growth factor signaling in C. elegans. WormBook. , 1-43 (2013).
  21. Shi, X., et al. Regulation of lipid droplet size and phospholipid composition by stearoyl-CoA desaturase. Journal of Lipid Research. 54 (9), 2504-2514 (2013).
  22. Watts, J. L., Ristow, M. Lipid and carbohydrate metabolism in Caenorhabditis elegans. Genetics. 207 (2), 413-446 (2017).
  23. Kimura, K. D., Tissenbaum, H. A., Liu, Y., Ruvkun, G. daf-2, an insulin receptor-like gene that regulates longevity and diapause in Caenorhabditis elegans. Science. 277 (5328), 942-946 (1997).
  24. Kwon, E. S., Narasimhan, S. D., Yen, K., Tissenbaum, H. A. A new DAF-16 isoform regulates longevity. Nature. 466 (7305), 498-502 (2010).
  25. Chen, A. T., et al. Longevity genes revealed by integrative analysis of isoform-specific daf-16/FoxO mutants of Caenorhabditis elegans. Genetics. 201 (2), 613-629 (2015).
  26. Lee, R. Y., Hench, J., Ruvkun, G. Regulation of C. elegans DAF-16 and its human ortholog FKHRL1 by the daf-2 insulin-like signaling pathway. Current Biology. 11 (24), 1950-1957 (2001).
  27. Mutlu, A. S., Gao, S. M., Zhang, H., Wang, M. C. Olfactory specificity regulates lipid metabolism through neuroendocrine signaling in Caenorhabditis elegans. Nature Communications. 11 (1), 1450 (2020).
  28. Chen, A. J., et al. Fingerprint Stimulated Raman Scattering imaging reveals retinoid coupling lipid metabolism and survival. Chemphyschem: a European Journal of Chemical Physics and Physical Chemistry. 19 (19), 2500-2506 (2018).
  29. Li, X., et al. Quantitative imaging of lipid synthesis and lipolysis dynamics in Caenorhabditis elegans by Stimulated Raman Scattering microscopy. Analytical Chemistry. 91 (3), 2279-2287 (2019).
  30. Lin, C. J., Wang, M. C. Microbial metabolites regulate host lipid metabolism through NR5A-Hedgehog signalling. Nature Cell Biology. 19 (5), 550-557 (2017).
  31. Fu, D., et al. In vivo metabolic fingerprinting of neutral lipids with hyperspectral stimulated Raman scattering microscopy. Journal of the American Chemical Society. 136 (24), 8820-8828 (2014).
  32. Perez, C. L., Van Gilst, M. R. A 13C isotope labeling strategy reveals the influence of insulin signaling on lipogenesis in C. elegans. Cell Metabolism. 8 (3), 266-274 (2008).
  33. Elle, I. C., Rodkaer, S. V., Fredens, J., Faergeman, N. J. A method for measuring fatty acid oxidation in C. elegans. Worm. 1 (1), 26-30 (2012).
  34. Ezcurra, M., et al. elegans eats its own intestine to make yolk leading to multiple senescent pathologies. Current Biology. 28 (16), 2544-2556 (2018).
  35. Lu, F. K., et al. Label-free DNA imaging in vivo with stimulated Raman scattering microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (37), 11624-11629 (2015).
  36. Long, R., et al. Two-color vibrational imaging of glucose metabolism using stimulated Raman scattering. Chemical Communications. 54 (2), Cambridge, England. 152-155 (2018).
  37. Zhao, Z., Shen, Y., Hu, F., Min, W. Applications of vibrational tags in biological imaging by Raman microscopy. Analyst. 142 (21), 4018-4029 (2017).
  38. Liao, C. S., et al. In vivo and in situ spectroscopic imaging by a handheld Stimulated Raman Scattering Microscope. ACS Photonics. 5 (3), 947-954 (2018).
  39. Lee, H. J., et al. Assessing cholesterol storage in live cells and C. elegans by stimulated Raman scattering imaging of phenyl-Diyne cholesterol. Scientific Reports. 5, 7930 (2015).
  40. Wang, P., et al. Imaging lipid metabolism in live Caenorhabditis elegans using fingerprint vibrations. Angewandte Chemie (International Edition in English). 53 (44), 11787-11792 (2014).
  41. Chen, W. W., et al. Spectroscopic coherent Raman imaging of Caenorhabditis elegans reveals lipid particle diversity. Nature Chemical Biology. 16 (10), 1087-1095 (2020).
  42. Freudiger, C. W., et al. Stimulated Raman Scattering microscopy with a robust fibre laser source. Nature Photonics. 8 (2), 153-159 (2014).
  43. Brinkmann, M., et al. Portable all-fiber dual-output widely tunable light source for coherent Raman imaging. Biomedical Optics Express. 10 (9), 4437-4449 (2019).

Tags

Biologi Utgave 171 Raman-avbildning Stimulert Raman-spredningsmikroskopi SRS-mikroskopi C. elegans lipidmetabolisme lipider fett lipiddråper etikettfri bildebehandling lipidavbildning levende bildebehandling
Etikettfri bildebehandling av Lipidlagringsdynamikk i <em>Caenorhabditis elegans</em> ved hjelp av stimulert Raman Scattering Microscopy
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mutlu, A. S., Chen, T., Deng, D.,… More

Mutlu, A. S., Chen, T., Deng, D., Wang, M. C. Label-Free Imaging of Lipid Storage Dynamics in Caenorhabditis elegans using Stimulated Raman Scattering Microscopy. J. Vis. Exp. (171), e61870, doi:10.3791/61870 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter