Summary
La microscopia a dispersione Raman stimolata (SRS) consente l'imaging selettivo e privo di etichette di specifiche moieties chimiche ed è stata efficacemente utilizzata per l'immagine di molecole lipidiche in vivo. Qui, forniamo una breve introduzione al principio della microscopia SRS e descriviamo i metodi per il suo uso nella conservazione lipidica di imaging in Caenorhabditis elegans.
Abstract
Il metabolismo lipidico è un processo fisiologico fondamentale necessario per la salute cellulare e dell'organismo. La disregolazione del metabolismo lipidico spesso provoca obesità e molte malattie associate tra cui disturbi cardiovascolari, diabete di tipo II e cancro. Per far progredire l'attuale comprensione della regolazione metabolica lipidica, i metodi quantitativi per misurare con precisione i livelli di conservazione lipidica in vivo nel tempo e nello spazio sono diventati sempre più importanti e utili. Gli approcci tradizionali per analizzare la conservazione lipidica sono semi-quantitativi per la valutazione microscopica o mancano di informazioni spazio-temporali per la misurazione biochimica. La microscopia a dispersione Raman stimolata (SRS) è una tecnologia di imaging chimico senza etichette che consente il rilevamento rapido e quantitativo dei lipidi nelle cellule vive con una risoluzione subcellulare. Poiché il contrasto è sfruttato dalle vibrazioni molecolari intrinseche, la microscopia SRS consente anche il tracciamento quadridimensionale dei lipidi negli animali vivi. Nell'ultimo decennio, la microscopia SRS è stata ampiamente utilizzata per l'imaging di piccole molecole nella ricerca biomedica e ha superato i principali limiti dei metodi convenzionali di colorazione fluorescente e di estrazione lipidica. In laboratorio, abbiamo combinato la microscopia SRS con gli strumenti genetici e biochimici a disposizione del potente organismo modello, Caenorhabditis elegans, per indagare la distribuzione e l'eterogeneità delle goccioline lipidiche tra diverse cellule e tessuti e, in ultima analisi, per scoprire nuove vie di segnalazione conservate che modulano il metabolismo lipidico. Qui, presentiamo i principi di lavoro e la configurazione dettagliata del microscopio SRS e forniamo metodi per il suo utilizzo nella quantificazione della conservazione lipidica in distinti punti di tempo di sviluppo di tipo selvaggio e insulina segnalando c. elegansmutanti carenti.
Introduction
L'obesità è diventata un problema di salute globale che minaccia un terzo della popolazione in tutto il mondo e presenta una seria preoccupazione medica, data la sua associazione con la cattivasalute mentale 1 e le malattie mortali tra cui diabete2, malattiecardiovascolari 3 e alcuni tipi dicancro 4. Lo studio del metabolismo lipidico è essenziale per comprendere meglio i problemi biologici alla base dell'obesità. Una quantificazione rapida e specifica dell'immagazzinamento lipidico comporta l'individuazione degli acidi grassi e dei loro derivati, nonché dei metaboliti contenenti steroli, ad alta sensibilità e preferibilmente con informazioni spaziali. I lipidi sono obiettivi impegnativi da identificare perché mancano di fluorescenza intrinseca e non possono essere facilmente etichettati fluorescentmente. I tag fluorescenti sono spesso più grandi delle molecole lipidiche e, pertanto, possono essere chimicamente invasivi e impraticabili per applicazioni in vivo. La strategia di etichettatura senza etichette o minima è necessaria per preservare la struttura idrofobica delle molecole lipidiche5. I recenti sviluppi nelle tecnologie di imaging hanno creato interessanti opportunità per l'imaging senza etichette di lipidi in cellule viventi, tessuti e organismi.
Gli approcci tradizionali per le analisi di conservazione lipidica in campioni biologici includono saggi biochimici e protocolli di colorazione con coloranti lipofili. I test biochimici di quantificazione che coinvolgono la spettrometria di massa (SM) non hanno eguali nella loro risolvibilità molecolare, ma richiedono quantità di campioni molto grandi e la preparazione del campione di solito richiede diverse ore, limitando la loro applicazione per l'imaging in tempo reale dei sistemiviventi 5. Un'altra importante limitazione di questi saggi è la mancanza di informazioni spaziali. D'altra parte, i coloranti lipofili come Oil Red O e Sudan Black forniscono la distribuzione tissutale e cellulare degli organelli di stoccaggio lipidico e rispetto alle tecniche MS, questi metodi di colorazione sono anche a basso costo e facili da eseguire. Tuttavia, questi protocolli di colorazione richiedono una fissazione, che può influire sulla natura idrofobica delle goccioline lipidiche, generare cambiamenti artificiali nella loro struttura e causare incongruenze tra gliesperimenti 6. Le difficoltà tecniche associate alle tecniche biochimiche e di colorazione hanno portato alla ricerca di metodi senza etichette per l'immagine delle molecole lipidiche e al rapido aumento dell'uso di microscopia a dispersione Raman coerente (CRS) nell'imaging lipidico.
L'effetto Raman è stato riconosciuto per la prima volta da Raman e Krishnan, dove hanno riferito che dopo aver interagito con un fotone, una molecola può generare luce diffusa senza alcun cambiamento di lunghezza d'onda (chiamata scattering Rayleigh) o raramente con una lunghezza d'onda alterata (chiamata scattering Raman) e questo cambiamento di lunghezza d'onda è caratteristico dei gruppi chimici funzionali all'internodella molecola 7. Quando i legami chimici all'interno di una molecola si eccitano ad un livello di energia vibrazionale più elevato da un fotone incidente, chiamato fotone della pompa, l'energia del fotone sparso, chiamato fotone di Stokes, diventa più bassa. Altrimenti, i legami chimici possono raggiungere un livello di energia vibrazionale inferiore se sono originariamente ad un livello superiore, e il fotone sparso guadagna energia per essere il fotone anti-Stokes. La differenza di frequenza tra l'incidente e i fotoni sparsi è nota come spostamento di Raman. Ogni legame chimico all'interno di una molecola ha uno spostamento raman caratteristico e quantificabile. Ad esempio, il legame CH2 ha uno spostamento Raman di 2.845 cm-1, che è abbondante nelle catene di acidi grassi8. Questo segnale Raman spontaneo è generalmente molto debole, il che ha ampiamente limitato la velocità di imaging nella microscopia spontanea raman convenzionale. Nel corso degli anni, sono stati sviluppati vari approcci per aumentare la velocità di imaging e la sensibilità della microscopia spontanea Raman. La microscopia a dispersione Raman coerente, inclusa la microscopia cars (Coherent Anti-Stokes Raman Scattering) e la microscopia SRS (Stimulated Raman Scattering), è il progresso più recente. CARS e SRS hanno principi di lavoro leggermente diversi, ma entrambi sono tecniche senza etichette che hanno capacità di imaging dal vivo, possono fornire informazioni spaziali e temporali sulla dinamica di conservazione lipidica e richiedono solo piccole dimensioni del campione. La microscopia CARS soffre di background non risonante, che proviene da vari processi non lineari, e i segnali CARS hanno anche una relazione non lineare con la concentrazione della molecola, che insieme complicano il processo diquantificazione 9. A differenza della microscopia CARS, la microscopia SRS non genera segnali di fondo non risonanti e offre una dipendenza lineare dalla concentrazione della molecola di interesse. Pertanto, attualmente la microscopia SRS è più ampiamente utilizzata per l'imaging lipidico.
Nella microscopia SRS, i deboli segnali spontanei Raman possono essere amplificati quando eccitati da due raggi laser sincronizzati con la loro differenza di frequenza corrispondente alla frequenza vibrazionale del legame chimico. La molecola sperimenterà una transizione migliorata verso uno stato eccitato a causa di un'eccitazione coerente. Di conseguenza, il tasso di generazione di fotoni Stokes viene aumentato. Di conseguenza, l'intensità del fascio "Stokes" trasmesso aumenta (guadagno raman stimolato, SRG) e l'intensità del fascio "pompa" trasmesso diminuisce (perdita raman stimolata, SRL). Il rilevamento dei segnali SRG o SRL è alla base dell'imaging della microscopia Stimulated Raman Scattering (SRS) di molecole con specifici legami chimici10. Se la differenza di frequenza tra i due raggi laser non corrisponde alla frequenza vibrazionale del legame chimico all'interno di una molecola di interesse, non verranno generati né segnali SRG né SRL. La velocità di imaging della microscopia SRS è di circa 2 μsec per pixel o 1 secondo per fotogramma, che è molto più veloce della microscopia ramanspontanea 11. La risoluzione laterale tipica per la microscopia SRS è limitata alla diffrazione e a circa 300 nm. Inoltre, i processi ottici a due fotoni della microscopia SRS consentono l'imaging 3D volumetrico di campioni di tessuto spesso relativo e la profondità di imaging potrebbe raggiungere i 300-500 μm. Nel complesso, la microscopia SRS presenta una tecnica di imaging efficiente e priva di etichette per rilevare biomolecole specifiche, in particolare lipidi.
Le goccioline lipidiche sono organelli a membrana singola, che sono il principale sito di stoccaggio cellulare per lipidi neutri, compresi i triacilgilceroli (TAGs) e gli esteri del colesterolo (CE). I legami CH2 nelle catene di acidi grassi di queste molecole lipidiche generano forti segnali SRS a 2.845 cm-1 quando eccitati8,consentendo così il rilevamento e la quantificazione dei livelli lipidici di stoccaggio in cellule intatte, sezioni tissutali e persino organismiinteri 12,13,14,15. In particolare, i C. elegans sono utili per gli studi di imaging lipidico grazie alla loro trasparenza. Come i mammiferi, anche i C. elegans immagazzinano lipidi nelle goccioline lipidiche e le vie di sintesi e degradazione delle molecole lipidiche sono altamente conservate16. In questo protocollo, forniremo il principio di funzionamento della microscopia SRS, la sua configurazione fondamentale e descriveremo i metodi per il suo utilizzo nell'imaging lipidico in C. elegans.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Configurazione strumentale per microscopia a dispersione Raman stimolata
NOTA: Il sistema di microscopia SRS è costruito su un laser a picosecondi con oscillatore parametrico ottico integrato della pompa e un microscopio a scansione laser confocale. L'oscillatore fornisce due treni a impulsi picosecondi, tra cui un fascio stokes a 1.064 nm e un fascio di pompaggio toniere tra 700-990 nm. La sovrapposizione temporale e spaziale dei due fasci si ottiene all'interno del laser. Un modulatore elettro-ottico integrato (EOM) è progettato specificamente per la microscopia SRS. Questo protocollo si concentrerà sull'accoppiamento del laser con il microscopio e sul funzionamento quotidiano di questo sistema (Figura 1). La configurazione di un sistema di microscopi srs si sta evolvendo nell'ultimo decennio. Va notato che la seguente descrizione rappresenta solo una delle diverse configurazioni.
- Alimentazione di raggi laser al microscopio
- Impostare il periscopio per sollevare il fascio dall'uscita della sorgente luminosa picoseconda alla porta di ingresso laser a infrarossi sullo scanner del microscopio.
ATTENZIONE: Leggere il manuale del sistema laser prima del funzionamento e prendere tutte le precauzioni necessarie perché la radiazione infrarossa vicina generata da questo sistema laser di classe IV può causare gravi danni agli occhi e alla pelle. Completare i corsi di formazione richiesti dai dipartimenti istituzionali per la sicurezza ambientale. Indossare occhiali protettivi e camice da laboratorio con maniche ammanettate. - In primo luogo, impostare il fascio della pompa a 750 nm e abbassare la potenza del laser a 50 mW, che può essere ispezionata visivamente, affiliata all'allineamento. Quindi, utilizzare un espansore di travi(Figure 1, L1 e L2) per regolare il diametro del fascio in base all'apertura posteriore degli obiettivi del microscopio. Utilizzare due specchi a relè(Figura 1,M1 e M2) per guidare il raggio laser verso il periscopio(Figura 1,P1 e P2). Il periscopio solleverà il fascio fino all'altezza dell'apertura dello scanner e fungerà anche da specchio dello sterzo per l'allineamento.
- Impostare le manopole sul periscopio al centro dell'intervallo di sintonizzazione e scegliere la posizione e l'angolo iniziali di ogni specchio in modo che il raggio laser colpisca approssimativamente il centro dello specchio.
- Eseguire l'allineamento grossolano utilizzando una porta vuota sulla torretta obiettivo e posizionare la sonda del misuratore di potenza per misurare la potenza della luce trasmessa. Impostare lo scanner del microscopio con lo zoom più alto (50x), quindi misurare la potenza della luce trasmessa con il punto del raggio laser focalizzato. Ottimizzare le manopole su ogni specchio, M1 e M2, iterativamente per ottenere la massima potenza laser trasmessa.
- Eseguire l'allineamento fine con lo strumento di allineamento. Mettere il tappo di allineamento del bersaglio a fluorescenza sul sedile obiettivo vuoto e regolare le manopole di M1 per centrare il punto. Quindi, introdurre il tubo di estensione per il bersaglio e sintonizzare le manopole di M2 per centrare il punto.
- Ripetere i passaggi 1.1.4 e 1.1.5 fino a quando la trave centra il bersaglio in entrambe le posizioni.
- Impostare il periscopio per sollevare il fascio dall'uscita della sorgente luminosa picoseconda alla porta di ingresso laser a infrarossi sullo scanner del microscopio.
- Collegamento del rilevamento e dell'elettronica
- Impostare il modulo di rilevamento SRS. Posizionare un cuber splitter del fascio dopo il condensatore per dirigere il laser trasmesso al modulo fotodiodo. Il modulo include un telescopio per relè e modificare le dimensioni del fascio per adattarsi all'area attiva del fotodiodo, così come un filtro ottico per rimuovere il fascio di Stokes modulato e lasciare passare il fascio della pompa per la demodulazione.
- Impostare la connessione elettronica (Figura 1). L'intensità del fascio stokes è modulata da un EOM integrato a 20 MHz all'interno del laser tonnibile picosecondo. L'uscita della frequenza di modulazione dal laser viene immessa nell'amplificatore lock-in come frequenza di riferimento per la demodulazione. Alimentare il segnale di uscita del fotodiodo nell'amplificatore lock-in per demodulare la SRL.
NOTA: I sistemi laser one-box possono essere aggiornati e quindi le loro specifiche possono variare a causa della diversa data di produzione. La versione precedente del sistema laser tonnibile picosecondo, utilizzato in questo protocollo, ha un fascio Stokes di 1.064 nm, ma la versione recente ha un fascio Stokes di 1.031 nm. La frequenza di modulazione dell'EOM utilizzata in questo protocollo è personalizzata a 8 MHz, ma la frequenza di modulazione predefinita per il sistema recente può essere di 10 o 20 MHz. - Infine, alimenta l'uscita dell'amplificatore lock-in nella scatola analogica del microscopio per convertire il segnale analogico elettrico in segnale digitale. Il sistema dovrebbe essere pronto per elaborare il segnale SRS.
- Ottimizzare le condizioni di imaging
- Creare un campione chimico per l'allineamento del sistema. Ad esempio, usa il dodecano per ottimizzare il microscopio, perché il dodecano ha un segnale SRS molto forte dai legami C-H. Utilizzare una guarnizione sicura per realizzare una mini camera; mettere 5 μL di dodecano e coprirlo con una coverlip.
NOTA: Sostituire il campione di dodecano una volta che sembra poco chiaro o presenta detriti, con un nuovo campione che potrebbe essere utilizzato per l'allineamento per 2-3 mesi. - Posizionare il campione sullo stadio del microscopio. Concentrarsi correttamente sulla goccia liquida. Può essere fatto più velocemente cercando il bordo del pad dodecane. Regolare il condensatore per l'illuminazione Kohler.
- Impostare i parametri di imaging. Verificare se la fase di ritardo è sui numeri giusti. Impostare la lunghezza d'onda del fascio della pompa su 795,8 nm. Utilizzando una scheda sensore IR e un visualizzatore IR, verificare se il percorso del fascio della pompa è ancora corretto.
- Impostare la potenza del fascio della pompa su 200 mW e il fascio Stokes a 400 mW sul pannello di controllo del sistema picosecond.
NOTA: Le velocità di passaggio laser dall'uscita laser all'obiettivo post dei due fasci sono di circa il 25% per la pompa e del 14% per Stokes per questa configurazione del sistema. Pertanto, una potenza post-obiettiva del fascio della pompa è di circa 50 mW e per il fascio di Stokes è di circa 56 mW. La larghezza dell'impulso del recente sistema laser a picosecondi è cambiata da 6 ps a 2 ps, quindi la potenza laser applicata dovrebbe essere ancora più bassa. - Impostare il guadagno dell'amplificatore lock-in al massimo. Aprire l'otturatore sia per le travi, sia per l'otturatore principale del laser.
- Scansiona l'esempio e controlla l'immagine sullo schermo del computer. Modificare la modalità di visualizzazione in Hi-Lo nel software di imaging. Regolare l'intervallo per visualizzare una saturazione di ~50%. Verificare se la saturazione è centrata nell'immagine. In caso meno, regolare attentamente gli specchietti sterzanti, M1 e M2, per massimizzare l'intensità dell'immagine e centrare l'intensità del picco.
- Mettere a punto lo stadio di ritardo e trovare l'intensità massima del segnale SRS dal campione di dodecano. Il sistema è quindi pronto per l'uso.
- Creare un campione chimico per l'allineamento del sistema. Ad esempio, usa il dodecano per ottimizzare il microscopio, perché il dodecano ha un segnale SRS molto forte dai legami C-H. Utilizzare una guarnizione sicura per realizzare una mini camera; mettere 5 μL di dodecano e coprirlo con una coverlip.
2. Preparazione di campioni di C. elegans per l'imaging di microscopie SRS
NOTA: Come organismi modello, caenorhabditis elegans si è dimostrato molto utile per più tecniche di imaging. Sono trasparenti per tutto il corpo, quindi vari tessuti possono essere immagini nell'animale intatto senza la necessità di dissezione. In C. elegans, i lipidi neutri sono conservati in goccioline lipidiche situate nell'intestino, che consiste di 20 cellule epiteliali situate bisemetralmente intorno al lume intestinale16. Anche le cellule ipodermiche e gli ovociti immagazzinano lipidi. La principale forma di lipidi di stoccaggio nelle goccioline lipidiche C. elegans sono i triacilgilceroli (TAGs)17, che generano forti segnali SRS a causa dell'abbondanza di legami CH2 presenti nelle loro catene di acidi grassi. Questa sezione si concentrerà su come preparare campioni di C. elegans per l'imaging della microscopia SRS e la quantificazione dei loro livelli totali di conservazione lipidica intestinale.
- Preparazione delle diapositive di imaging
- In primo luogo, preparare la soluzione di agarosio al 2% in H2O distillato e assicurarsi che tutto l'agarosio si sciolga prima di preparare le pastiglie di agarosio.
- Aggiungere una goccia di agarosio caldo al 2% su una diapositiva vuota (circa 100 μL) posizionata tra diapositive di supporto con due strati di nastro da laboratorio e posizionare rapidamente una seconda diapositiva sopra la prima diapositiva. Premere delicatamente per creare un cuscinetto sottile e uniforme di agarosio.
- Mettere da parte queste diapositive in posizione chiusa e non separarle fino a quando i vermi non sono pronti per essere montati. Preparare diapositive fresche prima di ogni sessione di imaging, poiché i pad si asciugheranno dopo 1 giorno.
NOTA: utilizzare camere di imaging multi-pozzo, se si imagingno diversi worm in schermi genetici ad alta produttività18. Utilizzare configurazioni di imaging dal vivo per immagini dinamiche spazio-temporali del metabolismo lipidico attraverso lo sviluppo e l'invecchiamento19.
- Montaggio dei vermi
- Preparare l'agente anestetizzante aggiungendo rispettivamente azide di sodio o levamisolo nel tampone M9 alla concentrazione finale di 100 mM o 1 mM.
NOTA: Utilizzare levamisolo se i vermi devono essere recuperati dopo l'imaging per il genotipizzazione dopo gli schermi genetici.
ATTENZIONE: Diversi agenti anestetizzanti, tra cui l'azide di sodio e la levamisolo, sono dannosi se inalati. Indossare guanti e indumenti protettivi, nonché utilizzare una cappa aspirante chimica durante la preparazione di tali soluzioni di lavoro. - Posizionare una goccia di agente anestetizzante in una busta di copertura (circa 4-5 μL per 10-20 vermi).
NOTA: Regolare la quantità dell'agente anestetizzante in base al numero di verme per mantenere i vermi il più vicini possibile l'uno all'altro. L'uso di troppo liquido per pochi vermi può causare la diffusione dei vermi sul cuscinetto di agarosio. - Selezionare i vermi da immaginire sotto la microscopia a dissezione e trasferirli nella gocciolamento dell'agente anestetizzante. Dopo che tutti i vermi sono stati aggiunti alla goccia, spostarli usando il raccoglitore di worm e assicurarsi che non si sovrappongano tra loro.
- Separare i vetrini (dal passaggio 2.1) senza perturpare il tampone di agarosio.
- Coprire la goccia di verme con lo scivolo di vetro che ha il cuscinetto di agarosio. Assicurarsi che il cuscinetto di agarosio sia rivolto verso i vermi. In alternativa, la goccia di invecchiamento anestetizzante può anche essere aggiunta sul tampone di agarosio e i vermi possono essere coperti con il copripasta.
- Infine, contrassegnare la posizione dei vermi utilizzando un marcatore permanente sullo scivolo di vetro.
- Preparare l'agente anestetizzante aggiungendo rispettivamente azide di sodio o levamisolo nel tampone M9 alla concentrazione finale di 100 mM o 1 mM.
3. Acquisizione e analisi di immagini
- Acquisizione delle immagini tramite il sistema di microscopio SRS.
- Prima di creare un campione, determinare i parametri di imaging e verificare i segnali SRS (come spiegato nel protocollo 1).
- Montare lo scivolo con il coverslip rivolto verso l'obiettivo. Accendere la sorgente luminosa del campo luminoso e indirizzarla all'oculare per individuare i vermi.
NOTA: Utilizzare una lente obiettiva 20x per immaginere la conservazione lipidica in tutto l'intestino. Prendi in considerazione l'uso di una lente obiettivo 60x per identificare la conservazione del grasso ipodermico o per quantificare le dimensioni /numero delle goccioline lipidiche. - Portare i vermi a fuoco e regolare la posizione del condensatore di conseguenza.
- Spegnere la sorgente luminosa del campo luminoso e passare all'unità di scansione laser. Inizia a scansionare il primo worm a una velocità di scansione rapida (ad esempio, 512 x 512 pixel) e regola la messa a fuoco fine per trovare l'area di interesse. Per l'immagine del primo campione, regolare i poteri laser al livello in cui i segnali SRS non sono saturi.
- Passare a una velocità di scansione più lenta (ad esempio, 2 μs/pixel) e a una risoluzione più elevata (ad esempio, 1024 x 1024 pixel) per ottenere l'immagine SRS.
NOTA: Mantenere costanti le potenze laser per ogni campione da immagini durante la sessione di imaging. - Salvare l'immagine SRS nel formato desiderato che consente un'alta risoluzione, ad esempio un file .tiff corrente). A seconda del software di imaging e della configurazione utilizzata, salvare la posizione del primo worm prima di passare al successivo.
- Imaging completo di tutti i vermi montati sullo scivolo. Spegnere l'otturatore per bloccare i raggi laser. Non spegnere la sorgente laser fino a quando non vengono imageati tutti i campioni.
- Rimuovere la diapositiva prima di posizionare la diapositiva di esempio successiva. Ripetere i passaggi da 3.1.2 a 3.1.7.
- Una volta che tutti i campioni sono stati imageati, mettere la sorgente laser in standby e spegnere l'apparecchiatura associata tra cui l'amplificatore, il rilevatore, il microscopio e il computer.
- Analisi delle immagini tramite ImageJ
- Aprite i file di immagine (in genere .tiff) da quantificare in ImageJ, selezionando i file e trascinandoli e rilasciandoli nella finestra ImageJ. Scaricare i plug-in ImageJ appropriati, se si utilizzano formati di microscopio Olympus specifici, ad esempio file oib.
- Selezionare le proprietà da analizzare (Analyze > Set Measurements). Per la quantificazione totale della conservazione lipidica, selezionare Area, Valore grigio minimo e Massimo e Valore grigio medio.
- Utilizzare lo strumento di selezione poligonale e delineare la regione dell'intestino del verme da quantificare. Per misurare i parametri selezionati nel passaggio 3.2.2, fare clic su Analizza > misura. Verrà visualizzata una nuova finestra con i risultati della misurazione. Ripetere questo passaggio per tutte le immagini aperte.
- Selezionare le misure per tutti i worm in un determinato genotipo e copiare/incollare i risultati in un nuovo foglio di calcolo. Ripetere i passaggi da 3.2.1 a 3.2.4 per tutti i genotipi nella stessa sessione di imaging.
- Selezionare un'area nelle vicinanze del worm che non ha alcun segnale SRS, da quantificare come sfondo. Assicurarsi che l'area selezionata per la misurazione dello sfondo non contenga batteri o detriti che potrebbero anche dare un segnale SRS.
- Sottrarre il valore grigio medio di sfondo dalle misurazioni di ogni singolo worm. Calcolare la deviazione media e standard dello sfondo sottratto valori grigi medi da tutti i worm in un determinato genotipo/gruppo di test. Normalizzare questo valore alla media del gruppo di controlli.
- Infine, eseguire l'analisi statistica appropriata utilizzando il valore grigio medio come misura per i livelli lipidici in ogni verme. In genere, utilizzare il test t diStudent per due gruppi e utilizzare ANOVA uni-way con un test di confronto multiplo appropriato per più di due gruppi.
NOTA: quando si selezionano le immagini per la presentazione della figura, assicurarsi che le immagini selezionate abbiano la stessa distribuzione dell'intensità dei pixel. Impostare la luminosità e il contrasto sullo stesso valore per tutte le immagini della stessa figura (Image > Adjust > Brightness and Contrast).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
La segnalazione dell'insulina è un'importante via endocrina che influisce sullo sviluppo, la riproduzione, la durata della vita e il metabolismo. Nei vermi, la segnalazione dell'insulina consiste di circa 40 ligandi peptidici insulino-simili, ortologo del recettore del fattore di crescita insulino-simile DAF-2, cascata pi3K / AKT chinasi a valle e ortologo del fattore di trascrizione FoxO, DAF-1620. I mutanti daf-2, che mancano del recettore dell'insulina, hanno più goccioline lipidiche nell'intestino, il tessuto di stoccaggio lipidico del verme21,22. Utilizzando la microscopia SRS, abbiamo quantificato i livelli lipidici intestinali nei vermi di tipo selvatico sincronizzati con l'età e nei mutanti daf-2 durante l'età adulta. Coerentemente con i risultati precedenti, abbiamo scoperto che i mutanti daf-2 hanno livelli lipidicipiù elevati 23,24 (Figura 2A). Abbiamo osservato un calo dei livelli lipidici nei vermi di tipo selvatico a partire dal primo giorno fino al giorno 9 dell'età adulta (Figura 2A). Tuttavia, i livelli lipidici nei mutanti daf-2 sono aumentati fino a quando non avevano 5 giorni e poi erano costanti intorno al livello di 2,5-3,0 volte superiore al tipo selvaggio (Figura 2A).
DAF-16, l'ortologo del fattore di trascrizione FoxO C. elegans, orchestra la maggior parte delle funzioni a valle della via di segnalazione dell'insulina. Le mutazioni nulle daf-16 sopprimono diversi fenotipi osservati nei mutanti daf-2, incluso l'accumulo di grasso. daf-16 il locus genomico codifica per 8 trascrizioni diverse (daf-16a-h), generate da un sito alternativo di inizio della trascrizione o da una giunzione alternativa20. Tra questi, daf-16a, daf-16b e daf-16d/f/h sono le trascrizioni più abbondanti e codificano per proteine con N termini diversi. Studi con mutazioni e transgeni specifici dell'isoforma hanno suggerito che gli isoformi DAF-16A e DAF-16D/F/H regolano lo sviluppo del dauere la durata della vita 24,25, mentre DAF-16B è importante per il rimodellamento faringeo durante la formazione di dauer26. In questo studio, utilizzando la microscopia SRS, abbiamo studiato la specificità isoforme del DAF-16 nella regolazione della conservazione intestinale dei lipidi. La Corte ha riscontrato che l'inattivazione del daf-16 sopprime l'aumento dei livelli lipidici dei mutanti daf-2 (Figura 2B,C). Esprimendo daf-16a o daf-16b isoforma nel daf-2; daf-16 doppi mutanti non ripristina i livelli lipidici. Tuttavia, l'espressione dell'isoforma daf-16d/f/h è sufficiente a ripristinare i livelli lipidici in daf-2; daf-16 ai livelli osservati nei singoli mutanti daf-2 (Figura 2B,C). Questi risultati hanno rivelato che specificamente le isoforme DAF-16D/F/H modulano il metabolismo lipidico nei vermi mutanti daf-2. Ciò è anche coerente con i risultati di un recente studio che ha mostrato che la regolazione olfattiva dello stoccaggio lipidico è mediata anche attraverso le attività trascrizionale di DAF-16D / F / H27.
Figura 1: Illustrazione del sistema di microscopio SRS. Il laser all-in-one fornisce raggi pump e Stokes combinati in modo temporale e spaziale, modulatore elettro-ottico integrato (EOM) e frequenza di riferimento per l'amplificatore lock-in. Il fascio combinato viene espanso dal telescopio (L1 e L2), trasmesso da due specchi a relè (M1 e M2) e sollevato dal periscopio (P1 e P2), e quindi inviato nello scanner del microscopio. Il fascio combinato viene scansionato dall'unità di scansione (SU) al microscopio e focalizzato sul campione. La luce trasmessa viene raccolta dal condensatore. Un filtro rimuoverà il fascio stokes e lascerà il fascio della pompa per essere rilevato dal fotodiodo (PD). Le frecce tratteggiate grigie mostrano la connessione tra l'elettronica. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: La riduzione della segnalazione dell'insulina in C. elegans porta ad un aumento dello stoccaggio lipidico. (A) Utilizzando la microscopia SRS, i livelli lipidici intestinali dei vermi mutanti di tipo selvatico e daf-2 sono quantificati nei giorni 1, 3, 5, 7 e 9 di età adulta. Nei vermi di tipo selvatico, i livelli lipidici diminuiscono nel tempo, mentre i mutanti daf-2 accumulano lipidi fino al giorno 5 e hanno circa 2,7 volte più lipidi rispetto ai vermi di tipo selvatico. (B) la cancellazione del daf-16 sopprime l'aumento dei livelli lipidici nei mutanti daf-2. Ripristino dell'espressione dell'isoforma daf-16d/f/h in daf-2; i doppi mutanti daf-16 sono sufficienti per aumentare i livelli lipidici ai livelli dei mutanti daf-2, mentre ripristinare l'espressione delle isoforme daf-16a o daf-16b non è. *** p < 0,001, n.s. non significativo da ANOVA unidirevi con il test di confronto multiplo di Bonferroni. (C) Immagini rappresentative dell'SRS. I pixel gialli indicano livelli lipidici più elevati. L'area intestinale quantificata è mostrata in linee tratteggiate. La barra di scala è di 40 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
File aggiuntivo. Clicca qui per scaricare questo file.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In difesa contro l'obesità e i suoi disturbi metabolici associati, sono stati implementati importanti sforzi di ricerca per comprendere meglio i meccanismi regolatori dell'omeostasi lipidica. Per il rilevamento quantitativo di molecole lipidiche in campioni biologici, l'imaging senza etichette mediante microscopia SRS si è dimostrato un'alternativa affidabile ai saggi biochimici e ad altri metodi di colorazione. Il nostro gruppo e altri hanno rivelato nuovi meccanismi biologici nella regolazione metabolica lipidica combinando l'uso di C. elegans e microscopia SRS12,18,28,29,30,31. In questo protocollo, utilizzando la microscopia SRS, abbiamo dimostrato che la segnalazione dell'insulina verso il basso nei vermi porta ad un aumento dei livelli lipidici intestinali totali. Abbiamo osservato che a partire dal primo giorno di età adulta, i lipidi si accumulano nell'intestino dei mutanti daf-2, che hanno una mutazione di perdita di funzione nel gene del recettore dell'insulina, mentre nei vermi di tipo selvatico i livelli lipidici intestinali diminuiscono. Inoltre, coerentemente con gli studiprecedenti 23,24, abbiamo scoperto che l'inattivazione daf-16 può sopprimere completamente l'aumento della conservazione lipidica nei mutanti daf-2 e tra i diversi isoformi daf-16, l'isoforma daf-16d / f / h regola specificamente l'omeostasi lipidica. Come suggerito da studi precedenti, la differenza nei livelli totali di accumulo lipidico intestinale nei mutanti daf-2 è probabilmente dovuta a una combinazione di fattori: aumento della sintesi lipidica de novo 32, diminuzione dell'utilizzolipidico 33, nonché riproduzione ridotta e accumulo dituorlo 34. I recenti progressi nelle tecniche coerenti di spettroscopia Raman (SRS e CARS) aiuterebbe a chiarire ulteriormente i meccanismi di come la segnalazione dell'insulina contribuisca alla regolazione di diversi tipi di stoccaggio lipidico in tessuti distinti, tra cui intestino, ipodermide e ovociti.
La microscopia SRS è stata utilizzata per l'immagine non solo dei lipidi, ma anche di altre biomolecole, tra cui DNA35,RNA14,proteine 13e glucosio36. È stato implementato per fornire importanti approfondimenti su molti aspetti della biologia come la biologia cellulare, la microbiologia, la biologia del cancro e la biologia dello sviluppo11. Più recentemente, l'uso di tag bioorthogonali (ad esempio, tag alchine e deuterio), per etichettare minimamente le molecole di interesse, ha ulteriormente migliorato la sensibilità e la specificità di rilevamento. Questi tag vibrazionali minimi non interrompono le proprietà chimiche della molecola, ma forniscono un contrasto chimico specifico, poiché il loro segnale Raman si trova all'interno della "finestra silenziosa" dello spettro Raman14,37. Oltre a migliorare la sensibilità e la specificità, raggiungere l'imaging SRS a super risoluzione è anche un'entusiasmante area di ricerca. Diversi gruppi di ricerca si sono anche adoperati per ridurre al minimo le dimensioni delle apparecchiature creando un microscopio SRS38 attraverso la adozione di un sistema di ricerca. Pertanto, l'applicazione dell'imaging SRS alla ricerca biomedica ha aperto nuove sedi per miglioramenti tecnologici e chimici per far progredire l'imaging lipidico.
Rispetto ai metodi tradizionali di quantificazione lipidica, la microscopia SRS ha diversi vantaggi. Prima di tutto, viene eseguita in modo privo di etichette e anche se deve essere utilizzata un'etichetta, l'etichetta può essere piccola come due atomi. Pertanto, non soffre del problema del fotobleaching come altri metodi di tagging e colorazione fluorescenti. In secondo luogo, la capacità di imaging vivo utilizzando organismi interi consente di tracciare la dinamica di metabolitispecifici 29,39,40. Infine, la microscopia SRS consente un maggiore grado di multiplexing e quindi può essere implementata per immaginare più biomolecole in compartimenti cellulari distinti contemporaneamente. La microscopia iperspettrale SRS/CARS ha un grande futuro nell'esplorare la dinamica metabolica di diverse biomolecole distinte, nonché diversi tipi di compartimenti di stoccaggio lipidici come le particelle di tuorlo in C. elegans41 o l'estere colesterile e le goccioline lipidiche ricche di TAG in diverse cellule e tessuti di mammiferi31. D'altra parte, la microscopia SRS sta affrontando limitazioni come l'elevato costo dell'hardware e la mancanza di piena disponibilità commerciale. Inoltre, richiede competenze per mantenere ed eseguire il sistema, il che può complicarne l'adozione. Gli sviluppi nell'integrazione delle fonti luminose e dei sistemi stanno migliorando la situazione. La sorgente laser a basso costo a base di fibre e i sistemi completamente integrati offrono nuove opportunità nella commercializzazione e aiuteranno a ridurre i costi infuturo 11,42,43. Inoltre, nonostante i nuovi approcci tecnologici per migliorare la velocità di imaging e la risoluzione spaziale dell'imaging SRS, la limitata sensibilità di rilevamento può continuare a ostacolare la capacità di sondare metaboliti di bassa abbondanza. Nel complesso, l'uso della microscopia SRS nella ricerca biomedica è cresciuto enormemente nell'ultimo decennio. L'imaging SRS trarrà ulteriore vantaggio dai miglioramenti tecnologici nella sensibilità al rilevamento, nella risoluzione spaziale e nella capacità di multiplexing e, in ultima analisi, amplierà il suo uso nel monitoraggio quantitativo delle biomolecole, in particolare dei lipidi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato dalle sovvenzioni NIH R01AG045183 (M.C.W.), R01AT009050 (M.C.W.), R01AG062257 (M.C.W.), DP1DK113644 (M.C.W.), March of Dimes Foundation (M.C.W.), Welch Foundation (M.C.W.) e dall'investigatore HHMI (M.C.W.). Ringraziamo il Caenorhabditis Genetics Center (CGC) per i ceppi di C. elegans.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A/D converter | Olympus | Analog Unit | |
| Agarose | GeneMate | 3119 | For making agarose pads |
| Alignment tool - adapter | Thorlabs | SM1A4 | For mounting the tool on scope |
| Alignment tool - target | Thorlabs | VRC2SM1 | For viewing IR laser |
| Alignment tool - tube | Thorlabs | SM1L40 | Length can vary |
| Autocorrelator (Optional) | APE | pulseCheck | |
| Bandpass filter | minicircuits | BBP-21.4+ if modulated at 20MHz or KR Electronics 2724 if modulated at 8 MHz | For signal with modulation frequency filtering |
| BNC cables | |||
| Dissection microscope | Nikon | SMZ800 | For handling and picking worms for imaging |
| Dodecane | Sigma-Aldrich | 44010 | Used for calibration of the SRS signal |
| Filter | Chroma Technology | 890/220 CARS | For removing Stokes beam |
| General purpose laboratory labeling tape | VWR | 89097 | For making agarose pads |
| Glass coverslips | VWR | 48393-106 | For covering worms for imaging |
| Glass microscope slide | VWR | 16004-422 | For making agarose pads |
| Laser scanning microscope | Olympus | FV3000 | |
| Lens | Thorlabs | L1: AC254-050-B L2: AC254-075-B |
For beam expander |
| Lock-in amplifier | Zurich | HF2LI | |
| Lowpass filter | minicircuits | BLP-1.9+ | For power supply noise suppression |
| Mirrors | Thorlabs | BB1-E03 | For relay and periscope |
| Objective | Olympus | UPlanSAPO 20x 0.75, UPlanSAPO 60XW 1.20 | |
| Photodiode | Thorlabs | FDS1010 | |
| Picosecond laser source | APE | picoEmerald | |
| Power supply | TEKPOWER | TP1342U | For photodiode, reversed 50V voltage |
| Sodium azide | Sigma | S2002 | For anaesthesizing the worms |
| Worm picker | WormStuff | 59-AWP |
References
- Luppino, F. S., et al. Overweight, obesity, and depression: a systematic review and meta-analysis of longitudinal studies. Archives of General Psychiatry. 67 (3), 220-229 (2010).
- Eckel, R. H., et al. Obesity and type 2 diabetes: what can be unified and what needs to be individualized. Diabetes Care. 34 (6), 1424-1430 (2011).
- Poirier, P., et al. Obesity and cardiovascular disease: pathophysiology, evaluation, and effect of weight loss. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 26 (5), 968-976 (2006).
- Bhaskaran, K., et al. Body-mass index and risk of 22 specific cancers: a population-based cohort study of 5.24 million UK adults. Lancet. 384 (9945), 755-765 (2014).
- Shen, Y., Hu, F., Min, W. Raman imaging of small biomolecules. Annual Review of Biophysics. 48, 347-369 (2019).
- Daemen, S., van Zandvoort, M., Parekh, S. H., Hesselink, M. K. C. Microscopy tools for the investigation of intracellular lipid storage and dynamics. Molecular Metabolism. 5 (3), 153-163 (2016).
- Syed, A., Smith, E. A. Raman imaging in cell membranes, lipid-rich organelles, and lipid bilayers. Annual Review of Analytical Chemistry. 10 (1), Palo Alto, Calif. 271-291 (2017).
- Thomas, G. J. Raman spectroscopy of protein and nucleic acid assemblies. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 28, 1-27 (1999).
- Evans, C. L., Xie, X. S. Coherent anti-stokes Raman scattering microscopy: chemical imaging for biology and medicine. Annual Review of Analytical Chemistry. 1, Palo Alto, Calif. 883-909 (2008).
- Freudiger, C. W., et al. Label-free biomedical imaging with high sensitivity by stimulated Raman scattering microscopy. Science. 322 (5909), 1857-1861 (2008).
- Hu, F., Shi, L., Min, W. Biological imaging of chemical bonds by stimulated Raman scattering microscopy. Nature Methods. 16 (9), 830-842 (2019).
- Wang, M. C., Min, W., Freudiger, C. W., Ruvkun, G., Xie, X. S. RNAi screening for fat regulatory genes with SRS microscopy. Nature Methods. 8 (2), 135-138 (2011).
- Wei, L., Yu, Y., Shen, Y., Wang, M. C., Min, W. Vibrational imaging of newly synthesized proteins in live cells by stimulated Raman scattering microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (28), 11226-11231 (2013).
- Wei, L., et al. Live-cell imaging of alkyne-tagged small biomolecules by stimulated Raman scattering. Nature Methods. 11 (4), 410-412 (2014).
- Ramachandran, P. V., Mutlu, A. S., Wang, M. C. Label-free biomedical imaging of lipids by stimulated Raman scattering microscopy. Current Protocols in Molecular Biology. 109, 31 (2015).
- Srinivasan, S. Regulation of body fat in Caenorhabditis elegans. Annual Review of Physiology. 77, 161-178 (2015).
- Vrablik, T. L., Petyuk, V. A., Larson, E. M., Smith, R. D., Watts, J. L. Lipidomic and proteomic analysis of Caenorhabditis elegans lipid droplets and identification of ACS-4 as a lipid droplet-associated protein. Biochimca Et Biophysica Acta. 1851 (10), 1337-1345 (2015).
- Yu, Y., Mutlu, A. S., Liu, H., Wang, M. C. High-throughput screens using photo-highlighting discover BMP signaling in mitochondrial lipid oxidation. Nature Communications. 8 (1), 865 (2017).
- Kelley, L. C., et al. Live-cell confocal microscopy and quantitative 4D image analysis of anchor-cell invasion through the basement membrane in Caenorhabditis elegans. Nature Protocols. 12 (10), 2081-2096 (2017).
- Murphy, C. T., Hu, P. J. Insulin/insulin-like growth factor signaling in C. elegans. WormBook. , 1-43 (2013).
- Shi, X., et al. Regulation of lipid droplet size and phospholipid composition by stearoyl-CoA desaturase. Journal of Lipid Research. 54 (9), 2504-2514 (2013).
- Watts, J. L., Ristow, M. Lipid and carbohydrate metabolism in Caenorhabditis elegans. Genetics. 207 (2), 413-446 (2017).
- Kimura, K. D., Tissenbaum, H. A., Liu, Y., Ruvkun, G. daf-2, an insulin receptor-like gene that regulates longevity and diapause in Caenorhabditis elegans. Science. 277 (5328), 942-946 (1997).
- Kwon, E. S., Narasimhan, S. D., Yen, K., Tissenbaum, H. A. A new DAF-16 isoform regulates longevity. Nature. 466 (7305), 498-502 (2010).
- Chen, A. T., et al. Longevity genes revealed by integrative analysis of isoform-specific daf-16/FoxO mutants of Caenorhabditis elegans. Genetics. 201 (2), 613-629 (2015).
- Lee, R. Y., Hench, J., Ruvkun, G. Regulation of C. elegans DAF-16 and its human ortholog FKHRL1 by the daf-2 insulin-like signaling pathway. Current Biology. 11 (24), 1950-1957 (2001).
- Mutlu, A. S., Gao, S. M., Zhang, H., Wang, M. C. Olfactory specificity regulates lipid metabolism through neuroendocrine signaling in Caenorhabditis elegans. Nature Communications. 11 (1), 1450 (2020).
- Chen, A. J., et al. Fingerprint Stimulated Raman Scattering imaging reveals retinoid coupling lipid metabolism and survival. Chemphyschem: a European Journal of Chemical Physics and Physical Chemistry. 19 (19), 2500-2506 (2018).
- Li, X., et al. Quantitative imaging of lipid synthesis and lipolysis dynamics in Caenorhabditis elegans by Stimulated Raman Scattering microscopy. Analytical Chemistry. 91 (3), 2279-2287 (2019).
- Lin, C. J., Wang, M. C. Microbial metabolites regulate host lipid metabolism through NR5A-Hedgehog signalling. Nature Cell Biology. 19 (5), 550-557 (2017).
- Fu, D., et al. In vivo metabolic fingerprinting of neutral lipids with hyperspectral stimulated Raman scattering microscopy. Journal of the American Chemical Society. 136 (24), 8820-8828 (2014).
- Perez, C. L., Van Gilst, M. R. A 13C isotope labeling strategy reveals the influence of insulin signaling on lipogenesis in C. elegans. Cell Metabolism. 8 (3), 266-274 (2008).
- Elle, I. C., Rodkaer, S. V., Fredens, J., Faergeman, N. J. A method for measuring fatty acid oxidation in C. elegans. Worm. 1 (1), 26-30 (2012).
- Ezcurra, M., et al. elegans eats its own intestine to make yolk leading to multiple senescent pathologies. Current Biology. 28 (16), 2544-2556 (2018).
- Lu, F. K., et al. Label-free DNA imaging in vivo with stimulated Raman scattering microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (37), 11624-11629 (2015).
- Long, R., et al. Two-color vibrational imaging of glucose metabolism using stimulated Raman scattering. Chemical Communications. 54 (2), Cambridge, England. 152-155 (2018).
- Zhao, Z., Shen, Y., Hu, F., Min, W. Applications of vibrational tags in biological imaging by Raman microscopy. Analyst. 142 (21), 4018-4029 (2017).
- Liao, C. S., et al. In vivo and in situ spectroscopic imaging by a handheld Stimulated Raman Scattering Microscope. ACS Photonics. 5 (3), 947-954 (2018).
- Lee, H. J., et al. Assessing cholesterol storage in live cells and C. elegans by stimulated Raman scattering imaging of phenyl-Diyne cholesterol. Scientific Reports. 5, 7930 (2015).
- Wang, P., et al. Imaging lipid metabolism in live Caenorhabditis elegans using fingerprint vibrations. Angewandte Chemie (International Edition in English). 53 (44), 11787-11792 (2014).
- Chen, W. W., et al. Spectroscopic coherent Raman imaging of Caenorhabditis elegans reveals lipid particle diversity. Nature Chemical Biology. 16 (10), 1087-1095 (2020).
- Freudiger, C. W., et al. Stimulated Raman Scattering microscopy with a robust fibre laser source. Nature Photonics. 8 (2), 153-159 (2014).
- Brinkmann, M., et al. Portable all-fiber dual-output widely tunable light source for coherent Raman imaging. Biomedical Optics Express. 10 (9), 4437-4449 (2019).
