Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

نموذج فأر للتحقيق في دور الخلايا الليفية المرتبطة بالسرطان في نمو الورم

Published: December 22, 2020 doi: 10.3791/61883
Automatic Translation
1,2, 1,2,3, 1,2, 3, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 3, 1,2, 1,2, 1,2,4, 1,2, 1,2,4
1Department of Molecular, Cell and Developmental Biology, University of California, Los Angeles, 2Department of Biological Chemistry, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles, 3Department of Molecular Biology, Princeton University, 4Molecular Biology Institute, University of California, Los Angeles

Summary

يتم توفير بروتوكول للحقن المشترك للخلايا السرطانية والخلايا الليفية ومراقبة نمو الورم بمرور الوقت. يمكن استخدام هذا البروتوكول لفهم الأساس الجزيئي لدور الخلايا الليفية كمنظم لنمو الورم.

Abstract

يمكن أن تلعب الخلايا الليفية المرتبطة بالسرطان (CAFs) دورا مهما في نمو الورم من خلال خلق بيئة دقيقة تعزز الورم. يمكن أن تكون نماذج دراسة دور CAFs في البيئة المكروية للورم مفيدة لفهم الأهمية الوظيفية للخلايا الليفية والخلايا الليفية من الأنسجة المختلفة والعوامل الوراثية المحددة في الخلايا الليفية. تعد نماذج الماوس ضرورية لفهم المساهمين في نمو الورم وتطوره في سياق الجسم الحي. هنا ، يتم توفير بروتوكول يتم فيه خلط الخلايا السرطانية مع الخلايا الليفية وإدخالها في الفئران لتطوير الأورام. يتم تحديد أحجام الورم بمرور الوقت وأوزان الورم النهائية ومقارنتها بين المجموعات. يمكن أن يوفر البروتوكول الموصوف مزيدا من التبصر في الدور الوظيفي ل CAFs في نمو الورم وتطوره.

Introduction

داخل البيئة المكروية للورم ، أحد أبرز أنواع الخلايا هو الخلايا الليفية المرتبطة بالسرطان (CAF) 1. يمكن أن تلعب هذه الخلايا الليفية المرتبطة بالسرطان دورا مثبطا للورم 2,3. على سبيل المثال ، تفرز الخلايا الليفية المعبرة عن S100A الكولاجين الذي يمكن أن يغلف المواد المسرطنة ويحمي من تكوين السرطان4. علاوة على ذلك ، فإن استنفاد الخلايا الليفية العضلية الإيجابية α الملساء (SMA) في سرطان البنكرياس يسبب كبت المناعة ويسرع تطور سرطان البنكرياس2. يمكن أن تتطور CAFs أيضا مع الخلايا السرطانية وتعزز تطور الورم5،6،7،8. يمكن للخلايا الليفية توليف وإفراز بروتينات مصفوفة خارج الخلية تخلق بيئة معززة للورم8. يمكن أن تسبب بروتينات المصفوفة خارج الخلية هذه تصلبا ميكانيكيا للأنسجة ، وهو ما يرتبط بتطور الورم 9,10. يمكن أن تعمل المصفوفة خارج الخلية المودعة كحاجز مادي يمنع التسلل المناعي11. ارتبط ترسب المصفوفة بواسطة CAFs أيضا بغزو الورم حيث ثبت أن الفبرونيكتين الناتج عن CAFs يعزز غزو الورم12. تعزز CAFs تكوين الأوعية الدموية وتجند الخلايا المثبطة للمناعة إلى البيئة المكروية للورم عن طريق إفراز عامل النمو المحول β (TGF- β) ، وعامل نمو بطانة الأوعية الدموية (VEGF) ، والإنترلوكين -6 (IL-6) ، و CXC-chemokine ligand 12 (CXCL12) 13،14،15. نظرا لدورها المركزي في تعزيز نمو الورم ، فإن الخلايا الليفية المرتبطة بالسرطان هي هدف ناشئ للعلاج المضاد للسرطان6،16،17،18.

يصف البروتوكول أدناه طريقة لاختبار كيفية تأثير الخلايا الليفية على نمو الأورام في نموذج فأر راسخ ومستخدم على نطاق واسع لنمو الورم. من أجل فهم أهمية الخلايا الليفية في البيئة المكروية للورم ، تم تعديل البروتوكول القياسي لإدخال الخلايا السرطانية في الفئران لمراقبة نموها ليشمل الخلايا الليفية مع إدخال الخلايا السرطانية. يمكن إدخال الخلايا السرطانية تحت الجلد أو داخل الأدمة. قد يؤدي الإدخال داخل الأدمة إلى أورام تنشأ من الجلد نفسه. تمثل الطعوم الخارجية التي يتم فيها حقن الخلايا السرطانية والخلايا الليفية في الفئران أداة منهجية مهمة لتشريح دور الخلايا الليفية والمجموعات الفرعية للخلايا الليفية وعوامل البروتين في القدرة على تعزيز نمو السرطان19،20،21. يتم توفير بروتوكول مفصل للحقن المشترك للخلايا السرطانية والخلايا الليفية في الفئران. يمكن استخدام هذه الطريقة لمقارنة وجود أو عدم وجود الخلايا الليفية ، لمقارنة الخلايا الليفية من مصادر مختلفة20 ، أو لمقارنة الخلايا الليفية مع وبدون التعبير عن بروتينات معينة19. بعد إدخال الخلايا السرطانية والخلايا الليفية ، يمكن مراقبة حجم الورم بمرور الوقت. في نهاية التجارب ، يمكن تشريح الأورام ووزنها. من خلال مراقبة نمو الورم بمرور الوقت ، يمكن تشريح أهمية العوامل المختلفة.

هناك طرق بديلة ممكنة لدراسة دور الخلايا الليفية في نمو الورم. على سبيل المثال ، هناك نماذج قائمة على Cre-loxed توفر خروجا مغلوطا خاصا بالأنسجة للجينات مع محركات يتم التعبير عنها بشكل تفضيلي في الخلايا الليفية. توفر هذه الأساليب أيضا فرصا للتحقيق في دور جينات ومسارات معينة في الخلايا الليفية لتطور الورم. بالمقارنة مع النهج القائمة على Cre-lox ، فإن البروتوكول المقدم سيمثل نهجا أسرع بكثير لمراقبة دور الخلايا الليفية لأنه سيتم مراقبة نمو الورم على مدى بضعة أسابيع فقط. كما أن النهج المقدم أقل تكلفة بشكل ملحوظ لأنه لا يتطلب توليد وإسكان مستعمرات الفئران المعدلة وراثيا. يمكن استخدام البروتوكول المقدم لاختبار تأثير ضربة قاضية للجينات المختلفة بسرعة باستخدام shRNAs بدلا من الحاجة إلى تطوير مستعمرات الفئران. كما أن النهج المقدم أكثر مرونة لأنه سيسمح بمقارنة أعداد مختلفة من الخلايا الليفية ، ونسب مختلفة من الخلايا السرطانية والخلايا الليفية ، وضربة قاضية للجينات المختلفة ، وحتى مقارنة الخلايا الليفية من مواقع أو أنواع الأنسجة المختلفة. سيكون لنهج Cre-lox ميزة أن الخلايا الليفية موجودة داخل الفئران في سياق فسيولوجي أكثر.

سيكون البروتوكول المذكور هنا ذا قيمة للعلماء الذين يسعون إلى مراقبة آثار الخلايا الليفية على نمو الورم بسرعة وفعالية من حيث التكلفة. هذا البروتوكول ذو قيمة خاصة للعلماء الذين يبحثون في مجموعات فرعية مختلفة من الخلايا الليفية أو الخلايا الليفية من مصادر مختلفة على نمو الورم على نمو الورم. إذا كان من المهم أن يحدث بدء الورم في سياق فسيولوجي ، فيجب النظر في نماذج الفئران المعدلة وراثيا.

هناك العديد من الطرق الممكنة لإجراء هذه التجارب. يمكن استخدام الفئران ذات الكفاءة المناعية كمضيفات ، مما يسمح بالتحقيق في تفاعلات الخلايا المناعية الليفية. بالنسبة لنماذج الفئران ذات الكفاءة المناعية ، يجب حقن خلايا سرطان الفئران والخلايا الليفية الجنينية للفأر (MEFs). يسمح استخدام MEFs أيضا للباحث بالاستفادة من مجموعة واسعة من سلالات الفئران بالضربة القاضية لاختبار وجود أو عدم وجود جين مهم. بدلا من ذلك ، يمكن استخدام الفئران التي تعاني من نقص المناعة لاختبار دور الخلايا الليفية البشرية في تعزيز نمو الأورام في الفئران المشتقة من الخلايا السرطانية البشرية. يمكن إجراء إدخال الخلايا السرطانية تحت الجلد أو بشكل تقويمي. بالنسبة للورم الميلانيني ، كما هو موضح أدناه ، يمكن حقن خليط الورم والخلايا الليفية داخل الأدمة للحقن التقويمي الذي يحاكي عن كثب الموقع داخل الجلد حيث قد يتطور الورم الميلانيني.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تمت الموافقة على جميع التجارب الموصوفة من قبل لجنة رعاية الحيوان في جامعة كاليفورنيا ، لوس أنجلوس.

ملاحظة: حدد الخلايا السرطانية والخلايا الليفية التي تتطابق مع الفئران المضيفة لسلالة الفأر. حدد الخلايا السرطانية والخلايا الليفية التي تتطابق مع جنس الفأر المضيف. الحصول على الفئران من مستعمرات التربية أو شرائها من البائعين ذوي السمعة الطيبة. إدخال الأورام في الفئران التي هي ~ 8-10 أسابيع من العمر. الفئران مع الفراء ستكون في مرحلة التيلوجين أو الراحة من دورة بصيلات الشعر. خطط لنسبة 0.5 إلى 3 خلايا ليفية إلى الخلايا السرطانية.

1. تحديد العدد المناسب من الفئران لاستخدامها في التجارب

  1. قبل إجراء الدراسات ، قم بإجراء تحليل للطاقة لتحديد العدد المناسب من الفئران لاستخدامها في الدراسات. استخدم الصيغة التالية لتحديد حجم العينة لتجربة باستخدام الطاقة المحددة:
    n = (Z (1-α / 2) + Z (1-β) / ES) 2
    إذا كان α هو المستوى المحدد للأهمية (عادة 0.05) ، فإن 1-α / 2 = 0.975 و Z = 1.960.
    β هي القوة وإذا كانت الطاقة مطلوبة بنسبة 80٪ ، فإن Z = 0.84.

    ES ، حجم التأثير = \ μ1-μ 0 \ / σ
    حيث μ 0 هو المتوسط تحت الفرضية H0 ، μ 1 هو المتوسط تحت الفرضية H1 ، و σ هو الانحراف المعياري لنتيجة الفائدة22.
    ملاحظة: يمكن العثور على مزيد من المعلومات حول حساب حجم العينة22.

2. توليد الخلايا السرطانية للحقن

  1. حدد معدل النمو ذي الصلة بالمعادلة التالية:
    غرام = (ln (N (t) / N (0))) / t

    ملاحظة: يتم عرض مثال للخلايا التي تتضاعف خلال 24 ساعة
    مضاعفة الوقت = ln (2) / معدل النمو
    24 ساعة = ln (2) / معدل النمو
    24 * معدل النمو = .693
    معدل النمو = .693/24 = .028875
  2. حدد عدد الخلايا السرطانية التي يجب أن تطبقها ومقدار الوقت الذي تحتاجه الخلايا للنمو قبل الحقن.
    ملاحظة: يتم حقن 0.25-1 مليون خلية سرطانية لكل ورم يتم تشكيله.
  3. احسب عدد الأيام المطلوبة لتوليد عدد كاف من الخلايا وفقا للمعادلة
    N(t)=N(0)egr*t
    حيث N (t) هو عدد الخلايا في الوقت t ، N (0) هو عدد الخلايا في الوقت 0 ، gr هو معدل النمو ، و t هو الوقت.
    ملاحظة: مثال على هذه الحسابات لزراعة 500000 خلية لتوليد 106 خلايا في كل من الأورام ال 12. بناء على هذه الحسابات ، 5 أيام كافية لتنمية العدد اللازم من الخلايا:
    N(t)=N(0)egr*t
    12 × 106 = 500000 إلكترون (غرام * ر)
    12 × 106 = 500000 إلكترون (.028875 * ر)
    24=ه(.028875*س)
    ln (24) = 0.028875x
    3.178 = 0.028875x
    X = 110 ساعة = 4.59 يوما
    اترك وقتا إضافيا للخلايا لتعلق على اللوحة وللخلايا التي فقدت أثناء التجميع.
  4. خلايا سرطان الصفائح.
    ملاحظة: ارتد القفازات ومعاطف المختبر عند العمل مع الخلايا المزروعة.
    ملاحظة: قم بإجراء معالجات الخلايا في غطاء التدفق الصفحي لتقليل إدخال الميكروبات من الهواء إلى العينات. عالج غطاء زراعة الأنسجة بالأشعة فوق البنفسجية قبل الاستخدام. استخدم تقنية معقمة وفقط الأدوات البلاستيكية والمواد الاستهلاكية لزراعة الخلايا المعقمة مثل الألواح المعالجة بزراعة الأنسجة والماصات والأنابيب المخروطية.
    1. احسب العدد والحجم الصحيحين لألواح زراعة الأنسجة بناء على عدد الخلايا في القارورة وتركيز الخلية المطلوب بمجرد طلائها.
    2. تسمية لوحات زراعة الأنسجة.
    3. تحضير حمام مائي بالماء عند 37 درجة مئوية.
    4. توسط القسمة في أنابيب مخروطية الشكل وتوضع في حمام مائي على حرارة 37 درجة مئوية. يمكن زراعة العديد من الخلايا السرطانية في وسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM) المكمل بمصل بقري جنيني بنسبة 10٪ (FBS).
    5. قم بإزالة العدد المطلوب من قوارير الخلايا المجمدة من مجمد النيتروجين السائل.
      ملاحظة: استخدم قفازات الفريزر عند التعامل مع الخلايا في مجمد النيتروجين السائل.
    6. قم بإذابة قوارير الخلية بسرعة في حمام مائي أثناء رجها برفق.
      ملاحظة: أضف الإيثانول إلى القفازات أثناء التعامل مع القوارير للحفاظ على العقم.
    7. باستخدام تقنية معقمة في غطاء زراعة الأنسجة ، قم بسحب الخلايا إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل يحتوي على 10 مل من DMEM + 10٪ FBS.
    8. جهاز طرد مركزي خليط الخلية عند 180 × جم لمدة 5 دقائق.
    9. قم بإزالة المادة الطافية برفق باستخدام شفط معقم أو ماصة معقمة سعة 10 مل.
    10. أعد تعليق الخلايا الموجودة في الحبيبات برفق إلى 1 مل من DMEM + 10٪ FBS.
    11. ماصة الخلايا المعاد تعليقها على لوحة زراعة الأنسجة المسمى مع p1000 معقمة.
    12. باستخدام ماصات معقمة سعة 10 مل ، ماصة متوسطة مع مصل في ألواح زراعة الأنسجة.
    13. احتضان لوحات زراعة الأنسجة في حاضنة زراعة الأنسجة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2.
  5. توسيع الخلايا السرطانية لتوليد خلايا سرطانية كافية للحقن.
    ملاحظة: راقب الخلايا باستخدام المجهر الضوئي للالتقاء. التربسين كل يومين إلى ثلاثة أيام أو حسب الحاجة لمنع الخلايا من الوصول إلى التقاء 100٪. إذا كانت هناك حاجة إلى عدد كبير من الخلايا ، فاستخدم القوارير الفائقة (جدول المواد) لزراعة عدد كبير من الخلايا بطريقة فعالة من حيث المساحة والمتوسطة. في كل مرة تحتاج فيها الخلايا إلى المرور ، اتبع هذا الإجراء:
    1. قم بإزالة الوسط من اللوحة بشفط معقم أو ماصة معقمة سعة 10 مل.
    2. اغسل الطبق برفق عن طريق سحب محلول ملحي دافئ مخزن بالفوسفات (PBS). ثم قم بإزالة برنامج تلفزيوني بشفط معقم أو ماصة.
    3. ماصة 5 مل من 1x حمض التربسين-إيثيلين ديامينيترايتيك (EDTA) في برنامج تلفزيوني لصفيحة 10 سم على الخلايا واحتضانها لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية.
    4. قم بإزالة الخلايا من اللوحة باستخدام صنابير لطيفة لإزاحة الخلايا من اللوحة.
    5. باستخدام ماصة معقمة سعة 10 مل ، اجمع الخلايا في DMEM مع مصل FBS بنسبة 10٪ في أنابيب مخروطية.
    6. أنابيب مخروطية الطرد المركزي في 180 × غرام لمدة 5 دقائق.
    7. قم بإزالة المادة الطافية عن طريق سكبها. يجب أن تكون بيليه الخلية مرئية. راقبه للتأكد من بقائه في الأنبوب.
    8. أعد تعليق الخلايا المحببة بإضافة 1 مل من DMEM + 10٪ FBS وسحب السحب لأعلى ولأسفل برفق.
    9. الخلايا المعاد تعليقها على ألواح زراعة الأنسجة الجديدة بالحجم المناسب مع DMEM + 10٪ FBS (10 مل من الوسائط مناسبة للوحة زراعة الأنسجة 10 سم).

3. توليد الخلايا الليفية للحقن

ملاحظة: سوف تشيخ الخلايا الليفية الأولية بعد الكثير من المضاعفة / الممرات. من المهم استخدام الخلايا الليفية الأولية بعد عدد محدود من الممرات أو المضاعفات. تتبع عدد الممرات أو المضاعفة التي نمت فيها الخلايا الليفية من جلد الفأر أو الإنسان. استخدم الخلايا الليفية التي تحتوي على أقل من 15 ممرا للخلايا الليفية الجلدية البشرية الأولية. استخدم الخلايا الليفية التي تحتوي على أقل من 9 ممرات للخلايا الليفية الجنينية للفأر. يتم تغيير الخلايا الليفية عندما تصبح متقاربة. التربسين الخلايا الليفية عندما تكون متقاربة بنسبة 90٪ تقريبا. سيكون للخلايا الليفية خصائص مختلفة اعتمادا على كيفية زراعتها. يروج العديد من العلماء للزراعة على ركائز أكثر صلة من الناحية الفسيولوجية من لوحات زراعة الأنسجة مثل مصفوفات الكولاجين ثلاثية الأبعاد التي تلتقط البيئات الشبيهة بالأنسجة بشكل أكثر فعالية23،24،25.

  1. استخدم المعادلة في القسم 2.1 لتحديد معدل نمو الخلايا الأرومية الليفية.
  2. استخدم المعادلة في القسم 2.2 لتحديد عدد الأيام اللازمة لتوسيع الخلايا الليفية.
  3. قم بصفيحة الخلايا الليفية كما هو موضح في القسم 2.3 باستخدام الوسيط المناسب في اليوم المناسب للتأكد من أن الخلايا السرطانية والخلايا الليفية ستكون جاهزة للحقن في نفس اليوم.
  4. قم بتوسيع الخلايا الليفية في الوسط المناسب لتوليد عدد كاف من الخلايا الليفية اللازمة باتباع الإجراءات الموضحة في القسم 2.4.

4. حلق الفئران لإعداد الفئران للحقن

ملاحظة: ارتد معاطف المختبر وشبكات الشعر وأغطية الأحذية والقفازات عند العمل مع الفئران.

  1. قبل يوم إلى يومين من الحقن ، وفقا لقواعد اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوان ، قم بتخدير الفئران. في حالة استخدام الأيزوفلوران للتخدير ، استخدم مزيجا من الأيزوفلوران و O2. ضع الفئران في غرفة التخدير وأدخل خليط إيزوفلوران (5٪) / O2 للحث على التخدير. ثم ضع مخروط الأنف على الحيوان المخدر للحفاظ على المستوى الجراحي للتخدير مع تدفق مستمر من خليط الأيزوفلوران (2٪) / O2 .
  2. افحص الحيوانات للتأكد من أنها في المستوى الجراحي المناسب للتخدير عن طريق الضغط على إصبع قدم الفأر والتأكد من أن الفأر لا يتحرك.
  3. باستخدام مقص الحيوانات بشفرة جراحية # 40 ، قم بإزالة الفراء برفق من المواضع المناسبة على جوانب الفئران عن طريق تمرير مقص الحيوانات على الجلد عدة مرات حتى تتم إزالة الفراء.
  4. راقب الفئران حتى تتعافى من التخدير.

5. تحضير الخلايا السرطانية والخلايا الليفية للحقن

ملاحظة: يجب حقن الخلايا السرطانية والخلايا الليفية في أقرب وقت ممكن بعد جمعها ، ويفضل أن يكون ذلك في غضون 30 دقيقة. في صباح يوم الحقن ، احصد الخلايا السرطانية والخلايا الليفية بشكل منفصل عن لوحات زراعة الأنسجة. لكل نوع خلية قم بتنفيذ الخطوات التالية:

  1. قم بإزالة الوسط من لوحة زراعة الأنسجة بشفط معقم لطيف أو عن طريق سحب الوسط.
  2. ماصة بلطف على 5 مل من PBS دون تعطيل الخلايا. دوامة برنامج تلفزيوني. قم بشفط PBS برفق بالشفط أو السحب من PBS.
  3. يوضع برفق 5 مل من التربسين-EDTA في برنامج تلفزيوني على طبقة الخلايا ويحتضن لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية.
  4. قم بإزالة الخلايا من اللوحة بصنابير لطيفة لإزاحة الخلايا. ماصة الخلايا عدة مرات مع ماصة 10 مل ونقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي يحتوي على DMEM مع 10 ٪ FBS.
  5. أجهزة الطرد المركزي الأنابيب المخروطية في 180 × غرام لمدة 5 دقائق.
  6. قم بإزالة المادة الطافية عن طريق سكبها برفق ، مع الاحتفاظ بحبيبات الخلية. اغسل بيليه الخلية مرتين باستخدام برنامج تلفزيوني. في كل مرة ، ماصة 10 مل من PBS على الخلايا. تخلط بلطف مع ماصة p1000.
  7. أجهزة الطرد المركزي الخلايا كما في الخطوة 5.5. قم بإزالة PBS برفق باستخدام ماصة وكرر.
  8. أعد تعليق الخلايا المغسولة والحبيبية في 1 مل من PBS باستخدام p1000.
  9. تنظيف شريحة مقياس الدم مع الكحول وجافة.
  10. ماصة 100 ميكرولتر من خليط الخلية في أنبوب وإضافة 400 ميكرولتر من 0.4٪ تريبان الأزرق لتركيز أزرق تريبان النهائي بنسبة 0.32٪.
  11. املأ برفق غرف مقياس الدم الزجاجي أسفل غطاء الغطاء عن طريق سحب خليط الخلية حتى تمتلئ الحجرة.
  12. باستخدام المجهر ، ركز على خطوط الشبكة لهدف 10x.
  13. عد الخلايا الحية غير الملوثة والخلايا الزرقاء في مجموعة واحدة من 16 مربعا.
  14. عد كل 4 مجموعات من 16 مربعا.
  15. متوسط عدد الخلايا للخلايا الواضحة والزرقاء من 4 مجموعات من 16 مربعا واضربها في 10000. اضرب في 5 لتصحيح التخفيف 1: 5 من Trypan الأزرق.
  16. العد النهائي هو التركيز في الخلايا / مل للخلايا القابلة للحياة والميتة. اضرب في الحجم لتحديد العدد الإجمالي للخلايا السرطانية والخلايا الليفية. تأكد من أن جزء الخلايا القابلة للحياة هو >80٪.
  17. تأكد من وجود عدد كاف من خلايا سرطان الجلد والخلايا الليفية لجميع الحقن المخطط لها ، بافتراض فقدان 20٪ على الأقل من العينة أثناء الحقن.
  18. نقل العدد المطلوب من الخلايا إلى أنبوب مخروطي جديد وحبيبات الخلايا عن طريق الطرد المركزي (180 × غرام لمدة 5 دقائق).
  19. قم بإزالة المادة الطافية باستخدام ماصة سعة 10 مل.
  20. أعد تعليق الحبيبات بالتركيز المطلوب بالكمية المناسبة من دستور الأدوية الأمريكي (USP) بدرجة PBS (50 ميكرولتر لكل ورم للحقن داخل الأدمة و 100 ميكرولتر لكل ورم للحقن تحت الجلد).

6. حقن الخلايا السرطانية والخلايا الليفية في الفئران

ملاحظة: إذا تمت الموافقة عليها من قبل لجنة رعاية الحيوان المؤسسية ، فقم بحقن ورمين في كل فأر ، واحد على كل جناح. عشوائيا أي ماوس سيتلقى أي حقنة على الجانبين الأيمن والأيسر. اعتمادا على عدد الفئران المراد حقنها ، قم بتخدير الفئران وحقن الخلايا السرطانية والخلايا الليفية في الفئران على دفعات.

  1. للحقن تحت الجلد للخلايا السرطانية
    1. تخدير الفئران كما هو موضح في القسم 4.1.
    2. امسح الجلد المحلوق بمسحات الكحول.
    3. املأ حقنة معقمة بالحجم المطلوب من الخلايا أو خليط الخلايا وقم بتغطية المحقنة بإبرة قياس 27.
      ملاحظة: تأكد من عدم وجود فقاعات هواء. حرك المحقنة حسب الحاجة لإزالة الفقاعات. بمجرد إدخال الخلايا في المحقنة ، حافظ على الخلايا داخل المحاقن مختلطة جيدا عن طريق قلب المحاقن باستمرار لمنع التكتل.
    4. أدخل الإبرة في المنطقة تحت الجلد على جناح الماوس وحقن الخلايا برفق في الماوس. استخدم معلق خلية 100 ميكرولتر لكل ورم للحقن تحت الجلد (لا ينصح باستخدام حجم يزيد عن 100 ميكرولتر لكل حقنة).
    5. راقب الفئران حتى تتعافى من التخدير. إذا لزم الأمر ، زود الفئران بمواد عازلة إضافية مثل الأكواخ و / أو وسادات التدفئة لمساعدة الفئران على التعافي التام.
  2. للحقن داخل الأدمة للخلايا السرطانية
    1. تخدير الفئران كما هو موضح في القسم 4.1.
    2. امسح الجلد المحلوق بمسحات الكحول.
    3. املأ حقنة معقمة بالحجم المطلوب من الخلايا أو خليط الخلايا وقم بتغطية المحقنة بإبرة قياس 27.
      ملاحظة: تأكد من عدم وجود فقاعات هواء. حرك المحقنة حسب الحاجة لإزالة الفقاعات. بمجرد إدخال الخلايا في المحقنة ، حافظ على الخلايا داخل المحاقن مختلطة جيدا عن طريق قلب المحاقن باستمرار لمنع التكتل.
    4. أدخل إبرة قياس 27 في المنطقة داخل الأدمة من الجلد على جناح الفأر وحقن الخلايا برفق في المنطقة داخل الأدمة في الفأر. استخدم معلق خلية 50 ميكرولتر لكل ورم للحقن داخل الأدمة (لا ينصح باستخدام حجم يزيد عن 50 ميكرولتر لكل حقنة).
    5. راقب الفئران حتى تتعافى من التخدير. إذا كانت هناك علامات على أن الفئران في محنة ، استشر الطبيب البيطري. إذا لزم الأمر ، زود الفئران بمواد عازلة إضافية مثل الأكواخ و / أو وسادات التدفئة لمساعدة الفئران على التعافي التام.

7. مراقبة الفئران أثناء نمو الورم

  1. راقب الفئران يوميا بحثا عن أي علامات للألم أو الضيق (وضعية منحنية ، أو تلوي ، أو نطق ، أو تمدد على طول القفص ، أو الضغط على بطنها إلى أسفل أرضية القفص ، أو الإحجام عن التحرك حول القفص) أو تكوين الخراج. إذا كانت هناك علامات على أن الفئران في محنة ، استشر الطبيب البيطري.
  2. بمجرد تكوين الأورام، قم بقياس حجم الورم كل يومين إلى ثلاثة أيام تقريبا. قياس طول الورم (أطول جانب) والعرض (عمودي على الطول) مع الفرجار.
    ملاحظة: أفضل الممارسات هي أن يقوم نفس الشخص بإجراء هذه القياسات طوال التجربة لتقليل التباين في البيانات. بالنسبة للقياسات ، قم بتخدير الفئران كما هو موضح في القسم 4.1
  3. احسب أحجام الورم بالصيغة الحجم = 0.5 × (الطول ×العرض 2).

8. حصاد الأورام وقياس أوزان الورم

  1. القتل الرحيم للفئران عندما يصل نمو الورم إلى نقطة نهاية تجريبية أنشأتها لجنة المؤسسة المعنية برعاية الحيوان. ضع الفئران في غرفة والقتل الرحيم مع إزاحة بطيئة (20-30٪ في الدقيقة) لهواء الغرفة مع CO2 المضغوط لمدة دقيقة واحدة بعد توقف التنفس.
  2. أداء خلع عنق الرحم على الفئران. كبح القوارض على سطح مستو صلب. ضع قلما قويا أو أي شيء آخر على الجزء الخلفي من الرقبة عند قاعدة الجمجمة. ادفع بسرعة للأمام وللأسفل مع تقييد الجسم للرأس أثناء السحب للخلف مع اليد التي تمسك بقاعدة الذيل. تأكد مع الجس من قطع الحبل الشوكي.
    ملاحظة: يجب إجراء خلع عنق الرحم من قبل موظفي المختبر ذوي الخبرة.
  3. لكل فأر في التجربة ، تأكد من أن الفأر لم يعد على قيد الحياة عن طريق التحقق من عدم وجود تنفس ولا ضربات قلب ولا استجابة لقرصة إصبع القدم.
  4. باستخدام مشرط معقم ومقص جراحي ، قم باستئصال الورم بالكامل من الماوس. باستخدام المقص الجراحي ، قم بقص الأنسجة غير السرطانية من الورم.
  5. وزن الورم على ميزان تحليلي وتسجيل وزن الورم.

9. التحليل الإحصائي لأحجام الورم وأوزان الورم

  1. قارن أحجام الورم بمرور الوقت في كل مجموعة مع تحليل التباين المتكرر (ANOVA). إجراء تحليل مزدوج إذا تم حقن ورمين لكل فأر.
  2. قارن أوزان الورم بين المجموعات المصابة ب ANOVA باستخدام اختبار ثنائي الذيل. يمكن بعد ذلك استخدام اختبار Tukey اللاحق لتحديد المجموعات التي تختلف اختلافا كبيرا عن بعضها البعض. إجراء تحليل مزدوج إذا تم حقن ورمين لكل فأر.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تم استزراع خلايا سرطان الجلد البشرية A2058 والخلايا الليفية الجلدية البشرية الأولية في ظل ظروف معقمة. تم جمع الخلايا وغسلها ثلاث مرات باستخدام برنامج تلفزيوني. تم حقن الفئران التي تعاني من نقص المناعة (NU / J - سلالة Foxn1 عارية) تحت الجلد على جناح واحد مع 0.25 مليون خلية سرطان الجلد A2058 وحدها. على الجانب الآخر ، تم حقن الفئران بمزيج من 0.25 مليون خلية سرطان الجلد A2058 و 0.75 مليون خلية ليفية. تم حقن الخلايا في 12 فأرا تعاني من نقص المناعة. تم الحقن في الأجنحة اليسرى واليمنى بشكل عشوائي. تمت مراقبة أحجام الورم في الأيام 12 و 14 و 16 و 19 و 21 يوما بعد الحقن (الشكل 1 أ). عند القتل الرحيم ، تم استئصال الأورام وتصويرها (الشكل 1 ب) ووزنها (الشكل 1 ج). يؤدي وجود الخلايا الليفية إلى أورام أكبر بكثير.

Figure 1
الشكل 1: مقارنة نمو الورم الميلانيني في وجود وغياب الخلايا الليفية المحقونة بالحقن المشترك. تم إدخال خلايا سرطان الجلد في الفئران العارية إما مع أو بدون الخلايا الليفية الجلدية الأولية. (أ) مخطط حجم الورم بمرور الوقت للأورام الميلانينية مع وبدون الخلايا الليفية المحقونة بشكل مشترك. تم حساب الحجم على أنه 0.5 * الطول * العرض2. يتم رسم متوسط الأحجام والخطأ المعياري للمتوسط (SEM). تم تنفيذ ANOVA لتحديد الأهمية. ب: صور الأورام المستأصلة. ج: الأوزان النهائية للأورام في نهاية التجربة في اليوم 21. يتم رسم متوسط الأوزان و SEM. تم استخدام اختبار t غير المزاوج ثنائي الطرف لمقارنة الأوزان النهائية. * تشير إلى p < 0.05 ، *** تشير إلى p < 0.001. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

في التجربة الموضحة في الشكل 1، أدى إدخال الخلايا الليفية الجلدية البشرية مع خلايا الورم الميلانيني A2058 البشرية إلى أورام أكبر مما كانت عليه عندما تم إدخال خلايا الورم الميلانيني بدون الخلايا الليفية المحقونة بشكل مشترك. يمكن اكتشاف هذا الاختلاف بسهولة بناء على حجم الورم ووزن الورم. تتوافق النتائج مع تقارير متعددة تفيد بأن الخلايا الليفية المرتبطة بالسرطان يمكن أن تعزز نمو الورم5،6،7،8. بالإضافة إلى نقاط النهاية التي تمت مناقشتها هنا مثل حجم الورم ووزن الورم ، يمكن أيضا مراقبة نقاط النهاية الإضافية. من الممكن أيضا إجراء تحليلات إضافية. على سبيل المثال ، يمكن جمع الأورام التي تتطور في الفورمالين للتثبيت ، وتضمين البارافين وتحليلها باستخدام الهيماتوكسيلين ويوزين للأنسجة. بدلا من ذلك ، يمكن جمع الأورام التي تم تطويرها في مركب درجة حرارة القطع الأمثل (OCT) لمزيد من التحليل مع التألق المناعي لبروتينات معينة.

أحد القيود المهمة لهذه التجارب هو أن الخلايا الليفية التي يتم حقنها مع الخلايا السرطانية قد تشيخ أو تموت بعد انقسامات قليلة في الخلايا. بدلا من ذلك ، قد تهاجر الخلايا الليفية المحقونة بشكل مشترك بعيدا عن الورم ، وفي هذه الحالة ، قد لا تؤثر على نمو الورم. إذا شيخت الخلايا الليفية أو ماتت أو هاجرت بعيدا عن الورم ، فستصبح أقل وفرة بمرور الوقت وسيصبح تأثير الخلايا الليفية التي يتم إدخالها بشكل مشترك أقل أهمية لنمو الورم. في الواقع ، من المتوقع أن تقوم الخلايا السرطانية المدخلة بتجنيد خلايا ليفية إضافية من المضيف. بالنسبة للتجارب التي يتم فيها هدم جين معين أو التخلص منه في الخلايا الليفية المدخلة ، بمرور الوقت ، من المتوقع أن يؤدي تجنيد الخلايا الليفية المضيفة التي تعبر عن البروتين المشفر إلى تقليل أي نمط ظاهري يمكن ملاحظته. لمراقبة وجود الخلايا الليفية المدخلة ، يمكن هندسة الخلايا الليفية وراثيا للتعبير عن بروتين فلوري مثل GFP26,27. إذا كانت الخلايا الليفية تعبر عن GFP ، فيمكن استخدام قياس التدفق الخلوي لمراقبة عدد الخلايا الليفية الموجودة داخل الورم في أيام مختلفة بعد إدخالها. كبديل ، يمكن إدخال إنزيم لوسيفيراز في الخلايا الليفية ويمكن استخدام تصوير التلألؤ الحيوي لمراقبة كمية الخلايا الليفية في الفئران بمرور الوقت. إذا تم التخلص من الخلايا الليفية بسرعة من البيئة المكروية للورم ، فإن نماذج الفئران المعدلة وراثيا Cre-lox ستعالج هذا القلق وتكمل الدراسات الموصوفة.

إذا تم إجراء التجارب عن طريق إدخال الخلايا السرطانية البشرية والخلايا الليفية في الفئران العارية ، فمن المتوقع أن يكون للجهاز المناعي المحدود تأثير كبير على النتائج. تفتقر الفئران العارية الأثيمية (NU / J) إلى الخلايا التائية وبالتالي تفتقر إلى المناعة الخلوية بوساطة. لديهم أيضا عيب جزئي في نمو الخلايا البائية. يمكن أن تلعب المناعة بوساطة الخلية ، أي قتل الخلايا عبر الخلايا التائية CD8 + المنشطة ، دورا مهما في قمع نمو الورم28,29. في الدراسات الحديثة ، تم الإبلاغ عن التفاعل بين الخلايا الليفية المرتبطة بالسرطان والخلايا التائية CD8 +30،31،32. يمكن اعتبار إدخال خلايا سرطان الفئران والخلايا الليفية للفأر في الفئران ذات الجهاز المناعي كنهج بديل من شأنه معالجة هذه المشكلة.

نهج بديل آخر هو استخدام نماذج الفئران المعدلة وراثيا حيث يتم استخدام نظام Cre-lox لتعديل مستويات أو نشاط بروتينات معينة في الخلايا الليفية المضيفة. أحد هذه الأساليب هو استخدام نماذج Cre-lox الغنية بالخلايا الليفية مع برامج تشغيل مثل FSP1 أو Col1a1 أو Col1a2 أو PDGFRa33،34،35. مع نموذج Cre / lox recombinase ، لن يكون هناك قلق من أن الخلايا الليفية المحقونة ستموت أو تهاجر بعيدا عن الورم.

هناك بعض الخطوات في البروتوكول المقدم والتي تعتبر حاسمة لنجاحه. يعد نمو الخلايا الليفية جزءا مهما من البروتوكول ومن المرجح أن يساهم بشكل كبير في النتيجة. تشيخ الخلايا الليفية الأولية بسهولة ، ويجب مراقبة المرور أو المضاعفة بعناية للتأكد من أن الخلايا الليفية في مرحلة النمو الأسي ولم تشيخ. من المتوقع أن تفرز الخلايا الليفية الهرمة مستويات عالية من السيتوكينات التي يمكن أن يكون لها تأثير كبير على نمو الورم36،37،38. وبالتالي ، من الأهمية بمكان أن يتم توثيق رقم الممر بعناية وأن الخلايا الليفية المحقونة ليست شيخوخة ما لم يستدعي البروتوكول تحليل الخلايا الليفية الهرمة.

عندما تصبح الخلايا الليفية متقاربة ، من المتوقع أن تخضع لعدد كبير من التغييرات ، ومن المحتمل أن ينعكس بعضها عند دخولها مرة أخرى إلى دورة الخلية39،40،41،42،43،44. يعد الحفاظ على الخلايا الليفية في حالة تكاثرية وتقسيمها عندما تكون متقاربة بنسبة 90٪ أمرا مهما لضمان اتساق الدراسات قدر الإمكان. من المحتمل أن تؤثر زراعة الخلايا الليفية على ألواح زراعة الأنسجة أيضا على سلوكها ويجب اعتبار البدائل مثل مصفوفات الكولاجين ثلاثية الأبعاد23،24،25. تظهر الخلايا الليفية المستزرعة في مصفوفات 3D أنماط هجرة مختلفة بشكل كبير عن الخلايا الليفية المزروعة على أسطح 2D 45،46،47،48،49 ، والتي من المحتمل أن تؤثر على قدرتها على تعزيز الورم عند إدخالها في الأورام ، حيث ستلعب الخلايا الليفية دورا نشطا في إنشاء البيئة الدقيقة للمصفوفة خارج الخليةللورم 50.

يمكن أن يؤدي حقن خلايا سرطان الجلد في الفأر عن طريق الحقن داخل الأدمة إلى نمو الورم القابل للتكرار أكثر من الحقن تحت الجلد. هذه خطوة صعبة حيث توجد مساحة صغيرة جدا في المنطقة داخل الأدمة. من المهم وضع الإبرة بعناية. إذا تم إجراء الحقن داخل الأدمة ، يتم حقن 50 ميكرولتر فقط من المحلول. حتى بالنسبة للباحثين ذوي الخبرة ، يمكن أن تتسرب هذه الحقن. من المهم ملاحظة ما إذا كانت كل حقنة قد تسربت بحيث إذا لم يتشكل ورم ، يمكن إزالته من التحليل النهائي.

يعد تحضير المحاقن للحقن خطوة حاسمة أخرى. من المهم إزالة جميع الفقاعات من المحقنة ، والتي قد تتطلب تحريك المحقنة للقضاء على الفقاعات. من المهم أيضا ألا تتكتل الخلايا. اقلب المحاقن بشكل متكرر لمنع التكتل.

جانب آخر صعب من هذه التجارب هو أن قياس حجم الورم يمكن أن يكون متغيرا من شخص لآخر. من أجل الحد من التباين في قياسات حجم الورم ، من المفيد تعيين مسؤول عضو واحد في المختبر عن أخذ جميع قياسات حجم الورم في جميع الفئران وفي جميع النقاط الزمنية طوال التجربة.

يفضل حقن الفئران بخلايا سرطانية من نفس جنس الفأر المضيف كلما أمكن ذلك. من الممكن استخدام كلا الجنسين وتضمين الجنس كمتغير في نماذج ANOVA لتحديد ما إذا كان الجنس يؤثر على حجم الورم بمرور الوقت.

يعد فهم البيئة المكروية للورم أمرا ضروريا لاكتساب نظرة ثاقبة حول تكوين الورم. يمكن أن يوفر البروتوكول أساسا لفهم دور الخلايا الليفية وأنواع مختلفة من الخلايا الليفية والمسارات المختلفة داخل الخلايا الليفية التي يمكن أن تؤثر على نمو الورم. قد تحدد نتائج هذه التجارب أهدافا علاجية جديدة تمنع الخلايا الليفية من تعزيز نمو الورم18.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

يود المؤلفون أن يشكروا جميع أعضاء مختبر كولر على المدخلات المفيدة. كان H.A.C. باحث ميلتون إي كاسيل في مؤسسة ريتا ألين. نحن نعترف بالمعاهد الوطنية للصحة / NCI 1 R01 CA221296-01A1 ، NIH 1 R01 AR070245-01A1 ، جائزة العلوم لفريق تحالف أبحاث سرطان الجلد ، جائزة برنامج تكامل المختبرات السريرية لمعهد أبحاث السرطان ، مركز إيريس كانتور لصحة المرأة / منحة UCLA CTSI NIH UL1TR000124 ، لجنة تنسيق أبحاث السرطان بجامعة كاليفورنيا ، جائزة موضوع التمثيل الغذائي في كلية ديفيد جيفن للطب ، معهد العلوم الانتقالية السريرية ومركز جونسون الشامل للسرطان ، جوائز الابتكار من مركز أبحاث الخلايا الجذعية العريضة (روز هيلز وها جابا) ، جائزة من UCLA SPORE في سرطان البروستاتا (المعهد الوطني للسرطان التابع للمعاهد الوطنية للصحة تحت رقم الجائزة P50CA092131) ، جائزة الابتكار من مركز برود للخلايا الجذعية ، مركز إيلي وإيديث برود للطب التجديدي وأبحاث الخلايا الجذعية في جامعة كاليفورنيا في لوس أنجلوس ، برنامج التدريب على بيولوجيا الخلايا السرطانية (جائزة USHHS Ruth L. Kirschstein Institutional National Research Service # T32 CA009056) ، وبرنامج الأمراض الجلدية T32 في UCLA AR071307 ، وبرنامج تدريب UCLA Muscle Cell Biology و Pathophysiology and Therapeutics T32 5 T32 AF 65972.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
26G Needles Fisher Scientific 14-826-10
Alcohol swabs Fisher Scientific 326895
Animal clipper miniARCO with surgical blade #40 WAHL Professional 8787-450A
Athymic nude mice (NU/J) The Jackson labs 002019 These mice are immunocompromised and can be used for experiments in which human cells are introduced. Immunocompetent mice can also be used if mouse cancer cells and fibroblasts will be introduced.
Cancer cells ATCC ATCC® CRL-11147™ This is the catalog number for a primary human melanoma cell line. Other cancer cell types can also be used.
Cell Culture Multi Flasks Fisher Scientific 14-826-95
Centrifuge for conical tubes capable of reaching 180 x g Fisher Scientific 14-432-22
Countess Cell Counting Chamber Fisher Scientific C10228
Dulbecco's Modified Eagle Medium Fisher Scientific 11965-118
Fetal bovine serum Fisher Scientific MT35010CV
Fibroblasts  ATCC PCS-201-012 We isolate fibroblasts from skin in our lab. This is a catalog number for an adult primary human dermal fibroblast cell line. MEFs and fibroblasts derived from other sites can also be used.
Isoflurane Henry Schein Animal Health NDC 11695-6776-2
PBS USP grade for injection into mice Fisher Scientific 50-751-7476
Sterile 10 ml serological pipet Celltreat 667210B
Sterile 5 ml serological pipet Celltreat 229005B
Sterile 50 ml centrifuge tubes Genesee Scientific 28-108
Sterile Syringe Filters pore size 0.2 microns Fisher Scientific 09-740-61A
Sterile tissue culture-grade Trypsin-EDTA Fisher Scientific 15400054
Sterile tissue-culture grade PBS Fisher Scientific 50-751-7476
Sterle 25 ml serological pipet Celltreat 667225B
TC treated 100 x 20 mm dishes Genesee Scientific 25-202
TC treated 150 x 20 mm dishes Genesee Scientific 25-203
TC treated 60 x 15 mm dishes Genesee Scientific 25-260
Trypan blue Fisher Scientific C10228

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Liu, T., et al. Cancer-associated fibroblasts: an emerging target of anti-cancer immunotherapy. Journal of Hematology and Oncololgy. 12 (1), 86 (2019).
  2. Ozdemir, B. C., et al. Depletion of carcinoma-associated fibroblasts and fibrosis induces immunosuppression and accelerates pancreas cancer with reduced survival. Cancer Cell. 25 (6), 719-734 (2014).
  3. Rhim, A. D., et al. Stromal elements act to restrain, rather than support, pancreatic ductal adenocarcinoma. Cancer Cell. 25 (6), 735-747 (2014).
  4. Zhang, J., et al. Fibroblast-specific protein 1/S100A4-positive cells prevent carcinoma through collagen production and encapsulation of carcinogens. Cancer Research. 73 (9), 2770-2781 (2013).
  5. Ohlund, D., Elyada, E., Tuveson, D. Fibroblast heterogeneity in the cancer wound. Journal of Experimental Medicine. 211 (8), 1503-1523 (2014).
  6. Chen, X., Song, E. Turning foes to friends: targeting cancer-associated fibroblasts. Nature Reviews Drug Discovery. 18 (2), 99-115 (2019).
  7. Wang, W., et al. Crosstalk to stromal fibroblasts induces resistance of lung cancer to epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors. Clinical Cancer Research. 15 (21), 6630-6638 (2009).
  8. Hwang, R. F., et al. Cancer-associated stromal fibroblasts promote pancreatic tumor progression. Cancer Research. 68 (3), 918-926 (2008).
  9. Tsujino, T., et al. Stromal myofibroblasts predict disease recurrence for colorectal cancer. Clinical Cancer Research. 13 (7), 2082-2090 (2007).
  10. Laklai, H., et al. Genotype tunes pancreatic ductal adenocarcinoma tissue tension to induce matricellular fibrosis and tumor progression. Nature Medicine. 22 (5), 497-505 (2016).
  11. Cukierman, E., Bassi, D. E. Physico-mechanical aspects of extracellular matrix influences on tumorigenic behaviors. Seminars in Cancer Biology. 20 (3), 139-145 (2010).
  12. Attieh, Y., et al. Cancer-associated fibroblasts lead tumor invasion through integrin-beta3-dependent fibronectin assembly. Journal of Cell Biology. 216 (11), 3509-3520 (2017).
  13. Ahmadzadeh, M., Rosenberg, S. A. TGF-beta 1 attenuates the acquisition and expression of effector function by tumor antigen-specific human memory CD8 T cells. Journal of Immunology. 174 (9), 5215-5223 (2005).
  14. Feig, C., et al. Targeting CXCL12 from FAP-expressing carcinoma-associated fibroblasts synergizes with anti-PD-L1 immunotherapy in pancreatic cancer. Proceedings of the National Academy of Science, U S A. 110 (50), 20212-20217 (2013).
  15. Kojima, Y., et al. Autocrine TGF-beta and stromal cell-derived factor-1 (SDF-1) signaling drives the evolution of tumor-promoting mammary stromal myofibroblasts. Proceedings of the National Academy of Science, U S A. 107 (46), 20009-20014 (2010).
  16. Kalluri, R. The biology and function of fibroblasts in cancer. Nature Reviews Cancer. 16 (9), 582-598 (2016).
  17. Ziani, L., Chouaib, S., Thiery, J. Alteration of the Antitumor Immune Response by Cancer-Associated Fibroblasts. Frontiers in Immunology. 9, 414 (2018).
  18. Sahai, E., et al. A framework for advancing our understanding of cancer-associated fibroblasts. Nature Reviews Cancer. 20 (3), 174-186 (2020).
  19. Grum-Schwensen, B., et al. Suppression of tumor development and metastasis formation in mice lacking the S100A4(mts1) gene. Cancer Research. 65 (9), 3772-3780 (2005).
  20. Kojima, M., et al. Human subperitoneal fibroblast and cancer cell interaction creates microenvironment that enhances tumor progression and metastasis. PLoS One. 9 (2), 88018 (2014).
  21. Noel, A., et al. Enhancement of tumorigenicity of human breast adenocarcinoma cells in nude mice by matrigel and fibroblasts. British Journal of Cancer. 68 (5), 909-915 (1993).
  22. Sullivan, L. M. Estimation from samples. Circulation. 114 (5), 445-449 (2006).
  23. Yamada, K. M., Cukierman, E. Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D. Cell. 130 (4), 601-610 (2007).
  24. Damianova, R., Stefanova, N., Cukierman, E., Momchilova, A., Pankov, R. Three-dimensional matrix induces sustained activation of ERK1/2 via Src/Ras/Raf signaling pathway. Cell Biology International. 32 (2), 229-234 (2008).
  25. Rhee, S. Fibroblasts in three dimensional matrices: cell migration and matrix remodeling. Experimental & Molecular Medicine. 41 (12), 858-865 (2009).
  26. Hoffman, R. M. Application of GFP imaging in cancer. Labortatory Investigation. 95 (4), 432-452 (2015).
  27. Orimo, A., et al. Stromal fibroblasts present in invasive human breast carcinomas promote tumor growth and angiogenesis through elevated SDF-1/CXCL12 secretion. Cell. 121 (3), 335-348 (2005).
  28. Naito, Y., et al. CD8+ T cells infiltrated within cancer cell nests as a prognostic factor in human colorectal cancer. Cancer Research. 58 (16), 3491-3494 (1998).
  29. Fu, C., Jiang, A. Dendritic Cells and CD8 T Cell Immunity in Tumor Microenvironment. Frontiers Immunolofy. 9, 3059 (2018).
  30. Lakins, M. A., Ghorani, E., Munir, H., Martins, C. P., Shields, J. D. Cancer-associated fibroblasts induce antigen-specific deletion of CD8 (+) T Cells to protect tumour cells. Nature Communications. 9 (1), 948 (2018).
  31. Kato, T., et al. Cancer-Associated Fibroblasts Affect Intratumoral CD8(+) and FoxP3(+) T Cells Via IL6 in the Tumor Microenvironment. Clinical Cancer Research. 24 (19), 4820-4833 (2018).
  32. Gorchs, L., et al. Human Pancreatic Carcinoma-Associated Fibroblasts Promote Expression of Co-inhibitory Markers on CD4(+) and CD8(+) T-Cells. Frontiers Immunology. 10, 847 (2019).
  33. Duscher, D., et al. Fibroblast-Specific Deletion of Hypoxia Inducible Factor-1 Critically Impairs Murine Cutaneous Neovascularization and Wound Healing. Plastic Reconstructive Surgery. 136 (5), 1004-1013 (2015).
  34. Zheng, B., Zhang, Z., Black, C. M., de Crombrugghe, B., Denton, C. P. Ligand-dependent genetic recombination in fibroblasts : a potentially powerful technique for investigating gene function in fibrosis. American Journal of Pathology. 160 (5), 1609-1617 (2002).
  35. Swonger, J. M., Liu, J. S., Ivey, M. J., Tallquist, M. D. Genetic tools for identifying and manipulating fibroblasts in the mouse. Differentiation. 92 (3), 66-83 (2016).
  36. Krtolica, A., Parrinello, S., Lockett, S., Desprez, P. Y., Campisi, J. Senescent fibroblasts promote epithelial cell growth and tumorigenesis: a link between cancer and aging. Proceedings of the National Academy of Science, U S A. 98 (21), 12072-12077 (2001).
  37. Ortiz-Montero, P., Londono-Vallejo, A., Vernot, J. P. Senescence-associated IL-6 and IL-8 cytokines induce a self- and cross-reinforced senescence/inflammatory milieu strengthening tumorigenic capabilities in the MCF-7 breast cancer cell line. Cell Communication and Signaling. 15 (1), 17 (2017).
  38. Coppe, J. P., et al. Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor. PLoS Biology. 6 (12), 2853-2868 (2008).
  39. Coller, H. A., Sang, L., Roberts, J. M. A new description of cellular quiescence. PLoS Biolofy. 4 (3), 83 (2006).
  40. Mitra, M., et al. Alternative polyadenylation factors link cell cycle to migration. Genome Biolofy. 19 (1), 176 (2018).
  41. Lemons, J. M., et al. Quiescent fibroblasts exhibit high metabolic activity. PLoS Biology. 8 (10), 1000514 (2010).
  42. Suh, E. J., et al. A microRNA network regulates proliferative timing and extracellular matrix synthesis during cellular quiescence in fibroblasts. Genome Biology. 13 (12), 121 (2012).
  43. Legesse-Miller, A., et al. Quiescent fibroblasts are protected from proteasome inhibition-mediated toxicity. Molecular Biology of the Cell. 23 (18), 3566-3581 (2012).
  44. Evertts, A. G., et al. H4K20 methylation regulates quiescence and chromatin compaction. Molecular Biology of the Cell. 24 (19), 3025-3037 (2013).
  45. Johnson, L. A., et al. Matrix stiffness corresponding to strictured bowel induces a fibrogenic response in human colonic fibroblasts. Inflammatory Bowel Disease. 19 (5), 891-903 (2013).
  46. Marinkovic, A., Liu, F., Tschumperlin, D. J. Matrices of physiologic stiffness potently inactivate idiopathic pulmonary fibrosis fibroblasts. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 48 (4), 422-430 (2013).
  47. Tschumperlin, D. J. Fibroblasts and the ground they walk on. Physiology (Bethesda). 28 (6), 380-390 (2013).
  48. Tschumperlin, D. J., et al. Mechanotransduction through growth-factor shedding into the extracellular space. Nature. 429 (6987), 83-86 (2004).
  49. Doyle, A. D., Wang, F. W., Matsumoto, K., Yamada, K. M. One-dimensional topography underlies three-dimensional fibrillar cell migration. Journal of Cell Biology. 184 (4), 481-490 (2009).
  50. Alexander, J., Cukierman, E. Stromal dynamic reciprocity in cancer: intricacies of fibroblastic-ECM interactions. Current Opinions in Cell Biology. 42, 80-93 (2016).

Tags

أبحاث السرطان ، العدد 166 ، الخلايا الليفية المرتبطة بالسرطان ، الطعم الأجنبي ، الورم الميلانيني ، الحقن داخل الأدمة ، تقويم العظام ، البيئة المكروية للورم
نموذج فأر للتحقيق في دور الخلايا الليفية المرتبطة بالسرطان في نمو الورم
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jelinek, D., Zhang, E. R., Ambrus,… More

Jelinek, D., Zhang, E. R., Ambrus, A., Haley, E., Guinn, E., Vo, A., Le, P., Kesaf, A. E., Nguyen, J., Guo, L., Frederick, D., Sun, Z., Guo, N., Sevier, P., Bilotta, E., Atai, K., Voisin, L., Coller, H. A. A Mouse Model to Investigate the Role of Cancer-Associated Fibroblasts in Tumor Growth. J. Vis. Exp. (166), e61883, doi:10.3791/61883 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter