Summary
Aquí describimos la adquisición óptica y la caracterización de potenciales de acción de cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas utilizando un sistema de fotometría modular de alta velocidad.
Abstract
Las técnicas convencionales de microelectrodos intracelulares para cuantificar la electrofisiología de cardiomiocitos son extremadamente complejas, requieren mucha mano de obra y, por lo general, se llevan a cabo con bajo rendimiento. La expansión rápida y continua de la tecnología de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) presenta un nuevo estándar en la investigación cardiovascular y ahora se necesita métodos alternativos para aumentar el rendimiento de los datos electrofisiológicos a nivel de una sola célula. VF2.1Cl es un tinte sensible al voltaje recientemente derivado que proporciona una respuesta rápida de un solo canal y de alta magnitud a las fluctuaciones en el potencial de membrana. Posee una cinética superior a las de otros indicadores de tensión existentes y pone a disposición datos funcionales equivalentes a los de las técnicas tradicionales de microelectrodos. Aquí, demostramos una caracterización simplificada y no invasiva del potencial de acción en cardiomiocitos humanos derivados de iPSC de ritmo externo utilizando un sistema de fotometría modular y altamente asequible.
Introduction
El modelado electrofisiológico de cardiomiocitos y la construcción de plataformas eficientes para el cribado de fármacos cardíacos es esencial para el desarrollo de estrategias terapéuticas para una variedad de trastornos arrítmicos. La rápida expansión de la tecnología de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) ha producido avances prometedores en el modelado de enfermedades humanas y la investigación farmacológica utilizando cardiomiocitos aislados derivados de pacientes (iPSC-CM). Las técnicas "estándar de oro" para la caracterización electrofisiológica de estas células a través de patch-clamp (current-clamp) pueden cuantificar la morfología y la duración del potencial de acción (AP), sin embargo, este método es increíblemente complejo y lento, y no es adecuado para la adquisición de datos de alto rendimiento1. Se informa regularmente que los iPSC-CMs tienen un mayor potencial de membrana diastólica y una mayor corriente de fuga en comparación con los cardiomiocitos nativos adultos2. Se sugiere que el tamaño celular más pequeño y la capacitancia de membrana reducida observada en iPSC-CMs pueden producir algún error sistemático al usar la técnica de pinza de corriente, tal vez explicando estas desviaciones3. Con el fin de maximizar la utilidad de una plataforma iPSC-CM, un método adicional es valioso para aumentar el rendimiento y garantizar la precisión de los datos al caracterizar los cambios de voltaje transmembrana a nivel de una sola celda en iPSC-CM.
Los colorantes sensibles al voltaje (VSD) han sido durante mucho tiempo un método propuesto para proporcionar un análisis más rápido, no invasivo y equivalente de la cinética cardíaca de AP comparativa con las de las técnicas tradicionales4. Un estudio reciente ha demostrado la idoneidad de la fotometría de sonda sensible al voltaje ratiométrico para cuantificar con precisión el APcardíaco 5. Además, la capacidad de ampliar fácilmente los enfoques de fotometría óptica presta esta técnica a pruebas de cardiotoxicidad a gran escala críticas en el desarrollo de fármacos terapéuticos (por ejemplo, CiPA). El desarrollo de protocolos estandarizados de cardiotoxicidad en un estudio cegado de múltiples sitios utilizando matriz de microelectrodos y técnicas ópticas de detección de voltaje ha demostrado el valor clave de este enfoque6.
Muchos colorantes potenciométricos están disponibles comercialmente, y el desarrollo sintético en curso de nuevas sondas muestra un potencial emocionante para racionalizar su efectividad en una variedad de construcciones cardíacas y neuronales. El VSD ideal tendrá una cinética y sensibilidad aumentadas, al tiempo que mostrará una menor carga capacitiva, fotobleaching y citotoxicidad. El recientemente sintetizado VF2.1Cl (FluoVolt) expresa muchas de estas propiedades beneficiosas en gran parte debido a su novedosa estructura molecular basada en cables, compartida por otros miembros de la nueva familia VoltageFluor (VF)7. A diferencia de los VSD electrocrómicos comunes en los que sondas simples se conjugan molecular y eléctricamente con la membrana plasmática, este tinte consiste en un alambre sintético insertado pasivamente que abarca la membrana que empareja un donante rico en electrones con un fluorescéforo de fluoresceína modificado (FITC). Los detalles mecanicistas se proporcionan en la Figura 1. Este tinte demuestra una excelente sensibilidad a las fluctuaciones de voltaje de la membrana, mostrando un cambio del 27% en la intensidad de emisión por 100 mV en comparación con ~ 10% visto en otras sondas comunes a velocidades comparables7. Además, los sistemas PeT basados en cables no interactúan directamente con el campo eléctrico celular, lo que produce una interferencia eléctrica mínima y cambios insignificantes en la carga capacitiva celular.
Figura 1: Parámetros químicos, espectrales y mecanicistas del colorante VF2.1Cl. (A) Estructura química de VF2.1Cl. Las características moleculares a tener en cuenta incluyen múltiples grupos alquilo dentro del alambre molecular de fenileno vinileno que facilitan la inserción en la membrana plasmática. Un grupo de ácido sulfónico cargado negativamente conjugado a la sonda FITC asegura la estabilización del fluoróforo en la superficie extracelular y ayuda a la inserción casi perpendicular en relación con el campo eléctrico de la bicapa lipídica. (B) Un esquema simplificado de la incrustación perpendicular vf2.1Cl en la membrana plasmática de una célula diana. (C) Espectros de absorción y emisión del colorante VF2.1Cl. Spectra es idéntico al de las sondas ESTÁNDAR FITC y GFP. (D) Representación del modo de acción mecanicista de VF2.1Cl. En condiciones de reposo (hiperpolarizadas), los voltajes intracelulares negativos impulsan los electrones libres hacia el fluoróforo rostral. La abundancia de electrones asegura que la transferencia de electrones fotoinducida (PeT) se favorezca como una vía para salir del estado excitado después de la excitación óptica, apagando efectivamente la fluorescencia. Por el contrario, un potencial de membrana despolarizada influye en el movimiento de electrones hacia abajo favoreciendo la fluorescencia sobre la excitación óptica. La respuesta fluorescente resultante está linealmente relacionada con el voltaje de la membrana y se puede utilizar con precisión para recopilar información temporal detallada sobre la cinética electrofisiológica celular. (E) Imágenes representativas de campo brillante (superior) y fluorescencia a 470 nm (inferior) de cardiomiocitos de leporina cargados con VF2.1Cl. (F) Z stack de un solo cardiomiocito cargado. Las flechas indican áreas de clara localización de VF2.1Cl a la membrana celular. Las imágenes se adquirieron con un sistema confocal de disco giratorio que consiste en una cabeza confocal de disco giratorio X-lightv3 con un patrón estenopeico de 50 μm; Iluminador LDI-7; Cámara Prime95B y un objetivo PlanApo Lambda 100x. Barra de escala: 20 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
La sonda FITC conjugada a VF2.1Cl garantiza que se pueda utilizar de manera efectiva en configuraciones de filtro estándar y GFP, y solo requiere un sistema de adquisición de un solo canal, que son características comunes de las plataformas de imágenes fluorescentes. El análisis de monocapas iPSC-CM humanas densas con este tinte se ha reportado recientemente8,9,10,11. Nuestro protocolo difiere de estos estudios debido a nuestra investigación de iPSC-CMs únicos y aislados, imperturbables por las influencias eléctricas y paracrinas de las monocapas sincitiales densas, y nuestro uso de un sistema de fotometría asequible y personalizable en lugar de complejos arreglos de imágenes confocales o de campo amplio.
Aquí, describimos nuestro protocolo para la rápida adquisición y análisis de AP ópticos robustos a partir de cardiomiocitos humanos aislados derivados de iPSC y cardiomiocitos nativos (ver Archivo Complementario). Utilizamos VF2.1Cl junto con una plataforma personalizable de última generación para mediciones de fotometría de una sola célula. Estos protocolos experimentales han sido aprobados por el comité de ética del Centro Médico Universitario de Gotinga (Nº 10/9/15).
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Protocol
1. Preparaciones celulares
NOTA: Las iPSC humanas utilizadas en este protocolo se derivaron de donantes sanos y se diferenciaron en monocapas utilizando la modulación de moléculas pequeñas completamente definida de la señalización WNT y las técnicas de purificación de lactato como se describió anteriormente12,13,14. Los iPSC-CMs se mantuvieron cada 2-3 días con un medio de cultivo que se describe a continuación.
- Preparar un medio de cultivo de medio basal (RPMI 1640) y suplemento al 2% (B27). Conservar a 4 °C. Uso a temperatura ambiente (RT).
- Preparar un medio de recubrimiento de medio basal (RPMI 1640), suplemento al 2% (B27) e inhibidor de ROCK 1:2000. Conservar a 4 °C. Uso en RT.
- Cubra las cubiertas de vidrio redondo de 10 mm esterilizadas de 10 mm #0 con 150 μL de matriz de membrana basal libre de factor 1:60 e incube a 4 °C durante 4 h.
NOTA: La optimización del volumen de la cubierta es necesaria para garantizar que todo el vidrio esté cubierto mientras se mantiene una tensión superficial adecuada para evitar derrames. Se recomienda 150 μL para fundas redondas de 10 mm. El tamaño del lote, el tipo de cubierta, el volumen de la cubierta y el tipo de placa de cultivo pueden adaptarse a las necesidades de los experimentadores. - Comience la disociación de iPSC-CM con un reactivo de disociación celular basado en EDTA. Asegúrese de que la monocapa esté completamente separada enjuagando suavemente con una pipeta de 1.000 μL.
- Transfiera la suspensión celular a un tubo de 15 ml y agregue un medio de revestimiento de doble volumen. Centrífuga durante 10 min a 100 x g.
- Resuspend el pellet con un volumen deseado (volumen de resuspensión) de medio de recubrimiento. Contar las celdas de forma manual o electrónica.
- Seleccione la densidad óptima por deslizamiento (15,000) que permitirá el análisis celular aislado más adelante.
- Calcule el volumen de suspensión celular "activa" (A) necesaria para cubrir todos los cubrecubres a esta densidad deseada. Aplique la siguiente fórmula y retírela en un tubo separado:
- Calcule el volumen de medio de chapado adicional (B) necesario para acomodar cada cubierta al volumen deseado. Aplique la siguiente fórmula y agregue el volumen resultante al tubo de suspensión activa:
- Retire la matriz de los coverslips y aplique el 'volumen de coverslip' de la suspensión celular (A + B) a cada coverslip. Resuspenda regularmente en el tubo para asegurar una distribución celular uniforme.
- Incubar a 37 °C durante 1 h. Llene suavemente el pozo con un medio de chapado.
- Después de 24 h, intercambie medios con medio de cultivo normal y manténgalo cada 2-3 días.
2. Configuración experimental
- Equipe un microscopio de epifluorescencia invertida con un aumento de 40x, lente de alta apertura numérica (N.A: > 0.75) para realizar experimentos.
- Acopla un LED blanco cálido de conmutación rápida al puerto de iluminación transmitido del microscopio. Inserte un filtro rojo simple de 660 nm en la ruta de luz transmitida.
NOTA: Esta luz se puede activar a través de experimentos de fotometría para observar la muestra sin contaminar la señal fluorescente verde. - Monte un cabezal LED de conmutación rápida de 470 nm para la grabación de fotometría. Inserte un filtro de excitación 470/40 en el puerto epifluorescente del microscopio para limpiar la luz generada por el LED.
NOTA: Para una cuantificación óptima de la señal, se recomienda un sistema de iluminación con control de retroalimentación de alta velocidad de salida óptica. - Inserte un cubo de microscopio que contenga un divisor de haz de paso largo de 495 nm en el carrusel de la unidad de espejo dentro del microscopio.
- Ajuste un brazo de detección que contenga un diafragma de campo ajustable al puerto de montaje C del microscopio para permitir la selección de la región de interés.
- Acopla por separado un detector fotomultiplicador (PMT) y una cámara USB al microscopio. Esto constituirá la base del sistema de detección de emisiones.
- Inserte un cubo de filtro que contenga un divisor de haz de paso largo de 565 nm y un filtro de emisión 535/50 en el puerto PMT. Esto divide la luz de emisión entre los dos detectores.
NOTA: Una cámara conectada al puerto transmitido del sistema de detección de emisiones puede detectar la luz transmitida bajo campo brillante a lo largo de todos los experimentos. - Acopla el PMT a una fuente de alimentación y un amplificador PMT. Conecte la salida del amplificador PMT a un pin de entrada analógico de un sistema de adquisición de datos.
- Filtre los datos analógicos del PMT a 1 kHz o superior.
- Digitalice los datos a una frecuencia que sea al menos el doble que la frecuencia más alta presente en la señal analógica (2 kHz o superior) para cumplir con los criterios de Nyquist y evitar el aliasing.
3. Carga celular con VF2.1Cl
NOTA: Todos los pasos que involucran este tinte deben llevarse a cabo en condiciones de poca luz.
- Preparar una solución de baño de Tyrode de (en mM): 140 NaCl, 10 HEPES, 10 Glucosa, 4 KCl, 1 MgCl2,2 CaCl2,pH = 7.35 y caliente a 37 °C.
- Preparar una alícuota de solución de carga en un tubo de microcentrífuga mezclando 5 μL de 1.000x VF2.1Cl y 50 μL de solución de poloxámero solubilizante al 20%.
- Aplique 5 μL de la solución de carga a 5 ml de solución de Tyrode calentada (concentración total de colorante 0,1x) en una placa de Petri de 20 mm.
NOTA: La concentración final de colorante es de 0.1x. Esto es 1/10de lo sugerido por el fabricante. Esto conserva los recursos, asegura una citotoxicidad insignificante y, lo que es más importante, aún conserva señales ópticas claras de las células cargadas con altas proporciones de señal a ruido. - Añadir un solo resbalón de la cubierta iPSC-CM al plato e incubar a 37 °C durante 20 min.
- Ensamble una cámara de imágenes de células vivas calentada. Monte en la etapa del microscopio y llene con 500 μL de solución fresca de Tyrode.
- Lave el cubrecubres con la solución fresca de Tyrode a 37 °C.
- Aplique con cuidado la funda iPSC-CM en la cámara de baño precalenqueada con bórceps de punta fina.
NOTA: Asegúrese de que la cámara y su contenido se calienten siempre a temperaturas fisiológicas. Si lo desea, comience con la perfusión continua de la solución de Tyrode calentada.
4. Estimulación del campo eléctrico
NOTA: La activación externa de iPSC-CM es opcional pero útil para la estandarización de la dinámica celular y los parámetros experimentales. Aumenta la facilidad de análisis y permite la investigación de efectos dependientes de la frecuencia.
- Coloque un inserto de estimulación con dos electrodos de platino espaciados 5 mm de distancia en la cámara de grabación.
- Conecte un estimulador externo al inserto de estimulación. Establecido en pulsos de campo bipolar de 5 ms a 0,5 Hz.
- Determine el voltaje de estimulación óptimo aumentando el estímulo de 1 V hacia arriba. El estímulo umbral se define como el voltaje más bajo al que las células comienzan a contraerse. Aplique voltajes aproximadamente un 25% por encima de este umbral. El rango normal está entre 1 V y 30 V.
- Fije la frecuencia de estimulación con el estimulador externo o activé la activa con un software de adquisición.
5. Adquisición de potencial de acción óptica
NOTA: Este protocolo utiliza un software comercial para la adquisición y el análisis.
- Visualice los miocitos en la vista de campo brillante utilizando la ruta de luz transmitida y la cámara USB.
- Seleccione una celda aislada y recorte herméticamente su trayectoria óptica con el diafragma de campo, asegurando que solo se monitoree la luz de la celda de interés.
- Active el amplificador PMT y configure la fuente PMT a 750 V.
- Ejecute el protocolo de estimulación (consulte el paso 4) junto con el software de adquisición y active simultáneamente la luz de excitación de 470 nm. Esto último se puede hacer a través de un panel remoto o automatizado a una intensidad fija (señal TTL).
- Ajuste la ganancia y el desplazamiento del amplificador PMT para asegurarse de que la señal no se sature y esté optimizada para el rango de detección del sistema de grabación.
- Registre 10 barridos asegurando que se detecten potenciales de acción estables.
- Continúe grabando e inmediatamente mueva la etapa del microscopio para adquirir brevemente la señal de fondo de una región desprovista de células. Apaga la luz de excitación.
NOTA: Este valor de fondo(desplazamiento F) se utilizará para tener en cuenta cualquier fluorescencia de fondo. - Si lo desea, perfunda localmente fármacos de referencia como 1 μM de nifedipino para identificar las respuestas celulares a la manipulación farmacológica.
- De forma secuencial, repita los pasos 5.2–5.7, cada vez que seleccione una nueva celda. Intercambie los cubrecos si lo desea para garantizar una alta rotación experimental en una sola sesión.
NOTA: Los protocolos de carga y adquisición de imágenes se describen en la Figura 2.
6. Análisis de datos
- Abra una grabación guardada con el software de análisis y promedie 10 barridos que contengan potenciales de acción estimulados de una sola célula.
- Tome una media de la señal de referencia que represente eldesplazamiento F y reste esto de la traza promediada.
- Calcule ∆F/F0 con la siguiente fórmula (donde F se mide la fluorescencia y F0 es la fluorescencia diastólica):
- Identificar el rastro basal (diastólico) y el área de interés (PA) y medir los parámetros potenciales de acción cardíaca deseados. Esto incluye, entre otros, el tiempo de descomposición para la repolarización del50%(APD 50) y del 90% (APD90).
- Exporte los datos de esta celda única a un software de hoja de cálculo.
- Repita los pasos 6.1 – 6.5 para todas las grabaciones. Evalúe los resultados con pruebas apropiadas no emparejadas o análisis de varianza.
Figura 2: Protocolos de carga y adquisición de imágenes. (A) Diagrama de flujo del protocolo de carga VF2.1Cl completo para iPSC-CMs y cardiomiocitos nativos. (B) Un esquema simplificado de las configuraciones de divisor de haz (BS) y filtro utilizadas en este protocolo para la excitación y detección de la emisión de VF2.1Cl en respuesta a cambios en el voltaje transmembrana. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Representative Results
Figura 3: Perfiles de potencial de acción óptica (AP) de cardiomiocitos nativos aislados y cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas por humanos (iPSC-CM). (A) AP óptico representativo de un solo cardiomiocito murino (centro) con media ± SEM de APD50 y APD90 (n = 7, derecha). (B) AP óptico representativo de un solo cardiomiocito humano derivado de iPSC (centro) con Media ± SEM de APD50 y APD90 (n = 48, derecha). (C) Manipulación farmacológica de iPSC-CM AP (centro) con 1 μM de nifedipino. Media ± SEM de alteración de APD90 después de la aplicación de nifedipino (n=5). **p < 0,01. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Se observó regularmente una alta relación señal/ruido en nuestras muestras, a pesar del campo de visión reducido al enfocar en una sola celda. Se observó más ruido en los iPSC-CM más pequeños, pero eso no dificultó el análisis posterior al promedio del conjunto. La morfología de AP está claramente definida, dando una visión general completa de la función electrofisiológica celular y la mecánica de repolarización a través de construcciones de cardiomiocitos. Las características a destacar son la velocidad de15 golpes agudos previamente descrita y las características pronunciadas de fase 1 de los cardiomiocitos murinos (APD50: 58.34±17.98 ms, APD90: 160.9±30.15 ms, n = 7; Figura 3A) que son morfológicamente distintas de las señales ópticas iPSC-CM humanas (APD50: 170.1±11.18 ms, APD90: 317.5±15.56 ms, n = 48; Figura 3B). Observamos una mayor tasa de fotobleaching y toxicidad celular después de la investigación óptica en cardiomiocitos nativos en comparación con iPSC-CMs humanos cultivados. Los protocolos de preparación y carga de colorantes en cardiomiocitos nativos se incluyen en el Material Suplementario.
Las iPSC-CM humanas responden a la manipulación farmacológica con nifedipino (1 μM). Se espera que un conocido antagonista del canal Ca2+ de tipo L (CaV1.2), la nifedipina disminuya la duración de la PA en células con función fisiológica. Durante la aplicación continua del fármaco, se observó una disminución del 41,5% en APD90 (n = 5), lo que sugiere tanto la expresión fisiológica de los canales de CaV1.2 en estas células como la funcionalidad de las imágenes basadas en VF2.1Cl como plataforma para estudios prospectivos de detección de fármacos cardíacos de alto rendimiento(Figura 3C).
Material complementario: Preparación de cardiomiocitos murinos nativos para imágenes de voltaje. Haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
Aquí describimos un protocolo básico para adquirir fácilmente perfiles AP detallados a partir de iPSC-CMs aislados adecuados para el modelado electrofisiológico y la detección de fármacos cardíacos. Detectamos AP regulares y robustos de nuestros iPSC-CMs escasamente sembrados, lo que sugiere tanto la funcionalidad del indicador como la fidelidad metodológica.
Debido al amplio espectro de metodologías comerciales para la reprogramación de iPSC y la falta de estandarización para los protocolos de diferenciación cardíaca, los modelos basados en iPSC pueden mostrar una inmensa variabilidad en su función ymorfología 16. Esto también puede dificultar la efectividad de los estudios de cardiotoxicidad. Informamos respuestas generalmente robustas a la investigación experimental extendida con citotoxicidad mínima inducida por indicadores a bajas intensidades de luz de excitación. La estandarización de la disociación básica y la siembra de hojas de cubierta es fundamental para garantizar una calidad constante de las preparaciones iPSC-CM. Los codales sueltos, que se pueden insertar y reemplazar fácilmente dentro de la plataforma de imágenes, son increíblemente útiles para la adquisición rápida de datos y la caracterización de cardiomiocitos individuales. Cabe señalar, sin embargo, que observamos una ligera disminución en la viabilidad celular después de períodos prolongados (es decir, más de 4 semanas) de cultivo escaso en cubiertas de vidrio.
La construcción modular de un sistema de fotometría de alta velocidad descrito en el paso 2 es de importancia crítica para este protocolo. Muchas configuraciones basadas en óptica están disponibles comercialmente y se pueden optimizar para una amplia gama de requisitos de grabación de señal. Estos van desde imágenes cuantitativas utilizando cámaras de alta resolución de gran área hasta mediciones de fotometría de la señal total de un área definida. Usando este último, cuantificamos la fluorescencia a alta velocidad desde una sola área enmascarada usando un fotomultiplicador (PMT). Combinado con componentes de iluminación de conmutación rápida, esto permite una disección completa de componentes potenciales de acción rápida con una resolución temporal extremadamente alta (señal analógica de hasta 1 kHz). Se requieren altas tasas de muestreo para garantizar mediciones confiables del potencial de acción en cardiomiocitos y pueden ser críticas en otras construcciones excitables (es decir, neuronas) con cinética de excitación extremadamente rápida. Además, este sistema flexible es beneficioso porque 1) permite una investigación exhaustiva de la electrofisiología de una sola celda con selección de diafragma de campo, 2) la digitalización de la señal analógica no está integrada ni preprocesada y, por lo tanto, está directamente bajo el control del experimentador, 3) la naturaleza modular de la instrumentación de fotometría permite una reconfiguración simple para permitir la medición óptica simultánea con otros indicadores o microelectrodos. La adición de un segundo canal fotomultiplicador, con conjuntos de filtros apropiados para evitar la superposición espectral, permitirá una verdadera medición simultánea del indicador de calcio intracelular fluorescente CAL-590 junto con VF2.1Cl. También es importante tener en cuenta que este sistema multipropósito se puede utilizar alternativamente para la evaluación profunda del manejo del calcio intracelular como se describió anteriormente17,18,19,20.
Si bien la resolución temporal de nuestro sistema trae muchas ventajas, debe tenerse en cuenta que los parámetros que requieren el análisis de la distribución espacial de las señales de fluorescencia, como los patrones de excitación o la velocidad de conducción, no son adecuados para la investigación mediante las técnicas de fotometría que utilizamos aquí y se encuentran en el ámbito del mapeo óptico. El hardware descrito aquí se puede convertir fácilmente a una configuración de mapeo óptico mediante el intercambio del fotomultiplicador por una cámara especializada adecuada con altas velocidades de fotogramas y gran capacidad de pozo. Nuestra configuración descrita puede ofrecer información temporal extremadamente detallada a una fracción (hasta 1/10de)del precio comercial de las cámaras avanzadas de gran área con capacidades equivalentes. Las técnicas de escaneo de línea confocal también son más detalladas espacialmente que nuestro método, sin embargo, las limitaciones en z restringen la adquisición de fluorescencia de múltiples planos transversales a la vez. Esto no es ideal para obtener imágenes de reporteros unidos a la membrana sostenidas por iPSC-CMs con morfologías típicamente heterogéneas. Las mediciones de fotometría utilizando un microscopio de epifluorescencia estándar evitan este problema al acceder a toda la superficie celular instantáneamente, nuevamente a un costo mucho menor por punto de datos.
Recomendamos encarecidamente VF2.1Cl para realizar ensayos de voltaje con células excitables. Actualmente, hay muchos VSD disponibles que operan bajo una multitud de mecanismos diferentes, cada uno con sus propias limitaciones inherentes. Sin embargo, los colorantes electrocrómicos de estirilo comunes como di-8-ANEPPS o di-4-ANBDQBS que muestran respuestas rápidas al voltaje transmembrana se ven obstaculizados por la baja sensibilidad y la alta carga capacitiva21,22. Los indicadores de voltaje codificados genéticamente (GEVI) utilizan la fusión de proteínas fluorescentes a los dominios de detección de voltaje molecular23 u opsinas microbianas24 y proporcionan disecciones altamente sensibles de la dinámica del voltaje celular, pero se ven obstaculizados por la cinética reducida y las respuestas no lineales. En la Tabla 1se incluye una lista de VSD comunes y sus propiedades dinámicas básicas. Las sondas PeT como VF2.1Cl ofrecen un buen compromiso, mostrando una cinética rápida y una sensibilidad decente con una interrupción celular mínima. Sin embargo, este VSD es limitado porque, a diferencia de los colorantes de estirilo21,no se puede utilizar para resolver el potencial absoluto de membrana. Esta desventaja inherente resalta la desafortunada consecuencia de mantener la precisión de los datos a un mayor rendimiento al ensayar la electrofisiología celular.
|
Sensibilidad (% ∆F/F por 100mV) |
Velocidad (ms) | |
| Colorantes a base de PeT | ||
| VF2.1Cl7 | 27 | <1 |
| BeRST125 | 24 | <1 |
| RhoVR126 | 47 | <1 |
| Colorantes de hemicianina | ||
| Di-8-ANEPPS21 | 10 | <1 |
| Di-4-ANEPPS27 | 8 | <1 |
| Di-4-ANBDQBS22 | 10–20 | <1 |
| RH23728 | 11 | <1 |
| PGH129 | 17.5 | <1 |
| GEVI | ||
| ArcLight30 | 32 | 12324 |
| Arco D95N31 | 40 | 4124 |
| Sirena32 | 40 | 17.4 |
| VSFP 2,333 | 13.3 | 2523 |
| QuasAr224 | 90 | 11 |
| TRASTE | ||
| Dio/DPA34 | 56 | 2 |
Tabla 1: Una breve lista de VSD comunes y sus principales propiedades fluorescentes.
Observamos que los desacopladores de excitación-contracción como la blebbistatina o el monoxima de 2,3-butano-diona (BDM) se utilizan a menudo en mediciones de voltaje óptico para reducir el artefacto de movimiento mediante la supresión de la contracción cardíaca35. Sin embargo, informes anteriores han demostrado que ambos compuestos prolongan significativamente la duración de la PA y aplanan la restitución de la AP en corazones perfundidos enteros36,37. Además, la blebbistatina tiene propiedades fluorescentes que se superponen con los espectros de VF2.1Cl y, por lo tanto, pueden no ser apropiadas para su uso con este colorante38.
Nuestro versátil protocolo requiere ajustes mínimos para la investigación óptica en una variedad de construcciones excitables bidimensionales y tridimensionales. Este método permite una cuantificación rápida y precisa de la mecánica de repolarización, que puede proporcionar información valiosa sobre las anomalías iónicas celulares. En nuestras manos, este protocolo ofrece señales ópticas claras con buenas relaciones señal-ruido incluso en celdas más pequeñas. Nuestra plataforma simple y efectiva se puede aplicar para la validación no invasiva de la seguridad de los medicamentos cardíacos y los estudios de detección de alto rendimiento utilizando iPSC-CM específicos del paciente.
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Disclosures
Cairn Research Ltd apoyó esta publicación cubriendo los costos de producción del archivo de video.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer a Cairn Research Ltd. por su amable contribución financiera que cubrió los costos de producción de esta publicación. Además, agradecemos a la Sra. Ines Mueller y a la Sra. Stefanie Kestel por su excelente apoyo técnico.
La investigación de los autores está respaldada por el Centro Alemán de Investigación Cardiovascular (DZHK), la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Fundación Alemana de Investigación, VO 1568/3-1, IRTG1816 RP12, SFB1002 TPA13 y bajo la Estrategia de Excelencia de Alemania - EXC 2067/1- 390729940) y la Else-Kröner-Fresenius Stiftung (EKFS 2016_A20).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| 0.25 Trypsin EDTA | Gibco | 25200056 | |
| B27 Supplement | Gibco | 17504044 | |
| CaCl2 | Carl Roth | HN04.2 | |
| D(+)-Glucose anhydrous BioChemica | ITW Reagents | A1422 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | |
| FluoVolt Membrane Potential Kit | Invitrogen | F10488 | |
| HEPES | Carl Roth | HN77.4 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | 6781.1 | |
| Lamanin | Sigma-Aldrich | 114956-81-9 | |
| Matrigel | BD | 354230 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 9265.2 | |
| Nifedipine | Sigma-Aldrich | 21829-25-4 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140 | |
| ROCK Inhibitor Y27632 | Stemolecule | 04-0012-10 | |
| RPMI 1640 Medium | Gibco | 61870010 | |
| Versene EDTA | Gibco | 15040033 | |
| Equipment | |||
| 495LP Dichroic Beamsplitter | Chroma Technology | ||
| Axopatch 200B Amplifier | Molecular Devices | ||
| Circle Coverslips, Thickness 0 | Thermo Scientific | CB00100RA020MNT0 | |
| Digidata 1550B | Molecular Devices | ||
| Dual OptoLED Power Supply | Cairn Research | ||
| ET470/40x Excitation Filter | Chroma Technology | ||
| ET535/50m | Chroma Technology | ||
| Etched Neubauer Hemacytometer | Hausser Scientific | ||
| Filter Cubes | Cairn Research | ||
| IX73 Inverted Microscope | Olympus | ||
| MonoLED | Cairn Research | ||
| Multiport Adaptors | Cairn Research | ||
| Myopacer Cell Stimulator | IonOptix | ||
| Optomask Shutter | Cairn Research | ||
| Optoscan System Controller | Cairn Research | ||
| PH-1 Temperature Controlled Platform | Warner Instruments | ||
| Photomultiplier Detector | Cairn Research | ||
| PMT Amplifier Insert | Cairn Research | ||
| PMT Supply Insert | Cairn Research | ||
| RC-26G Open Bath Chamber | Warner Instruments | ||
| SA-OLY/2AL Stage Adaptor | Olympus | ||
| T565lpxr Dichroic Beamsplitter | Chroma Technology | ||
| T660lpxr Dichroic Beamsplitter | Chroma Technology | ||
| TC-20 Dual Channel Temperature Controller | npi Electronic | ||
| UPLFLN 40X Objective | Olympus | ||
| USB 3.0 Colour Camera | Imaging Source | ||
| Software | |||
| Clampex 11.1 | Molecular Devices | ||
| Clampfit 11.1 | Molecular Devices | ||
| IC Capture 2.4 | Imaging Source | ||
| Prism 8 | Graphpad |
References
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