Summary
여기서는 고속 모듈식 광혈약 시스템을 사용하여 유도된 다능줄기 세포 유래 심근세포로부터의 작용 잠재력의 광학 획득 및 특성화를 설명합니다.
Abstract
기존의 세포내 미세 전기 전극 기술은 심근세포 전기 생리학을 정량화하는 매우 복잡하고 노동 집약적이며 일반적으로 낮은 처리량에서 수행됩니다. 유도 된 다능성 줄기 세포 (iPSC) 기술의 신속하고 지속적인 확장은 심장 혈관 연구에서 새로운 표준을 제시하고 대체 방법은 이제 단일 세포 수준에서 전기 생리 학적 데이터의 처리량을 증가하는 데 필요한. VF2.1Cl은 최근 유래된 전압 민감 성 염료로, 멤브레인 전위변동에 대한 신속한 단일 채널, 높은 크기 응답을 제공한다. 다른 기존 전압 지표보다 우수한 운동학을 보유하고 있으며 기존의 미세 전극 기술과 동등한 기능성 데이터를 제공합니다. 여기서는 모듈식및 매우 저렴한 광합성 시스템을 사용하여 외부적으로 진행되는 인간 iPSC 파생 심근세포에서 단순화되고 비침습적인 작용 잠재적 특성화를 입증합니다.
Introduction
심근세포의 전기생리학적 모델링과 심장 약물 스크리닝을 위한 효율적인 플랫폼 구축은 다양한 부정맥 장애에 대한 치료 전략의 개발에 필수적이다. 유도 된 다능성 줄기 세포 (iPSC) 기술의 급속한 확장은 고립 된 환자 파생 심근 세포 (iPSC-CM)를 사용하여 인간 질병 모델링 및 약리학적 조사에 유망한 진입을 일으켰습니다. 패치 클램프(current-clamp)를 통해 이들 세포의 전기생리학적 특성화를 위한 "골드 스탠다드" 기술은 작용 전위(AP) 형태및 지속시간을 정량화할 수 있지만, 이 방법은 매우 복잡하고 느리며 높은 처리량 데이터 수집1에적합하지 않다. iPSC-CM은 성인 토착 심근세포2에비해 확장막 전위 및 누출 전류가 증가하는 것으로 정기적으로 보고된다. iPSC-CM에서 관찰된 더 작은 세포 크기 및 감소된 막 정전용량이 현재 클램프 기술을 사용할 때 일부 체계적인 오류를 생성할 수 있으며, 아마도 이러한 편차를 설명할 수 있는 것으로나타났다3. iPSC-CM 플랫폼의 유용성을 극대화하기 위해 iPSC-CM의 단일 셀 수준에서 막 전압 변화를 특성화할 때 처리량을 늘리고 데이터 정확도를 보장하는 추가 방법이 중요합니다.
전압 민감염료(VSD)는 기존의 기술4와비교한 심장 AP 역학의 더 빠르고 비침습적이며 동등한 분석을 제공하는 제안된 방법이다. 최근 연구는 정확하게 심장 AP5를정량화하는 비율 전압 민감한 프로브 광합성의 적합성을 입증했다. 더욱이, 광학 광합성 접근법을 용이하게 확장하는 능력은 치료 약물 개발(예를 들어 CiPA)에서 중요한 대규모 심폐성 스크린에 이 기술을 빌려준다. 마이크로 전극 어레이 및 전압 감지 광학 기술을 이용한 시각 장애인 다중 현장 연구에서 표준화된 심폐성 프로토콜의 개발은 이 접근법6의핵심 가치를 입증했다.
많은 전능성 염료는 시판되고, 새로운 프로브의 지속적인 합성 개발은 다양한 심장 및 신경 구조물에 걸쳐 그들의 효과를 간소화하기위한 흥미로운 잠재력을 보여줍니다. 이상적인 VSD는 증가 된 운동과 감도를 가지며 정전 용량 부하, 광 표백 및 세포 독성을 줄입니다. 최근 합성 된 VF2.1Cl (FluoVolt)은 새로운 전압 플루어 (VF) 제품군7의다른 구성원이 공유하는 새로운 와이어 기반 분자 구조로 인해 이러한 유익한 특성의 대부분을 표현한다. 간단한 프로브가 플라즈마 멤브레인에 분자및 전기적으로 컨쥬게이트되는 일반적인 전기 색소와 는 달리,이 염료는 변형 된 형광성 불소 호레 (FITC)와 전자가 풍부한 기증자를 페어링 하는 수동적으로 삽입된 멤브레인 스패닝 합성 와이어로 구성됩니다. 기계학적 세부 사항은 그림 1에서제공됩니다. 이 염료는 멤브레인 전압 변동에 대한 우수한 감도를 나타내며, 비교 가능한 속도7에서다른 일반적인 프로브에서 볼 수 있는 ~10%와 달리 100mV당 배출 강도의 27% 변화를 나타낸다. 또한, 와이어 기반 PeT 시스템은 셀룰러 전기장과 직접 상호 작용하지 않아 최소한의 전기 간섭과 셀룰러 정전 용량 부하의 무시할 수 있는 변화를 일으킵니다.
그림 1: VF2.1Cl 염료의 화학, 스펙트럼 및 기계론 파라미터. (A)VF2.1Cl. 분자 피처의 화학적 구조는 플라즈마 멤브레인내로 삽입을 용이하게 하는 페닐렌 비닐렌 분자 와이어 내의 다중 알킬 군을 포함한다. FITC 프로브에 접합된 음전하 황포산 단은 세포외 표면의 불소 안정화를 보장하고 지질 이중층의 전기장에 비해 수직 삽입 부근에 보조를 지원한다. (b)표적 세포의 혈장 막에 수직 VF2.1Cl을 포함시키는 단순화된 회로도. (C)VF2.1Cl 염료의 흡수 및 방출 스펙트럼. 스펙트럼은 표준 FITC 및 GFP 프로브와 동일합니다. (D)VF2.1Cl의 기계주의 적 행동 모드 묘사. 휴식 조건 (과극성)에서, 음의 세포 내 전압은 로스트랄 불소로 전환기쪽으로 무료 전자를 구동한다. 전자 풍부는 광 유발 전자 전달(PeT)이 광 흥분 상태에서 나오는 통로로서 선호되고, 효과적으로 형광을 담금질할 수 있도록 보장한다. 대조적으로, 탈극막 전위는 광학 여기에 형광을 선호하는 하향 전자 운동에 영향을 미칩니다. 결과 형광 반응은 멤브레인 전압과 선형적으로 관련되어 있으며 세포 전기 생리학적 운동학에 대한 상세한 측두정보를 수집하기 위해 정확하게 활용할 수 있습니다. (E)대표적인 브라이트필드(upper) 및 470nm(하부)의 형광은 VF2.1Cl로 로드된 leporine 심근세포의이미지(이하)단일 하중심근세포의 Z 스택이다. 화살표는 세포 막에 VF2.1Cl의 명확한 국소화영역을 나타낸다. 이미지는 X-lightv3 회전 디스크 공초점 헤드로 구성된 회전 디스크 공초점 시스템으로 50 μm 핀홀 패턴을 획득했습니다. LDI-7 조명기; Prime95B 카메라와 PlanApo Lambda 100x 목표. 스케일 바: 20 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
VF2.1Cl에 컨쥬게이트된 FITC 프로브는 표준 및 GFP 필터 구성에 따라 효과적으로 사용할 수 있도록 보장하며, 형광 이미징 플랫폼의 공통 특징인 단일 채널 수집 시스템만 필요합니다. 이 염료를 가진 조밀한 인간 iPSC-CM 단층의 분석은 최근에보고되었습니다 8,9,10,11. 우리의 프로토콜은 조밀한 싱크로나단층의 전기 및 파라크리안 영향에 흔들리지 않는 단일 격리 된 iPSC-CM에 대한 조사와 복잡한 공초점 또는 넓은 현장 이미징 준비와는 달리 저렴하고 사용자 정의 가능한 광측정 시스템의 사용으로 인해 이러한 연구와 다릅니다.
여기서는 고립된 인간 iPSC 유래 심근세포및 원심근세포로부터 견고한 광학 AP를 빠르게 획득하고 분석하기 위한 프로토콜을 설명합니다(보충 파일참조). 우리는 단일 셀 광측정 측정을위한 아트 플랫폼의 사용자 정의 상태와 함께 VF2.1Cl을 사용합니다. 이러한 실험 프로토콜은 대학 의료 센터 괴팅겐의 윤리위원회에 의해 승인되었습니다 (번호 10/9/15).
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Protocol
1. 셀룰러 제제
참고: 본 프로토콜에 사용된 인간 iPSC는 건강한 기증자로부터 파생되고 이전에 설명된12,13,14와같이 WNT 시그널링 및 젖산 정제 기술의 완전히 정의된 소분자 변조를 사용하여 단층층에서 분화되었다. iPSC-CM은 아래설명된 문화 매체로 2-3일마다 유지되었습니다.
- 기저 배지(RPMI 1640) 및 2% 보충(B27)의 배양 배지를 준비한다. 4 °C에 보관하십시오. 실온(RT)에서 사용하십시오.
- 기초 매체(RPMI 1640), 2% 보충제(B27) 및 1:2000 ROCK 억제제의 도금 매체를 준비한다. 4 °C에 보관하십시오. RT에서 사용하십시오.
- 코팅 살균 10mm 원형 유리 #0 커버립 150 μL 1:60 인자 무료 지하 멤브레인 매트릭스와 4 h에 대 한 4°C에서 배양.
참고: 유출을 방지하기 위해 적절한 표면 장력을 유지하면서 유리 전체를 덮는 것을 보장하기 위해 커버슬립 볼륨의 최적화가 필요합니다. 10mm 둥근 커버립에 150 μL이 권장됩니다. 배치 크기, 커버 슬립 유형, 커버 슬립 볼륨 및 배양 플레이트 유형은 실험자의 요구에 적합할 수 있습니다. - EDTA 기반 세포 해리 시약으로 iPSC-CM 해리를 시작합니다. 1,000 μL 파이펫으로 부드럽게 플러싱하여 단층이 완전히 분리되었는지 확인합니다.
- 셀룰러 서스펜션을 15mL 튜브로 옮기고 이중 볼륨 도금 매체를 추가합니다. 원심분리기 10분 100 x g.
- 도금 매체의 원하는 부피(재서스펜션 부피)로 펠릿을 다시 중단합니다. 셀을 수동으로 또는 전자적으로 계산합니다.
- 나중에 격리된 세포 분석을 허용하는 커버슬립당 최적의 밀도(15,000)를 선택합니다.
- 이 원하는 밀도에서 모든 커버립을 플레이트하는 데 필요한 '활성' 셀룰러 서스펜션(A)의 부피를 계산합니다. 다음 수식을 적용하고 별도의 튜브로 인출하십시오.
- 원하는 볼륨에서 각 커버슬립을 수용하는 데 필요한 추가 도금 매체(B)의 부피를 계산합니다. 다음 수식을 적용하고 활성 현탁액 튜브에 결과 볼륨을 추가합니다.
- 커버슬립에서 매트릭스를 제거하고 각 커버슬립에 셀 서스펜션(A+B)의 '커버슬립 볼륨'을 적용합니다. 세포 분포를 보장하기 위해 튜브에서 정기적으로 재중지하십시오.
- 1 h에 대한 37 °C에서 인큐베이션. 도금 매체로 웰을 부드럽게 채웁니다.
- 24 시간 후, 일반 문화 매체와 미디어를 교환하고 2-3 일마다 유지합니다.
2. 실험 용 설정
- 40배배율, 고숫자 조리개 렌즈(N.A: > 0.75)를 사용하여 반전된 피형성 현미경을 장착하여 실험을 수행합니다.
- 현미경의 전송 된 조명 포트에 빠른 스위칭 따뜻한 흰색 LED를 커플. 간단한 빨간색 660 nm 필터를 전송된 라이트 경로에 삽입합니다.
참고: 이 빛은 광합성 실험 전반에 걸쳐 활성화되어 녹색 형광 신호를 오염하지 않고 샘플을 관찰할 수 있습니다. - 포토메트리 레코딩을 위해 빠른 스위칭 470 nm LED 헤드를 탑재합니다. 현미경의 상피 형광 포트에 470/40 여기 필터를 삽입하여 LED에 의해 생성 된 빛을 청소하십시오.
참고: 최적의 신호 정량화를 위해 광학 출력의 고속 피드백 제어가 있는 조명 시스템을 권장합니다. - 현미경 내의 미러 유닛 회전 목마에 495 nm 길이의 패스 빔 스플리터를 포함하는 현미경 큐브를 삽입합니다.
- 현미경 C-마운트 포트에 조정 가능한 필드 다이어프램을 포함하는 검출 암을 맞추어 관심 영역을 선택할 수 있도록 합니다.
- 별도로 광증 검출기 (PMT)와 현미경에 USB 카메라를 결합합니다. 이것은 배출 감지 시스템의 기초를 형성합니다.
- 565nm 길이의 패스 빔 스플리터를 포함하는 필터 큐브와 535/50 배출 필터를 PMT 포트에 삽입합니다. 이렇게 하면 두 검출기 간에 방출 광이 분할됩니다.
참고: 배기가스 감지 시스템의 전송된 포트에 부착된 카메라는 모든 실험에서 밝은 필드에서 전송된 빛을 감지할 수 있습니다. - PMT를 전원 공급 장치와 PMT 앰프에 결합합니다. PMT 증폭기 출력을 데이터 수집 시스템의 아날로그 입력 핀에 연결합니다.
- PMT에서 아날로그 데이터를 1kHz 이상으로 필터링합니다.
- 나이퀴스트 기준을 충족하고 별칭을 방지하기 위해 아날로그 신호(2kHz 이상)에 존재하는 가장 높은 주파수의 두 배 이상의 주파수로 데이터를 디지털화합니다.
3. VF2.1Cl셀로딩
참고: 이 염료와 관련된 모든 단계는 저조도 조건에서 수행해야 합니다.
- 타이로드의 목욕 용액(mM)을 준비하십시오: 140 NaCl, 10 HEPES, 10 포도당, 4 KCl, 1 MgCl2,2 CaCl2,pH = 7.35 및 37°C에 따뜻하게.
- 1,000x VF2.1Cl 5μL과 20% 용용 폴로사머 용액의 50 μL을 혼합하여 마이크로센트심분리기 튜브에 적재 용액의 알리쿼트를 준비합니다.
- 20mm 페트리 접시에 5μL의 로딩 용액을 5mL의 온난티 티로드 용액(총 0.1x 염료 농도)에 적용합니다.
참고: 최종 염료 농도는 0.1배입니다. 이것은 1/10제조 업체에 의해 제안 th. 이는 자원을 절약하고, 무시할 수 있는 세포 독성을 보장하며, 중요한 것은 여전히 신호대 잡음 비율이 높은 로드된 셀에서 선명한 광학 신호를 유지한다는 것입니다. - 접시에 iPSC-CM 커버 슬립 을 넣고 37 °C에서 20 분 동안 배양합니다.
- 가열 된 라이브 세포 이미징 챔버를 조립합니다. 현미경 단계에 마운트하고 신선한 Tyrode의 용액의 500 μL을 채웁니다.
- 37°C에서 신선한 티로드용액으로 커버슬립을 씻으시다.
- iPSC-CM 커버슬립을 미세 한 점 집게를 사용하여 미리 데운 목욕 챔버에 조심스럽게 적용하십시오.
참고: 챔버와 그 내용물들은 항상 생리학적 온도에서 가열되도록 하십시오. 원하는 경우, 따뜻하게 된 티로드의 용액의 지속적인 관류로 시작하십시오.
4. 전기장 자극
참고: iPSC-CM의 외부 트리거링은 선택 사항이지만 셀룰러 역학 및 실험 매개 변수의 표준화에 유용합니다. 그것은 분석의 용이성을 증가하고 주파수 의존적 인 효과의 조사를 할 수 있습니다.
- 두 개의 백금 전극이 5mm 간격을 가진 자극 인서트를 기록 챔버에 부착합니다.
- 외부 자극기를 자극 삽입에 연결합니다. 0.5Hz에서 5ms 양극성 필드 펄스로 설정합니다.
- 자극을 1V 위쪽으로 늘려 최적의 자극 전압을 결정합니다. 임계값 자극은 셀이 수축하기 시작하는 가장 낮은 전압으로 정의됩니다. 이 임계값보다 약 25% 높은 전압을 적용합니다. 일반 범위는 1 V와 30 V 사이입니다.
- 외부 자극기로 자극 주파수를 수정하거나 획득 소프트웨어로 트리거합니다.
5. 광학 액션 잠재력 획득
참고: 이 프로토콜은 획득 및 분석을 위해 상용 소프트웨어를 사용합니다.
- 전송된 라이트 패스와 USB 카메라를 사용하여 밝은 시야에서 심사이클을 시각화합니다.
- 격리된 셀을 선택하고 관심 셀의 빛만 모니터링할 수 있도록 필드 다이어프램으로 광학 경로를 단단히 자르게 합니다.
- PMT 증폭기를 활성화하고 PMT 공급을 750 V로 설정합니다.
- 획득 소프트웨어와 함께 자극 프로토콜(4단계 참조)을 실행하고 동시에 470 nm 흥분 광을 활성화합니다. 후자는 원격 패널을 통해 수행되거나 고정 강도(TTL 신호)로 자동화할 수 있습니다.
- PMT 증폭기의 게인 및 오프셋을 조정하여 신호가 포화되지 않고 기록 시스템의 검출 범위에 최적화되었는지 확인합니다.
- 안정적인 작업 잠재력을 감지할 수 있도록 10개의 스윕을 기록합니다.
- 기록을 계속하고 즉시 현미경 단계를 이동하여 세포가 없는 영역에서 배경 신호를 잠시 습득합니다. 흥분 빛을 끕니다.
참고: 이 배경 값(F오프셋)은 배경 형광을 설명하는 데 사용됩니다. - 원하는 경우, 약리학 조작에 대한 세포 반응을 식별하기 위해 1 μM 니페디핀과 같은 국소 적으로 관련 된 기준 약물을 사용합니다.
- 순차적인 방식으로, 새로운 셀을 선택할 때마다 5.2-5.7 단계를 반복합니다. 원하는 경우 커버립을 교체하여 단일 좌석에서 높은 실험 회전율을 보장합니다.
참고: 로딩 및 이미지 수집 프로토콜은 그림 2에설명되어 있습니다.
6. 데이터 분석
- 분석 소프트웨어로 저장된 레코딩을 열고 단일 셀에서 자극된 작업 잠재력을 포함하는 평균 10개의 스윕을 엽니다.
- F오프셋을 나타내는 기준 신호의 평균을 가지고 평균 추적에서 이를 뺍니다.
- 다음 공식으로 ∆F/F0을 계산합니다(F가 형광을 측정하고 F0은 확장기 형광입니다).
- 추적 기준선(확장기) 및 관심 영역(AP)을 식별하고 원하는 심장 작용 잠재적 매개 변수를 측정합니다. 여기에는 50%(APD50)및 90%(APD90)재극화에 대한 감쇠 시간에 국한되지 않습니다.
- 이 단일 셀에서 스프레드시트 소프트웨어로 데이터를 내보냅니다.
- 모든 레코딩에 대해 6.1 - 6.5 단계를 반복합니다. 적절한 페어링되지 않은 테스트 또는 분산 분석으로 결과를 평가합니다.
그림 2: 로딩 및 이미지 수집 프로토콜입니다. (A)iPSC-CM 및 네이티브 심근세포에 대한 완전한 VF2.1Cl 로딩 프로토콜의 흐름 차트. (B)막 전압의 변화에 대응하여 VF2.1Cl 방출의 자궁내포 및 검출을 위해 이 프로토콜에 사용되는 빔 스플리터(BS) 및 필터 구성의 단순화된 회로도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Representative Results
도 3: 분리된 토착 심근세포 및 인간 유도만능 줄기세포의 광학 작용 전위(AP) 프로파일유래 심근세포(iPSC-CM). (A)APD 50 및 APD90(n= 7, 오른쪽)의 평균 ± SEM을 가진 단일 모린 심근세포(중앙)의 대표적인 광학 AP. (B)APD 50 및 APD90(n= 48, 오른쪽)의 평균 ± SEM을 가진 단일 인간 iPSC 유래 심근세포(중앙)의 대표적인 광학 AP. (C)iPSC-CM AP(중앙)의 약리학적 조작( 가운데) 1 μM 니페디핀. nifedipine 응용 프로그램 후 APD90 변경의 ± SEM (n =5)을 의미한다. **p < 0.01. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
단일 셀에 초점을 맞출 때 시야가 감소했음에도 불구하고 샘플에서 높은 신호 대 잡음 비가 정기적으로 관찰되었습니다. 더 작은 iPSC-CM에서 더 많은 소음이 관찰되었지만 앙상블 평균에 따른 분석을 방해하지 는 않았습니다. AP 형태는 명확하게 정의되어, 심근 세포 구조에 걸쳐 세포 전기 생리적 기능 및 재극화 역학의 철저한 개요를 제공. 참고의 특징은 이전에 설명된15개의 날카로운 업스트로크 속도와 발음된 1상 1상 특성인 무린 심근세포(APD50: 58.34±17.98 ms, APD 90 : 160.9±30.15 ms, n=7; 그림 3A) 인간 iPSC-CM 광학 신호(APD50: 170.1±11.18 ms, APD90: 317.5±15.56 ms, n=48; 그림 3B). 우리는 배양 된 인간 iPSC-CM에 비해 토착 심근세포에서 광학 조사 후 광표백 및 세포 독성의 높은 비율을 관찰했다. 네이티브 심근세포에서 의제 및 염료 하중을 위한 프로토콜은 보충 재료에포함되어 있습니다.
인간 iPSC-CM은 니페디핀(1 μM)을 사용하여 약리학적 조작에 반응한다. 알려진 L형 Ca2+ 채널(CaV1.2) 길항제, 니페디핀은 생리적 기능을 가진 세포에서 AP 지속 시간을 감소시킬 것으로 예상된다. 지속적인 약물 적용 동안 APD90(n=5)의 41.5% 감소가 관찰되었으며, 이러한 세포에서 Ca V 1.2 채널의 생리적 발현과 VF2.1Cl 기반 이미징의 기능을 모두 제안하여 높은 처리량 심장 약물 스크리닝 연구를 위한 플랫폼으로서(그림3C).
보조 재료: 전압 이미징을 위한 네이티브 뮤린 심근세포 제제. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
여기서 우리는 전기 생리학적 모델링 및 심장 약물 스크리닝에 적합한 격리된 iPSC-CM에서 상세한 AP 프로파일을 쉽게 획득하기 위한 기본 프로토콜을 설명합니다. 우리는 표시기 기능과 방법론 적 충실도를 모두 시사하는 희소하게 시드 된 iPSC-CM에서 정기적이고 견고한 AP를 감지합니다.
iPSC 재프로그래밍을 위한 광범위한 상용 방법론과 심장 분화 프로토콜에 대한 표준화 부족으로 인해 iPSC 기반 모델은 기능 및형태학(16)에서엄청난 가변성을 보여줄 수 있다. 이것은 또한 심장 독성 연구의 효과를 방해할 수 있습니다. 우리는 낮은 흥분 광 강도에 최소한의 지표 유도 세포 독성으로 확장 된 실험 조사에 일반적으로 강력한 반응을보고합니다. iPSC-CM 제제의 일관된 품질을 보장하기 위해서는 기본 해리 및 커버슬립 시드의 표준화가 중요합니다. 이미징 플랫폼 내부에 쉽게 삽입되고 교체할 수 있는 느슨한 커버립은 단일 심근세포의 신속한 데이터 수집 및 특성화에 매우 유용합니다. 그러나 유리 커버립에 희소한 배양의 연장된 기간(즉, 4주 이상)후에 세포 생존능력이 약간 감소하는 것을 관찰한다는 점에 유의해야 합니다.
2단계에 설명된 고속 광측정 시스템의 모듈식 구조는 이 프로토콜에 매우 중요합니다. 많은 광학 기반 설정을 시판할 수 있으며 광범위한 신호 기록 요구 사항에 최적화할 수 있습니다. 이는 고해상도, 넓은 면적 카메라를 이용한 정량적 이미징부터 정의된 영역에서 총 신호의 광측정 측정에 이르기까지 다양합니다. 후자를 사용하여, 우리는 광승화 (PMT)를 사용하여 하나의 마스크 영역에서 고속으로 형광을 정량화합니다. 빠른 스위칭 조명 구성 요소와 결합하여 매우 높은 시간적 해상도(최대 1kHz의 아날로그 신호)를 갖춘 빠른 동작 잠재적 구성 요소의 철저한 해부를 허용합니다. 높은 샘플링 속도는 심근세포에서 작용 잠재력 업스트로크의 신뢰할 수 있는 측정을 보장해야 하며 매우 빠른 흥분 운동과 함께 다른 흥분 가능한 구조(즉, 뉴런)에서 중요할 수 있습니다. 또한, 이러한 유연한 시스템은 1) 필드 다이어프램 선택과 단일 세포 전기 생리학의 철저한 조사를 허용하기 때문에 유익하며, 2) 아날로그 신호의 디지털화는 통합되거나 사전 처리되지 않았기 때문에 실험자 제어 하에 직접, 3) 광측정 계측의 모듈식 특성은 다른 지표 또는 미세전과 동시에 광학 측정을 가능하게 하는 간단한 재구성을 가능하게 한다. 스펙트럼 중첩을 피하기 위해 적절한 필터 세트가 있는 두 번째 광증 채널의 추가는 VF2.1Cl과 함께 형광 내 세포 내 칼슘 표시기 CAL-590을 실제 동시 측정할 수 있게 합니다. 또한 이 다목적 시스템은 이전에 설명된 바와 같이 세포내 칼슘 취급의 심층 평가를 위해 대안적으로 사용될 수 있다는 점에 유의하는 것이 중요하다17,18,19,20.
우리 시스템의 시간적 해결은 많은 장점을 제공하지만, 발수 패턴이나 전도 속도와 같은 형광 신호의 공간 분포의 분석을 요구하는 매개 변수는 우리가 여기에서 사용하고 광학 매핑의 영역에있는 광구 법에 의해 조사에 적합하지 않다는 점에 유의해야합니다. 여기에 설명된 하드웨어는 높은 프레임 속도와 큰 웰 용량을 갖춘 적합한 전문 카메라에 대한 광승수 교환을 통해 광학 매핑 구성으로 쉽게 변환할 수 있습니다. 우리의 설명 된 구성은 동등한 기능을 가진 고급 넓은 영역 카메라의 상용 가격의 분수 (최대 1/10th)에서매우 상세한 시간 정보를 제공 할 수 있습니다. 공초점 라인 스캔 기술은 또한 우리의 방법보다 공간적으로 더 상세하지만 z의 제한은 한 번에 여러 횡단 평면에서 형광 취득을 제한합니다. 이것은 전형적으로 이기종 형태를 가진 iPSC-CM에 의해 개최된 화상 진막 바운드 기자를 위해 이상적이지 않습니다. 표준 표피 형광 현미경을 이용한 광혈측정 측정은 데이터 포인트당 훨씬 저렴한 비용으로 다시 세포 표면 전체에 즉시 액세스하여 이 문제를 피합니다.
우리는 매우 흥분 셀과 전압 어세이크를 수행하기위한 VF2.1Cl을 권장합니다. 현재 많은 VSD는 고유한 제한 사항이 있는 다양한 메커니즘에서 작동할 수 있습니다. 디-8-ANEPPS 또는 디-4-ANBDQBS와 같은 일반적인 전기 색소믹 스티릴 염료는 극막 전압에 대한 빠른 응답을 표시하는 그러나 낮은 감도 및 높은 정전 용량 부하21,22에의해 방해된다. 유전자 인코딩 된 전압 지표 (GEVIs)는 분자 전압 감지 도메인(23 또는 미생물 opsins24)에 형광 단백질의 융합을 활용하고 세포 전압 역학의 매우 민감한 해부를 제공하지만, 감소 된 운동 및 비선형 반응에 의해 방해된다. 일반적인 VSD 목록과 기본 동적 속성 목록은 표 1에포함되어 있습니다. VF2.1Cl과 같은 PeT 프로브는 세포 중단을 최소화하면서 빠른 운동과 괜찮은 감도를 표시하는 좋은 타협을 제공합니다. 그러나, 이러한 VSD는 비율측정치와 달리 스티릴염료(21)와달리 절대막 전위를 해결하는 데 사용할 수 없기 때문에 제한적이다. 이 내재된 단점은 세포 전기 생리학을 분석할 때 더 높은 처리량에서 데이터 정확도를 유지하는 불행한 결과를 강조합니다.
|
민감 (100mV당 ∆F/F) |
속도 (ms) | |
| PeT 기반 염료 | ||
| VF2.1Cl7 | 27 | <1 |
| BeRST125 | 24 | <1 |
| 로VR126 | 47 | <1 |
| 헤미야닌 염료 | ||
| 디-8-ANEPPS21 | 10 | <1 |
| 디-4-ANEPPS27 | 8 | <1 |
| 디-4-ANBDQBS22 | 10–20 | <1 |
| RH23728 | 11 | <1 |
| PGH129 | 17.5 | <1 |
| GEV | ||
| 아크라이트30 | 32 | 12324 |
| 아치 D95N31 | 40 | 4124 |
| 인어32 | 40 | 17.4 |
| VSFP 2.333 | 13.3 | 2523 |
| 준아224 | 90 | 11 |
| 무서 워 | ||
| 디오/DPA34 | 56 | 2 |
표 1: 일반적인 VSD 및 주요 형광 특성의 간략한 목록입니다.
우리는 ebbistatin 또는 2,3-butane-dione 단축 (BDM)과 같은 흥분 수축 단자 종종 심장 수축을 억제하여 모션 아티팩트를 줄이기 위해 광학 전압 측정에 사용된다 는 점에 유의한다35. 그러나, 이전 보고서는 두 화합물이 AP 지속 시간을 크게 연장하고 전체 perfused 된 마음36,37에서AP 배상금을 평평하게 하는 것으로 나타났습니다. 또한, 블리스타틴은 VF2.1Cl의 스펙트럼과 겹치는 형광 성질을 가지므로 이염료(38)와함께 사용하기에 적합하지 않을 수 있다.
당사의 다목적 프로토콜은 다양한 2차원 및 3차원 흥분 가능한 구문에 대한 광학 조사를 위한 최소한의 조정이 필요합니다. 이 방법을 사용하면 재편광 역학을 신속하고 정확하게 정량화할 수 있으므로 세포 이온 이상에 대한 귀중한 통찰력을 얻을 수 있습니다. 우리의 손에, 이 프로토콜은 작은 세포에서도 잡음 비율에 좋은 신호와 명확한 광학 신호를 제공합니다. 당사의 간단하고 효과적인 플랫폼은 환자 특정 iPSC-CM을 사용하여 심장 약물 안전 및 높은 처리량 스크리닝 연구의 비침습적 검증을 위해 적용될 수 있습니다.
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Disclosures
케언 리서치(Cairn Research Ltd)는 비디오 파일의 제작 비용을 충당하여 이 출판물을 지원했습니다.
Acknowledgments
저자는 이 출판물의 생산 비용을 충당한 Cairn Research Ltd.의 친절한 재정적 기여에 대해 인정하고 싶습니다. 또한, 이네스 뮬러 씨와 스테파니 케스텔(Stefanie Kestel) 씨의 뛰어난 기술 지원에 감사드립니다.
저자의 연구는 심장 혈관 연구를위한 독일 센터에 의해 지원됩니다 (DZHK), 도이치 포르스충스게마인샤프트 (DFG, 독일 연구 재단, VO 1568/3-1, IRTG1816 RP12, SFB1002 TPA13 및 독일의 우수 전략 - EXC 2067/1- 390729940) 및 엘스 크뢰너-프레세니우스 스티프퉁(EKFS 2016_A20).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| 0.25 Trypsin EDTA | Gibco | 25200056 | |
| B27 Supplement | Gibco | 17504044 | |
| CaCl2 | Carl Roth | HN04.2 | |
| D(+)-Glucose anhydrous BioChemica | ITW Reagents | A1422 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | |
| FluoVolt Membrane Potential Kit | Invitrogen | F10488 | |
| HEPES | Carl Roth | HN77.4 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | 6781.1 | |
| Lamanin | Sigma-Aldrich | 114956-81-9 | |
| Matrigel | BD | 354230 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 9265.2 | |
| Nifedipine | Sigma-Aldrich | 21829-25-4 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140 | |
| ROCK Inhibitor Y27632 | Stemolecule | 04-0012-10 | |
| RPMI 1640 Medium | Gibco | 61870010 | |
| Versene EDTA | Gibco | 15040033 | |
| Equipment | |||
| 495LP Dichroic Beamsplitter | Chroma Technology | ||
| Axopatch 200B Amplifier | Molecular Devices | ||
| Circle Coverslips, Thickness 0 | Thermo Scientific | CB00100RA020MNT0 | |
| Digidata 1550B | Molecular Devices | ||
| Dual OptoLED Power Supply | Cairn Research | ||
| ET470/40x Excitation Filter | Chroma Technology | ||
| ET535/50m | Chroma Technology | ||
| Etched Neubauer Hemacytometer | Hausser Scientific | ||
| Filter Cubes | Cairn Research | ||
| IX73 Inverted Microscope | Olympus | ||
| MonoLED | Cairn Research | ||
| Multiport Adaptors | Cairn Research | ||
| Myopacer Cell Stimulator | IonOptix | ||
| Optomask Shutter | Cairn Research | ||
| Optoscan System Controller | Cairn Research | ||
| PH-1 Temperature Controlled Platform | Warner Instruments | ||
| Photomultiplier Detector | Cairn Research | ||
| PMT Amplifier Insert | Cairn Research | ||
| PMT Supply Insert | Cairn Research | ||
| RC-26G Open Bath Chamber | Warner Instruments | ||
| SA-OLY/2AL Stage Adaptor | Olympus | ||
| T565lpxr Dichroic Beamsplitter | Chroma Technology | ||
| T660lpxr Dichroic Beamsplitter | Chroma Technology | ||
| TC-20 Dual Channel Temperature Controller | npi Electronic | ||
| UPLFLN 40X Objective | Olympus | ||
| USB 3.0 Colour Camera | Imaging Source | ||
| Software | |||
| Clampex 11.1 | Molecular Devices | ||
| Clampfit 11.1 | Molecular Devices | ||
| IC Capture 2.4 | Imaging Source | ||
| Prism 8 | Graphpad |
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