Summary
Hier beschrijven we optische acquisitie en karakterisering van actiepotentiaalen van geïnduceerde pluripotente stamcel afgeleide cardiomyocyten met behulp van een snel modulair fotometriesysteem.
Abstract
Conventionele intracellulaire micro-elektrodetechnieken om cardiomyocytenelektrofysiologie te kwantificeren zijn uiterst complex, arbeidsintensief en worden meestal uitgevoerd in lage doorvoer. Snelle en voortdurende uitbreiding van geïnduceerde pluripotente stamceltechnologie (iPSC) vormt een nieuwe standaard in cardiovasculair onderzoek en alternatieve methoden zijn nu nodig om de doorvoer van elektrofysiologische gegevens op een enkel celniveau te verhogen. VF2.1Cl is een recent afgeleide spanningsgevoelige kleurstof die een snelle eenkanaals, hoge magnitude respons biedt op fluctuaties in membraanpotentiaal. Het bezit een kinetiek die superieur is aan die van andere bestaande spanningsindicatoren en stelt functionele gegevens beschikbaar die gelijkwaardig zijn aan die van traditionele micro-elektrodetechnieken. Hier demonstreren we vereenvoudigde, niet-invasieve actiepotentiaalkarakterisering in extern getemporeerde menselijke iPSC-afgeleide cardiomyocyten met behulp van een modulair en zeer betaalbaar fotometriesysteem.
Introduction
Elektrofysiologische modellering van cardiomyocyten en de bouw van efficiënte platforms voor cardiale geneesmiddelenscreening is essentieel voor de ontwikkeling van therapeutische strategieën voor een verscheidenheid aan aritmische aandoeningen. Snelle uitbreiding van geïnduceerde pluripotente stamcel (iPSC) technologie heeft veelbelovende inbraken in de menselijke ziekte modellering en farmacologisch onderzoek met behulp van geïsoleerde patiënt afgeleide cardiomyocyten (iPSC-CM) geproduceerd. "Gouden standaard" -technieken voor elektrofysiologische karakterisering van deze cellen door middel van patch-clamp (current-clamp) kunnen de morfologie en duur van het actiepotentiaal (AP) kwantificeren, maar deze methode is ongelooflijk complex en traag en niet goed geschikt voor gegevensacquisitie met hoge doorvoer1. iPSC-CMs hebben regelmatig een verhoogd diastolisch membraanpotentiaal en verhoogde lekstroom in vergelijking met volwassen inheemse cardiomyocyten2. Er wordt gesuggereerd dat kleinere celgrootte en verminderde membraancapaciteit waargenomen in iPSC-CMs een systematische fout kunnen veroorzaken bij het gebruik van de stroomklemtechniek, misschien als verklaring voor deze afwijkingen3. Om het nut van een iPSC-CM-platform te maximaliseren, is een extra methode waardevol om de doorvoer te verhogen en de nauwkeurigheid van gegevens te garanderen bij het karakteriseren van transmembraanspanningsveranderingen op een enkel celniveau in iPSC-CMs.
Spanningsgevoelige kleurstoffen (VSD) zijn al lang een voorgestelde methode om een snellere, niet-invasieve en gelijkwaardige analyse van cardiale AP-kinetiek te bieden in vergelijking met die van traditionele technieken4. Een recente studie heeft de geschiktheid aangetoond van ratiometrische spanningsgevoelige sondefotometrie om de cardiale AP5nauwkeurig te kwantificeren. Bovendien leent de mogelijkheid om optische fotometriebenaderingen gemakkelijk op te schalen deze techniek aan grootschalige cardiotoxiciteitsscreenings die van cruciaal belang zijn bij de ontwikkeling van therapeutische geneesmiddelen (bijv. CiPA). Ontwikkeling van gestandaardiseerde cardiotoxiciteitsprotocollen in een geblindeerde multi-site studie met behulp van micro-elektrode array en spanningsgevoelige optische technieken heeft de belangrijkste waarde van deze aanpak aangetoond6.
Veel potentiometrische kleurstoffen zijn commercieel verkrijgbaar en de voortdurende synthetische ontwikkeling van nieuwe sondes toont een opwindend potentieel voor het stroomlijnen van hun effectiviteit in een verscheidenheid aan cardiale en neurale constructies. De ideale VSD heeft een verhoogde kinetiek en gevoeligheid, terwijl de capacitieve belasting, fotobleaching en cytotoxiciteit afnemen. De onlangs gesynthetiseerde VF2.1Cl (FluoVolt) drukt veel van deze gunstige eigenschappen uit, grotendeels te danken aan de nieuwe draadgebaseerde moleculaire structuur, gedeeld door andere leden van de nieuwe VoltageFluor (VF) -familie7. In tegenstelling tot gewone elektrochrome VSD's waarin eenvoudige sondes moleculair en elektrisch conjugeren met het plasmamembraan, bestaat deze kleurstof uit een passief ingebrachte, membraanoverspannende synthetische draad die een elektronrijke donor koppelt aan een gemodificeerde fluoresceïnefluoofoor (FITC). Mechanistische details zijn te vinden in figuur 1. Deze kleurstof toont een uitstekende gevoeligheid voor membraanspanningsfluctuaties en vertoont een verandering van 27% in emissie-intensiteit per 100 mV in tegenstelling tot ~ 10% gezien in andere veel voorkomende sondes bij vergelijkbare snelheden7. Bovendien hebben draadgebaseerde PeT-systemen geen directe interactie met het cellulaire elektrische veld, wat minimale elektrische interferentie en verwaarloosbare veranderingen in cellulaire capacitieve belasting produceert.
Figuur 1: Chemische, spectrale en mechanistische parameters van VF2.1Cl kleurstof. (A) Chemische structuur van VF2.1Cl. Moleculaire kenmerken om op te merken omvatten meerdere alkylgroepen in de fenyleenvinyleen moleculaire draad die het inbrengen in het plasmamembraan vergemakkelijken. Een negatief geladen sulfonzuurgroep geconjugeerd aan de FITC-sonde zorgt voor fluorofoorstabilisatie op het extracellulaire oppervlak en helpt bij het bijna loodrecht inbrengen ten opzichte van het elektrische veld van de lipide dubbellaag. B)Een vereenvoudigd schema van loodrechte VF2,1Cl inbedding in het plasmamembraan van een doelcel. (C) Absorptie- en emissiespectra van VF2.1Cl kleurstof. Spectra is identiek aan die van standaard FITC- en GFP-sondes. D)Weergave van het mechanistische werkingsmechanisme van VF2.1Cl. In rustomstandigheden (hyperpolarisch) drijven negatieve intracellulaire spanningen vrije elektronen naar de rostrale fluorofoor. Elektronenrijkdom zorgt ervoor dat foto-geïnduceerde elektronenoverdracht (PeT) de voorkeur krijgt als een pad uit de aangeslagen toestand na de optische excitatie, waardoor fluorescentie effectief wordt geblust. Daarentegen beïnvloedt een gedepolariseerde membraanpotentiaal de neerwaartse elektronenbeweging ten gunste van fluorescentie bij optische excitatie. De resulterende fluorescerende respons is lineair gerelateerd aan membraanspanning en kan nauwkeurig worden gebruikt om gedetailleerde temporele informatie over cellulaire elektrofysiologische kinetiek te verzamelen. (E) Representatieve brightfield (bovenste) en fluorescentie bij 470 nm (onderste) beelden van leporine cardiomyocyten geladen met VF2.1Cl. (F) Z stack van een enkele geladen cardiomyocyt. Pijlen geven gebieden aan met een duidelijke lokalisatie van VF2.1Cl naar het celmembraan. Beelden werden verkregen met een ronddraaiend schijf confocaal systeem bestaande uit een X-lightv3 draaiende schijf confocale kop met een 50 μm pinhole patroon; LDI-7 verlichting; Prime95B camera en een PlanApo Lambda 100x objectief. Schaalbalk: 20 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
De FITC-sonde geconjugeerd aan VF2.1Cl zorgt ervoor dat deze effectief kan worden gebruikt onder standaard- en GFP-filterconfiguraties, en vereist slechts een enkelkanaals acquisitiesysteem, die beide gemeenschappelijke kenmerken zijn van fluorescerende beeldvormingsplatforms. Analyse van dichte menselijke iPSC-CM monolagen met deze kleurstof is onlangs gemeld8,9,10,11. Ons protocol verschilt van deze studies vanwege ons onderzoek naar enkele, geïsoleerde iPSC-CMs, niet gestoord door de elektrische en paracriene invloeden van dichte syncytiele monolagen, en ons gebruik van een betaalbaar en aanpasbaar fotometriesysteem in tegenstelling tot complexe confocale of wide-field beeldvormingsarrangementen.
Hier beschrijven we ons protocol voor de snelle verwerving en analyse van robuuste optische AP's van geïsoleerde menselijke iPSC-afgeleide cardiomyocyten en inheemse cardiomyocyten (zie Aanvullend bestand). We gebruiken VF2.1Cl in combinatie met een aanpasbaar state-of-the-art platform voor fotometriemetingen met één cel. Deze experimentele protocollen zijn goedgekeurd door de ethische commissie van het Universitair Medisch Centrum Göttingen (nr. 10/9/15).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cellulaire preparaten
OPMERKING: Menselijke iPSC's die in dit protocol worden gebruikt, zijn afgeleid van gezonde donoren en gedifferentieerd in monolagen met behulp van volledig gedefinieerde kleine molecuulmodulatie van WNT-signalerings- en lactaatzuiveringstechnieken zoals eerder beschreven12,13,14. iPSC-CMs werden om de 2-3 dagen onderhouden met een kweekmedium dat hieronder wordt beschreven.
- Bereid een kweekmedium van basaal medium (RPMI 1640) en 2% supplement (B27). Bewaren bij 4 °C. Gebruik bij kamertemperatuur (RT).
- Bereid een platingmedium van basaal medium (RPMI 1640), 2% supplement (B27) en 1:2000 ROCK-remmer. Bewaren bij 4 °C. Te gebruiken bij RT.
- Coat gesteriliseerde 10 mm ronde glas #0 coverslips met 150 μL van 1:60 factorvrije keldermembraanmatrix en incubeer bij 4 °C gedurende 4 uur.
OPMERKING: Optimalisatie van het afdekvolume is noodzakelijk om ervoor te zorgen dat het hele glas wordt bedekt met behoud van voldoende oppervlaktespanning om morsen te voorkomen. 150 μL wordt aanbevolen voor ronde afdeksels van 10 mm. Batchgrootte, coverslip-type, coverslipvolume en kweekplaattype kunnen worden aangepast aan de behoeften van de experimentatoren. - Begin met iPSC-CM-dissociatie met een op EDTA gebaseerd celdissociatiereagens. Zorg ervoor dat de monolaag volledig wordt losgemaakt door voorzichtig te spoelen met een pipet van 1.000 μL.
- Breng de cellulaire suspensie over in een buis van 15 ml en voeg dubbel volume plating medium toe. Centrifugeer gedurende 10 min bij 100 x g.
- Resuspend de pellet met een gewenst volume (resuspensievolume) van het beplatingsmedium. Tel cellen handmatig of elektronisch.
- Selecteer de optimale dichtheid per coverslip (15.000) die de geïsoleerde cellulaire analyse later mogelijk maakt.
- Bereken het volume 'actieve' cellulaire suspensie (A) dat nodig is om alle coverslips op deze gewenste dichtheid te platen. Pas de volgende formule toe en trek terug in een aparte buis:
- Bereken het volume extra beplatingsmedium (B) dat nodig is om elke afdekplaat op een gewenst volume te accommoderen. Pas de volgende formule toe en voeg het resulterende volume toe aan de buis van actieve suspensie:
- Verwijder de matrix van coverslips en breng het 'coverslip volume' van celsuspensie (A+B) aan op elke coverslip. Regelmatig resuspend in de buis om een gelijkmatige cellulaire verdeling te garanderen.
- Incubeer bij 37 °C gedurende 1 uur. Vul de put voorzichtig met beplatingsmedium.
- Wissel na 24 uur media uit met een normaal kweekmedium en onderhoud elke 2-3 dagen.
2. Experimentele opstelling
- Rust een omgekeerde epifluorescentiemicroscoop uit met een 40x vergrotingslens met hoog numeriek diafragma (N.A: > 0,75) om experimenten uit te voeren.
- Koppel een snel schakelende warmwitte LED aan de verzonden verlichtingspoort van de microscoop. Plaats een eenvoudig rood 660 nm-filter in het doorlatende lichtpad.
OPMERKING: Dit licht kan tijdens fotometrie-experimenten worden geactiveerd om het monster te observeren zonder het groene fluorescerende signaal te vervuilen. - Monteer een snel schakelende 470 nm LED-kop voor fotometrie-opname. Plaats een 470/40 excitatiefilter in de epifluorescente poort van de microscoop om het licht dat door de LED wordt gegenereerd op te ruimen.
OPMERKING: Voor een optimale signaalkwantificering wordt een verlichtingssysteem met hoge snelheidsfeedbackregeling van de optische uitgang aanbevolen. - Plaats een microscoopkubus met een 495 nm lange pass beam splitter in de carrousel van de spiegeleenheid in de microscoop.
- Monteer een detectiearm met een verstelbaar veldmembraan op de C-mount-poort van de microscoop om het interessante gebied te kunnen selecteren.
- Koppel afzonderlijk een fotomultiplicatordetector (PMT) en een USB-camera aan de microscoop. Dit zal de basis vormen van het emissiedetectiesysteem.
- Plaats een filterkubus met een 565 nm lange pass beam splitter en een 535/50 emissiefilter in de PMT-poort. Dit verdeelt het emissielicht tussen de twee detectoren.
OPMERKING: Een camera die is aangesloten op de verzonden poort van het emissiedetectiesysteem kan tijdens alle experimenten doorschijnend licht onder helder veld detecteren. - Koppel de PMT aan een voeding en een PMT-versterker. Sluit de PMT-versterkeruitgang aan op een analoge ingangspin van een data-acquisitiesysteem.
- Filter analoge gegevens van de PMT op 1 kHz of hoger.
- Digitaliseer gegevens met een frequentie die minstens het dubbele is van de hoogste frequentie die aanwezig is in analoog signaal (2 kHz of hoger) om aan nyquistcriteria te voldoen en aliasing te voorkomen.
3. Cellulair laden met VF2.1Cl
OPMERKING: Alle stappen met betrekking tot deze kleurstof moeten worden uitgevoerd bij weinig licht.
- Bereid een Tyrode-badoplossing van (in mM): 140 NaCl, 10 HEPES, 10 Glucose, 4 KCl, 1 MgCl2, 2 CaCl2, pH = 7,35 en warm tot 37 °C.
- Bereid een aliquot van de laadoplossing in een microcentrifugebuis door 5 μL van 1.000x VF2,1Cl en 50 μL van 20% oplosbare poloxameeroplossing te mengen.
- Breng 5 μL van de laadoplossing aan op 5 ml verwarmde Tyrode-oplossing (totaal 0,1x kleurstofconcentratie) in een petrischaaltje van 20 mm.
OPMERKING: De uiteindelijke kleurstofconcentratie is 0,1x. Dit is 1/10e die door de fabrikant wordt voorgesteld. Dit bespaart hulpbronnen, zorgt voor een verwaarloosbare cytotoxiciteit en, belangrijker nog, het behoudt nog steeds duidelijke optische signalen van geladen cellen met hoge signaal-ruisverhoudingen. - Voeg een enkele iPSC-CM afdekslip toe aan de schaal en incubeer bij 37 °C gedurende 20 minuten.
- Monteer een verwarmde levende celbeeldkamer. Monteer op het microscooppodium en vul met 500 μL verse Tyrode-oplossing.
- Was de deklip met verse Tyrode-oplossing op 37 °C.
- Breng de iPSC-CM coverslip voorzichtig aan op de voorverwarmde badkamer met behulp van een fijne punt tang.
OPMERKING: Zorg ervoor dat de kamer en de inhoud ervan altijd worden verwarmd bij fysiologische temperaturen. Begin indien gewenst met continue perfusie van de verwarmde Tyrode-oplossing.
4. Elektrische veldstimulatie
OPMERKING: Externe triggering van iPSC-CM is optioneel maar nuttig voor standaardisatie van cellulaire dynamica en experimentele parameters. Het verhoogt het analysegemak en maakt het mogelijk om frequentieafhankelijke effecten te onderzoeken.
- Bevestig een stimulatie-inzetstuk met twee platina-elektroden op 5 mm afstand van elkaar in de opnamekamer.
- Sluit een externe stimulator aan op de stimulatie-insert. Ingesteld op bipolaire veldpulsen van 5 ms bij 0,5 Hz.
- Bepaal de optimale stimulatiespanning door de stimulus van 1 V naar boven te verhogen. Drempelprikkel wordt gedefinieerd als de laagste spanning waarbij cellen beginnen samen te trekken. Breng spanningen aan die ongeveer 25% boven deze drempel liggen. Normaal bereik ligt tussen 1 V en 30 V.
- Fix stimulatiefrequentie met de externe stimulator of activeer deze met acquisitiesoftware.
5. Acquisitie van optische actiemogelijkheden
OPMERKING: Dit protocol maakt gebruik van commerciële software voor acquisitie en analyse.
- Visualiseer de myocyten in brightfield-weergave met behulp van het doorlatende lichtpad en de USB-camera.
- Selecteer een geïsoleerde cel en snijd het optische pad strak bij met het veldmembraan, zodat alleen licht van de cel van belang wordt bewaakt.
- Activeer de PMT-versterker en stel de PMT-voeding in op 750 V.
- Voer het stimulatieprotocol (zie stap 4) samen met de acquisitiesoftware uit en activeer tegelijkertijd het excitatielicht van 470 nm. Dit laatste kan via een remote panel of geautomatiseerd worden op een vaste intensiteit (TTL signaal).
- Pas de versterking en offset van de PMT-versterker aan om ervoor te zorgen dat het signaal niet verzadigd raakt en is geoptimaliseerd voor het detectiebereik van het opnamesysteem.
- Record 10 sweeps die ervoor zorgen dat stabiele actiepotentiaal wordt gedetecteerd.
- Ga door met opnemen en verplaats onmiddellijk de microscooptrap om kort een achtergrondsignaal te verkrijgen van een gebied zonder cellen. Schakel het excitatielampje uit.
OPMERKING: Deze achtergrondwaarde(F-offset) wordt gebruikt om rekening te houden met eventuele achtergrondfluorescentie. - Indien gewenst, perfuseer lokaal referentiegeneesmiddelen zoals 1 μM nifedipine om cellulaire reacties op farmacologische manipulatie te identificeren.
- Herhaal achtereenvolgens stap 5.2 tot en met 5.7, telkens wanneer u een nieuwe cel selecteert. Verwissel indien gewenst coverslips om een hoge experimentele omzet in één keer te garanderen.
OPMERKING: Protocollen voor laden en beeldacquisitie worden beschreven in figuur 2.
6. Data-analyse
- Open een opgeslagen opname met de analysesoftware en gemiddeld 10 sweeps met gestimuleerde actiepotentiaalen van een enkele cel.
- Neem een gemiddelde van het basislijnsignaal datF-offset vertegenwoordigt en trek dit af van het gemiddelde spoor.
- Bereken ∆F/F0 met de volgende formule (waarbij F fluorescentie wordt gemeten en F0 diastolische fluorescentie):
- Identificeer de trace baseline (diastolisch) en het interessegebied (AP) en meet de gewenste cardiale actiepotentiaalparameters. Dit omvat, maar is niet beperkt tot, de vervaltijd voor 50% (APD50)en 90% (APD90)repolarisatie.
- Exporteer de gegevens uit deze ene cel naar een spreadsheetsoftware.
- Herhaal stap 6.1 – 6.5 voor alle opnames. Beoordeel de resultaten met geschikte ongepaarde tests of analyse van variantie.
Figuur 2: Protocollen voor laden en beeldacquisitie. (A) Stroomdiagram van het volledige VF2.1Cl-laadprotocol voor iPSC-CMs en inheemse cardiomyocyten. (B) Een vereenvoudigd schema van bundelsplitser (BS) en filterconfiguraties die in dit protocol worden gebruikt voor excitatie en detectie van VF2.1Cl-emissie als reactie op veranderingen in de transmembraanspanning. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 3: Optische actiepotentiaal (AP) profielen van geïsoleerde inheemse cardiomyocyten en door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel afgeleide cardiomyocyten (iPSC-CM). (A) Representatieve optische AP van een enkele muriene cardiomyocyt (midden) met gemiddelde ± SEM van APD50 en APD90 (n = 7, rechts). (B)Representatieve optische AP van een enkele menselijke iPSC afgeleide cardiomyocyt (midden) met Gemiddelde ± SEM van APD50 en APD90 (n = 48, rechts). (C) Farmacologische manipulatie van iPSC-CM AP (midden) met 1 μM nifedipine. Gemiddelde ± SEM van APD90-verandering na toepassing van nifedipine (n = 5). **p < 0,01. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Een hoge signaal-ruisverhouding werd regelmatig waargenomen in onze monsters, ondanks het verminderde gezichtsveld bij het scherpstellen op een enkele cel. Er werd meer ruis waargenomen in kleinere iPSC-CMs, maar dat belemmerde de analyse na ensemblegemiddelde niet. AP-morfologie is duidelijk gedefinieerd en geeft een grondig overzicht van de cellulaire elektrofysiologische functie en repolarisatiemechanica in cardiomyocytenconstructies. Kenmerken van belang zijn de eerder beschreven15 scherpe upstroke snelheid en uitgesproken fase 1 kenmerken van murine cardiomyocyten (APD50:58.34±17.98 ms, APD90: 160.9±30.15 ms, n =7; Figuur 3A) die morfologisch verschillen van menselijke iPSC-CM optische signalen (APD50: 170.1±11.18 ms, APD90: 317.5±15.56 ms, n=48; Figuur 3B). We zagen een hogere snelheid van fotobleaching en cellulaire toxiciteit na optisch onderzoek in inheemse cardiomyocyten in vergelijking met gekweekte menselijke iPSC-CMs. Protocollen voor bereiding en kleurstofbelasting in inheemse cardiomyocyten zijn opgenomen in het aanvullend materiaal.
Humane iPSC-CM reageren op farmacologische manipulatie met nifedipine (1 μM). Een bekende L-type Ca2+ kanaal (CaV1.2) antagonist, nifedipine zal naar verwachting de AP-duur in cellen met fysiologische functie verminderen. Tijdens continue toepassing van het geneesmiddel werd een afname van 41,5% in APD90 waargenomen (n = 5), wat zowel de fysiologische expressie van CaV1.2-kanalen in deze cellen als de functionaliteit van op VF2.1Cl gebaseerde beeldvorming suggereert als een platform voor prospectieve cardiale geneesmiddelenscreeningstudies met hoge doorvoer(figuur 3C).
Aanvullend materiaal: Inheemse murine cardiomyocyten voorbereiding voor spanning beeldvorming. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier beschrijven we een basisprotocol om eenvoudig gedetailleerde AP-profielen te verkrijgen van geïsoleerde iPSC-CMs die geschikt zijn voor elektrofysiologische modellering en cardiale geneesmiddelenscreening. We detecteren regelmatige, robuuste AP's van onze schaars gezaaide iPSC-CMs, wat zowel indicatorfunctionaliteit als methodologische betrouwbaarheid suggereert.
Vanwege het brede spectrum van commerciële methodologieën voor iPSC-herprogrammering en het gebrek aan standaardisatie voor cardiale differentiatieprotocollen, kunnen iPSC-gebaseerde modellen een enorme variabiliteit in hun functie en morfologie vertonen16. Dit kan ook de effectiviteit van cardiotoxiciteitsstudies belemmeren. We rapporteren over het algemeen robuuste reacties op uitgebreid experimenteel onderzoek met minimale indicator-geïnduceerde cytotoxiciteit bij lage excitatie lichtintensiteiten. Standaardisatie van basisdissociatie en coverslip-zaaiing is van cruciaal belang om een consistente kwaliteit van iPSC-CM-preparaten te garanderen. Losse coverslips, die gemakkelijk kunnen worden ingebracht en vervangen in het beeldvormingsplatform, zijn ongelooflijk nuttig voor snelle gegevensverzameling en karakterisering van enkele cardiomyocyten. Er moet echter worden opgemerkt dat we een lichte afname van de levensvatbaarheid van de cel waarnemen na langere perioden (d.w.z. meer dan 4 weken) van schaarse cultuur op glazen dekpunten.
De modulaire opbouw van een snel fotometriesysteem zoals beschreven in stap 2 is van cruciaal belang voor dit protocol. Veel op optica gebaseerde opstellingen zijn in de handel verkrijgbaar en kunnen worden geoptimaliseerd voor een breed scala aan signaalopnamevereisten. Deze variëren van kwantitatieve beeldvorming met behulp van hoge resolutie, groot gebied camera's tot fotometrie metingen van het totale signaal van een gedefinieerd gebied. Met behulp van de laatste kwantificeren we fluorescentie met hoge snelheid vanuit een enkel gemaskeerd gebied met behulp van een fotomultiplicator (PMT). In combinatie met snel schakelende verlichtingscomponenten maakt dit een grondige dissectie mogelijk van snelle actiepotentiaalcomponenten met een extreem hoge temporele resolutie (analoog signaal tot 1 kHz). Hoge bemonsteringsfrequenties zijn vereist om betrouwbare metingen van actiepotentiaal upstroke in cardiomyocyten te garanderen en kunnen van cruciaal belang zijn in andere prikkelbare constructies (d.w.z. neuronen) met extreem snelle excitatiekinetiek. Verder is dit flexibele systeem gunstig omdat 1) het grondig onderzoek van de elektrofysiologie van eencellige cellen met veldmembraanselectie mogelijk maakt, 2) digitalisering van het analoge signaal niet geïntegreerd of voorbewerkt is en daarom direct onder experimenteercontrole staat, 3) de modulaire aard van de fotometrie-instrumentatie eenvoudige herconfiguratie mogelijk maakt om gelijktijdige optische meting met andere indicatoren of micro-elektroden mogelijk te maken. Toevoeging van een tweede fotomultiplicatorkanaal, met geschikte filtersets om spectrale overlap te voorkomen, zal echte gelijktijdige meting van de fluorescerende intracellulaire calciumindicator CAL-590 naast VF2.1Cl mogelijk maken. Het is ook belangrijk op te merken dat dit multifunctionele systeem alternatief kan worden gebruikt voor een diepe beoordeling van intracellulaire calciumbehandeling zoals eerder beschreven17,18,19,20.
Hoewel de temporele resolutie van ons systeem veel voordelen met zich meebrengt, moet worden opgemerkt dat parameters die analyse van de ruimtelijke verdeling van fluorescentiesignalen vereisen, zoals excitatiepatronen of geleidingssnelheid, niet geschikt zijn voor onderzoek door de fotometrietechnieken die we hier gebruiken en zich op het gebied van optische mapping bevinden. De hier beschreven hardware kan eenvoudig worden omgezet in een optische mappingconfiguratie door de fotomultiplicator in te ruilen voor een geschikte specialistische camera met hoge framesnelheden en grote putcapaciteit. Onze beschreven configuratie kan extreem gedetailleerde temporele informatie bieden tegen een fractie (tot 1/10th)van de commerciële prijs van geavanceerde camera's met een groot gebied met gelijkwaardige mogelijkheden. Confocale lijnscantechnieken zijn ook ruimtelijk gedetailleerder dan onze methode, maar beperkingen in z beperken fluorescentie-acquisitie van meerdere dwarsvlakken tegelijk. Dit is niet ideaal voor beeldvorming van membraangebonden verslaggevers die worden vastgehouden door iPSC-CMs met typisch heterogene morfologieën. Fotometriemetingen met behulp van een standaard epifluorescentiemicroscoop voorkomen dit probleem door onmiddellijk toegang te krijgen tot het hele cellulaire oppervlak, opnieuw tegen veel lagere kosten per gegevenspunt.
We raden VF2.1Cl ten zeerste aan voor het uitvoeren van spanningstests met prikkelbare cellen. Momenteel zijn er veel VSD's beschikbaar die werken onder een groot aantal verschillende mechanismen, elk met hun eigen inherente beperkingen. Veel voorkomende elektrochrome styrylkleurstoffen zoals di-8-ANEPPS of di-4-ANBDQBS die snelle reacties op transmembraanspanning vertonen, worden echter gehinderd door een lage gevoeligheid en hoge capacitieve belasting21,22. Genetisch gecodeerde spanningsindicatoren (GEFI's) maken gebruik van de fusie van fluorescerende eiwitten tot moleculaire spanningsdetectiedomeinen23 of microbiële opsins24 en bieden zeer gevoelige dissecties van cellulaire spanningsdynamiek, maar worden belemmerd door verminderde kinetiek en niet-lineaire reacties. Een lijst met veelvoorkomende VSD's en hun dynamische basiseigenschappen zijn opgenomen in tabel 1. PeT-sondes zoals VF2.1Cl bieden een goed compromis, met snelle kinetiek en fatsoenlijke gevoeligheid met minimale cellulaire verstoring. Deze VSD is echter beperkt omdat het, in tegenstelling tot ratiometrische styrylkleurstoffen21,niet kan worden gebruikt om het absolute membraanpotentiaal op te lossen. Dit inherente nadeel benadrukt het ongelukkige gevolg van het handhaven van gegevensnauwkeurigheid bij een hogere doorvoer bij het testen van cellulaire elektrofysiologie.
|
Gevoeligheid (% ∆F/F per 100mV) |
Snelheid (ms) | |
| Kleurstoffen op basis van PET | ||
| VF2.1Cl7 | 27 | <1 |
| BeRST125 | 24 | <1 |
| RhoVR126 | 47 | <1 |
| Hemicyanine kleurstoffen | ||
| Di-8-ANEPPS21 | 10 | <1 |
| Di-4-ANEPPS27 | 8 | <1 |
| Di-4-ANBDQBS22 | 10–20 | <1 |
| Rh23728 | 11 | <1 |
| PGH129 | 17.5 | <1 |
| GEFI's | ||
| Arclight30 | 32 | 12324 |
| Boog D95N31 | 40 | 4124. |
| Zeemeermin32 | 40 | 17.4 |
| VSFP 2,333 | 13.3 | 2523. |
| QuasAr224 | 90 | 11 |
| FRET | ||
| Dio/DPA34 | 56 | 2 |
Tabel 1: Een korte lijst van veel voorkomende VSD's en hun belangrijkste fluorescerende eigenschappen.
We merken op dat excitatie-contractie-ontkoppelaars zoals blebbistatine of 2,3-butaan-dionamonoxime (BDM) vaak worden gebruikt in optische spanningsmetingen om bewegingsartefacten te verminderen door hartcontractie te onderdrukken35. Eerdere rapporten hebben echter aangetoond dat beide verbindingen de AP-duur aanzienlijk verlengen en AP-restitutie in hele doordrenkte hartenafvlakken 36,37. Bovendien heeft blebbistatine fluorescerende eigenschappen die overlappen met de spectra van VF2.1Cl en daarom mogelijk niet geschikt zijn voor gebruik met deze kleurstof38.
Ons veelzijdige protocol vereist minimale aanpassingen voor optisch onderzoek naar een verscheidenheid aan tweedimensionale en driedimensionale prikkelbare constructies. Deze methode maakt een snelle en nauwkeurige kwantificering van repolarisatiemechanica mogelijk, wat waardevolle inzichten kan bieden in cellulaire ionische afwijkingen. In onze handen levert dit protocol duidelijke optische signalen met goede signaal-ruisverhoudingen, zelfs in kleinere cellen. Ons eenvoudige en effectieve platform kan worden toegepast voor niet-invasieve validatie van cardiale geneesmiddelenveiligheid en screeningsstudies met hoge doorvoer met behulp van patiëntspecifieke iPSC-CMs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Cairn Research Ltd ondersteunde deze publicatie door de productiekosten van het videobestand te dekken.
Acknowledgments
De auteurs willen Cairn Research Ltd. bedanken voor hun vriendelijke financiële bijdrage die de productiekosten van deze publicatie dekte. Daarnaast bedanken we mevrouw Ines Mueller en mevrouw Stefanie Kestel voor hun uitstekende technische ondersteuning.
Het onderzoek van de auteurs wordt ondersteund door het Duitse Centrum voor Cardiovasculair Onderzoek (DZHK), de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation, VO 1568/3-1, IRTG1816 RP12, SFB1002 TPA13 en in het kader van de Duitse Excellence Strategy - EXC 2067/1- 390729940) en de Else-Kröner-Fresenius Stiftung (EKFS 2016_A20).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| 0.25 Trypsin EDTA | Gibco | 25200056 | |
| B27 Supplement | Gibco | 17504044 | |
| CaCl2 | Carl Roth | HN04.2 | |
| D(+)-Glucose anhydrous BioChemica | ITW Reagents | A1422 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | |
| FluoVolt Membrane Potential Kit | Invitrogen | F10488 | |
| HEPES | Carl Roth | HN77.4 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | 6781.1 | |
| Lamanin | Sigma-Aldrich | 114956-81-9 | |
| Matrigel | BD | 354230 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 9265.2 | |
| Nifedipine | Sigma-Aldrich | 21829-25-4 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140 | |
| ROCK Inhibitor Y27632 | Stemolecule | 04-0012-10 | |
| RPMI 1640 Medium | Gibco | 61870010 | |
| Versene EDTA | Gibco | 15040033 | |
| Equipment | |||
| 495LP Dichroic Beamsplitter | Chroma Technology | ||
| Axopatch 200B Amplifier | Molecular Devices | ||
| Circle Coverslips, Thickness 0 | Thermo Scientific | CB00100RA020MNT0 | |
| Digidata 1550B | Molecular Devices | ||
| Dual OptoLED Power Supply | Cairn Research | ||
| ET470/40x Excitation Filter | Chroma Technology | ||
| ET535/50m | Chroma Technology | ||
| Etched Neubauer Hemacytometer | Hausser Scientific | ||
| Filter Cubes | Cairn Research | ||
| IX73 Inverted Microscope | Olympus | ||
| MonoLED | Cairn Research | ||
| Multiport Adaptors | Cairn Research | ||
| Myopacer Cell Stimulator | IonOptix | ||
| Optomask Shutter | Cairn Research | ||
| Optoscan System Controller | Cairn Research | ||
| PH-1 Temperature Controlled Platform | Warner Instruments | ||
| Photomultiplier Detector | Cairn Research | ||
| PMT Amplifier Insert | Cairn Research | ||
| PMT Supply Insert | Cairn Research | ||
| RC-26G Open Bath Chamber | Warner Instruments | ||
| SA-OLY/2AL Stage Adaptor | Olympus | ||
| T565lpxr Dichroic Beamsplitter | Chroma Technology | ||
| T660lpxr Dichroic Beamsplitter | Chroma Technology | ||
| TC-20 Dual Channel Temperature Controller | npi Electronic | ||
| UPLFLN 40X Objective | Olympus | ||
| USB 3.0 Colour Camera | Imaging Source | ||
| Software | |||
| Clampex 11.1 | Molecular Devices | ||
| Clampfit 11.1 | Molecular Devices | ||
| IC Capture 2.4 | Imaging Source | ||
| Prism 8 | Graphpad |
References
- Miller, E. W. Small molecule fluorescent voltage indicators for studying membrane potential. Current Opinion in Chemical Biology. 33, 74-80 (2016).
- Liang, P., et al. Drug screening using a library of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes reveals disease-specific patterns of cardiotoxicity. Circulation. 127 (16), 1677-1691 (2013).
- Horváth, A., et al. Low resting membrane potential and low inward rectifier potassium currents are not inherent features of hiPSC-derived cardiomyocytes. Stem Cell Reports. 10 (3), 822-833 (2018).
- Salama, G., Morad, M. Merocyanine 540 as an optical probe of transmembrane electrical activity in the heart. Science. 191 (4226), 485-487 (1976).
- Hortigon-Vinagre, M., et al. The use of ratiometric fluorescence measurements of the voltage sensitive dye Di-4-ANEPPS to examine action potential characteristics and drug effects on human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Toxicological Sciences. 154 (2), 320-331 (2016).
- Blinova, K., et al. International multisite study of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug proarrhythmic potential assessment. Cell Reports. 24 (13), 3582-3592 (2018).
- Miller, E. W., et al. Optically monitoring voltage in neurons by photo-induced electron transfer through molecular wires. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (6), 2114-2119 (2012).
- Bedut, S., et al. High-throughput drug profiling with voltage- and calcium-sensitive fluorescent probes in human iPSC-derived cardiomyocytes. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 311 (1), 44-53 (2016).
- McKeithan, W. L., et al. An automated platform for assessment of congenital and drug-induced arrhythmia with hiPSC-derived cardiomyocytes. Frontiers in Physiology. 8, 766 (2017).
- Duncan, G., et al. Drug-mediated shortening of action potentials in LQTS2 human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cells and Development. 26 (23), 1695-1705 (2017).
- Asakura, K., Hayashi, S., Ojima, A., Taniguchi, T., Miyamoto, N. Improvement of acquisition and analysis methods in multi-electrode array experiments with iPS cell-derived cardiomyocytes. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 75, 17-26 (2015).
- Lian, X., et al. Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/β-catenin signaling under fully defined conditions. Nature Protocols. 8 (1), 162-175 (2013).
- Burridge, P. W., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nature methods. 11 (8), 855-860 (2014).
- Kleinsorge, M., Cyganek, L. Subtype-directed differentiation of human iPSCs into atrial and ventricular cardiomyocytes. STAR Protocols. , 100026 (2020).
- Knollmann, B. C., Katchman, A. N., Franz, M. R. Monophasic action potential recordings from intact mouse heart: validation, regional heterogeneity, and relation to refractoriness. Journal of Cardiovascular Electrophysiology. 12 (11), 1286-1294 (2001).
- Leopold, J. A., Loscalzo, J. Emerging role of precision medicine in cardiovascular disease. Circulation Research. 122 (9), 1302-1315 (2018).
- Voigt, N., Zhou, X. B., Dobrev, D. Isolation of human atrial myocytes for simultaneous measurements of Ca2+ transients and membrane currents. Journal of Visualized Experiments. (77), e50235 (2013).
- Voigt, N., et al. Enhanced sarcoplasmic reticulum Ca2+ Leak and increased Na+-Ca2+ exchanger function underlie delayed afterdepolarizations in patients with chronic atrial fibrillation. Circulation. 125 (17), 2059-2070 (2012).
- Voigt, N., et al. Cellular and molecular mechanisms of atrial arrhythmogenesis in patients with paroxysmal atrial fibrillation. Circulation. 129 (2), 145-156 (2014).
- Fakuade, F. E., et al. Altered atrial cytosolic calcium handling contributes to the development of postoperative atrial fibrillation. Cardiovascular Research. , doi: 10.1093/cvr/cvaa162. Online ahead of print 162 (2020).
- Gross, E., Bedlack, R. S., Loew, L. M. Dual-wavelength ratiometric fluorescence measurement of the membrane dipole potential. Biophysical Journal. 67 (1), 208-216 (1994).
- Matiukas, A., et al. Near-infrared voltage-sensitive fluorescent dyes optimized for optical mapping in blood-perfused myocardium. Heart Rhythm. 4 (11), 1441-1451 (2007).
- Mutoh, H., et al. Spectrally-resolved response properties of the three most advanced fret based fluorescent protein voltage probes. PLoS One. 4 (2), 4555 (2009).
- Hochbaum, D. R., et al. All-optical electrophysiology in mammalian neurons using engineered microbial rhodopsins. Nature Methods. 11 (8), 825-833 (2014).
- Huang, Y. L., Walker, A. S., Miller, E. W. A photostable silicon rhodamine platform for optical voltage sensing. Journal of the American Chemical Society. 137 (33), 10767-10776 (2015).
- Deal, P. E., Kulkarni, R. U., Al-Abdullatif, S. H., Miller, E. W. Isomerically pure tetramethylrhodamine voltage reporters. Journal of the American Chemical Society. 138 (29), 9085-9088 (2016).
- Fluhler, E., Burnham, V. G., Loew, L. M. Spectra, membrane binding, and potentiometric responses of new charge shift probes. Biochemistry. 24 (21), 5749-5755 (1985).
- Fromherz, P., Muller, C. O. Voltage-sensitive fluorescence of amphiphilic hemicyanine dyes in neuron membrane. Biochimica et Biophysica Acta. 1150 (2), 111-122 (1993).
- Salama, G., et al. Properties of new, long-wavelength, voltage-sensitive dyes in the heart. Journal of Membrane Biology. 208 (2), 125-140 (2005).
- Jin, L., et al. Single action potentials and subthreshold electrical events imaged in neurons with a fluorescent protein voltage probe. Neuron. 75 (5), 779-785 (2012).
- Kralj, J. M., Douglass, A. D., Hochbaum, D. R., MacLaurin, D., Cohen, A. E. Optical recording of action potentials in mammalian neurons using a microbial rhodopsin. Nature Methods. 9 (1), 90-95 (2012).
- Tsutsui, H., Karasawa, S., Okamura, Y., Miyawaki, A. Improving membrane voltage measurements using FRET with new fluorescent proteins. Nature Methods. 5 (8), 683-685 (2008).
- Lundby, A., Mutoh, H., Dimitrov, D., Akemann, W., Knöpfel, T. Engineering of a genetically encodable fluorescent voltage sensor exploiting fast Ci-VSP voltage-sensing movements. PLoS One. 3 (6), 2514 (2008).
- Bradley, J., Luo, R., Otis, T. S., DiGregorio, D. A. Submillisecond optical reporting of membrane potential in situ using a neuronal tracer dye. The Journal of neuroscience. 29 (29), 9197-9209 (2009).
- Herron, T. J., Lee, P., Jalife, J. Optical imaging of voltage and calcium in cardiac cells & tissues. Circulation Research. 110 (4), 609-623 (2012).
- Kappadan, V., et al. High-resolution optical measurement of cardiac restitution, contraction, and fibrillation dynamics in beating vs. blebbistatin-uncoupled isolated rabbit hearts. Frontiers in Physiology. 11, 464 (2020).
- Kettlewell, S., Walker, N. L., Cobbe, S. M., Burton, F. L., Smith, G. L. The electrophysiological and mechanical effects of 2,3-butane-dione monoxime and cytochalasin-D in the Langendorff perfused rabbit heart. Experimental Physiology. 89 (2), 163-172 (2004).
- Képiró, M., et al. para-Nitroblebbistatin, the non-cytotoxic and photostable Myosin inhibitor. Angewandte Chemie International Edition. 53 (31), 8211-8215 (2014).
