Microfluïdische co-cultuurmodellen voor het ontleden van de immuunrespons in in vitro tumormicro-omgevingen

Summary

In het tijdperk van immunotherapie en eencellige genomische profilering vereist kankerbiologie nieuwe in vitro en computationele hulpmiddelen voor het onderzoeken van de tumor-immuuninterface in een juiste spatiotemporale context. We beschrijven protocollen om tumor-immuun microfluïdische co-culturen te exploiteren in 2D- en 3D-instellingen, compatibel met dynamische, multiparametrische monitoring van cellulaire functies.

Abstract

Complexe ziektemodellen vereisen geavanceerde hulpmiddelen die fysiologisch en pathologisch relevante, bruikbare inzichten kunnen leveren en anders onzichtbare processen kunnen onthullen. Geavanceerde celtests die nauw nabootsen in vivo landschappen vestigen zich als nieuwe manieren om het bidirectionele tumor-gastheer samenspel te visualiseren en te meten dat de progressie van kanker beïnvloedt. Hier beschrijven we twee veelzijdige protocollen om zeer controleerbare 2D- en 3D-coculturen in microdevices na te bootsen, waarbij de complexiteit van de tumormicro-omgeving (TME) wordt nagebootst, onder natuurlijke en door therapie geïnduceerde immunosurveillance. In sectie 1 wordt een experimentele setting geboden om kruisverwijzing tussen aanhangende tumorcellen en zwevende immuunpopulaties te monitoren, door middel van brightfield time-lapse microscopie. Als toepassingsscenario analyseren we de effecten van antikankerbehandelingen, zoals de zogenaamde immunogene kankerceldoodinductoren op de rekrutering en activering van immuuncellen. In sectie 2 worden 3D-tumor-immuunmicro-omgevingen geassembleerd in een concurrerende lay-out. Differentiële immuuninfiltratie wordt gemonitord door fluorescentiemomentopnamen tot 72 uur, om combinatietherapeutische strategieën te evalueren. In beide omgevingen worden beeldverwerkingsstappen geïllustreerd om een overvloed aan immuuncelparameters te extraheren (bijv. Immuuncelmigratie en interactie, reactie op therapeutische middelen). Deze eenvoudige en krachtige methoden kunnen verder worden afgestemd om de complexiteit van de TME te simuleren die de heterogeniteit en plasticiteit van kanker-, stromale en immuuncelsubtypen omvat, evenals hun wederzijdse interacties als aanjagers van kankerevolutie. De naleving van deze snel evoluerende technologieën met live-cell high-content imaging kan leiden tot het genereren van grote informatieve datasets, wat nieuwe uitdagingen met zich meebrengt. Inderdaad, de driehoek ''co-culturen/microscopie/geavanceerde data-analyse' zet de weg naar een precieze probleemparametrisatie die op maat gemaakte therapeutische protocollen kan helpen. We verwachten dat de toekomstige integratie van kanker-immuun on-a-chip met kunstmatige intelligentie voor high-throughput processing een grote stap voorwaarts zal betekenen in het benutten van de mogelijkheden als voorspellende en preklinische hulpmiddelen voor precisie en gepersonaliseerde oncologie.

Introduction

De evolutie van verschillende takken van de geneeskunde als experimentele disciplines is afhankelijk geweest van het vermogen om celpopulatie en orgaanfuncties onder gecontroleerde omstandigheden te manipuleren¹. Een dergelijk vermogen heeft zijn wortels in de beschikbaarheid van meetbare modellen die in staat zijn om processen in ons lichaam samen te vatten.

In het tijdperk van immunotherapie en eencellige genomische profilering 2, moet de kankerbiologie profiteren van opkomende in vitro en computationele modellen voor het onderzoeken van de tumor-immuuninterface in een juiste spatiotemporale context ^2,3.

De tumor micro-omgeving⁴ (TME) is een complex weefsel waar kankercellen continu interageren en dynamisch co-evolueren met de andere cellulaire (immuun-, stromale en endotheelcellen) en niet-cellulaire (de extracellulaire matrix, ECM) componenten. De dynamische aard van dit complexe landschap bepaalt of immuuncellen spelen als vrienden of vijanden van kwaadaardige cellen, waardoor zowel de ziekteprogressie als de respons op therapie sterk worden beïnvloed. Tegenwoordig komen grote inspanningen van onco-immunologen, bio-informatici en systeembiologische experts samen om de klinische betekenis van heterogeniteit van kanker 5,6 aan te pakken, hetzij in de ruimte (d.w.z. in verschillende tumorgebieden) en tijd (d.w.z. in verschillende tumorprogressiestadia)^5,6, en om het fenotype en de functie van kanker en immuuncellen op eencellig niveau te karakteriseren. Als voorbeeld van deze synergie worden geavanceerde computervisietechnieken nu routinematig gebruikt voor het ruimtelijk in kaart brengen van immuuninfiltraat in histologische monsters ^7,8.

Aan de voorkant van experimentele modellen, overbruggingsdierstudies en traditionele in vitro-methoden, geven ontwikkelingen in microfluïdica en co-kweektechnieken toegang tot verschillende klassen van micro-engineered cellulaire modellen zoals organoïden, microfysiologische systemen 9,10,11 (MPS) en organen-op-chip^12,13,14 (OOC). Ze delen de gemeenschappelijke eigenschap om in te zoomen op het 'grote plaatje' van de cellulaire ecosystemen en het in vitro potentieel uit te breiden om micro-omgevingsfactoren te beheersen, terwijl ze gebruik maken van microscopie¹⁵ met een hoog gehalte en beeldverwerkingsbenaderingen.

Tegenwoordig zijn state-of-the-art MPS- en OOC-systemen begonnen immunologische aspecten op te nemen , waarbij verschillende subtypen immuuncellen in bestaande weefsels en co-culturen worden opgenomen, zodat een verscheidenheid aan processen zoals ontstekingsziekten, wondgenezing, mucosale immuniteit en reactie op toxines of dagelijkse voedingsproducten wordt onderzocht en gemeten¹⁶. TME-on-a-chip modellen 10,11,12,13,14,15,16,17, ook geïntegreerd met perfuseerbare microvessels 18,19,20,21, zijn ontwikkeld om celtype-afhankelijke interacties, fysische en chemische verstoringen en de cytotoxische activiteit van infiltrerende lymfocyten²², evenals klinisch relevante immunomodulerende middelen²³.

Hier bieden we veelzijdige protocollen, variërend van het laden van cellen in chips tot beeldverwerkingstools, om geavanceerde tumor-immuun microfluïdische coculturen te benutten in 2D (sectie 1) en 3D (sectie 2) instellingen¹⁶, compatibel met dynamische, multiparametrische²⁴ monitoring en visualisatie van cellulaire functies. Dit wordt bereikt met behoud van gebruiksgemak en flexibiliteit, zowel in monsterbeheer als gegevensanalyse, gebruikmakend van Fiji freeware-software en zijn toolboxen^25,26.

Het microfluïdische apparaat, beschreven in sectie 1, is ontworpen om 2D-coculturen van aanhangende kanker en zwevende immuuncellen uit te voeren. Dit platform werd gevalideerd voor de in vitro meting van het gedrag van immuuncellen in aanwezigheid van genetische mutaties²⁷ en/of immunodeficiënties²⁸. Hier illustreren we stappen voor het volgen van immuuncellen in time-lapse bright-field-afbeeldingen, door gebruik te maken van een semi-automatische methode op basis van Trackmate (een plug-in geïmplementeerd in Fiji-software). Deze procedure maakt de extractie mogelijk van kinematische descriptoren van immuunmigratie ²⁹ en respons (d.w.z. interactietijden) om kankercellen te targeten, al dan niet behandeld met immunogene celdoodinductoren²⁷.

Belangrijk is dat deze parameters, geëxtraheerd uit tijdreeksafbeeldingen, kunnen worden verwerkt met geavanceerde wiskundige machines. Als voorbeeld van de potentie van deze benadering publiceerden onze groepen onlangs een analyse op basis van wiskundige methoden van stochastische processen en statistische mechanica om cellulaire netwerkeigenschappen te modelleren en een geparametriseerde beschrijving van immuuncelgedrag te geven (d.w.z. bevooroordeelde of niet-gecorreleerde willekeurige wandeling, sterk of niet gecoördineerde beweging^30,31).

De 3D-instelling, die in de tweede sectie wordt verstrekt, is gebaseerd op een co-cultuurprotocol om complexere immunocompetente TME's ingebed in twee gelregio's met verschillende combinaties van celtypen en geneesmiddelen op een concurrerende manier te recreëren. Hier worden beeldverwerkingsstappen beschreven om, op verschillende tijdstippen, de infiltratie van gekleurde immuuncellen in menselijke A375M-melanoomcellen gekweekt in Matrigel te meten, om antitumormiddelcombinaties te evalueren³². A375M-lijn, een van A375P afgeleide cellijn gekenmerkt door een sterk gemetastaseerd fenotype, werd gekozen om hun metastatische vermogen te evalueren in de aanwezigheid van immuuncellen³².

De beschreven modellen kunnen volledig compatibel zijn met verschillende celbronnen (murine en menselijke vereeuwigde of primaire cellijnen, organoïden, xenografts, onder de anderen). In recente studies van ons lab, door high-content videomicroscopie te combineren met beeldanalyse, werd de competitieve 3D-lay-out toegepast om te onderzoeken: i) een anti-tumorale (antilichaam-afhankelijke cel-gemedieerde cytotoxiciteit, ADCC) immuunrespons en ontleed de rol van fibroblasten in resistentie tegen trastuzumab-therapie in HER2 ⁺ borstkanker on-chip modellen³³; ii) de werking van myeloïde cellen (d.w.z. kanker-geassocieerde macrofagen) in mechanismen van tumorontwijking en rekrutering van T-cellen³⁴; iii) de werkzaamheid van immunotherapeutische regimes, specifiek gebaseerd op interferon-α-geconditioneerde dendritische cellen (IFN-DC's), gekweekt met met geneesmiddelen behandelde darmkankercellen in collageenmatrices, en om efficiënte beweging en de daaropvolgende fagocytosegebeurtenissen te evalueren³⁵; iv) de chemotactische migratie van van beenmerg afgeleide eosinofielen naar met IL-33 behandelde of onbehandelde melanoomcellen³⁶.

Deze geavanceerde modellen kunnen dienen als observatievensters voor het begrijpen van de rol van immuuncontexten bij kankermetastase en resistentiemechanismen, maar er zijn inspanningen nodig om bevindingen naar de klinieken te vertalen en de kloof met fundamenteel onderzoek te dichten³⁷.

Als een opkomend scenario, het benutten van de kracht van geautomatiseerde high-content microscopie gekoppeld aan het gebruik van meer fysiologisch relevante microsystemen opent nieuwe potentiële uitdagingen voor de verwerking, verwerking en interpretatie van honderden, en zelfs duizenden, Gigabytes aan multiparametrische gegevens, die kunnen worden gegenereerd uit een enkele experimentele campagne. Dit impliceert een directe koppeling van OOC-experimenten met kunstmatige intelligentie 38,39,40,41,42 (AI)-gebaseerde algoritmen, zowel voor geavanceerde geautomatiseerde analyse als voor het genereren van functies die op hun beurt kunnen worden gevoed in silico-modellen van kanker-immuun samenspel 43, met spannende nieuwe toepassingen aan de horizon^, zoals de ontwikkeling van voorspellende medicijnscreeningtests ⁴⁴.

Een steeds groter wordende stroom van inspanningen is gericht op het ontwerp van ziektemodellen samen met de optimalisatie van strategieën om de grootschalige perturbatieschermen met eencellige multi-omics-uitlezingen te implementeren. Dit zal ongetwijfeld helpen bij de ontwikkeling en, hopelijk, de klinische implementatie, vergezeld van een passende mate van methodestandaardisatie, van een systematische onco-immunologie-op-een-chip-benadering om nieuwe inzichten te verkrijgen in immuunstoornissen en kankerverspreidingsmechanismen.

Protocol

1. Chipontwerp voor hechtende en zwevende cellen 2D-coculturen

OPMERKING: De 2D-cocultuurlay-out (figuur 1A-C) wordt gekenmerkt door drie kamers (100 μm hoog) die onderling verbonden zijn door twee sets microkanaalarrays (500 x 12 x 10 μm³, L×B×H). De tussenliggende kamer vormt twee gesloten doodlopende compartimenten die zwevende immuuncellen blokkeren die tijdens de laadstap 2.5 overlopen naar de tumorplaats. Dit apparaattype is nuttig voor real-time bidimensionale metingen van eencellige (adhesieve of zwevende) motiliteit en van cel-cel interacties 16,27,28,30,31. Een typische celmigratiestudie (uitgevoerd van enkele uren tot meerdere dagen) combineert live-cell microscopie met beeldverwerkingsalgoritmen⁴⁵, om de verkregen beeldsequenties te vertalen in numerieke kenmerken²⁵. Op basis van de migratiepatronen kunnen verschillende biofysische indicatoren worden geschat, zoals de verplaatsing en snelheid van cellen, evenals de duur van immuuncel- en doelcelinteracties²⁴.

1. Bereiding van kanker- en PBMC-cellen
   1. Kankercelkweek
      OPMERKING: MDA-MB-231 triple-negatieve [oestrogeenreceptor (ER)-, progesteronreceptor (PR)-, en humane epidermale groeifactorreceptor 2 (HER2)-] menselijke adenocarcinoomcellen van de borst worden routinematig gekweekt in een Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium aangevuld met 10% (v / v) foetaal runderserum (FBS), 2 mM L-glutamine, 100 IE ml−1 penicilline G natriumzout en 100 μg ml⁻¹ streptomycinesulfaat (groeimedium), onder standaard kweekomstandigheden (37 °C en 5% CO₂).
      1. Om de celkweekgroei te optimaliseren, plaat MDA-MB-231 cellen in 75 cm² kolven met een dichtheid van 1 × 10⁶ cellen ^ml-1 in 12 tot 15 ml groeimedium.
      2. Wanneer cellen de 75-80% van de samenvloeiing bereiken, gooit u het groeimedium weg, wast u cellen met voorverwarmde fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) om FBS volledig te verwijderen en maakt u ze vervolgens los met voorverwarmd trypsine (1 tot 2 minuten bij 37 °C).
      3. Voeg groeimedium toe om de enzymatische activiteit van trypsine te inactiveren en losgemaakte cellen te verzamelen. Was de cellen tweemaal gedurende 5 minuten op 1.100 x g bij kamertemperatuur (RT).
      4. Tel cellen in een celtelplaat door middel van trypan blue kleurstofuitsluitingstest en zaai ze vervolgens opnieuw in voor onderhoudscultuur (voor niet meer dan 6 passages van ontdooien) of voor experimentele procedures.
      5. Voor microfluïdische experimenten, zaad 1 × 10 6 cellen in^6-well platen in 3 ml groeimedium en ofwel behandelen met 25 μM doxorubicine (DOXO) of een gelijk volume DOXO oplosmiddel (PBS) als controle.
      6. Was vier tot 6 uur daarna doxo-behandelde cellen tweemaal met voorverwarmde PBS gedurende 5 minuten op 1.100 x g bij RT.
      7. Tel doxo-behandelde en met PBS behandelde controlecellen zoals hierboven (zie stap 1.1.1.5) en stel de co-cultuur in met perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC's) in microfluïdische apparaten.
   2. PBMC-isolatie
      1. Verzamel veneus volbloed (ongeveer 10 ml) van gezonde vrijwilligers in gehepariniseerde injectieflacons en meng voorzichtig door de buis 2 tot 4 keer⁴⁷ om te keren.
      2. Verdun bloed 1:1 met PBS en laag over 10 ml dichtheidsgradiënt medium Lymphoprep in een buis van 50 ml.
         OPMERKING: Zorg ervoor dat u de gelaagdheid heel voorzichtig en langzaam doet om bloed en lymfopam twee verschillende lagen te laten vormen.
      3. Centrifugebuizen gedurende 30 minuten bij 400 x g bij 4 °C in een uitklapbare bak zonder remmen. Vier verschillende lagen zullen zich vormen: (i) plasma aan de bovenkant, (ii) een witte en troebele laag met PBMC's, (iii) lymforep en (iv) een pellet van erytrocyten en granulocyten.
      4. Zuig voorzichtig PBMC's op met een pipet van 2 ml en resuspensie onmiddellijk in warm groeimedium (hetzelfde gebruikt in stap 1.1.1) en was tweemaal gedurende 5 minuten op 1.100 x g bij RT.
      5. Tel pmc's in pellets zoals hierboven (zie stap 1.1.1.5) en gebruik ze voor experimentele procedures of vries ze in voor langdurige opslag.
2. De cellen plateren in 2D-chips
   OPMERKING: PBMC's zijn niet gekleurd in dit protocol. Om specifieke fenotypes op de chip te karakteriseren, kunnen immuuncelsubpopulaties worden geïsoleerd door immunomagnetische kralenselectie, gekleurd met fluorescerende celtrackers, opnieuw gemengd met de niet-gelabelde resterende fractie en dus geconfronteerd met doelkankercellen, zoals gerapporteerd in de on-chip experimenten, beschreven in Vacchelli et ^al.27, en in Racioppi et ^al.34.
   1. Voordat u begint met co-cultuurexperimenten en om de toevoeging van reagentia te vergemakkelijken, activeert u opgeslagen chips gedurende enkele seconden door een zuurstofplasmabehandeling. Vul reservoirs onmiddellijk met gedeïoniseerd water of PBS om PDMS-oppervlakken (polydimethylsiloxaan) hydrofiel te houden tot platingstappen.
      OPMERKING: PDMS is intrinsiek hydrofoob, wat kan leiden tot problemen bij het werken en bij het insluiten van luchtbellen in microkanalen. Zie stap 7 in het aanvullende dossier met details over de activering van zuurstofplasma.
   2. Steriliseer onder een UV-kast gedurende 20 minuten, was 2-3 keer met verse PBS en incubeer vervolgens gedurende 1 uur met kweekmedia. Bewaar chips in de incubator totdat u platingstappen uitvoert.
   3. Trek overtollige media uit alle zes reservoirs. Zorg ervoor dat u geen media uit de belangrijkste cultuurkamers opzuigt.
   4. Breng langzaam 1 × 10⁵ kankercellen geresuspendeerd aan in 10-20 μL groeimedium in het reservoir linksboven en vervolgens in het onderste putje (figuur 1A, reservoirs 1 en 2). Wacht 5 minuten om cellen in de tumorkamer te laten hechten. Sommige cellen zullen zich nestelen en hechten in de reservoirs.
      OPMERKING: Plaats cellulaire ophanging naast de kanaalopeningen. Deze procedure wordt toegepast op MDA-MB-231 kankercellen, andere lijnen vereisen celdichtheidsoptimalisatie. Om de hechting van kankercellen te verbeteren, kan een coatingfunctionalisatie van oppervlakken (bijv. Poly-L-lysine, fibronectine) worden uitgevoerd. Raadpleeg eerder gepubliceerde protocollen voor coatingstappen¹⁶, ^48,49,50.
   5. Aan de rechterkant pipetteer voorzichtig 1 × 10⁶ PBMC's geresuspendeerd in 50 μL groeimedium in putjes 3 en 4 (zie figuur 1A, reservoirs 3 en 4).
      OPMERKING: Na het stromen zal PBMC zich in de tussenliggende kamer verspreiden en een "front" creëren, dat het startpunt van het experiment vertegenwoordigt.
   6. Vul alle zes reservoirs met maximaal 100-150 μL groeimedium. Controleer onder een microscoop of de cellen correct verdeeld zijn in de kweekcompartimenten zoals afgebeeld in figuur 1D-E. De uiteindelijke volumes kunnen variëren met de grootte van de reservoirs. Pas de volumes aan zodat deze in alle putten gelijk zijn.
   7. Plaats de chips ongeveer 1 uur terug in de incubator om het systeem te stabiliseren voordat de time-lapse-opname plaatsvindt. Voeg om de 3 dagen vers medium toe, omdat het kan worden blootgesteld aan verdampingsverliezen.
      OPMERKING: Het systeem is compatibel met zowel live/dead-cell analyse als dynamische multiplex cytokine secretieprofilering van geconditioneerde media. Voor chemokine-analyses kunnen tot 200-250 μL aliquots van supernatanten toegankelijk zijn door media te verzamelen uit de twee reservoirs van elk compartiment. Klassieke ELISA- en Luminex-cytokineprofileringstests vereisen ongeveer 50 μL supernatanten. Zie ^51,52 voorbeelden van studies van andere laboratoria die cytokineprofilering uitvoeren op OOC-modellen.
3. Time-lapse acquisitie van ongelabelde kanker en immuuncellen
   OPMERKING: Meestal zijn 3 chips gerangschikt op een enkele microscoopglaasje (zie Figuur 1A voor 2D-chip en Figuur 4B voor 3D-chip). Met behulp van podiumhouders die 4 dia's toewijzen, kunnen co-culturen geschikt zijn om te worden bewaakt door geautomatiseerde microscopie met een hoog gehalte om grote batches experimentele omstandigheden te analyseren. Chips kunnen eenvoudig worden gemonteerd op dia's met een dikte gelijk aan 1 mm of 170 micron (plastic of glazen coverslips, 6-well optische bodem multi-wells) voor confocale beeldvorming met hoge resolutie.
   1. Neem heldere veldbeeldreeksen van niet-gelabelde cellen op door middel van een videomicroscopie-opstelling uitgerust met een incubatiesysteem.
      OPMERKING: Hier werden tijdreeksgegevenssets (tijdvenster: 48 uur, framesnelheid: 2 min) verkregen met een fluorescentiemicroscoop, uitgerust met een 4x-objectief en CMOS 1,3M-pixels, geoptimaliseerd om in een standaard celkweekincubator te passen.
   2. Warm de microscoop minstens 2 uur op om te balanceren tot 37 °C en 5% CO₂ voordat u begint met de acquisitie.
   3. Selecteer het observatievenster door de microkanaalarray tussen de tumor en het centrale compartiment te centreren. Dit maakt het mogelijk om de dynamiek van immuuninfiltratie en de interacties binnen het gebied waarin kankercellen zijn gezaaid te visualiseren.
   4. Pas de verlichtingsintensiteit en focus van kanker- en immuuncellen aan.
   5. Voor het starten van time-lapse-acquisitie optimaliseert u de framesnelheid en tijdsduur op basis van het experiment en het celtype dat wordt bestudeerd.
      OPMERKING: De beeldcondities moeten worden geoptimaliseerd om overmatige fotobelichting te voorkomen met behoud van een goede signaal-ruisverhouding (SNR). Omdat immuuncellen zeer beweeglijk zijn, moet de acquisitieframesnelheid voldoende hoog zijn om het dynamische proces van interesse te volgen en eenvoudige tracking mogelijk te maken⁵³. Er moet een compromis worden bereikt tussen het trackingalgoritme, de compatibiliteit met de grootte van de resulterende dataset en de levensvatbaarheid, dichtheid en beweeglijkheid van waargenomen cellen.
   6. Gebruik aan het einde van de time-lapse de functie Import Image Sequence en Save as van de ImageJ-software om de framegegevensset te converteren naar een ongecomprimeerd videobestand van 25 fps.
      OPMERKING: Het gegenereerde videobestand is nu klaar voor analyse van het bijhouden van cellen. Hier werden RGB (1280x1024 pixels) beelden verzameld met een ruimtelijke resolutie van 1,33 μm/pixel. Een film van 24 uur (stack van 3,5 GB) van één gezichtsveld (FOV) bestaat uit 720 frames voor elke voorwaarde.
4. Data-analyse: Semi-automatische extractie van ongelabelde immuunsporen door Trackmate
   OPMERKING: Hier wordt immuunmotiliteitsanalyse in 2D-ongelabelde time-lapse-afbeeldingen uitgevoerd met TrackMate⁵⁴, een open-source toolbox die beschikbaar is in de Fiji/ImageJ-softwarebundel (https://imagej.nih.gov/ij/). Er zijn verschillende algoritmen beschikbaar om geautomatiseerde single-particle tracking uit te voeren⁵⁵(SPT) van vlekachtige structuren. Ze zijn efficiënt toegepast op fluorescerende beelden, waarbij objecten helder zijn over een donkere achtergrond met een hoge SNR (d.w.z. fluorescerende vlekken met subresolutie, gelabelde verkeersblaasjes, kernen)^{1,25,56,57,58}. SPT is voornamelijk gebaseerd op twee opeenvolgende stappen. Ten eerste worden objecten gelokaliseerd met geïdentificeerde posities in meerdere frames (segmentatie), zoals geschematiseerd inFiguur 2. In de tweede fase (deeltjeskoppeling) worden gedetecteerde vlekken over opeenvolgende frames gekoppeld om beweging te schatten en hun trajecten te reconstrueren, in de vorm van een spoor (Figuur 3). Numerieke kenmerken kunnen worden berekend uit elke geëxtraheerde X-, Y- en Z-coördinatenarray in de loop van de tijd. Uitgebreide documentatie wordt gerapporteerd in⁵⁴evenals online (http://imagej.net/TrackMate), volgens de zelfstudie Aan de slag met TrackMate. De nauwkeurigheid van het proces kan onmiddellijk worden geïnspecteerd, met een intuïtieve grafische gebruikersinterface (wizard-achtige GUI) waarmee gebruikers bij elke stap instellingen kunnen aanpassen. In het volgende deel wordt kort beschreven hoe u Trackmate kunt gebruiken voor beeldverwerking en kwantificeringsstappen, toegepast op afbeeldingen met zichtbaar licht:
   1. Sleep de full-time video / afbeelding stapel op de Fiji werkbalk.
   2. Kalibratiestack instellen (Figuur 2A).
      1. Controleer de dimensionaliteit en wijs de afbeeldingseigenschappen toe door Afbeelding> Eigenschappen te selecteren. Vuleenheid van lengte, pixelafmetingen en frame-intervalvakken.
         OPMERKING: Gebruik voor het uitvoeren van de kalibratie de bekende lengte van de microkanalen (500 μm, figuur 1C) en deel door de overeenkomstige gemeten lengte in pixels. Voor 2D-tijdreeksen moet u het Z/T-veld verwisselen door 1 in te voeren als z-slice en het juiste aantal filmframes. Als dit niet wordt bereikt, worden trackmate kwantitatieve outputs en parameters gerapporteerd in pixeleenheden en tijdsbestekken.
   3. Voorbewerking van beelden.
      1. Om de juiste discriminatie van immuuncellen van een lawaaierige achtergrond te verbeteren, verwerkt u heldere veldbeelden vooraf om artefacten te compenseren. Zorg ervoor dat gegevenssets bestaan uit 8-bits TIFF-afbeeldingen (helderheidsbereik: 0-255).
         OPMERKING: Ongelijke verlichting, lage SNR en verontreiniging door kleine vuildeeltjes in beelden van zichtbaar licht kunnen het succes van een celvolgproces in gevaar brengen. Hier worden tijdreeksgegevenssets voorbewerkt door achtergrondaftrekking, helderheid / contrast aanpassingsfunctie en door lokale beeldaftrek van een Gaussiaanse onscherpte van originele afbeeldingen. Er zijn andere verschillende analysetoolkits beschikbaar in ImageJ voor het verwerken en segmenteren van fasecontrast- of helderveldafbeeldingen, waaronder Empirical Gradient Threshold (EGT)⁵⁹.
   4. Eerste kalibratiepaneel (figuur 2A)
      1. Terwijl image stack is geselecteerd, start u Trackmate (Plugins>Tracking).  Herzie/bevestig de dimensionaliteit en het temporele venster van gegevens (d.w.z. pixelbreedte en frame-interval).
         OPMERKING: TrackMate leest automatisch in het vak met afbeeldingseigenschappen om de uiteindelijke trackingresultaten te geven in gekalibreerde fysieke eenheden (d.w.z. μm en minuten).
      2. Definieer een interessant gebied om de extractie van immuunsporen te berekenen door handmatig waarden in te voegen of door een gesloten gebied over de actieve afbeelding te tekenen en vervolgens op de knop Bron vernieuwen te drukken. Om globale immuunmigratiepaden te extraheren, selecteert u rechthoekige gebieden aan respectievelijk de rechterkant van microkanalen (centrale kamer, figuur 1E) en aan de linkerkant (tumorkamer, figuur 1D). Als u interacties tussen kanker en immuunhotspots wilt analyseren, tekent u cirkelvormige subregio's met behulp van ROI-tools (ga naar Bewerken → selectie → opgeven).
         OPMERKING: Wanneer u deze toolbox voor de eerste keer op een nieuwe biologische toepassing uitvoert, besteedt u de nodige tijd aan het optimaliseren van de instellingen voor het reconstrueren van de sporen.
         OPMERKING: Voer handmatige tracking van de celtrajecten (ongeveer 50-100 cellen) uit om empirisch de juiste configuratie te vinden en naast het valideren als benchmark de betrouwbaarheid van automatische extractie van bewegingen. Werk bovendien in eerste instantie op een kleiner gebied om de nauwkeurigheid van de gekozen parameters eenvoudig te controleren.
   5. Detectiestap immuunvlekken (figuur 2B)
      1. Selecteer de standaard Laplacian of Gaussian (LoG) detector. De LoG-detector werkt om heldere, blobachtige, ronde objecten te vinden en een Laplacian of Gaussian-filter toe te passen op het beeld dat is afgestemd op tussenliggende spotgroottes (5 tot 20 pixels in diameter).
      2. Voer bij Geschatte klodderdiameter (hier 10-13 μm) een waarde in die iets groter is dan de verwachte spotgrootte. Verhoog de drempelwaarde (hier 1-3 μm) totdat extra valse achtergrondvlekken worden verminderd, mogelijk zonder de objectkenmerken te verwijderen. Detecties onder de drempelwaarde (op basis van kwaliteitsstatistieken) worden verwijderd uit latere analyses. Vink het vakje aan voor het mediaanfilter en de subpixellokalisatie om de kwaliteit van de spotdetectie te verbeteren.
      3. Gebruik de knop Voorvertoning om geïdentificeerde immuuncellen te bekijken en snel te inspecteren die door magentakleurige cirkels over de afbeeldingen zijn gelegd.
         OPMERKING: Fouten tijdens de detectie hebben een aanzienlijke invloed op het koppelingsproces. Andere ongewenste detecties kunnen in de volgende menu's worden gecorrigeerd door door de gebruiker gedefinieerde filters (d.w.z. op spotintensiteit, grootte of positie).
   6. Zodra u tevreden bent met selecties, drukt u op Volgende.
      OPMERKING: Deze instellingen kunnen variëren afhankelijk van de experimentele opstelling en acquisitiebeeldvormingsmodaliteiten (bijv. FOV, objectieve vergroting, helderveld- of fluorescerende beelden), celtype (adherente of zwevende cellen), van langzame of snelle beweeglijkheid, soort cellulair gedrag (interactie of niet) en lage / gemiddelde / hoge dichtheid in het observatiegebied.
   7. Ga verder en sla het menu Initiële drempelwaarde over. Selecteer het venster Hyperstack Displayer.
   8. Stel filters in op het deelvenster Vlekken (afbeelding 2C).
      1. Selecteer: Uniforme kleur. Filters, zoals weergegeven in figuur 2C, kunnen worden toegevoegd om gelabelde vlekken met objectwaarden te behouden, weergegeven in een histogram, boven of onder een omkeerbare drempel.
   9. Tracker-selectiefase (figuur 3A). Kies de Simple LAP-tracker, als deeltjeskoppelingsalgoritme dat vraagt om drie velden in te vullen (in dit geval "Linking max distance": 30-50 μm, "Gap-closing max distance": 25-50 μm, "Gap-closing max frame gap": 4-6). Deze detector beheert gap-closing events, waarbij de kostenkoppeling uitsluitend gebaseerd is op hun respectievelijke afstand.
      OPMERKING: De maximaal toegestane koppelingsafstand beperkt het ruimtelijke zoekbereik voor kandidaat-matchingplaatsen, wat overeenkomt met de maximaal toegestane verplaatsing tussen twee opeenvolgende frames (figuur 3D).
      1. Geef grotere waarden van maximale verplaatsing wanneer de fragmentatie van sporen van zeer beweeglijke deeltjes wordt opgemerkt.
         OPMERKING: Twee koppelingen worden niet verbonden als de frame-to-frame-beweging groter is dan de opgegeven maximale afstandswaarde. Als segmenten twee verschillende cellen slecht overbruggen, verlaagt u de waarde van maximale verplaatsing.
      2. Probeer ontbrekende plekken opnieuw te verbinden, waarbij de waarden van "de maximale afstand voor het sluiten van de opening" en "de maximale framekloof" worden gevarieerd.
         OPMERKING: Deze parameters hebben betrekking op gebeurtenissen die gapen sluiten in niet-aangrenzende frames. Vlekverdwijning kan optreden voor sommige frames (d.w.z. onscherpe deeltjes, cellen die weglaten en in de FOV, segmentatiefouten in een luidruchtig beeld).
         OPMERKING: Om splitsings- of samenvoegingsgebeurtenissen af te handelen, kiest u voor LAP-linker als detector die boetes voor het koppelen van kostenmatrix introduceert.
   10. Klik op Volgende om de trackingberekening uit te voeren. Druk op Volgende.
   11. Deelvenster Filtersporen (afbeelding 3B). Wijzig de kleur van immuunpaden en selecteer in het vervolgkeuzemenu "Track ID" of andere trackfuncties. Kies op dit punt optioneel om interactieve filters functioneel in te stellen, om de kwaliteit van het resultaat te verbeteren en de procedure opnieuw te bekijken.
       OPMERKING: Valse vlekken ontstaan door ruis in het beeld en verlies van functiekwaliteit. Dit genereert korte segmenten, terwijl interessante cellen over veel frames kunnen worden gevolgd.
       1. Als u korte paden wilt verwijderen, probeert u deze te filteren op basis van het aantal plekken dat ze bevatten. Sorteer bovendien tracks met behulp van een combinatie van opties zoals Track displacement, Track duration of Minimal/Mean/Maximum Velocity om valse of ongewenste tracks (met minder frames ten opzichte van de totale duur van time-lapse of met vuile of niet-bewegende deeltjes) uit te sluiten van verdere nabewerking.
          OPMERKING: De keuze van filters kan variëren afhankelijk van de specifieke toepassing en het biologische systeem.
   12. Bekijk alle tracks in de interface Weergaveopties, blader door de tijd en controleer hoe nauwkeurig tracks overeenkomen met celmigratiepaden. Het vervolgkeuzemenu biedt kleurcodes voor vlekken en paden voor eenvoudige visualisatie en filtering op verschillende modaliteiten (bijv. Kinetische parameters, intensiteit, tijdelijke of ruimtelijke positie).
       OPMERKING: Voor het volgen van culturen met een hoge dichtheid of cellen met een hoge beweeglijkheid, verhoogt u de acquisitieframesnelheid die de celverplaatsing in opeenvolgende tijdsintervallen minimaliseert.
   13. Handmatige correctie van segmentatie- en koppelingsfouten (figuur 3E).
       1. Om de kwaliteit van de resultaten verder te verbeteren, bewerkt u handmatig vlekken (puindeeltjes, stationaire cellen) en verwijdert u foutieve sporen die voortvloeien uit gedetecteerde tumorgrenzen bij het analyseren van tumor-immuuninteractie-ROIs.
       2. Selecteer eerst het gereedschap TrackMate op de werkbalk ImageJ. Om een bestaande plek in de hele stapel te elimineren, drukt u op shift en maakt u met de muiscursor een ROI-masker over de doelplek (bewerkt in een groene cirkel) en drukt u vervolgens op de DEL-toets.
       3. Voor het toevoegen van een nieuwe plek (in het geval van ontbrekende sporen als gevolg van het verdwijnen van vlekken) drukt u op de A-toets en legt u de muis op de puntige locatie. Herhaal het berekeningsproces voor het koppelen van tracks na deze stap.
   14. Als u tevreden bent, selecteert u Analyse in het deelvenster Weergaveopties om drie tekstbestanden te genereren (afbeelding 3C en 3F). De tabel in "Spots in tracks statistics" geeft de spatiotemporale coördinaten van immuunvlekken (X-Y-Z posities van de cellen gelabeld met het bijbehorende frame en track nummer). "Links in track statistics" en "Track statistics" bevatten informatie met betrekking tot de tracks: track duur, aantal gedetecteerde hiaten of spots, track initial en stop-frame, etc. Opslaan en exporteren voor elke gegevensset.
       OPMERKING: Wanneer u op een rij in de resultaatvensters klikt, wordt de betreffende plek, link of track geactiveerd in de time-lapse-video voor visuele inspectie. Herhaal de filterstappen om tracks te selecteren/verwijderen. Alle toekomstige geëxporteerde gegevens worden bijgewerkt. TIP: Track initiële en stop-frame en track duurwaarden kunnen worden gebruikt om de tijden van contact tussen kanker en immuuncellen te berekenen bij het verwerken van ROIs van interactie.
   15. Druk op de knop Opslaan om een XML-bestand te genereren dat alle parameterwaarden, het pad naar afbeeldingen en steunposities in de tijd bevat. De opdracht ''Load TrackMate file'' (Plugins> Tracking) herstelt de hele processessie voor elk filmbestand afzonderlijk.
   16. Ga naar het laatste deelvenster van de GUI met de naam Selecteer een actie. Gebruik in de lijst de functie Overlay vastleggen> Uitvoeren om een video te maken met tracks over elkaar heen. TIP: De optie "Plot N-spots vs time" kan worden gebruikt om de ruimtelijke dichtheid van immuuncellen in een ROI te berekenen (figuur 6B, rechterpaneel).
   17. Nabewerkingsanalyse en migratiestatistieken
       1. Analyseer de ruwe positionele gegevens rechtstreeks in Trackmate of exporteer gegevens om uitgebreide kinetische parameters²⁹ te berekenen (d.w.z. totale trajectlengte, Euclidische afstand, opsluitingsverhouding, gemiddelde-kwadraatverplaatsing⁵⁶, gemiddelde of momentane spoorsnelheid, arrestatiecoëfficiënt, verdeling van migratiehoeken, voorwaartse migratie-index, gemiddelde rechtlijnige snelheid) om immuuncelmigratiegedrag te classificeren (bijv. Gerichte of diffusieve beweging^{30, 31}) en respons op doelkankercellen (bijv. behandeld versus controle).
          OPMERKING: Aanvullende nuttige plug-ins zoals The Chemotaxis and Migration Tool (http://ibidi.com/software/chemotaxis_and_migration_tool/) bieden verschillende grafieken (bijv. Rose of sectorplots, zoals afgebeeld in figuur 6) en statistische tests voor geavanceerde analyse en visualisatie van experimentele migratie- en chemotaxisgegevens. Het combineren van celtracerings- en celsegmentatie-algoritmen^24,25,45 kan metingen van morfologische metrieken op het niveau van één cel mogelijk maken (d.w.z. celoppervlak^, de lengte van de grote en kleine as en de hoogte-breedteverhouding van de cel).

2. 3D immuno-competent kanker on-chip model in een competitieve assay

OPMERKING: Het ontwerp van de 3D-chip, afgebeeld infiguur 4, bestaat uit 5 grote compartimenten: een centrale voor de inname van zwevende immuuncellen, twee zijgebieden voor het inbedden van tumorcellen in  hydrogelmatrices (150-250 μm hoog) en mediaperfusiekamers. Immuun- en tumorkamers zijn verbonden door twee sets smalle arrays van microkanalen (200×12×10 μm³, L×W×H, Figuur 4E). Regelmatig werken 100 μm verdeelde trapeziumvormige gelijkbenige micropillars (ongeveer 25-30 interfaces voor elk zijgelgebied, figuur 4C) als barrières om de geloplossing tijdens injectie op te sluiten, waarbij de balans tussen oppervlaktespanning en capillaire krachten^60,61 wordt benut en tumorgebieden worden verbonden met de twee laterale extra mediakamers om een gel-vloeistofinterface in te stellen (figuur 5). De gedetailleerde kenmerken van de 3D-competitieve test zijn weergegeven in figuur 4. Preferentiële migratie van immuuncellen naar de twee hydrogelcompartimenten met tumorcellen die verschillende behandelingen hebben ondergaan, kan worden gevolgd en gekwantificeerd. De specifieke competitieve lay-out kan worden toegepast om een overvloed aan verschillende fenotypen van kankerbiologie te onderzoeken (bijv. Medicijnresistent versus agressief, primair of gemetastaseerd, responders versus non-responders). Bovendien kunnen de in gel ingebedde regio's gemakkelijk worden geïntegreerd met verschillende celpopulaties om meer heterogene TME's te recreëren, waaronder stromale componenten (fibroblasten, endotheelcellen)²³ of om specifiek immunosuppressief milieu³⁴ (bijv. Macrofagen) te simuleren voor het ontleden van mechanismen van geneesmiddelresistentie en tumorontwijking.
OPMERKING: Nucleaire en actieve caspasekleuring, door gebruik te maken van commerciële kits voor levende/dode assays (bijv. Thermo Fisher Scientific, Incucytenreagentia), kan worden geïmplementeerd om mitotische of apoptotische doodsgebeurtenissen te beoordelen, zoals gerapporteerd in Nguyen et ^al.33.

1. Bereiding van matrixoplossing met cellen en laden in het apparaat
   OPMERKING: In de volgende experimentele setting bevatten de twee gelregio's mengsels van menselijke A375M melanoomcellijnen, gekweekt in matrixoplossing (bijv. Matrigel), blootgesteld aan therapeutische middelen die worden gebruikt als monotherapie of in combinatie. Deze instelling stelde ons in staat om de werkzaamheid van een combinatie van twee geneesmiddelen ten opzichte van afzonderlijke geneesmiddelen op een concurrerende manier te evalueren en hun vermogen om PBMC's aan te trekken te kwantificeren.
   1. Ontdooi een voorraad matrixoplossing (bijv. Matrigel) door een dag voor het experiment op ijs in een koelkast van 4 °C te plaatsen.
      OPMERKING: Stel het product niet bloot aan meerdere vries-dooicycli omdat het "klonterig" wordt. Andere synthetische of natuurlijke hydrogelprotocollen kunnen geschikt zijn om in deze setting te worden gebruikt. Zie ^33,34,35 voor de bereiding van kankercellen in collageenmatrices.
   2. Resuspendie A375 menselijke melanoomcellen, gekleurd met live-compatibele PKH67 Green Fluorescent Cell Linker in matrixoplossing (2 mg ^ml-1). Voeg indien geïndiceerd, 5-aza-2'-deoxycytidine (DAC; 2,5 μM), aangeduid als DAC, en / of IFN-α2b (IFN) toe in de juiste doses³².
      OPMERKING: Match de Lot # op het matrixflesspecificatieblad. Bereken op basis van de concentratie het volume medium dat nodig is om tot 2 mg ^ml-1 te maken Pas de optimale eiwitconcentratie en de concentratie van kankercellen aan uw toepassing van belang aan.
   3. Pipetteer voorzichtig op en neer om het ontstaan van bubbels te voorkomen. Houd de microcentrifugebuis op ijs tijdens het mengen om ongewenste polymerisatie te voorkomen.
   4. Plaats de apparaten na sterilisatie op ijs (met behulp van een ijsemmer en deksel) om stolling van de matrixoplossing tijdens de hele procedure van celbelasting te voorkomen.
   5. Injecteer de twee IFN- en DAC/IFN Matrigel/tumorcelmengsels (2-4 μL) langzaam in de linker- en rechtergelpoort, respectievelijk met 10-μL micropipette met behulp van koude tips (figuur 5A). Oefen zachte druk uit om de matrixoplossing van de ene kant te duwen totdat de andere kant wordt bereikt.
      OPMERKING: Het volume van de matrixoplossing is gekozen om overloop in aangrenzende kanalen te voorkomen. Oefen geen overmatige pipetteerdruk uit om te voorkomen dat de oplossing in de media en centrale kanalen lekt. Als tijdens het laden het gelpad langs het kanaal wordt geblokkeerd, probeer dan de oplossing van de andere inlaat in te brengen totdat de gelfronten elkaar ontmoeten. Houd bij het verwijderen van de micropipet uit de inlaten de zuiger vast, anders zal de onderdruk de matrixoplossing opzuigen.
   6. Plaats het apparaat gedurende 30 minuten rechtop in een incubator bij 37 °C en 5% CO₂ om de matrixoplossing te laten branden (figuur 5B). Hanteer met zorg chips met ingebouwde ongepolymeriseerde gel om lekken uit het gelkanaal te voorkomen.
   7. Resuspendeer in de tussentijd PKH67-gelabelde PBMC's (1x10⁶ cellen) in 10 μL complete DMEM (Dulbecco's gemodificeerde Eagle's medium).
   8. Vul na matrixgelatie mediakanalen met (50-100 μL) hetzelfde aliquot kweekmedium in alle zes reservoirs om uitdroging van gel in de chips te voorkomen. Bewaren in de couveuse totdat de immuuncel suspensie zaait.
      OPMERKING: Controleer onder een microscoop de juiste en homogene verdeling van tumorcellen in de gel en de integriteit van de gepolymeriseerde gelbarrières. Gedeeltelijk of niet-uniforme gelvormige gebieden of bellen in het mengsel leiden tot het voortijdig stromen van PBMC's in gelmediakanalen aan het begin van het experiment als gevolg van drukinitiële fluctuaties.
   9. Zuig media uit de zes putten en plaats de punt in de buurt van de inlaat van een mediakanaal om voorzichtig te injecteren met pmc-celsuspensie onder matige druk. De temporele laadvolgorde is weergegeven in figuur 5C:
      1. PBMC's in 10 μL medium in de bovenste centrale put.
      2. 50-100 μL medium in elk van de vier putjes van laterale kanalen.
      3. 40-90 μL medium in de bovenste centrale put.
      4. 50-100 μL medium in de onderste centrale put.
   10. Zorg er onder een microscoop voor dat de verdeling van de PBMC's na de laadstap beperkt blijft tot de centrale kamer. (Figuur 7A).
       OPMERKING: Als het niet optimaal is, pas dan indien nodig de concentratie aan en herhaal de zaaistappen met behulp van ongerepte chips. Bij het berekenen van volumes voor de geplande experimentele omstandigheden, verwijzen naar een overmaat aantal chips (15-20%) om rekening te houden met mogelijke fouten en aanpassingen. Volumes en concentraties moeten worden geoptimaliseerd volgens de specifieke toepassing.
   11. Plaats geassembleerde apparaten op een vlak oppervlak in de incubator bij 37 °C en 5% CO₂ voor daaropvolgende fluorescentiebeeldvorming. Behandel met zorg chips na het laden van immuuncellen die drijven.
       OPMERKING: Compenseer verdampingsverliezen van volumes in reservoirs door media om de 2-3 dagen te vervangen. Voor chemokineprofilering kan tot 100 μL uit elk van de twee putjes van kweekcompartimenten worden aangezogen, zie stap 2.7 in stap 1.
2. Geautomatiseerd tellen van gerekruteerde PBMC's in eenkanaals fluorescerende beelden in ImageJ
   OPMERKING: Klassieke methoden van immunofluorescentie voor confocale beeldvorming met hoge resolutie kunnen worden toegepast op on-chip operaties als eindpuntmetingen. De basiskleuringsprocedure omvat cel-on-chipfixatie, permeabilisatie, blokkering, antilichaambinding, kleuring van kernen met wasstappen ertussen. Niet-gelabelde immuuncellen geïnfiltreerd in 3D-gelregio's met ingebedde kankermicro-omgevingen kunnen op de gewenste tijdstippen worden gefixeerd en gekleurd voor expressiemarkers van activering / uitputting / rijping (bijv. Voor CD8-cellen, monitoring van CD69, CD95, PD1, TIM3-markers). In Parlato et al.³⁵, fagocytose van SW620 apoptotische cellen werd geëvalueerd door confocale microscopie, met behulp van apparaten gemonteerd op 170 μm-dikke coverslips. IFN-DC's werden gekleurd en voegden on-chip anti-menselijke HLA-DR-FITC Ab aliquots toe.
   Om de omvang van geïnfiltreerde fluorescerend gekleurde levende immuuncellen te berekenen die worden uitgedaagd met concurrerende signalen, wordt een gemeenschappelijke beeldanalyseworkflow als volgt ingesteld (Figuur 7D-G):
   1. Verkrijg, op specifieke tijdstippen, fasecontrast en rood/groene kanalen fluorescentiemicrofoto's van de linker- en rechtergelregio's die tumorcellen bevatten die respectievelijk zijn blootgesteld aan enkele of combinaties van farmacologische regimes.
      OPMERKING: Hier werden beelden vastgelegd met een EVOS-FL fluorescentiemicroscoop na celbelasting (0 uur), na 48 uur en na 72 uur incubatie (figuur 7A-B). Een vergroting van 4x-10x werd gebruikt om de centrale kamer, de microkanaalarrays en de twee naast elkaar geplaatste zijkanalen met A375 plus IFN en A375 plus DAC / IFN te verkrijgen.
      1. Houd bij het uitvoeren van acquisitiebewerkingen rekening met de parameters die moeten worden gemeten en vermijd verzadiging van functies die moeten worden geteld. Optimale segmentatieresultaten zijn afhankelijk van de aard van de verkregen beelden, vanwege de variabiliteit in de biologische monsters zelf, de kwaliteit van de kleuring en de microscopietechnieken die worden gebruikt voor gebruikersgerichte toepassingen.
   2. Laad fluorescentie single-channel data (in dit geval rood = PBMC's), in Fiji door deze naar het hoofdvenster te slepen (Figuur 7D). Dupliceer de afbeelding om te voorkomen dat de onbewerkte gegevens worden overschreven tijdens de selectie van voorbewerkingsfilters tot de uiteindelijke segmentatie.
      1. Als de afbeelding een kleurenafbeelding (RGB) is, drukt u op Afbeelding > Type 8 of 16-bits om te converteren naar grijswaarden. Controleer of Opties voor bewerken > > Conversiesis ingesteld op schalen tijdens het converteren.
   3. Het voorbewerken van ruwe data via het opschonen van ruis en artefacten.
      1. Ga naar het menu Achtergrond verwerken > aftrekken door het rollende balalgoritme toe te passen om ongelijke ruisachtergrond met grote ruimtelijke variaties van intensiteiten te corrigeren. Stel de straal in op ten minste de grootte van het grootste voorgronddeeltje. Kies het vak Voorbeeld voor de procedure voor vallen en opstaan om optimale resultaten te verkrijgen. Te kleine waarden kunnen ten onrechte structuren van belang verwijderen.
      2. Sleep in de opdracht Helderheid en contrast de schuifregelaars Minimum/Maximum om het intensiteitsbereik in het histogram te wijzigen. Verschuif de schuifregelaar Maximum naar links om de helderheid te verhogen, zonder uitwasfuncties. Verplaats de dia Minimum naar rechts om het contrast van de afbeelding te verhogen en te voorkomen dat minder zichtbare kenmerken op de achtergrond verdwijnen. Klik op Toepassen om de wijzigingen op te lossen.
   4. Beeldverbetering.
      1. Ga naar Procesfilters > en experimenteer met de mediaan- en Gaussische filters op afbeeldingen (figuur 7E).
         OPMERKING: De voorfilterstraal moet worden aangepast aan de beeldruispixels. Het niet-lineaire mediaanfilter vervangt de pixelwaarde door de mediaanwaarde van buren, om zout-en-peperruis te verminderen. "Gaussian Blur" wordt gebruikt om een digitale foto vloeiender te maken, door pixels te vervangen door een gewogen gemiddelde van omringende pixels. De gewichten komen van de Gaussische kansverdeling, dus de dichtstbijzijnde pixels zijn invloedrijker.
      2. Ga optioneel naar Proces > wiskunde > gamma met aangevinkt vakje Voorvertoning om het contrast te verhogen.
         OPMERKING: Intensiteiten die in het B&C-paneel zijn ingesteld, worden geschaald tussen de twee min- en max-limieten. Waarden < 1.0 accentueren verschillen tussen lage intensiteiten, terwijl waarden > 1.0 verschillen tussen hoge intensiteiten accentueren. Gammacorrectie is functioneel om een weergavebereik te vinden, waarbij de zwakste objecten worden weergegeven zonder de helderste te verzadigen.
   5. Creatie van een binair afbeeldingsmasker.
      1. Ga naar afbeelding > pas > drempel aan. De meest eenvoudig gebruikte methode om drempels te bepalen is gebaseerd op histogramanalyse van intensiteitsniveaus, zoals weergegeven in figuur 7F. Speel in het vervolgkeuzemenu met verschillende algemene drempelmethoden (in ons geval wordt Otsu toegepast).
      2. Blader of typ handmatig een bekend bereik van pixelintensiteiten in de histogrampanelen, observeer de verandering van het rode patroon dat de afbeelding bedekt die meestal lijkt op het werkelijke celgebied. Met de knop Opnieuw instellen verwijdert u de overlay. Als u tevreden bent, klikt u op Toepassen om een binaire versie van de afbeelding te genereren. Schakel Opties voor binaire > verwerken > in om te bepalen hoe afbeeldingen met drempelwaarden worden weergegeven en hoe objecten worden geïdentificeerd door de deeltjesanalysator.
   6. Gebruik de menuopdracht Process/Binary/Watershed Particles om gedeeltelijk overlappende of samengevoegde deeltjes te delen tijdens de drempelwaarde. Watershed kan ze vaak nauwkeurig uit elkaar snijden door een 1-pixel dikke lijn toe te voegen. Voer morfologische bewerkingen uit zoals verwijden of eroderen om pixels te laten groeien of te verwijderen uit onder- of oververzadigde pixels.
      OPMERKING: Zie voor meer informatie de sectie Menuopdrachten of raadpleeg MorphoLibJ, een geïntegreerde bibliotheek op basis van wiskundige morfologie om binaire gegevens te verwerken.
   7. Beschrijving van kwantitatieve afbeeldingsfuncties.
      1. Zodra u een bevredigende objectherkenning hebt verkregen, opent u de deeltjesanalysator van Analyze > Analyze Particles. Deeltjes kunnen worden uitgesloten door hun grootte en circulariteit, uitgedrukt in pixels of in een gekalibreerde meeteenheid (controleer de juiste schaal ten opzichte van de microscoopinstellingen onder Afbeelding > Eigenschappen). Als u alles wilt opnemen, houdt u de standaardwaarde van 0-oneindigheid en het standaardbereik circulariteit op 0,00 - 1,00 (0 = rechte lijn, 1 = perfecte cirkel).
      2. Als u kleine ruispixels of functies die niet interessant zijn wilt filteren, stelt u het minimale en maximale bereik in. Schakel de opties Gaten, Weergeven, Overzicht en Resultaten weergeven in het vensterveld in. Met Uitsluiten op Randen worden deeltjes verwijderd die aan de randen van de afbeelding zijn gedetecteerd. Add to Manager voegt de verkregen selectie toe aan de ROI-manager voor verdere analyse met behoud van de positie-informatie van het deeltje.
         OPMERKING: In de "ROI Manager" is het mogelijk om de automatische segmentatie opgenomen uitvoer te corrigeren (gesplitste cellen samenvoegen, samengevoegde cellen splitsen). Selecteer, met behulp van selectietools in de Fiji-werkbalk, ROI's in beide gelregio's waar kankercellen zijn ingebed om immuuninfiltratie te schatten.
   8. Exporteer de verkregen waarden naar een spreadsheet om statistische analyses uit te voeren zoals weergegeven in figuur 7G. "Resultaten" geeft een gegevenstabel weer met betrekking tot genummerde geschetste deeltjeseigenschappen die zijn geïdentificeerd. "Samenvatten" opent een venster met de naam van de afbeelding, het totale aantal en andere informatie voor de hele afbeelding.
      1. Ga naar Metingen analyseren > instellen om een breed scala aan parameters op te nemen.
   9. Neem optioneel een macro op (door Plug-ins > Macro's > Record te selecteren) om de verwerkingsworkflow te automatiseren en tijd te besparen bij het analyseren van grote gegevenssets.
      1. Gebruik dezelfde verwerkingsroutine om het groene fluorescentiekanaal in dezelfde regio's te analyseren voor het analyseren van morfologische veranderingen van tumorcellen in 3D-regio's¹⁶

Representative Results

Tumorimmuuninfiltratie is een parameter van de antitumorrespons van de gastheer. Tumoren zijn heterogeen in de samenstelling, dichtheid, locatie en functionele staat van infiltrerende leukocyten die interacties met kankercellen kunnen ondersteunen klinisch relevante informatie om het ziekteverloop en de respons op de therapie te voorspellen. In die zin kunnen microfluïdische technologieën worden gebruikt als complementaire en bevoorrechte in vitro hulpmiddelen om de immuuncontext van tumoren te onderzoeken, evenals om de respons op antikankertherapieën te volgen. De koppeling van de microfluïdische assay, live-cell imaging en trackingsoftware kan betrouwbare kwantificeringsmethoden vaststellen om te kwantificeren hoe immuuncellen hun migratiepatroon in verschillende contexten aanpassen. In dit hoofdstuk hebben we stappen beschreven voor het opzetten van veelzijdige 2D- of 3D-coculturen van immuun- en doelkankercellen in ad hoc microfluïdische apparaten die worden gerealiseerd door standaard zacht-lithografische procedures. In sectie 1 werden microfluïdische apparaten gebruikt om chemische en fysische contacten tussen adherente (MDA-MB-231 kankercellen) en niet-adherente (PBMC's) populaties mogelijk te maken. Sommige chemotherapeutische middelen (bijv. Antracyclines onder de anderen) kunnen "immunogene" apoptose van kwaadaardige cellen induceren, waardoor hun zichtbaarheid in immunocompetente gastheren wordt verbeterd. Kanker immunogene celdood (ICD) wordt gekenmerkt door de afgifte van membraangebonden en oplosbare signalen die worden afgegeven door stervende cellen die functioneren als alarmins voor immuuncellen. Om een kwantitatieve validatie van de ICD-respons te bieden, gebruiken we gegevens die zijn verzameld in het microfluïdische platform, waar leukocyten door goed gebouwde microkanaalbruggen naar hun doelcellen kunnen bewegen. Time-lapse opnames werden uitgevoerd na het co-loaden van PBMC's, van gezonde donoren (WT, wild type), met menselijke MDA-MB-231 borstkankercellen al dan niet voorbehandeld met de anthracycline DOXO. Microfoto's werden elke 2 minuten gegenereerd, gedurende twee opeenvolgende tijdsintervallen van 24 en 48 uur. (Voorbeeldig Film S1 van 0-24 uur interval). Trackinganalyse van individuele PBMC's die worden uitgedaagd met stervende (DOXO-behandelde) of levende (PBS-behandelde) kankercellen werd gedaan met behulp van de Trackmate-plug-in, zoals te zien is in Figuur 6A (linkerpaneel). Relevante chemotaxiswaarden en migratieplots werden automatisch gegenereerd met behulp van de Chemotaxis and Migration Tool, zoals beschreven in⁶². De celtrajecten werden allemaal geëxtrapoleerd naar (x, y) = 0 op tijdstip 24 h. De resultaten wezen op een ander migratieprofiel van de immuuncellen wanneer ze samen werden geladen met borstkankercellen die werden blootgesteld aan DOXO of PBS. Wanneer PBMC's werden geconfronteerd met apoptotische kankercellen, kruisten ze microkanalen naar stervende / dode cellen (maar niet naar levende onbehandelde cellen). Migratie X/Y spin- en rozenpercelen, weergegeven in het linkerdeelvenster Figuur 6B-C, werden in kaart gebracht en vergeleken om de impact van immunogene inductoren op verschillen in immuundynamiek te benadrukken. Roosplots tonen aan dat PBMC's voornamelijk in bijna alle richtingen migreerden in het controle-experiment, slechts een verwaarloosbare fractie wordt geleid door de gradiënt gegenereerd door prolifererende kankercellen. Omgekeerd benadrukken de paden van individuele cellen een sterke biasbeweging langs de richting van apoptotische borstkankercellen (negatieve x-richting). Om gerichte immuuncelmigratie naar met DOXO behandelde of met PBS behandelde kankercellen te evalueren, worden verschillende chemotaxisparameters berekend, waaronder: a) het massamiddelpunt (ruimtelijk gemiddeld punt van alle eindpunten); b) de directionaliteit; c) de forward migration index (d.w.z. de gemiddelde celverplaatsing in een richting van belang, wat in ons geval naar de doeltumorplaats betekent). Deze laatste waarden vertegenwoordigen een meting van de efficiëntie van een cel om te migreren in de richting gegeven chemotactische stimuli. Na het bereiken van de linker kamer vertoonde een fractie van leukocyten met een toenemende dichtheid gedurende 24-48 uur langdurige (>60 min) contacten met DOXO-behandelde MDA-MB-231. PBMC's slagen er niet in om massaal te migreren en deel te nemen aan dergelijke langdurige en aanhoudende interacties met levende kankercellen (zoals blijkt uit representatieve microfoto's van naderende PBMC's in Figuur 6A, rechts). Voor het kwantificeren van verschillen in tumor-immuun samenspel, werd het tumorgebied afgebakend met een vaste cirkel van diameter variërend van 20-80 micron, genaamd "hotspot". De kwantificering en analyse van representatieve FOV's worden weergegeven in Figuur 6 (Rechterpaneel, B-C).

In sectie 2 werd een nieuw 3D-immuno-competent tumormodel beschreven om de rekrutering van immuuncellen te kwantificeren als reactie op anti-kankercombinaties van epigenetische geneesmiddelen³² (DAC / IFN versus IFN alleen), waardoor de vergelijking van twee verschillende behandelingsomstandigheden van A375-melanoomcellen tegelijkertijd mogelijk is. Zo werden A375M melanoomcellen, gelabeld met PKH67 groene fluorescerende kleurstof, ingebed in Matrigel-matrices in aanwezigheid van DAC en / of IFN in elke gelkamer, terwijl PKH26 rood gelabelde PBMC's homogeen werden verdeeld in de centrale vloeistofkamer op het startpunt (figuur 7A). We vergeleken tegelijkertijd de twee tumormassa's in 3D-matrices voor hun vermogen om PBMC's aan te trekken. Na 48 en 72 uur worden PBMC's massaal in de rechtermicrokanalen geleid, zoals waargenomen in figuur 7B.

Een preferentiële homing van PBMC's naar de gelmatrix met DAC / IFN-behandelde, in plaats van IFN-behandelde, melanoomplaats werd duidelijk waargenomen, terwijl een slechte migratiesnelheid zichtbaar was naar A375-cellen die werden blootgesteld aan een enkele behandeling (linker chipzijde). De competitieve setting is van toepassing op het onderzoeken van een overvloed aan verschillende fenotypes van kankerbiologie (bijv. Medicijnresistent versus agressief, primair of gemetastaseerd (bijv. A375P versus A375M melanoomcellen) en responders versus non-responders). Gelkamers kunnen bestaan uit complexe co-culturen van kwaadaardige cellen en meerdere niet-kankerachtige tumor-geassocieerde cellen, zoals endotheelcellen, immuuncellen en fibroblasten³³ om tme-niveau geneesmiddelresponsen te karakteriseren. Gebeurtenissen van mitose en apoptotische dood van kankercellen kunnen worden gecontroleerd door kleuring met levende kleurstoffen³³. Immunostainingprocedures op 3D-microfluïdische apparaten kunnen worden aangepast om de activeringstoestand van geïnfiltreerde immuuncellen op tumorlocaties te evalueren door confocale microscopie³⁵. In die zin kunnen deze 3D-microfluïdische systemen complexe tumorstructuren en meercellige interacties nabootsen en daarom waardevolle platforms zijn voor betrouwbaardere preklinische geneesmiddelentests.

Figuur 1. Planimetrie van het microfluïdische apparaat voor het assembleren van 2D tumor-immuun co-culturen. (A) Echte microfoto van 3 chips geassembleerd in een enkele microscoopglaas. De reservoirs zijn genummerd afhankelijk van de laadvolgorde en hebben een kleurcode als de overeenkomstige kweekkamers die in de legenda worden vermeld. Scalebar, 6 mm. (B) 3D CAD van chip bestaande uit drie hoofdcelkweekgebieden verbonden door microgrooves. C) Details van de smalle microgrooves-brug, met de afmetingen afgestemd op kankercellen en PBMC-grootte. D-E) Zichtbaar licht microfoto werd verkregen vóór het begin van de time-lapse, die de verdeling van kankercellen en PBMC's respectievelijk in de linker en de tussenliggende kamer laat zien. Schaalbalk, 500 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2. Trackmate-analysepijplijn voor lokalisatie van immuunvlekken in tijdreeksafbeeldingen. A) Bovenpaneel: Screenshot van het Trackmate-beeldkalibratiemenu. Onderpaneel: Fiji "Image properties menu" om tijd en ruimtelijke eenheden in te stellen. B) Bovenpaneel: Screenshot van het trackmate "Spots detection" menu. Onderpaneel: Uitvoerafbeelding met toegepaste verschillende waarden van "Drempel". C) Bovenpaneel: Screenshot van het Trackmate "Spot filtering" menu dat enkele filters illustreert. Onderste paneel: Voorbeeldige time-lapse-afbeelding, met immuunvlekken gefilterd op positie langs X in de tussenliggende kamer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3. Trackmate Analysis-pijplijn voor het reconstrueren van immuunsporen in tijdreeksbeeldsequenties. A-C) Screenshots van Trackmate-menu's voor het bouwen van tracks, het filteren van tracks en voor het exporteren van definitieve gegevens. D) Voorbeelden van gegenereerde tracks in voorbewerkte time-lapse-beelden die de koppelingsdetectorinstellingen variëren. E) Voorbeeld van valse sporen en slechte links afgeleid van de detectie van tumorcelranden. F) Tracks worden groen gemarkeerd door rijen in het bestand te selecteren .txt met resultaten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4. Schematisch overzicht voor 3D immunocompetente tumor-on chips. A) Voorbeeld van een microgestructureerde siliciummaster. Stempels voor PDMS werden gemodelleerd in SU-8 negatieve weerstand in een cleanroomfaciliteit uitgerust met e-beam en optische lithografie. B) PDMS-replica's werden vervaardigd met behulp van standaard softlithografiemethoden. De centrale eenheid heeft de kamers gekleurd als die getekend in 3D-weergave van de chip, afgebeeld in het paneel D. C) Scanning elektronenmicroscopie (SEM) vergrote weergave van de reeks micropillars die geschikt zijn voor het beknellen van hydrogeloplossingen. D)3D CAD met de kamers, verbonden door microgrooves en de laadputten. Onderbroken dozen worden verwezen naar SEM-foto's van details (paneel C en E). E) SEM-foto van 10 μm hoge verbindingsmicrogrooves. F) 2D CAD-lay-out met de afmetingen van microstructuren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5. Schematische workflow van de belangrijkste laadprotocolstappen voor het samenstellen van 3D-coculturen. A) Bovenpaneel: Schema's van de injectiestap van Matrigel-oplossing in elk gelzijdegebied. Onderste paneel: echte foto van de chip die de voortgang van de gelfront langs het kanaal toont tijdens de laadstap. B) Schema's van matrigel polymerisatie stap. Onderpaneel: Fasecontrastmicroscopisch beeld van de gel-luchtinterface gevormd na gelatiestap. Scalebar, 100 μm. C)Bovenpaneel: Tekening, die de belasting van cellen en media weergeeft met voorbeeldige volumes die in het protocol worden gebruikt. Onderste paneel: Een 4X fasecontrastbeeld van de geassembleerde co-cultuur op 0h wordt getoond. Scalebar, 200 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 6. Analyse van migratieprofielen en interactiegedrag van PBMC naar stervende/levende tumorkamer in het tijdvenster van 24-48 uur. Linkerpaneel. A) Screenshots van time-lapse voorbewerkte afbeeldingen bedekt met immuun gekleurde tracks, geëxtraheerd door Trackmate. De immuunpaden worden verkregen door een enkele FOV in de aangegeven experimentele omstandigheden in het interval van 24 tot 48 uur in de tussenliggende kamer. B-C) Representatieve migratiesporen en rozenpercelen van PBMC's gekweekt in de twee verschillende omstandigheden (n = 1550 PBMC's versus DOXO-behandelde kankercellen, DOXO + of n = 1434 PBMC's versus controlekankercellen, DOXO-). Elke lijn binnen x-y plots toont een enkele PBMC-baan en elke cirkel vertegenwoordigt de uiteindelijke positie van een enkele cel ten opzichte van de beginpositie. Beginpunten worden ingesteld op (0,0) met behulp van een coördinaattransformatie. De coördinaten en verplaatsing van het massamiddelpunt van de celmigratie worden weergegeven in de aangegeven experimentele omstandigheden. Het centrum van massacoördinaten en verplaatsing (berekend als gemiddelde Euclidische afstand voor de X- en Y-componenten) geven een indicatie van de gemiddelde richting waarin de groep cellen voornamelijk reisde en de grootte van de totale celbeweging in toestandsgroepen. Blauwe en groene lijnen markeren respectievelijk individuele sporen met een Euclidische afstandswaarde groter/kleiner dan een drempelwaarde (100 μm). D) Schema van numerieke gegevens geëxtraheerd door een celspoor. E-F) Box & Whiskers plot met respectievelijk directionaliteit (p<0,0001 Unpaired t-test met Welch's correctie) en FMI (p<0,0001 Unpaired t-test met Welch's correctie). De horizontale lijn in vakken vertegenwoordigt mediaanwaarden. De FMI-waarden zijn het gemiddelde voor alle celsporen in elke conditiegroep. Rechterpaneel. A) Screenshots van Trackmate geëxtraheerde ROIs die differentiële interacties tonen tussen PBMC's en DOXO- of PBS-behandelde kankercellen. B) Tijdsdichtheid van PBMC's rond DOXO-behandelde of controle MDA-MB-231 kankercellen. Aantal PBMC's aanwezig in geselecteerde ROI rond kankercellen voor elke aandoening. De gerapporteerde waarden zijn het gemiddelde over 9 geselecteerde ROI van een fov met één time-lapse. Kankerhotspots worden gedefinieerd in een ROI (80 μm in diameter). De bijbehorende heatmap met dichtheid wordt weergegeven. Stippen vertegenwoordigen het gemiddelde aantal cellen berekend over 9 kankerhotspots op aangegeven tijdstippen. C) Verdeling van de tijden (min) van de contacten voor elke experimentele groep. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 7. Preferentiële rekrutering van PBMC's als reactie op DAC plus IFN-medicijncombinaties in een concurrerend 3D-immuno-competent melanoom op chipmodel. A) Verdeling van initieel geladen PBMC's in de centrale kamer van microfluïdische apparaten. Microfoto's worden verkregen door EVOS-FL fluorescentiemicroscoop gedurende een interval van 0-72 uur. Rode fluorescentie (PKH67-gelabelde cellen) vertegenwoordigt PBMC's van gezonde donoren. PKH67-gelabelde (groene) menselijke melanoomcellen ingebed in Matrigel met enkele of dubbele combinatiebehandelingen werden in laterale kamers geplaatst. B) A375-cellen plus IFN aan de linkerkant versus A375 plus DAC / IFN aan de rechterkant. Fluorescentiebeelden werden getoond op 72 uur co-cultuur. Het stopgezette gele vak toont zichtbaar massale werving in A375 plus DAC / IFN-zijde. C) PBMC telt in vier verschillende ROI's van IFN-kamers versus DAC + IFN-kamers. Histogrammen vertegenwoordigen het aantal cellen +/- S.D.; heatmap somde waarden op van elke ROI. Scalebars, 200 μm. D-G) Schema's van segmentatie- en kwantificeringsstappen van geïnfiltreerde PBMC's in gelmatrices toegepast op eenkanaals fluorescentiebeelden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullend dossier. Microfabricage protocol Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende film 1. Time-lapses sequenties in een 2D tumor-immuun on-chip co-cultuur. Microfoto's werden elke 2 minuten verkregen, in een tijdsinterval van 0-24 uur door middel van een compacte microscoop die in een standaard celkweekincubator werd geplaatst. Linkerpaneel. Film van PBMC's van gezonde donoren (WT, wild type), verguld met MDA-MB-231 controle borstkankercellen. Rechterpaneel. Film van een massale migratie van PBMC's WT naar de chipkamer waar MDA-MB-231 DOXO-behandelde kankercellen worden geladen. De lay-out van de 2D-chip wordt in detail beschreven in sectie 1 van het Protocol en weergegeven in figuur 1. Klik hier om deze film te downloaden.

Discussion

De beschreven methoden proberen een algemene benadering te ontwerpen om, met moduleerbare mate van complexiteit, twee belangrijke aspecten op het gebied van onco-immunologie samen te vatten, die kunnen profiteren van de toepassing van meer relevante in vitro modellen. De eerste heeft betrekking op de tumorcelpopulatiezijde, waar het aanpakken van enkelcellige kenmerken kan leiden tot een betere beschrijving van heterogeniteit en gecorreleerde biologische en klinische betekenis, waaronder resistentie tegen therapie, propension tegen metastase, stamcel en differentiatiegraad. De andere kant van het verhaal wordt vertegenwoordigd door de TME, inclusief niet-kankerachtige componenten (immuun- en stromale cellen, bloedvaten) en chemisch / fysisch landschap (ECM-bestanddelen, chemokines en andere oplosbare factoren die vrijkomen) die zowel de kenmerken van de ziekte als de reactie van het individu op therapie⁶³, met name op immunotherapie, diepgaand kunnen vormen. Het is vermeldenswaard dat het exporteren van de beschreven aanpak naar andere onderzoeksgebieden een diep begrip vereist van beperkingen en uitdagingen die de ontwikkeling en acceptatie van nieuwe modellen met zich meebrengt.

Onder verwijzing naar een stelregel die wordt toegepast in technische modellering ("modelleer het probleem niet het systeem"), moet het worden geoptimaliseerd, wat het minimale aantal (cellulaire, fysische en chemische) componenten en omstandigheden is dat nodig is om een eigen on-chip model biologisch relevant en stabiel te maken gedurende het hele experiment. Elke combinatie van celtypen/micro-omgeving/experimentele omgeving moet dus nauwkeurig worden gekozen, geëvalueerd en continu worden gemonitord langs enkele experimenten en van sessie tot sessie. Deze controles omvatten, zoals vermeld in de protocolsecties, strikte controle van parameters zoals volumes in de microfluïdische apparaten die kunnen worden gewijzigd door vochtigheidsomstandigheden of verwarming van verlichtingsbronnen, mogelijke bewegingen en niet-planariteit van stadia die ongecontroleerde vloeistofdriften veroorzaken, maar ook enige eindpuntverificatie van celtoestand, levensvatbaarheid en fenotypische karakterisering. Een cruciale stap betreft de beslissing om perfusiesystemen te gebruiken om gevasculariseerde (soortgelijke) structuren te creëren, of voor medicijnafgifte op de chip³³, omdat dit de experimenten kan beïnvloeden in termen van toenemende complexiteit, celkweekduur en modulatie van de chemische factoren in aanwezigheid van zwevende cellen zoals de immuuncellen.

Hieronder vatten we de belangrijkste kritische en relevante kwesties samen die te vinden zijn in de experimentele omgevingen en in de meest recente literatuur.

ECM en chemische landschapsdefinitie
TME wordt ook sterk beïnvloed door de mechanische 64,65 eigenschappen van de omgeving^{63, 66}. Om deze reden is de keuze van de kweekmatrix fundamenteel, vooral wanneer het gaat om immuuncellen die in bepaalde omstandigheden kunnen reageren op signalen die door de matrix zelf worden vrijgegeven. Relevante vooruitgang wordt in de komende toekomst ook verwacht van het ontwerp en de ontwikkeling van nieuwe materialen en hydrogels (gekenmerkt door verschillende stijfheid, porositeit, aanwezigheid van oplosbare factoren, naast de andere parameters) die een steeds verfijndere en controleerbare ECU mogelijk maken, waarbij specifieke kenmerken van verschillende weefsels vandaag, verschillende patiënten morgen worden nagebootst. Aan de andere kant is het ook van cruciaal belang om de veranderingen veroorzaakt door de verschillende celpopulaties in de ECM te volgen en strategieën te definiëren om deze informatie op te nemen in dynamische en fenotypische analyses.

Gegevensbeheer
Het pad naar de inzet van tumor-on-chip-technieken in een klinische workflow zal profiteren van een enorm experimenteel werk dat langs verschillende richtingen plaatsvindt. Organ-on-chip-modellen zijn, zoals veel in-vitrotechnieken, functioneel, althans potentieel, om metingen met een hoge doorvoer / hoge inhoud uit te voeren. Parallellisatie van experimentele omstandigheden, inclusief positieve en negatieve controles, en technische/biologische replicaties wordt mogelijk gemaakt door verschillende chips op dezelfde plaat te integreren. De toename van de kwantitatieve doorvoer speelt een cruciale rol bij het vertalen en valideren van deze systemen in een snelle pijplijn voor geneesmiddelen- of genscreening voor immunotherapieën. Inderdaad, verschillende bedrijven hebben al platforms ontwikkeld in een multi-well-formaat en verschillende beeldvormingsbenaderingen worden getest om een groot aantal apparaten tegelijkertijd te kunnen monitoren¹⁴. In de hierboven beschreven protocollen gebruikten we microscoopglaasjes die maximaal 3 chips toewezen, met de mogelijkheid om tot 12 experimentele omstandigheden parallel te visualiseren, met behulp van een standaard microscoop multi-slide tray. Deze opstelling is compatibel met handpipetteren en geschikt voor op maat gemaakte aanpassingen die worden uitgevoerd in onze microfabricagefaciliteit. Integendeel, wanneer een sterke parallellisatie nodig is (meerdere screeningtests en -controles), zijn installatie-optimalisaties vereist om een hoger automatiseringsniveau in te stellen (d.w.z. gebruik van pipetteerrobots, plastic multi-wells).

Bij het ontwerpen van experimenten moet rekening worden gehouden met een afweging tussen ruimtelijke en temporele resolutie.

De enorme hoeveelheid gegevens, geproduceerd door microscopie met een hoog gehalte, vormt een beperkende factor in termen van opslag, overdracht en analyse. Deze problemen worden aangepakt met computationele benaderingen die machine learning-tools en hardware / software-middelen implementeren, wat de toekomstige mogelijkheid kan bevorderen om on-chip / in-silico-experimenten^{te koppelen 67,68} bij het kiezen van therapeutische strategieën^, en dat vertegenwoordigt een ambitieuze maar niet-uitstelbare kans.

Meer dan fluorescentiebeeldvorming
Fluorescentie-etikettering, door kleurstoffen of reportergenen, vertegenwoordigt vanwege zijn hoge specificiteit ongetwijfeld de gouden standaardmethode om verschillende celpopulaties in co-kweekomstandigheden te identificeren en moleculaire eigenschappen met een hoge SNR op te lossen. In OOC-modellen wordt deze benadering vaak gebruikt als referentie en met name in heterogene tumor-op-chip micro-omgevingen kan het waardevol zijn om het fenotype van geïnfiltreerde en interagerende immuuncellen te karakteriseren.

Niettemin is er steeds meer bewijs dat effecten geïnduceerd door fluoroforen, moeizame kleuringsprocedures en verlichtingsroutines moeten worden gecontroleerd en geminimaliseerd⁶⁹ omdat het celgedrag en toestand^70,71 diep kunnen beïnvloeden. Dit risico lijkt vooral te gelden voor fragiele systemen, zoals immuuncellen^72,73. Fototoxische reacties kunnen beperkingen introduceren bij het definiëren van de temporele vensterverwerving van levende cellen wanneer ze worden bewaakt met een hoge ruimtelijke en temporele resolutie. Bovendien maakt de rijkdom in de verscheidenheid aan immuunsubpopulaties het onhaalbaar om alleen door fluorescerende kleuring tussen hen te onderscheiden, gezien het beperkte aantal filters dat gewoonlijk op microscopen beschikbaar is.

Om dit probleem aan te pakken, verschijnen er vanuit instrumenteel oogpunt nu nieuwe labelvrije 74-microscopietechnieken zoals holografische 56 of hyperspectrale microscopie⁵⁷ op het podium. Ze beloven geavanceerde cellulaire procesclassificatiestrategieën die verder gaan dan fluorescentie en kunnen bijzonder waardevol zijn voor het bestuderen van gevoelige monsters. Vanuit het oogpunt van data-analyse zijn geavanceerde computationele benaderingen, gebaseerd op deep learning-algoritmen⁷⁵ (getraind door datasets met fluorescentiebeelden), deuropeners om de zogenaamde "in silico-etikettering" uit te ^voeren76,77. Ze zijn met succes toegepast om fluorescerende markers van bright-field beelden^{te voorspellen 78}, het genereren van gelabelde beelden, zonder kleurcellen, waardoor de informatieve kracht van heldere veldmicroscopie toeneemt. Deze strategie kan ook nuttig zijn om tijd en fluorescentiekanalen voor andere markers te besparen. Wij geloven dat de OOC-gemeenschap zal profiteren van deze nieuwe technieken die een minder invasieve studie van de interactie tussen celpopulaties mogelijk maken.

Data-analyse
Mechanismen van interacties tussen immuun- en doelkankercellen kunnen worden onderzocht door het volgen van celbewegingen^28,79. Time-lapse tracking experimenten in complexe en heterogene co-culturen zijn uiterst waardevol om celmigratiepatronen, morfologische en toestandsveranderingen en uitgebreide afstammingsinformatie te extraheren. Het uitvoeren van handmatige analyse is praktisch alleen haalbaar voor korte sequenties met weinig cellen, maar niet voor systematische experimenten met een hoge doorvoer. Bijgevolg is de ontwikkeling van computationele hulpmiddelen voor celtracking, geheel of gedeeltelijk geautomatiseerd, een essentieel onderzoeksgebied in beeldanalyse²⁴. Doorgaans vereist conventionele celtracking een relatief hoge frequentie van bemonstering en ruimtelijke resolutie om segmentatietaken correct uit te voeren, wat in veel experimentele omstandigheden een uitdaging kan zijn. Om cellen te lokaliseren, zijn er open-access segmentatie- en trackingtools beschikbaar (bijv. ImageJ-software²²) zoals gepresenteerd in dit protocol of speciale propriëtaire software. In grootschalige studies pasten we een eigen software toe genaamd Cell Hunter^16,31, ontwikkeld door de Universiteit van Tor Vergata in Rome^, om op een volledig automatische manier kanker en immuuncellen te onderscheiden in multi-populatie context. Op maat gemaakte oplossingen op basis van machine learning en neurale netwerkbenaderingen 80,81,82 worden vandaag geïmplementeerd in microscopiesoftwarepakketten ^83, van het verbeteren van SNR tot het beheren van kritieke acquisitieparameters of segmentatiestappen. Machine learning kan worden gebruikt om gemeenschappelijke cellulaire patronen (bijvoorbeeld bewegingsstijlen) te herkennen om de biologische respons met betrekking tot micro-omgevingsfactoren te karakteriseren.

In Comes et ^al.41 werd een vooraf getrainde Deep Learning Convolutional Neural Network-architectuur toegepast om te classificeren of kankercellen al dan niet worden blootgesteld aan een medicamenteuze behandeling door als "marker" de beweeglijkheid van de immuuncellen te gebruiken, gevolgd uit time-lapse-gegevens van co-culturen van borstkankercellen en PBMC's in collageenmatrices in microdevices, zoals beschreven in³³.

Single-cell omics methoden en ontologieën ontwikkeling
We wijzen op de noodzaak van een strategische alliantie tussen eencellige omics-technologieën⁸⁴ (bijv. Proteomics, metabolomics, genomics) en on-chip methoden: de moleculaire gedetailleerde karakterisering, geconjugeerd aan functionele dynamische informatie, zou het begrip van basismechanismen en klinische beschrijving kunnen verbeteren. In dit geval staan nieuwe instrumenten om de twee werelden met elkaar te verbinden aan het begin^{van 85}. De eerste uitdaging is om eencellige omics-benaderingen rechtstreeks op de onco-immunologische chips te implementeren²². Bovendien kunnen organ-on-chips worden gebruikt als platforms om potentiële doelen te testen die zijn geïdentificeerd door genomics- en proteomics-analyses^86,87. Een tweede koppelingstool, die nog grotendeels ontbreekt, is een gestructureerde, gestandaardiseerde manier om gemeten systeemresultaten^88,89 te annoteren en op te slaan. Maar dit is precies wat we in de toekomst nodig hebben om systematische databases van cellulaire kwantitatieve resultaten en gemeten kenmerken te bouwen, om ze te ontginnen, af te leiden en te correleren met de inherente biologische informatie. Kortom, de behoefte aan standaardisatie en systematische analyse van heterogene experimentele datasets vraagt om een ontologiekader.

Modellen personaliseren
Organs-on-chip-technologie is geschikt voor personalisatie¹², omdat cellen en weefsels van afzonderlijke patiënten (of klassen van patiënten) onder gecontroleerde omstandigheden in de apparaten kunnen worden gebruikt, wat leidt tot klinisch relevante uitlezingen, nuttig om therapeutische of preventiestrategieën te informeren. Enkele voorbeelden beginnen te verschijnen in literatuur⁹⁰. Natuurlijk, voor tumor-op-chip modellen, stelt deze uitdaging verschillende technische en wetenschappelijke vragen die moeten worden opgelost³⁶ (zoals TME-kenmerken controle zoals zuurstofconcentratie, cytokinegradiënten, enz.). Belangrijk is dat het vooruitzicht om oncologische en onco-immunologische therapieën effectiever te maken en tegelijkertijd schadelijke effecten voor elke patiënt te verminderen, aantrekkelijk is, zowel vanuit het oogpunt van kwaliteit van leven als voor de optimalisatie van de middelen voor de gezondheidszorg.

Concluderend is het duidelijk dat dit veld een authentiek interdisciplinair veld is en als zodanig een grote inspanning vereist bij het vaststellen van een gemeenschappelijke taal en gedeelde doelen tussen onderzoeker, clinici, industrie, maar ook uit verschillende disciplines (engineering, biologie, data science, geneeskunde, chemie) het vinden van een goede balans en nieuwe oplossingen⁹¹.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell culture materials
50 mL tubes	Corning-Sigma Aldrich, St. Louis, MO	CLS430828	centrifuge tubes
5-aza-2'-deoxycytidine DAC	Millipore-Sigma; St. Louis, MO	A3656	DNA-hypomethylating agent
6-well plates	Corning-Sigma Aldrich, St. Louis, MO	CLS3506	culture dishes
75 cm2 cell culture treated flask	Corning, New York, NY	430641U	culture flasks
A365M	American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA	CVCL_B222	human melanoma cell line
Doxorubicin hydrochloride	Millipore-Sigma; St. Louis, MO	D1515	anthracycline antibiotic
Dulbecco's Modified Eagle Medium DMEM	EuroClone Spa, Milan, Italy	ECM0728L	Culture medium for SK-MEL-28  cells
Dulbecco's Phosphate Buffer Saline w/o Calcium w/o Magnesium	EuroClone Spa, Milan, Italy	ECB4004L	saline buffer solution
Fetal Bovine Serum	EuroClone Spa, Milan, Italy	ECS0180L	ancillary for cell culture
Ficoll	GE-Heathcare	17-1440-02	separation of mononuclear cells from human blood.
hemocytometer	Neubauer		Cell counter
Heparinized vials	Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA		Vials for venous blood collection
interferon alpha-2b	Millipore-Sigma; St. Louis, MO	SRP4595	recombinant human cytokine
L-Glutamine 100X	EuroClone Spa, Milan, Italy	ECB3000D	ancillary for cell culture
Liquid nitrogen
Lympholyte cell separation media	Cedarlane Labs, Burlington, Canada		Separation of lymphocytes by density gradient centrifugation
Lymphoprep	Axis-Shield PoC AS, Oslo, Norway
Matrigel	Corning, New York, NY	354230	growth factor reduced basement membrane matrix
MDA-MB-231	American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA	HTB-26	human breast cancer cell line
Penicillin/ Streptomycin 100X	EuroClone Spa, Milan, Italy	ECB3001D	ancillary for cell culture
Pipet aid	Drummond Scientific Co., Broomall, PA	4-000-201	Liquid handling
PKH26 Red Fluorescent cell linker	Millipore-Sigma; St. Louis, MO	PKH26GL	red fluorescent cell dye
PKH67 Green fluorescent cell linker	Millipore-Sigma; St. Louis, MO	PKH67GL	green fluorescent cell dye
RPMI-1640	EuroClone Spa, Milan, Italy	ECM2001L	Culture medium for MDA-MB-231 cells
serological pipettes (2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL, 50 mL)	Corning- Millipore-Sigma; St. Louis, MO	CLS4486; CLS4487; CLS4488; CLS4489; CLS4490	Liquid handling
sterile tips (1-10 μL, 10-20 μL, 20-200 μL, 1000 μL)	EuroClone Spa, Milan, Italy	ECTD00010; ECTD00020; ECTD00200; ECTD01005	tips for micropipette
Timer
Trypan Blue solution	Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA	15250061	cell stain to assess cell viability
Trypsin	EuroClone Spa, Milan, Italy	ECM0920D	dissociation reagent for adherent cells
Cell culture equipment
EVOS-FL fluorescence microscope	Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA		Fluorescent microscope for living cells
Humified cell culture incubator	Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA	311 Forma Direct Heat COIncubator; TC 230	Incubation of cell cultures at 37 °C, 5% CO2
Juli Microscope	Nanoentek
Laboratory refrigerator (4 °C)	FDM
Laboratory Safety Cabinet (Class II)	Steril VBH 72 MP		Laminar flow hood
Optical microscope	Zeiss
Refrigerable centrifuge	Beckman Coulter
Thermostatic bath
Microfabrication materials
3-Aminopropyl)triethoxysilane (Aptes)	Sigma Aldrich	A3648	silanizing agent for bonding PDMS to plastic coverslip
Chromium quartz masks / 4"x4", HRC / No AZ	MB W&A,  Germany		optical masks for photolithography
Glass coverslip, D 263 M Schott glass,  (170 ± 5 µm)	Ibidi, Germany	10812
Hydrogen Peroxide solution 30%	Carlo Erba Reagents	412081	reagents for piranha solution
Methyl isobutyl ketone	Carlo Erba Reagents	461945	PMMA e-beam resist developer
Microscope Glass Slides (Pack of 50 slides) 76.2 mm x 25.4 mm	Sail Brand	7101	substrates for bonding chips
Miltex Biopsy Punch with Plunger, ID 1.0mm	Tedpella		dermal biopsy punches for chip reservoirs
PMMA  950 kDa	Allresist,Germany	AR-P. 679.04	Positive electronic resists for patterning optical masks
Polymer untreated coverslips	Ibidi, Germany	10813	substrates for bonding chips
Prime CZ-Si Wafer,  4”, (100), Boron Doped	Gambetti Xenologia Srl, Italy	30255
Propan-2-ol	Carlo Erba Reagents	415238
Propylene glycol monomethyl ether acetate (PGMEA)	Sigma Aldrich	484431-4L	SU-8 resists developer
SU-8 3005	Micro resist technology,Germany	C1.02.003-0001	Negative Photoresists
SU-8 3050	Micro resist technology,Germany	C1.02.003-0005	Negative Photoresists
Suite of Biopunch, ID 4.0 mm, 6.0 mm, 8.0 mm	Tedpella	15111-40, 15111-60, 15111-80	dermal biopsy punches for chip reservoirs
Sulfuric acid 96%	Carlo Erba Reagents	410381	reagents for piranha solution
SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit	Dowsil, Dow Corning	11-3184-01	Silicone Elastomer (PDMS)
Trimethylchlorosilane (TMCS)	Sigma Aldrich	92360-100ML	silanizing agent for SU-8 patterned masters
Microfabrication equipment
100 kV e-beam litography	Raith-Vistec EBPG 5HR
hotplate
Optical litography system	EV-420 double-face contact mask-aligner
Reactive Ion Etching system	Oxford plasmalab 80 plus system
Vacuum dessicator