In het tijdperk van immunotherapie en eencellige genomische profilering vereist kankerbiologie nieuwe in vitro en computationele hulpmiddelen voor het onderzoeken van de tumor-immuuninterface in een juiste spatiotemporale context. We beschrijven protocollen om tumor-immuun microfluïdische co-culturen te exploiteren in 2D- en 3D-instellingen, compatibel met dynamische, multiparametrische monitoring van cellulaire functies.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Microfluïdische co-cultuurmodellen voor het ontleden van de immuunrespons in in vitro tumormicro-omgevingen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Complexe ziektemodellen vereisen geavanceerde hulpmiddelen die fysiologisch en pathologisch relevante, bruikbare inzichten kunnen leveren en anders onzichtbare processen kunnen onthullen. Geavanceerde celtests die nauw nabootsen in vivo landschappen vestigen zich als nieuwe manieren om het bidirectionele tumor-gastheer samenspel te visualiseren en te meten dat de progressie van kanker beïnvloedt. Hier beschrijven we twee veelzijdige protocollen om zeer controleerbare 2D- en 3D-coculturen in microdevices na te bootsen, waarbij de complexiteit van de tumormicro-omgeving (TME) wordt nagebootst, onder natuurlijke en door therapie geïnduceerde immunosurveillance. In sectie 1 wordt een experimentele setting geboden om kruisverwijzing tussen aanhangende tumorcellen en zwevende immuunpopulaties te monitoren, door middel van brightfield time-lapse microscopie. Als toepassingsscenario analyseren we de effecten van antikankerbehandelingen, zoals de zogenaamde immunogene kankerceldoodinductoren op de rekrutering en activering van immuuncellen. In sectie 2 worden 3D-tumor-immuunmicro-omgevingen geassembleerd in een concurrerende lay-out. Differentiële immuuninfiltratie wordt gemonitord door fluorescentiemomentopnamen tot 72 uur, om combinatietherapeutische strategieën te evalueren. In beide omgevingen worden beeldverwerkingsstappen geïllustreerd om een overvloed aan immuuncelparameters te extraheren (bijv. Immuuncelmigratie en interactie, reactie op therapeutische middelen). Deze eenvoudige en krachtige methoden kunnen verder worden afgestemd om de complexiteit van de TME te simuleren die de heterogeniteit en plasticiteit van kanker-, stromale en immuuncelsubtypen omvat, evenals hun wederzijdse interacties als aanjagers van kankerevolutie. De naleving van deze snel evoluerende technologieën met live-cell high-content imaging kan leiden tot het genereren van grote informatieve datasets, wat nieuwe uitdagingen met zich meebrengt. Inderdaad, de driehoek ''co-culturen/microscopie/geavanceerde data-analyse' zet de weg naar een precieze probleemparametrisatie die op maat gemaakte therapeutische protocollen kan helpen. We verwachten dat de toekomstige integratie van kanker-immuun on-a-chip met kunstmatige intelligentie voor high-throughput processing een grote stap voorwaarts zal betekenen in het benutten van de mogelijkheden als voorspellende en preklinische hulpmiddelen voor precisie en gepersonaliseerde oncologie.
Inleiding
De evolutie van verschillende takken van de geneeskunde als experimentele disciplines is afhankelijk geweest van het vermogen om celpopulatie en orgaanfuncties onder gecontroleerde omstandigheden te manipuleren1. Een dergelijk vermogen heeft zijn wortels in de beschikbaarheid van meetbare modellen die in staat zijn om processen in ons lichaam samen te vatten.
In het tijdperk van immunotherapie en eencellige genomische profilering 2, moet de kankerbiologie profiteren van opkomende in vitro en computationele modellen voor het onderzoeken van de tumor-immuuninterface in een juiste spatiotemporale context
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Chipontwerp voor hechtende en zwevende cellen 2D-coculturen
OPMERKING: De 2D-cocultuurlay-out (figuur 1A-C) wordt gekenmerkt door drie kamers (100 μm hoog) die onderling verbonden zijn door twee sets microkanaalarrays (500 x 12 x 10 μm3, L×B×H). De tussenliggende kamer vormt twee gesloten doodlopende compartimenten die zwevende immuuncellen blokkeren die tijdens de laadstap 2.5 overlopen naar de tumorplaats. Dit apparaattype is nuttig voor real-time bidimensionale metingen van eencellige (adhesieve of zwevende) motiliteit ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Tumorimmuuninfiltratie is een parameter van de antitumorrespons van de gastheer. Tumoren zijn heterogeen in de samenstelling, dichtheid, locatie en functionele staat van infiltrerende leukocyten die interacties met kankercellen kunnen ondersteunen klinisch relevante informatie om het ziekteverloop en de respons op de therapie te voorspellen. In die zin kunnen microfluïdische technologieën worden gebruikt als complementaire en bevoorrechte in vitro hulpmiddelen om de immuuncontext van tumoren te onderzoeken, evenals om de.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De beschreven methoden proberen een algemene benadering te ontwerpen om, met moduleerbare mate van complexiteit, twee belangrijke aspecten op het gebied van onco-immunologie samen te vatten, die kunnen profiteren van de toepassing van meer relevante in vitro modellen. De eerste heeft betrekking op de tumorcelpopulatiezijde, waar het aanpakken van enkelcellige kenmerken kan leiden tot een betere beschrijving van heterogeniteit en gecorreleerde biologische en klinische betekenis, waaronder resistentie tegen therapie, prope.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen. AS wordt ondersteund door de Fondazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC, Start-Up 2016 #18418) en Ministero Italiano della Salute (RF_GR-2013-02357273). GS en FM worden ondersteund door de Italiaanse vereniging voor kankeronderzoek (AIRC) nr. 21366 tot G.S.).
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Celkweekmateriaal | |||
| 50 mL buizen | Corning-Sigma Aldrich, St. Louis, MO | CLS430828 | centrifugebuizen |
| 5-aza-2'-deoxycytidine DAC | Millipore-Sigma; St. Louis, MO | A3656 | DNA-hypomethyleringsmiddel |
| 6-well platen | Corning-Sigma Aldrich, St. Louis, MO | CLS3506 | kweekschalen |
| 75 cm2 celkweek behandelde flacon | Corning, New York, NY | 430641U | kweekflacons |
| A365M | American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA | CVCL_B222 | menselijke melanoomcellijn |
| Doxorubicine hydrochloride | Millipore-Sigma; St. Louis, MO | D1515 | anthracycline antibioticum |
| Dulbecco's Gemodificeerd Eagle Medium DMEM | EuroClone Spa, Milaan, Italië | ECM0728L | Kweekmedium voor SK-MEL-28 cellen |
| Dulbecco's Fosfaat Bufferoplossing zonder Calcium zonder Magnesium | EuroClone Spa, Milaan, Italië | ECB4004L | zoutoplossing |
| Fetaal Rundserum | EuroClone Spa, Milaan, Italië | ECS0180L | aanvullend voor celkweek |
| Ficoll | GE-Heathcare | 17-1440-02 | scheiding van mononucleaire cellen uit menselijk bloed. |
| hemocytometer | Neubauer | Celteller | |
| Heparine flesjes | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA | Flesjes voor veneuze bloedafname | |
| interferon alfa-2b | Millipore-Sigma; St. Louis, MO | SRP4595 | recombinant humaan cytokine |
| L-Glutamine 100X | EuroClone Spa, Milaan, Italië | ECB3000D | aanvullend voor celkweek |
| Vloeibare stikstof | |||
| Lympholyte celscheidingsmedium | Cedarlane Labs, Burlington, Canada | scheiding van lymfocyten door dichtheidsgradiëntcentrifugatie | |
| Lymphoprep | Axis-Shield PoC AS, Oslo, Noorwegen | ||
| Matrigel | Corning, New York, NY | 354230 | groeifactor verminderde basement membraanmatrix |
| MDA-MB-231 | American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA | HTB-26 | menselijke borstkankercellijn |
| Penicilline/ Streptomycine 100X | EuroClone Spa, Milaan, Italië | ECB3001D | aanvullend voor celkweek |
| Pipet aid | Drummond Scientific Co., Broomall, PA | 4-000-201 | Vloeistofveiligheid |
| PKH26 Rood Fluorescerend cel linker | Millipore-Sigma; St. Louis, MO | PKH26GL | rood fluorescerende celkleurstof |
| PKH67 Groen fluorescerende cel linker | Millipore-Sigma; St. Louis, MO | PKH67GL | groen fluorescerende celkleurstof |
| RPMI-1640 | EuroClone Spa, Milaan, Italië | ECM2001L | Kweekmedium voor MDA-MB-231 cellen |
| serologische pipetten (2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL, 50 mL) | Corning- Millipore-Sigma; St. Louis, MO | CLS4486; CLS4487; CLS4488; CLS4489; CLS4490 | Vloeistofveiligheid |
| steriele tips (1-10 μL, 10-20 μL, 20-200 μL, 1000 μL) | EuroClone Spa, Milaan, Italië | ECTD00010; ECTD00020; ECTD00200; ECTD01005 | tips voor micropipet |
| Timer | |||
| Trypan Blauw oplossing | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA | 15250061 | celkleurstof om cellevensvatbaarheid te beoordelen |
| Trypsine | EuroClone Spa, Milaan, Italië | ECM0920D | dissociatiereagens voor adherente cellen |
| Celkweekapparatuur | |||
| EVOS-FL fluorescentiemicroscoop | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA | Fluorescentiemicroscoop voor levende cellen | |
| Bevochtigde celkweekincubator | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA | 311 Forma Direct Heat COIncubator; TC 230 | Incubatie van celculturen bij 37 °C, 5% CO2 |
| Juli Microscoop | Nanoentek | ||
| Laboratoriumkoelkast (4 °C) | FDM | ||
| Laboratoriumveiligheidskast (Klasse II) | Steril VBH 72 MP | Laminare stromingskast | |
| Optische microscoop | Zeiss | ||
| Koolstofcentrifuge | Beckman Coulter | ||
| Thermostaatbad | |||
| Microfabricagematerialen | |||
| 3-Aminopropyl)triethoxysilaan (Aptes) | Sigma Aldrich | A3648 | silaniseringsmiddel voor het verbinden van PDMS met plastic dekglas |
| Chroom kwartsmaskers / 4"x4", HRC / Geen AZ | MB W&A, Duitsland | optische maskers voor fotolithografie | |
| Glasdekglas, D 263 M Schott glas, (170 ± 5 µm) | Ibidi, Duitsland | 10812 | |
| Waterstofperoxide oplossing 30% | Carlo Erba Reagents | 412081 | reagentia voor piranha oplossing |
| Methyl isobutyl keton | Carlo Erba Reagents | 461945 | PMMA e-beam resist developer |
| Microscoop Glasplaten (Verpakking van 50 platen) 76,2 mm x 25,4 mm | Sail Brand | 7101 | substraten voor het verbinden van chips |
| Miltex Biopsie Punch met Plunger, ID 1,0 mm | Tedpella | dermale biopsie punches voor chip reservoirs | |
| PMMA 950 kDa | Allresist,Duitsland | AR-P. 679 |
Referenties
- Abbas, A. K., L, A. H., P, S. Cellular and Molecular Immunology, Ninth Edition. , (2018).
- Eisenstein, M. Cellular censuses to guide cancer care. Nature. , (2019).
- Cancer Cell. Models for Immu....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
