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Biochemistry

सीरियल क्रिस्टलोग्राफी प्रयोगों के लिए एंडोथियापेप्सिन क्रिस्टल के विकास का अनुकूलन

Published: February 4, 2021 doi: 10.3791/61896
Automatic Translation
1, 1
1Swiss Light Source, Paul Scherrer Institut

Summary

इस लेख का उद्देश्य दर्शकों को एक ठोस समझ देना है कि बड़े, एकल प्रोटीन क्रिस्टल को बढ़ाने के लिए उनके छोटे-मात्रा, वाष्प-प्रसार प्रोटोकॉल को सीरियल क्रिस्टलोग्राफी के लिए एक बड़ी मात्रा बैच माइक्रो-क्रिस्टलीकरण विधि में कैसे बदला जाए।

Abstract

यहां, सिंक्रोट्रॉन और एक्सएफईएल दोनों पर सीरियल क्रिस्टलोग्राफी प्रयोगों के लिए उपयुक्त सूक्ष्म-क्रिस्टलीय स्लरी की बड़ी मात्रा (> 100 μL) के निर्माण की सुविधा के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया गया है। विधि प्रोटीन क्रिस्टल चरण आरेख की समझ पर आधारित है, और उस ज्ञान का उपयोग कैसे किया जा सकता है। विधि को तीन चरणों में विभाजित किया गया है: (1) क्रिस्टल आकृति विज्ञान का अनुकूलन, (2) बैच में संक्रमण, और (3) स्केलिंग। चरण 1 में अच्छी तरह से अलग किए गए, एकल क्रिस्टल खोजना शामिल है, उम्मीद है लेकिन जरूरी नहीं, क्यूब जैसी आकृति विज्ञान में प्रस्तुत करना। स्टेज 2 में, स्टेज 1 की स्थिति क्रिस्टल विकास समय द्वारा अनुकूलित की जाती है। यह रणनीति वाष्प प्रसार द्वारा उगाए गए क्रिस्टल को बैच में बदल सकती है। एक बार जब क्रिस्टल की वृद्धि लगभग 24 घंटे के भीतर हो सकती है, तो प्रोटीन और प्रीसिपेटेंट मिश्रण के एक मोर्फोग्राम को प्लॉट किया जा सकता है और स्केलिंग रणनीति (चरण 3) के आधार के रूप में उपयोग किया जा सकता है। जब क्रिस्टल को बैच में उगाया जा सकता है, तो स्केलिंग का प्रयास किया जा सकता है, और वॉल्यूम बढ़ने के साथ क्रिस्टल आकार और एकाग्रता को अनुकूलित किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल के लिए एंडोथियापेप्सिन का उपयोग प्रदर्शन प्रोटीन के रूप में किया गया है। प्रस्तुत किए गए कुछ निर्णय एंडोथियापेप्सिन के लिए विशिष्ट हैं। हालांकि, यह आशा की जाती है कि जिस तरह से उन्हें लागू किया गया है, वह इस प्रक्रिया के बारे में सोचने का एक तरीका प्रेरित करेगा जो अन्य अपनी परियोजनाओं के अनुकूल हो सकते हैं।

Introduction

कमरे का तापमान (आरटी) मैक्रोमोलेक्यूलर क्रिस्टलोग्राफी संरचनात्मक जीव विज्ञान समुदाय के भीतर फिर से लोकप्रिय है। एक्स-रे फ्री इलेक्ट्रॉन लेजर (एक्सएफईएल) प्रकाश स्रोतों के विकास ने आरटी नमूना वितरण दृष्टिकोण 1,2,3,4 के विकास को प्रेरित किया है, और इन विधियों को अब सिंक्रोट्रॉन 5,6,7,8 पर लागू किया गया है। न केवल आरटी विधियां पंप-प्रोब प्रयोगात्मक स्ट्रैजेट्स 9,10,11,12 की संभावना को खोलती हैं, बल्कि इस बात के भी बढ़ते सबूत हैं कि वे प्रोटीन 13,14,15,16,17 के भीतर वैकल्पिक संवहन अवस्थाओं को बढ़ावा देते हैं।

हालांकि, 1990 के दशक के उत्तरार्ध में आरटी दृष्टिकोण पर क्रायो-विधियों ने कर्षण प्राप्त करने का मुख्य कारण उप-शून्य क्रिस्टल तापमान18 द्वारा विकिरण क्षति को धीमा करना था। क्रायो-मेथड्स19 ने एकल प्रोटीन क्रिस्टल से एक पूर्ण डेटासेट के संग्रह की अनुमति देना शुरू किया। एक्सएफईएल और सिंक्रोट्रॉन में आधुनिक आरटी विधियों ने तेजी से (> 100 हर्ट्ज) क्रिस्टलवितरण रणनीतियों 1,2,3,4 के विकास से एकल-क्रिस्टल विकिरण क्षति की समस्या को हल किया। ये विधियां हजारों व्यक्तिगत रूप से उजागर क्रिस्टल से एक पूर्ण डेटासेट के संग्रह की अनुमति देती हैं। इसलिए इन आरटी वितरण दृष्टिकोणों को समरूप माइक्रो-क्रिस्टल (> 50 μm क्रिस्टल के 100 μL <) युक्त समाधानों की बड़ी मात्रा के उत्पादन की आवश्यकता होती है। हालांकि, चूंकि क्रायो-विधियों को केवल एकल क्रिस्टल की आवश्यकता होती है, इसलिए इस तरह के सूक्ष्म-क्रिस्टलीय स्लरी बनाने के तरीके वर्तमान में प्रोटीन क्रिस्टलोग्राफी प्रयोगशालाओं में सर्वव्यापी नहीं हैं।

सीरियल क्रिस्टलोग्राफी नमूनों के लिए माइक्रो-क्रिस्टलाइजेशन अनुकूलन प्रक्रिया के कुछ हिस्सों को कैसे किया जाए, इसके साहित्य में उदाहरण हैं। यहां, झिल्ली और घुलनशील प्रोटीन के बीच अंतर किया जाना चाहिए। लिपिडिक क्यूबिक चरण (एलसीपी) के लिए मोनोओलिन (या कुछ अन्य लिपिड) में उगाए गए सूक्ष्म-झिल्ली प्रोटीन क्रिस्टल के विकास को अनुकूलित करने के लिए प्रोटोकॉल को अच्छी तरह से वर्णित किया गया है20,21,22. हालांकि, गैर-एलसीपी स्थितियों में उगाए गए झिल्ली प्रोटीन सहित घुलनशील प्रोटीन के सूक्ष्म-क्रिस्टलीकरण के तरीकों में आम तौर पर कमी होती है। पिछले अध्ययनों ने प्रक्रिया के विशिष्ट भागों पर ध्यान केंद्रित किया है, जैसे कि माइक्रो-क्रिस्टल स्क्रीनिंग 23,24, न्यूक्लियेशन24 को बढ़ाना, और फ्री-इंटरफ़ेस प्रसार 25 का उपयोग करके स्केलिंग, लेकिन एक पूर्ण विधि नहीं।

हालांकि, एक विधि को हाल ही में वर्णित किया गया था26 जो एक पूर्ण प्रोटोकॉल की पेशकश करने का प्रयास करता है। प्रोटीन क्रिस्टलोग्राफी के कई पहलुओं की तरह, यह नया नहीं है। प्रस्तावित विचारों में से कई पहले से ही रायमेंट (2002)27 द्वारा वर्णित किए गए थे। विधि का उद्देश्य क्रिस्टलोग्राफरों को यह दिखाना है कि वाष्प प्रसार का उपयोग करके उगाए गए एकल, क्रिस्टल से हजारों सूक्ष्म-क्रिस्टल विकसित करने के लिए एक बैच पद्धति में रूपांतरण कैसे किया जाए। विधि एक सामान्य प्रारंभिक बिंदु के रूप में वाष्प प्रसार पर केंद्रित है, क्योंकि सभी प्रोटीन डेटा बैंक (पीडीबी) के जमाव का 95% वाष्प प्रसार प्लेटों में उगाए गए क्रिस्टल सेआता है। वाष्प प्रसार, हालांकि, सूक्ष्म-क्रिस्टलीकरण26 के लिए आदर्श विधि नहीं है, इसलिए वाष्प प्रसार को बैच क्रिस्टलीकरण में परिवर्तित करने के लिए एक पद्धति का वर्णन किया गया है। एक बार जब क्रिस्टल को बैच में उगाया जा सकता है, तो बड़ी मात्रा में स्केलिंग मार्ग अधिक व्यावहारिक हो जाते हैं। प्रोटीन क्रिस्टलीकरण की अनिश्चितताओं को देखते हुए, लेखक इस बात पर जोर देंगे कि यह विधि विफल नहीं है। हालांकि, प्रोटोकॉल को कम से कम, एक प्रोटीन के 'क्रिस्टलीकरण स्थान' में अंतर्दृष्टि प्रदान करनी चाहिए।

यह विधि प्रोटीन क्रिस्टलीकरण चरण आरेख पर निर्भर करती है और उस आरेख की समझ सूक्ष्म-क्रिस्टलीकरण अनुकूलन के दौरान एक गाइड के रूप में कैसे कार्य कर सकती है। एक प्रोटीन चरण आरेख को आमतौर पर एक्स / वाई प्लॉट के रूप में दर्शाया जाता है, जिसमें क्रमशः एक्स और वाई अक्षों पर प्रीसिपेटेंट और प्रोटीन सांद्रता होती है (चित्रा 1 ए)। शुद्ध जल बिंदु (नीचे बाएं कोने - चित्रा 1 ए) से, प्रोटीन और प्रीसिपेटेंट दोनों की एकाग्रता तब तक बढ़ जाती है जब तक कि घुलनशीलता रेखा तक नहीं पहुंच जाती। घुलनशीलता रेखा सूखे के बिंदु को चिह्नित करती है (बैंगनी रेखा - चित्रा 1 ए)। जब एक प्रोटीन सुपरसैचुरेटेड होता है, तो समाधान थर्मोडायनामिक रूप से अस्थिर हो जाता है और दो चरणों में अलग होना शुरू हो जाएगा: 'प्रोटीन युक्त' और एक स्थिर संतृप्त समाधान। यह पृथक्करण घुलनशीलता रेखा से परे कहीं भी हो सकता है और इसके कैनेटीक्स प्रोटीन के गुणों और समाधान के घटकों पर निर्भर हैं।

जब प्रोटीन और प्रीसिपेटेंट सांद्रता बहुत अधिक होती है, तो प्रोटीन घोल से अस्थिर रूप से विघटित हो जाएगा और परिणामस्वरूप अनाकार अवक्षेप (गुलाबी क्षेत्र - चित्रा 1 ए) होगा। हालांकि, क्रमबद्ध चरण पृथक्करण न्यूक्लियेशन क्षेत्र में हो सकता है [विस्तृत विवरण के लिए गार्सिया-रुइज़ (2003)28 देखें] और क्रिस्टल न्यूक्लिएंट में बनने की प्रवृत्ति होती है (हरा क्षेत्र - चित्रा 1 ए)। न्यूक्लियेशन और विकास समाधान से प्रोटीन को हटा देता है और बूंद को मेटास्टेबल क्षेत्र में ले जाता है जहां घुलनशीलता रेखा तक पहुंचने तक विकास जारी रह सकता है [विस्तृत चर्चा के लिए मैकफर्सन और कुज़नेत्सोव (2014)29 देखें]। आरेख, क्रिस्टलीकरण स्थितियों के विशाल बहुमत के लिए, एक सकल अति सरलीकरण30 है। इसके बावजूद, आरेख अभी भी सूक्ष्म-क्रिस्टलोग्राफरों के लिए बहुत उपयोगी है क्योंकि आरेख का मानचित्रण घुलनशीलता रेखा और न्यूक्लियेशन के कैनेटीक्स को निर्धारित करने की अनुमति देता है।

माइक्रो-क्रिस्टल बनाने के संदर्भ में, क्रिस्टलीकरण के दौरान जिन दो कारकों को अनुकूलित करने की आवश्यकता होती है, वे क्रिस्टल की संख्या (एक्सएन) और उनके औसत, सबसे लंबे आयाम (एक्सएस) हैं। X n न्यूक्लियेशन घटनाओं (n ) (Eq. 1) की संख्या के समानुपाती होगा।

Equation 1     समीकरण 1

X s घुलनशीलता रेखा (Ps) के ऊपर मुक्त प्रोटीन की सांद्रता के समानुपाती है जिसे Xn (Eq. 2) द्वारा विभाजित किया गयाहै।

Equation 2     समीकरण 2

एक आदर्श स्थिति में, प्रत्येक न्यूक्लियेशन घटना एक संभावित क्रिस्टल उत्पन्न करेगी और इनमें से प्रत्येक क्रिस्टल को समाधान में उपलब्ध प्रोटीन तक समान पहुंच होगी। चित्रा 2 एक्सएन और एक्स एस के बीच संबंधों के एक आदर्श परिदृश्य से एक ग्राफिकल प्रतिनिधित्वहै। व्यावहारिक रूप से, एक क्रिस्टलोग्राफर का एक्सएन और एक्सएस पर मुख्य नियंत्रण न्यूक्लियेशन की मात्रा को प्रभावित करके या बीज क्रिस्टल के अतिरिक्त होता है। माइक्रो-क्रिस्टलोग्राफर को यह तय करना चाहिए कि एक्सएन को कैसे बढ़ाया जाए ताकि एक उपयुक्त क्रिस्टल एकाग्रता और क्रिस्टल आकार दोनों बनाया जा सके।

अधिकांश क्रिस्टलीकरण तकनीकों के लिए 'संक्रमण अवधि' की आवश्यकता होती है (चित्रा 1 बी)। उदाहरण के लिए, एक वाष्प प्रसार प्रयोग में, प्रोटीन और प्रीसिपेटेंट समाधानों को मिलाने पर, प्रत्येक की सांद्रता बदल जाएगी क्योंकि बूंद अच्छी तरह से समाधान के साथ मेल खाती है। एक उम्मीद है कि ये परिवर्तन धीरे-धीरे गिरावट को न्यूक्लियेशन क्षेत्र में बदल देंगे जहां क्रिस्टलीकरण की प्रवृत्ति बढ़ जाएगी। जैसे-जैसे क्रिस्टल न्यूक्लियेट और बढ़ने लगते हैं, समाधान में प्रोटीन की मात्रा गिरना शुरू हो जाएगी, जिससे आगे न्यूक्लियेशन की संभावना कम हो जाएगी। न्यूक्लियेशन की अंतिम मात्रा प्रोटीन और स्थिति विशिष्ट होगी, और न्यूक्लियेशन क्षेत्र में प्रवेश की गहराई पर भी निर्भर करेगी। उन तरीकों के सीमित न्यूक्लियेशन ज़ोन प्रवेश को देखते हुए जिनके लिए संक्रमण चरण की आवश्यकता होती है, न्यूक्लियेशन का स्तर अंततः मेटास्टेबल-न्यूक्लियेशन क्षेत्र सीमा पर न्यूक्लियेशन की दर तक सीमित होगा।

एक माइक्रो-क्रिस्टलोग्राफर के लिए न्यूक्लियेशन के स्तर को बढ़ाने में सक्षम होने के महत्व के कारण, बैच क्रिस्टलीकरण पद्धति में जाना महत्वपूर्ण है। बैच पूरे न्यूक्लियेशन क्षेत्र (चित्रा 1 सी) का अधिक लाभ उठा सकता है। बैच विधियों में, विचार प्रोटीन और प्रीसिपेटेंट को एक साथ मिलाना है ताकि घटक सांद्रता में किसी भी बदलाव की आवश्यकता के बिना एक सुपरसैचुरेटेड समाधान बनाया जा सके। मिश्रण पर न्यूक्लियेशन तुरंत संभव होना चाहिए। इसलिए बैच विधियां पूरे न्यूक्लियेशन क्षेत्र को सैद्धांतिक रूप से पहुंचने की अनुमति देती हैं। मेटास्टेबल-न्यूक्लियेशन सीमा से परे न्यूक्लियेशन कैनेटीक्स में किसी भी वृद्धि का उपयोग किया जा सकता है।

यदि क्रिस्टल न्यूक्लियेशन का बेसल-स्तर एक बड़ा एक्सएन उत्पन्न करने के लिए पर्याप्त नहीं है, तो माइक्रो-सीडिंग विधियों का उपयोग किया जा सकता है। माइक्रो-सीडिंग में, पहले से उगाए गए क्रिस्टल को क्रिस्टलीय टुकड़ों का घोल बनाने के लिए तोड़ दिया जाता है जो ताजाक्रिस्टल विकास के लिए मचान के रूप में कार्य कर सकता है। क्रिस्टल न्यूक्लियेशन (चित्रा 1 सी) को बढ़ाने की आवश्यकता के बिना एक्सएन को बढ़ाने के तरीके के रूप में सीरियल क्रिस्टलोग्राफिक नमूना तैयारी में माइक्रो-सीडिंग का व्यापक रूप से उपयोग किया गया है।

वाष्प प्रसार से बैच तक संक्रमण को एक चरण आरेख पर देखा जा सकता है क्योंकि प्रयोगात्मक प्रारंभिक बिंदु को गैर-सुपरसैचुरेटेड या मेटास्टेबल क्षेत्रों से न्यूक्लियेशन ज़ोन में ले जाया जाता है। यह प्रोटीन और / या प्रीसिपेटेंट सांद्रता को बढ़ाकर, और / या बूंद के भीतर दोनों के अनुपात (चित्रा 1 डी) को बढ़ाकर किया जा सकता है, और यह देखते हुए कि किन स्थितियों में तेजी से क्रिस्टल दिखाई देते हैं (< 24 घंटे)26। पूर्ण वाष्प प्रसार ड्रॉप संतुलन में दिन या सप्ताह33 लग सकते हैं। इसलिए, तेजी से दिखाई देने वाले क्रिस्टल दिखाने वाली स्थितियों की तलाश करके, बैच की स्थितियों को वैकल्पिक क्रिस्टलीकरण स्क्रीनिंग प्रारूपों जैसे माइक्रो-बैच34,35,36,37 में स्थानांतरित किए बिना पाया जा सकता है।

एक बार न्यूक्लियेशन ज़ोन पाए जाने के बाद, एक बैच स्थिति पाई गई है और एक मोर्फोग्राम - यहां, एक मोटा चरण आरेख - बनाया जा सकता है। सीड-बैच या स्ट्रेट बैच प्रोटोकॉल का उपयोग करने पर विचार करते समय मोर्फोग्राम की बहुत उपयोगिता है। एक्सएन को प्रोटीन और प्रीसिपेटेंट एकाग्रता के कार्य के रूप में प्लॉट करके, न्यूक्लियेशन कैनेटीक्स का आकलन किया जा सकताहै। यदि एक्स एन पूरे न्यूक्लियेशन क्षेत्र में कम रहता है, तो क्रिस्टल विकास को सीमित करने के लिए एक्सएन को पर्याप्त बड़ा बनाने के लिए बीज-बैच की आवश्यकता हो सकती है। यह मूल्यांकन बड़े वॉल्यूम (> 100 μL) तक स्केलिंग की प्रक्रिया में पहला कदम है।

इस विधि को इस तरह से डिज़ाइन किया गया था कि इसे मानक वाष्प प्रसार क्रिस्टलीकरण उपकरण का उपयोग करके अधिकांश क्रिस्टलीकरण प्रयोगशालाओं में आयोजित किया जा सकता है। कई अध्ययन भी आयोजित किए गए हैं जो इस प्रक्रिया के कई हिस्सों को सुविधाजनक बनाने के लिए तकनीकों का वर्णन करते हैं, क्या उपकरण उपलब्ध होना चाहिए। इनमें शामिल हैं, लेकिन इन तक सीमित नहीं हैं, गतिशील प्रकाश प्रकीर्णन (डीएलएस) 25,27, गैर-रैखिक इमेजिंग 20,24,25, पाउडर विवर्तन 20,24,27, और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी 26 [एक अच्छी समीक्षा के लिए चेंग एट अल (2020)40 देखें]।

इस काम का उद्देश्य छोटी मात्रा (< 500 एनएल) वाष्प प्रसार क्रिस्टलीकरण से बड़ी मात्रा (> 100 μL) बैच क्रिस्टलीकरण में संक्रमण करने के लिए विधि का एक दृश्य प्रदर्शन प्रदान करना है। इस अनुवाद को प्रदर्शित करने के लिए एक उदाहरण प्रणाली के रूप में क्राईफोनक्ट्रिया परजीवी से एंडोथियापेप्सिन का उपयोग किया गया है। प्रयोग का प्रकार और नमूना वितरण विधि जिसके लिए माइक्रो-क्रिस्टल की आवश्यकता होती है, आदर्श एक्सएस आउटपुट26 को प्रभावित करेगी। मिलीसेकंड टाइम रिज़ॉल्यूशन41 या गैस-डायनामिक वर्चुअल नोजल42 की आवश्यकता वाले प्रयोगों को मिलाने के लिए, < 5 μm का अंतिम X s वांछनीय हो सकताहै । इस मामले में, लक्ष्य प्रोटीन क्रिस्टल का उत्पादन करना था जो फोटॉन-सक्रिय पंप-जांच प्रयोग के लिए और एक निश्चित-लक्ष्य वितरण दृष्टिकोण का उपयोग करके लगभग 1.5 ° तक अलग हो जाता है।

एंडोथियापेप्सिन का उपयोग करके इस तरह के सीरियल क्रिस्टलोग्राफी प्रयोग की नमूना आवश्यकताओं का एक उदाहरण देने के लिए, तालिका 1 एक काल्पनिक प्रयोग के प्रयोगात्मक मापदंडों को दिखाती है। नमूना जानकारी नीचे वर्णित प्रोटोकॉल पर आधारित थी। हिट दरों और डेटा संग्रह आवश्यकताओं पर कुछ रूढ़िवादी अनुमानों को देखते हुए, पूरे प्रयोग के लिए 50 मिलीग्राम कुल नमूना खपत अनुमान है।

चित्रा 3 प्रारंभिक छोटे मात्रा वाष्प प्रसार क्रिस्टलीकरण से बड़े पैमाने पर बैच तक पूर्ण अनुकूलन प्रक्रिया का प्रवाह-चार्ट दिखाता है। अधिकांश सीरियल क्रिस्टलोग्राफी परियोजनाओं के लिए, यह प्रोटोकॉल चरण 2 पर शुरू होगा: 'बैच में संक्रमण', क्योंकि लक्ष्य प्रोटीन पहले से ही क्रिस्टलीकृत हो चुका होगा। हालांकि, चरण 1 को पूर्णता के लिए और पाठकों को इसके महत्व की याद दिलाने के लिए शामिल किया गया है। एक ऐसी स्थिति खोजना जो एक अच्छी तरह से अलग करने वाले, एकल, बड़े क्रिस्टल को जन्म देती है, माइक्रो-क्रिस्टल अनुकूलन के लिए सबसे अच्छा प्रारंभिक बिंदु है। चरण 2 में, इस स्थिति को वाष्प प्रसार से बैच तक अनुकूलित किया जा सकता है, और न्यूक्लियेशन और मेटास्टेबल क्षेत्रों के एक मोर्फोग्राम को प्लॉट किया जा सकता है। एक बार ऐसा हो जाने के बाद, बैच की स्थिति को बड़े वॉल्यूम में स्केल करना चरण 3 में किया जा सकता है। प्रवाह-चार्ट के अंत तक, एक क्रिस्टलोग्राफर ने एक दोहराने योग्य, बड़ी मात्रा (> 100 μL), माइक्रो-क्रिस्टलीकरण, एंडोथियापेप्सिन के लिए बैच प्रोटोकॉल बनाया होगा। इस विधि को तब उनकी रुचि के विशेष प्रोटीन पर लागू किया जा सकता है।

Protocol

नोट: सभी 96-अच्छी तरह से बैठने-ड्रॉप क्रिस्टलीकरण प्रयोगों को 2 या 3-ड्रॉप प्लेटों का उपयोग करके स्थापित किया गया था। सभी 96-वेल स्क्रीन की तैयारी और निगरानी की सुविधा के लिए एक तरल हैंडलिंग रोबोट और एक क्रिस्टलीकरण इमेजर / होटल का उपयोग किया गया था। क्रिस्टलीकरण प्रयोगों के लिए सभी अभिकर्मक सांद्रता मिश्रण से पहले उनकी शुरुआती सांद्रता पर दी जाती हैं।

1. क्रिस्टल आकृति विज्ञान का अनुकूलन

नोट: चरण 1.1.1. और 1.1.6. वर्णन करें कि एंडोथियापेप्सिन क्रिस्टलीकरण की स्थिति कैसे पाई गई थी, और इन स्थितियों को एक एकल स्थिति खोजने के लिए कैसे अनुकूलित किया गया था जो एकल, अच्छी तरह से विच्छेदित क्रिस्टल उत्पन्न करता था।

  1. विरल-मैट्रिक्स अनुकूलन
    1. ताजा एंडोथियापेप्सिन घोल तैयार करें।
      नोट: एंडोथियापेप्सिन, जब सुपरन 600 के रूप में खरीदा जाता है, तो इसे इसके भंडारण समाधान से बाहर स्थानांतरित किया जाना चाहिए और केंद्रित किया जाना चाहिए।
      1. 4 डिग्री सेल्सियस पर 0.1 एम एनए एसीटेट पीएच 4.6 का 3 एल तैयार करें।
      2. डायलिसिस ट्यूबिंग के 20 सेमी काटें और संक्षेप में बफर में धो लें। एक क्लिप का उपयोग करके टयूबिंग के एक छोर को सील करें, 50 एमएल एंडोथियापेप्सिन समाधान को ट्यूबिंग में रखें और फिर दूसरे छोर को सील करें।
      3. समाधान को एनए एसीटेट बफर के 1 एल में 4 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 4 घंटे (या रात भर) के लिए डायलाइज करने के लिए छोड़ दें। भंडारण बफर के घटकों के कारण, डायलिसिस बैग में समाधान अब लगभग 100 एमएल होगा।
      4. एंडोथियापेप्सिन युक्त डायलिसिस बैग को 4 डिग्री सेल्सियस, 0.1 एम एनए एसीटेट पीएच 4.6 के ताजा लीटर में स्थानांतरित करें। इस चरण को एक बार फिर दोहराएं जैसे कि मूल बफर को एनए एसीटेट के खिलाफ 2000x पतला किया गया है।
      5. एंडोथियापेप्सिन अब लगभग 10 मिलीग्राम / एमएल पर होगा। 10 केडीए केन्द्रापसारक सांद्रक और एक सेंट्रीफ्यूज का उपयोग करके 100 मिलीग्राम / एमएल पर ध्यान केंद्रित करें।
      6. 50 μL एलिकोट में तरल नाइट्रोजन में एंडोथियापेप्सिन घोल को फ्लैश ठंडा करें और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    2. एक पैक्ट प्रीमियर 96-अच्छी तरह से विरल-मैट्रिक्स स्क्रीन तैयार करें।
      1. एक तरल हैंडलिंग रोबोट का उपयोग करके, 70 मिलीग्राम / एमएल एंडोथियापेप्सिन के 100 एनएल और प्रति कुएं में 100 एनएल अच्छी तरह से घोल वितरित करें। क्रिस्टलीकरण बफर के अलावा प्रोटीन और अच्छी तरह से घोल को 3 बार मिलाएं।
      2. प्लेट को सील करें और 28 दिनों के लिए 20 डिग्री सेल्सियस पर पहले सप्ताह के लिए हर दिन चित्र लें और फिर 4 सप्ताह के लिए हर हफ्ते छोड़ दें।
    3. विरल-मैट्रिक्स विश्लेषण
      1. उन हिट ्स की पहचान करें जो एकल एंडोथियापेप्सिन क्रिस्टल का उत्पादन करते हैं। पैक्ट स्क्रीन से, एमजीसीएल2 वाली स्थितियां सुई समूहों के बजाय सिंगलटन के रूप में बढ़ीं।
    4. विरल-मैट्रिक्स अनुकूलन
      1. चरण 1.1.3.1 में पहचाने गए एमजीसीएल2 युक्त स्थितियों से, यादृच्छिक रूप से संयोजन और विभिन्न अच्छी तरह से घटकों को बदलने के लिए 96-वेल स्क्रीन बनाएं।
      2. एक तरल हैंडलिंग रोबोट का उपयोग करके, 70 मिलीग्राम / एमएल एंडोथियापेप्सिन के 100 एनएल और प्रति कुएं में 100 एनएल अच्छी तरह से घोल वितरित करें। क्रिस्टलीकरण बफर के अलावा प्रोटीन और अच्छी तरह से घोल को 3 बार मिलाएं।
      3. प्लेट को सील करें और 28 दिनों के लिए 20 डिग्री सेल्सियस पर पहले सप्ताह के लिए हर दिन चित्र लें और फिर 4 सप्ताह के लिए हर हफ्ते छोड़ दें।
    5. अनुकूलन विश्लेषण
      1. उपयुक्त स्प्रेडशीट सॉफ्टवेयर का उपयोग करके, क्रिस्टलीकरण स्थितियों को रैंक करें जो क्रिस्टल की गुणवत्ता और वर्षा स्तर के आधार पर क्रिस्टल को जन्म देते हैं, क्रमशः कोई क्रिस्टल (0) से आदर्श (5) और निम्न (0) से उच्च (5) नहीं। क्रिस्टल की गुणवत्ता के संबंध में, व्यापक मानदंड बॉक्स जैसी आकृति विज्ञान के साथ एकल क्रिस्टल हैं।
      2. क्रिस्टलीकरण स्थिति सामग्री और क्रिस्टल मात्रा और वर्षा स्तर के बीच पियर्सन का सहसंबंध विश्लेषण करें।
      3. इन डेटा को हीट मैप के रूप में प्लॉट करें। उन घटकों और स्थितियों की तलाश करें जो पसंदीदा परिणामों के साथ सहसंबद्ध थे।
    6. विवर्तन विश्लेषण।
      1. पुष्टि करें कि चरण 1.1.5 में पहचाने गए स्थितियों से विकसित क्रिस्टल एक्स-रे विवर्तन प्रयोग करके सीरियल क्रिस्टलोग्राफी के लिए उपयुक्त हैं।
      2. पहचाने गए प्रत्येक स्थिति से एंडोथियापेप्सिन क्रिस्टल का एक नमूना उन समर्थनों पर लोड करें जो 100 या 293 K पर डेटा संग्रह की अनुमति देते हैं और एक्स-रे विवर्तन प्रयोग करते हैं। यदि क्रायो के तहत काम कर रहे हैं, तो क्रायो-प्रोटेक्टेंट के रूप में 25% एथिलीन ग्लाइकॉल का उपयोग करें।
      3. एक उपयुक्त सॉफ्टवेयर सूट के माध्यम से इन डेटा को संसाधित करें। एंडोथियापेप्सिन क्रिस्टल को 1.5 ° से अधिक तक अलग किया जाना चाहिए। ट्विनिंग की जांच करें, क्योंकि जुड़वां क्रिस्टल सीरियल क्रिस्टलोग्राफिक डेटा प्रोसेसिंग को काफी जटिल कर सकते हैं।
      4. यदि क्रिस्टल सिंगलटन हैं और 1.5 ° तक अलग हो जाते हैं, तो चरण 2 पर आगे बढ़ें। यदि नहीं, तो चरण 1.1.2 पर वापस जाएं और आशाजनक स्थितियों की पहचान करने के लिए अधिक विरल-मैट्रिक्स स्क्रीन का प्रयास करें। चरण 1.1.5 में किए गए विश्लेषण के बाद। और 1.1.6., 25% (डब्ल्यू / वी) पीईजी 6,000, 0.1 एम ट्रिस-एचसीएल पीएच 7.0 और 0.15 एम एमजीसीएल2 की क्रिस्टलीकरण स्थिति को अनुमानित आदर्श के रूप में पाया जाना चाहिए था।

2. बैच में संक्रमण

  1. मोर्फोग्राम प्रयोग
    1. एक माइक्रो-क्रिस्टल बीज स्टॉक बनाएं।
      नोट: बीज-स्टॉक बनाते समय यह सबसे अच्छा अभ्यास है, विशेष रूप से कार्य के लिए उगाए गए क्रिस्टल से बीज बनाना। यह प्रजनन क्षमता के साथ बहुत मदद करता है। चरण 2.1.1.1 से 2.1.1.11 में प्रस्तुत अन्य विचार हमेशा कुओं की एक मानक संख्या से उगाए गए क्रिस्टल का उपयोग करना है - यहां 5 - और एक बार स्टॉक को एलिकोट करें जब वे फ्रीज-पिघलने चक्रों को नकारने के लिए बनाए जाते हैं।
      1. क्रिस्टलीकरण बफर युक्त कुओं के साथ एक 96-अच्छी तरह से क्रिस्टलीकरण प्लेट तैयार करें: 25% (डब्ल्यू / वी) पीईजी 6,000, 0.1 एम ट्रिस-एचसीएल पीएच 7.0 और 0.15 एम एमजीसीएल2।
      2. एक तरल हैंडलिंग रोबोट का उपयोग करके, 200 एनएल डीफ्रॉस्ट किए गए 70 मिलीग्राम / एमएल एंडोथियापेप्सिन और 200 एनएल कुएं के घोल को प्रति कुएं में एक सब-वेल में वितरित करें। क्रिस्टलीकरण बफर के अलावा प्रोटीन और अच्छी तरह से घोल को 3 बार मिलाएं।
      3. प्लेट को सील करें और 24 घंटे के लिए छोड़ दें।
      4. 250 μL क्रिस्टलीकरण बफर और 10-15 1 मिमी ग्लास मोती के साथ 1.5 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब भरें। सेंट्रीफ्यूज ट्यूब को 5-10 मिनट के लिए ठंडा होने के लिए बर्फ पर छोड़ दें।
      5. क्रिस्टल के साथ 5 कुओं का चयन करें, एक स्केलपेल के साथ कुओं को खोलें और एक पिपेट टिप का उपयोग करके, कुओं में क्रिस्टल को कुचल दें।
      6. आइस्ड सेंट्रीफ्यूज ट्यूब से बफर के 1 μL को एस्पिरेट करें और कुचल क्रिस्टल घोल को समरूप करने के लिए उपयोग करें। एक बार सजातीय होने पर, पूरे घोल को एस्पिरेट करें और ठंडा सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में इकट्ठा करें।
      7. 5 उप-कुओं में से प्रत्येक के लिए चरण 2.1.2.6 दोहराएँ।
      8. भंवर सेंट्रीफ्यूज ट्यूब जिसमें बफर, पूल ्ड स्लरी और बीड्स होते हैं, 30 सेकंड के लिए 1000 आरपीएम पर।
      9. सेंट्रीफ्यूज ट्यूब को 30 सेकंड के लिए बर्फ पर लौटाएं।
      10. चरण 2.1.2.8 और 2.1.2.9 को दो बार दोहराएँ।
      11. बीज-स्टॉक अब तैयार है और इसे 10 μL बैचों में उद्धृत किया जा सकता है और -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
    2. मोर्फोग्राम प्रयोग करें।
      1. 2-ड्रॉप 96-वेल ग्रिड स्क्रीन तैयार करें। प्लेट स्तंभों के साथ पीईजी 6,000 की सांद्रता को 5 से 40% (डब्ल्यू / वी) तक बदलें, बफर और नमक को क्रमशः 0.1 एम ट्रिस-एचसीएल पीएच 7.0 और 0.15 एम एमजीसीएल2 पर रखें।
      2. 8 चरणों में 100 से 12.5 मिलीग्राम / एमएल तक 0.1 एम एनए एसीटेट पीएच 4.6 में एंडोथियापेप्सिन का अनुक्रमिक कमजोर पड़ने की तैयारी करें। प्लेट की प्रत्येक पंक्ति के लिए एंडोथियापेप्सिन की एक अलग एकाग्रता का उपयोग किया जाएगा।
      3. एक तरल हैंडलिंग रोबोट का उपयोग करके, 150 एनएल एंडोथियापेप्सिन को उप-कुओं 1 और 2 दोनों में वितरित करें। सब-वेल 1 में, कुएं के घोल के 150 एनएल को वितरित करें। सब-वेल 2 में, मल्टी-एस्पिरेट 50 एनएल डीफ्रॉस्ट बीज-स्टॉक और 100 एनएल अच्छी तरह से घोल होता है, और फिर दोनों को प्रोटीन समाधान में वितरित करता है। क्रिस्टलीकरण बफर के अलावा समाधान को 3 बार मिलाएं।
      4. प्लेट को सील करें और 20 डिग्री सेल्सियस पर हर 0, 3, 6, 12, 18, 24 घंटे में चित्र लें, फिर पहले सप्ताह के लिए हर दिन और अगले चार के लिए हर सप्ताह। यदि स्वचालित इमेजिंग संभव नहीं है, तो दिन 1 पर प्रति घंटा इमेजिंग के बारे में चिंता न करें।
  2. मोर्फोग्राम विश्लेषण।
    1. 24 घंटे के बाद ली गई छवियों को देखते हुए, प्रत्येक कुएं में मौजूद क्रिस्टल की संख्या का अनुमान लगाएं और प्रदान किए गए "मोर्फोग्राम जनरेटर" वर्कशीट में इन अनुमानों को रिकॉर्ड करें। इन अनुमानों को सटीक होने की आवश्यकता नहीं है; व्यक्तिगत रूप से हजारों माइक्रो-क्रिस्टल की गिनती, यदि मौजूद है, तो व्यावहारिक या आवश्यक नहीं है। मुख्य रूप से यह सुनिश्चित करने का प्रयास करें कि अनुमान पूरी प्लेट पर संगत हैं।
      नोट: 24 घंटे का नियम बील एट अल (2019)26 में किए गए अवलोकनों पर आधारित था। वाष्प प्रसार क्रिस्टलीकरण की स्थिति को संतुलित करने में दिन या सप्ताह लग सकते हैं। तेजी से दिखाई देने वाले क्रिस्टल ड्रॉप घटकों के क्रमिक संतुलन के बजाय बैच प्रक्रिया के माध्यम से बढ़ने की अधिक संभावना रखते हैं। इसलिए, 24 घंटे का मानदंड कुछ हद तक मनमाना है और एक बैच और वाष्प प्रसार प्रयोग के बीच एक सटीक कट-ऑफ समय स्थिति के विशिष्ट मिश्रण पर निर्भर करेगा [देखें बील एट अल]। (2019) पूर्ण विवरण के लिए 26 ]।
    2. इंगित बक्से में एंडोथियापेप्सिन और पीईजी 6,000 की शुरुआती सांद्रता इनपुट करें।
    3. वर्कशीट स्वचालित रूप से परिणामों को पारंपरिक चरण आरेख प्रारूप में क्रमशः एक्स और वाई अक्षों पर प्रीसिपेटेंट और प्रोटीन एकाग्रता के साथ प्लॉट करेगी। अच्छी तरह से स्थितियां जो केवल उनके बीज की बूंदों में क्रिस्टल को जन्म देती हैं, आरेख (पारदर्शी नीले) के मेटास्टेबल क्षेत्र को इंगित करती हैं, जबकि जिन स्थितियों में बीज और गैर-बीज वाली बूंदों दोनों में क्रिस्टल होते हैं, वे न्यूक्लियेशन ज़ोन (ठोस हरे) का संकेत देते हैं।
      नोट: आदर्श रूप से, न्यूक्लियेशन ज़ोन का अधिकांश भाग आरेख पर मौजूद होना चाहिए (यानी, आरेख के तल पर कुछ स्पष्ट कुएं हैं और कुछ अवक्षेप उच्च प्रोटीन और प्रीसिपेटेंट सांद्रता पर दिखाई देना चाहिए)। यदि ऐसा नहीं है, तो शायद, प्रयोग को दोहराएं लेकिन प्रोटीन और / या प्रीसिपेटेंट एकाग्रता (यदि संभव हो) बढ़ाएं।
    4. यदि क्रिस्टल 24 घंटे से कम समय में दिखाई दिया है, तो चरण 2.3.1 पर आगे बढ़ें। यदि नहीं, तो चरण 2.4 पर आगे बढ़ें और बैच की ओर अनुकूलन जारी रखें।
  3. क्रिस्टल विश्लेषण
    1. जैसा कि चरण 1 के अंत में कहा गया है, अगले चरण में जाने से पहले, सुनिश्चित करें कि इन क्रिस्टल में वांछित आकृति विज्ञान और विवर्तन गुणवत्ता है। आकृति विज्ञान के संबंध में, क्या क्रिस्टल सुई-गेंद जैसी या पंखे जैसी संरचनाओं के बजाय सिंगलटन के रूप में अपरिवर्तनीय और बनते हैं? विवर्तन के संबंध में, यदि संभव हो तो क्रिस्टल से विवर्तन डेटा एकत्र करें। यदि ये क्रिस्टल अलग नहीं होते हैं, तो यह असंभव है कि बड़ी मात्रा में उगाए गए क्रिस्टल अलग हो जाएंगे।
    2. मोर्फोग्राम प्रयोग से एंडोथियापेप्सिन क्रिस्टल का एक नमूना उन समर्थनों पर लोड करें जो 100 या 293 K पर डेटा संग्रह की अनुमति देते हैं और एक्स-रे विवर्तन प्रयोग करते हैं। यदि क्रायो के तहत काम कर रहे हैं, तो क्रायो-प्रोटेक्टेंट के रूप में 25% एथिलीन ग्लाइकॉल का उपयोग करें।
    3. एक उपयुक्त सॉफ्टवेयर सूट के माध्यम से इन डेटा को संसाधित करें। एंडोथियापेप्सिन क्रिस्टल को 1.5 ° से अधिक तक अलग किया जाना चाहिए। क्रिस्टल के नमूने के पार, सेल के आकार, टिप्पणियों की कुल संख्या और मोज़ेसिटी का निरीक्षण करें; ये उपाय विच्छेदित क्रिस्टल की समरूपता के रूप में एक संकेत देंगे।
    4. यदि क्रिस्टल आकृति विज्ञान और विवर्तन गुणवत्ता पर्याप्त है, तो चरण 3 पर आगे बढ़ें।
  4. क्रिस्टल विकास समय का अनुकूलन करें।
    नोट: मोर्फोग्राम विश्लेषण (चरण 2.2) ने क्रिस्टलीकरण प्रारंभिक बिंदु का संकेत दिया होगा (यानी, चरण आरेख का क्षेत्र जहां बूंद स्थित है जब प्रीसिपेटेंट और प्रोटीन समाधान मिश्रित थे)। क्या मेटास्टेबल क्षेत्र में गिरावट या घुलनशीलता रेखा से नीचे है? बैच क्रिस्टलीकरण न्यूक्लियेशन ज़ोन (चित्रा 1 सी) में शुरू होता है। इस चरण का लक्ष्य इस प्रारंभिक बिंदु को घुलनशीलता रेखा या मेटास्टेबल क्षेत्र के नीचे से न्यूक्लियेशन ज़ोन (चित्रा 1 डी) में स्थानांतरित करना है। यदि बीज चरण 2.2 से गिरता है। तेजी से क्रिस्टल का उत्पादन किया है, यह एक संकेत है कि बूंद मिश्रण पहले से ही मेटास्टेबल क्षेत्र में है, यदि नहीं, तो यह संभावना है कि बूंद सुपरसैचुरेटेड नहीं है।
    1. क्रिस्टल विकास समय का अनुकूलन।
      1. चरण 2.1.3 के समान स्क्रीन का उपयोग करके, 3-ड्रॉप प्लेट में 96-अच्छी तरह से वाष्प प्रसार क्रिस्टलीकरण प्रयोग तैयार करें।
      2. वाई अक्ष पर एंडोथियापेप्सिन की शुरुआती प्रोटीन एकाग्रता बढ़ाएं (यानी, प्रोटीन को आगे केंद्रित करें, शायद एंडोथियापेप्सिन के लिए 120 मिलीग्राम / एमएल)।
      3. चरण 2.1.3.2 के रूप में एक सीरियल कमजोर पड़ने का प्रदर्शन करें, जैसे कि प्लेट की प्रत्येक पंक्ति में क्रमिक रूप से कम प्रोटीन एकाग्रता होती है।
      4. प्लेट पर तीन बूंदों में से प्रत्येक में अलग-अलग ड्रॉप अनुपात का उपयोग करें: 1: 1, 1: 2, और 2: 1, प्रोटीन: प्रीसिपेटेंट।
      5. प्लेट को पहले दिन 0, 3, 6, 12, 18, 24 घंटे पर देखें या छवि बनाएं और फिर पहले सप्ताह के लिए हर दिन, और अगले चार के लिए हर सप्ताह। यदि स्वचालित इमेजिंग संभव नहीं है, तो दिन 1 पर प्रति घंटा इमेजिंग के बारे में चिंता न करें।
      6. उन बूंदों की पहचान करें जो सबसे तेजी से दिखाई देने वाले क्रिस्टल का उत्पादन करते हैं और इन्हें 24 घंटे के भीतर क्रिस्टल विकास होने तक बार-बार अनुकूलन के शुरुआती बिंदु बनाते हैं।
      7. जब तेजी से दिखाई देने वाली क्रिस्टल-स्थिति की पहचान की जाती है, तो स्केलिंग शुरू करने के लिए एक प्रस्तावना के रूप में मोर्फोग्राम को फिर से तैयार करने के लिए चरण 2.1 पर लौटें।

3. स्केलिंग

  1. रैंक स्केलिंग मार्ग। इस स्तर पर, एकल स्केलिंग मार्ग पर निर्णय लेना आवश्यक नहीं है, केवल विकल्पों की पहचान और रैंक करने के लिए ताकि उन्हें बारी-बारी से खोजा जा सके। चूंकि स्केलिंग प्रक्रिया के दौरान बैच मिश्रण की मात्रा बढ़ जाती है, इसलिए न्यूक्लियेशन की दर और क्रिस्टल आकार की सीमा में परिवर्तन होगा। हालांकि, इन्हें घटक सांद्रता के सावधानीपूर्वक बदलाव से दूर किया जा सकता है क्योंकि स्केल की गई मात्रा बढ़ जाती है।
    नोट: चरण 3.1.1 और 3.1.2 वर्णन करते हैं कि मोर्फोग्राम से कैसे पता लगाया जाए, कि बैच या सीड-बैच प्रोटोकॉल अधिक उपयुक्त है या नहीं।
    1. सीधे बैच प्रोटोकॉल
      1. क्या न्यूक्लियेशन ज़ोन में एक्सएन प्रोटीन और / या प्रीसिपेटेंट एकाग्रता के समानुपाती है? यानी क्या एक्सएन या तो प्रीसिपेटेंट और / या प्रोटीन एकाग्रता के कार्य के रूप में बढ़ता है? -हाँ? चरण 3.1.1.2 पर जाएँ। नहीं? चरण 3.1.2 पर जाएँ। 
      2. उन स्थितियों का पता लगाएं जो आवश्यक आकार के क्रिस्टल उत्पन्न करती हैं और चरण 3.2 पर जाएं।
    2. सीडेड-बैच प्रोटोकॉल
      1. क्या एक्सएन न्यूक्लियेशन ज़ोन के पार सपाट है? अर्थात। एक्सएन या तो प्रीसिपेटेंट और / या प्रोटीन एकाग्रता के कार्य के रूप में नहीं बढ़ता है।
      2. बीज वाली स्थितियों का पता लगाएं जो आवश्यक आकार के क्रिस्टल उत्पन्न करते हैं और चरण 3.2 पर जाते हैं। यदि सभी क्रिस्टल बहुत बड़े हैं - चरण 3.1.2.3 पर जाएं।
      3. मोर्फोग्राम प्रयोग (चरण 2.1) को दोहराएं, लेकिन इस बार बीज वाले कुओं में उपयोग किए जाने वाले बीज-स्टॉक की एकाग्रता में वृद्धि करें। इसके निर्माण में अधिक क्रिस्टल का उपयोग करके बीज स्टॉक को बढ़ाया जा सकता है। उदाहरण के लिए, चरण 2.1.1.5 में 5 कुओं के बजाय, 10 कुओं का उपयोग करें।
      4. पहले 0, 3, 6, 12, 18, 24 घंटे में प्लेट को देखें या छवि बनाएं।
      5. बीज की बूंदों में एक्सएन में वृद्धि होनी चाहिए थी और एक्सएस में कमी आई थी। यदि छोटे क्रिस्टल की आवश्यकता हो तो इस चक्र को दोहराएं और फिर एक बीज-बैच प्रोटोकॉल का पालन करें।
  2. धीरे-धीरे स्केलिंग
    1. 96-वेल प्लेटों में स्केलिंग। एंडोथियापेप्सिन मोर्फोग्राम से, क्रिस्टलीकरण स्थिति 0.1 एम ट्रिस-एचसीएल पीएच 7.0, 0.15 एम एमजीसीएल2, और 30% (डब्ल्यू / वी) पीईजी 6,000 का उपयोग करके एक सीधी बैच विधि को शुरू में स्केलिंग के लिए चुना गया था। 1: 1 अनुपात में क्रिस्टलीकरण बफर के साथ मिश्रित 100 मिलीग्राम / एमएल एंडोथियापेप्सिन।
      1. 2-अच्छी तरह से 96-अच्छी तरह से बैठने-ड्रॉप प्लेट में 2-3 कुएं तैयार करें, जिसमें 0.1 एम ट्रिस-एचसीएल पीएच 7.0, 0.15 एम एमजीसीएल2, और 30% (डब्ल्यू / वी) पीईजी 6,000 के 100 μL हों।
      2. ताजा डीफ्रॉस्ट किए गए 100 मिलीग्राम / एमएल एंडोथियापेप्सिन समाधान का उपयोग करके, प्रति कुएं 0.5 μL प्रोटीन और 0.5 μL प्रीसिपेटेंट वितरित करें, सील करें और 20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
      3. पहले 0, 3, 6, 12, 18, 24 घंटे में प्लेट को देखें या छवि बनाएं। Xs और X n की श्रेणी में किसी भी परिवर्तन को नोटकरें।
      4. यदि परिवर्तन हुए हैं, तो चरण 3.2.1.1 से 3.2.1.2 तक दोहराएं, लेकिन एक्सएस और एक्सएन की सीमा में किसी भी परिवर्तन को बहाल करने के लिए प्रोटीन, प्रीसिपेटेंट और / या बीज एकाग्रता को बढ़ाएं या घटाएं।
      5. जब Xs और Xn की सीमा स्वीकार्य हो, तो चरण 3.2.2 पर आगे बढ़ें।
    2. 24-वेल हैंगिंग-ड्रॉप प्लेटों में स्केलिंग
      1. वैक्यूम ग्रीस के साथ कुएं के किनारों को चिकना करके 24-अच्छी तरह से हैंगिंग-ड्रॉप प्लेट का एक कुआं तैयार करें।
      2. 0.1 M Tris-HCl pH 7.0, 0.15 M MgCl2, और 30% (w/v) PEG 6,000 का 0.5 mL तैयार करें और ग्रीज़ को अच्छी तरह से भरें।
      3. ताजा डीफ्रॉस्ट किए गए एंडोथियापेप्सिन समाधान का उपयोग करके, ग्लास कवरस्लिप की सतह पर प्रोटीन के 1 μL का उपयोग करें। प्रोटीन ड्रॉप पर क्रिस्टलीकरण बफर के पिपेट 1 μL और पिपेट का उपयोग करके मिलाएं।
      4. पहले 0, 3, 6, 12, 24 घंटे में प्लेट को देखें या छवि बनाएं। Xs और X n की श्रेणी में किसी भी परिवर्तन को नोटकरें।
      5. यदि परिवर्तन हुए हैं, तो चरण 3.2.2.1 से 3.2.2.4 तक दोहराएं, लेकिन एक्सएस और एक्सएन की सीमा में किसी भी परिवर्तन को बहाल करने के लिए प्रोटीन, प्रीसिपेटेंट और / या बीज एकाग्रता को बढ़ाएं या घटाएं।
      6. जब/यदि Xs और Xn की सीमा स्वीकार्य है, तो चरण 3.2.2.7 पर आगे बढ़ें।
      7. चरण 3.2.2.1 से 3.2.2.5 तक दोहराएं, प्रयोग की कुल मात्रा धीरे-धीरे 10 μL तक बढ़ जाए।
      8. एक बार 10 μL या उससे बड़े वॉल्यूम पर, चरण 3.2.3 में सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों के लिए आगे बढ़ें।
    3. सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में स्केलिंग
      नोट: एंडोथियापेप्सिन बैच स्थिति का शोधन मुख्य रूप से 200 μL वॉल्यूम (परिणाम, स्केलिंग देखें) के बिंदु पर हुआ। प्रक्रिया 0.1 एम ट्रिस-एचसीएल पीएच 7.0, 0.15 एम एमजीसीएल2, और 30% (डब्ल्यू / वी) पीईजी 6,000 की क्रिस्टलीकरण स्थिति के साथ शुरू हुई। हालांकि, पीईजी एकाग्रता अंततः 40% (डब्ल्यू / वी) में बदल गई। एक्सएन को नियंत्रित करने के लिए बीज की भी आवश्यकता थी, और क्रिस्टल को बहुत बड़ा होने से रोकने के लिए, क्रिस्टल विकास को बुझाना पड़ा। चरण 3.2.3.1 से 3.2.3.7 स्थिति अनुकूलन की प्रक्रिया का विस्तार करते हैं। चरण 3.2.4. अंतिम बैच प्रोटोकॉल का वर्णन करें।
      1. 1 एमएल क्रिस्टलीकरण बफर तैयार करें: 0.1 एम ट्रिस-एचसीएल पीएच 7.0, 0.15 एम एमजीसीएल2, और 30% (डब्ल्यू / वी) पीईजी 6,000।
      2. ताजा डीफ्रॉस्टकिए गए 100 मिलीग्राम / एमएल एंडोथियापेप्सिन का उपयोग करके 1.5 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में 25 μL प्रोटीन जोड़ें।
      3. पिपेट टिप के साथ 1: 1 अनुपात में प्रोटीन समाधान के साथ क्रिस्टलीकरण बफर को अच्छी तरह से मिलाएं। ट्यूब को 20 डिग्री सेल्सियस पर उच्च आंदोलन के साथ रिवॉल्वर / रोटेटर में रखें।
      4. नियमित (5, 10, 30, 60 मिनट, 2, 5, 10, 24 घंटे) 2.5 μL एलिकोट लें और हेमोसाइटोमीटर में देखें। Xn और Xs श्रेणी रिकॉर्ड करें।
      5. यदि परिवर्तन हुए हैं, तो चरण 3.2.3.1 दोहराएँ। 3.2.3.4 तक। लेकिन एक्सएस और एक्सएन की सीमा में किसी भी बदलाव को बहाल करने के लिए प्रोटीन, प्रीसिपेटेंट और / या बीज एकाग्रता को बढ़ाएं या घटाएं।
      6. जब Xs और Xn की श्रेणी स्वीकार्य हो, तो चरण 3.2.3.7 पर आगे बढ़ें।
      7. चरण 3.2.2.1 से 3.2.2.5 तक दोहराएं, प्रयोग की कुल मात्रा को धीरे-धीरे 200 μL या उससे बड़े तक बढ़ाएं, जैसा कि आवश्यक है।
    4. अंतिम सीड-बैच प्रोटोकॉल
      1. बीज-स्टॉक तैयार करें।
        1. क्रिस्टलीकरण बफर के 2 एमएल तैयार करें: 0.1 एम ट्रिस-एचसीएल पीएच 7.0, 0.15 एम एमजीसीएल2, और 40% (डब्ल्यू / वी) पीईजी 6,000।
        2. ताजा डीफ्रॉस्टकिए गए 100 मिलीग्राम / एमएल एंडोथियापेप्सिन का उपयोग करके 1.5 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में 100 μL प्रोटीन जोड़ें।
        3. पिपेट टिप के साथ 1: 1 अनुपात में प्रोटीन समाधान के साथ क्रिस्टलीकरण बफर को अच्छी तरह से मिलाएं। ट्यूब को 24 घंटे के लिए 20 डिग्री सेल्सियस पर उच्च आंदोलन के साथ एक रिवॉल्वर / घूर्णन में रखें ताकि 50 μm क्रिस्टल बढ़ सकें।
        4. 50 μm क्रिस्टल घोल में 10-15 1 मिमी ग्लास मोती जोड़ें।
        5. भंवर सेंट्रीफ्यूज ट्यूब जिसमें 30 सेकंड के लिए 1000 आरपीएम पर घोल और मोती होते हैं।
        6. सेंट्रीफ्यूज ट्यूब को 30 सेकंड के लिए बर्फ पर लौटाएं।
        7. चरण 3.2.4.1.5 और 3.2.4.1.6 को 10 और बार दोहराएँ।
        8. यह अब 1x बीज-स्टॉक का 200 μL है। 1.8 एमएल क्रिस्टलीकरण बफर के अतिरिक्त बीज-स्टॉक 10 x को पतला करें। 50 μL बैचों में 10x बीज-स्टॉक को एलिकोट करें और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
      2. सीड-बैच प्रोटोकॉल।
        1. क्रिस्टलीकरण बफर तैयार करें: 0.1 एम ट्रिस-एचसीएल पीएच 7.0, 0.15 एम एमजीसीएल2, और 40% (डब्ल्यू / वी) पीईजी 6,000।
        2. एक सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में, 100 μL क्रिस्टलीकरण बफर को 50 μL ताजा डीफ्रॉस्ट किए गए 10x बीज-स्टॉक के साथ मिलाएं।
        3. ताजा डीफ्रॉस्टकिए गए 100 मिलीग्राम / एमएल एंडोथियापेप्सिन का उपयोग करके 1.5 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में 150 μL प्रोटीन जोड़ें।
        4. क्रिस्टलीकरण बफर/बीज मिश्रण को एंडोथियापेप्सिन घोल के साथ पिपेट टिप के साथ अच्छी तरह मिलाएं और ट्यूब को 20 डिग्री सेल्सियस पर उच्च आंदोलन के साथ रिवॉल्वर/रोटेटर में रखें।
        5. नियमित 2.5 μL एलिकोट लेकर क्रिस्टलीकरण की निगरानी करें और एक हेमोसाइटोमीटर में क्रिस्टल देखें। Xn और Xs श्रेणी रिकॉर्ड करें।
        6. लगभग 80 मिनट के बाद, जब क्रिस्टल 15 μm के Xs तक पहुंच जाते हैं, तो 0.05 M Na एसीटेट pH 4.6, 0.05 M Tris-HCl pH 7.0, 0.075 M MgCl2, और 20% (w/v) PEG 6,000 (एंडोथियापेप्सिन बफर और क्रिस्टलीकरण बफर से बना एक समाधान, मिश्रित 1: 1) के 150 μL को जोड़कर प्रतिक्रिया को बुझाएं।
        7. क्रिस्टल को 20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
      3. क्या प्रोटोकॉल ने इच्छित प्रयोग के लिए एक स्वीकार्य क्रिस्टल आकार सीमा और संख्या का उत्पादन किया है? हाँ - DONE- नहीं - चरण 3.1 पर लौटें। और एक वैकल्पिक स्केलिंग विकल्प का प्रयास करें। उदाहरण के लिए, एक अलग प्रोटीन: प्रीसिपेटेंट अनुपात संभव हो सकता है या बीज जोड़ना यदि यह पहले नहीं किया गया था। जब ये सभी समाप्त हो जाते हैं, तो चरण 1 पर एक नई स्थिति ढूंढना आवश्यक हो सकता है।

Representative Results

क्रिस्टल आकृति विज्ञान का अनुकूलन।
चरण 1, क्रिस्टल आकृति विज्ञान का अनुकूलन, पाठक को इसके महत्व की याद दिलाने के लिए शामिल किया गया है। खराब विवर्तन सुई-गेंदों से सही माइक्रो-क्रिस्टल बनाना संभव हो सकता है; हालांकि, लेखक सुझाव देंगे कि दोनों को अलग-अलग अनुकूलित करना बेहतर है। सबसे पहले, ऐसी स्थितियों का पता लगाएं जो वाष्प प्रसार के माध्यम से अच्छी तरह से अलग करने वाले, एकल क्रिस्टल को जन्म देते हैं, और फिर इन स्थितियों को दो चरणों को एक साथ गठबंधन करने की कोशिश करने के बजाय बैच में परिवर्तित करते हैं। इस स्तर पर, अत्यधिक न्यूक्लिटिंग स्थितियों की खोज आवश्यक नहीं है; आकृति विज्ञान और विवर्तन गुणवत्ता प्रमुख लक्ष्य हैं।

एंडोथियापेप्सिन के सूक्ष्म-क्रिस्टलीकरण की शुरुआत करने से पहले, पीडीबी से जमा संरचना क्रिस्टलीकरण स्थितियों का विश्लेषण किया गया था। क्रिस्टलीकरण की स्थिति और अनुमानित प्रोटोकॉल एंथोथियापेप्सिन के 48 जमावों में से 47 के लिए प्राप्त किए जा सकते हैं। ये सभी मोटे तौर पर मोव्स और बन्न (1970)46 द्वारा आयोजित एंडोथियापेप्सिन के पहले क्रिस्टलीकरण पर आधारित थे। इन स्थितियों और उनके 'शास्त्रीय' मूल की समानता को देखते हुए, क्रिस्टलीकरण स्थितियों की एक विस्तृत विविधता का पता लगाने के लिए एक 96-अच्छी तरह से, वाष्प प्रसार, विरल-मैट्रिक्स स्क्रीन का प्रदर्शन किया गया था। एंडोथियापेप्सिन को 70 मिलीग्राम / एमएल तक केंद्रित किया गया था और एक पैक्ट विरल-मैट्रिक्स स्क्रीन47 को 20 डिग्री सेल्सियस पर 96-अच्छी तरह से बैठने वाली ड्रॉप प्लेट में 100 एनएल प्रोटीन के साथ 100 एनएल अच्छी तरह से मिश्रण किया गया था। 36 घंटे के बाद इस प्रयोग से हर स्थिति ने क्रिस्टल को जन्म दिया। हालांकि, क्रिस्टल आकृति विज्ञान के विश्लेषण ने संकेत दिया कि कुछ स्थितियां सूक्ष्म-क्रिस्टलीकरण अनुकूलन के लिए बेहतर साबित हो सकती हैं।

चित्रा 4 ए पैक्ट स्क्रीन से एक बूंद दिखाता है जो मोटे तौर पर प्लेट के बहुमत में देखे गए लोगों का प्रतिनिधि था। पहली नज़र में, यह सोचना लुभावना हो सकता है कि ये क्रिस्टल सूक्ष्म-क्रिस्टलीकरण के लिए आगे अनुकूलन के लायक हो सकते हैं। क्रिस्टल बड़े होते हैं और महत्वपूर्ण न्यूक्लियेशन प्रतीत होता है। हालांकि, समग्र क्रिस्टल आकृति विज्ञान आदर्श नहीं है। सबसे पहले, क्रिस्टल निर्विवाद रूप से सिंगलटन नहीं हैं क्योंकि ऐसा प्रतीत होता है कि एकल न्यूक्लियेशन बिंदुओं से कई क्रिस्टल बढ़ रहे हैं। दूसरे, क्रिस्टल का आकार अत्यधिक असममित होता है जिसमें विकास मुख्य रूप से एक अक्ष के नीचे होता है। एक्स-रे बीम में वितरित होने पर ऐसे क्रिस्टल सैद्धांतिक रूप से अधिमान्य रूप से संरेखित होने की अधिक संभावना रखते हैं। दोनों विशेषताएं सीरियल क्रिस्टलोग्राफिक डेटा के संग्रह और प्रसंस्करण के दौरान समस्याएं पेश करती हैं।

चित्रा 4 बी, हालांकि, एमजीसीएल2 की उपस्थिति में उगाए गए एंडोथियापेप्सिन क्रिस्टल को दर्शाता है। यह आकृति विज्ञान उन सभी स्थितियों में सुसंगत था जिनमें एमजीसीएल 2 शामिल था और इसलिए सुझाव दिया कि उनकी आकृति विज्ञान एमजीसीएल2 के कारण था। एमजीसीएल2 स्थितियों ने एकल, अधिक बॉक्स जैसे क्रिस्टल का उत्पादन किया जो अंतिम धारावाहिक प्रयोगों के लिए बेहतर लक्ष्य का प्रतिनिधित्व करते थे।

पैक्ट स्क्रीन के भीतर चार स्थितियां थीं जिनमें एमजीसीएल2 शामिल था। एंडोथियापेप्सिन क्रिस्टलीकरण पर इन स्थितियों के सभी विभिन्न घटकों के प्रभाव को बेहतर ढंग से समझने के लिए, एक यादृच्छिक अनुकूलन किया गया था। एक स्क्रीन बनाई गई थी जिसमें सांद्रता और पीएच की एक सीमा पर बफर और प्रीसिपेंट्स का एक यादृच्छिक संयोजन था। एमजीसीएल2 एकाग्रता भी विविध थी और फिर परिणामी बूंदों को उनके दृश्य क्रिस्टल गुणवत्ता और वर्षा स्तर के संदर्भ में मनमाने ढंग से 0-5 (0 कोई क्रिस्टल या वर्षा नहीं) से वर्गीकृत किया गया था।

चित्रा 5 ए वर्षा स्तर और क्रिस्टल की गुणवत्ता, और स्क्रीन चर के बीच पियरसन के सहसंबंध विश्लेषण से परिणामों का एक हीटमैप दिखाता है (इस प्रयोग से बूंदों के उदाहरण चित्रा 5 बी, सी और डी में दिखाए गए हैं)। परिणामों ने संकेत दिया कि समाधान का पीएच वर्षा के स्तर से अत्यधिक सहसंबद्ध था, क्षारीय बफर के परिणामस्वरूप अधिक वर्षा हुई। एमजीसीएल2 एकाग्रता को वर्षा के स्तर से थोड़ा सहसंबद्ध किया गया था, जैसा कि क्रिस्टल की गुणवत्ता के लिए पीएच और प्रीसिपेटेंट एकाग्रता थी।

इन परिणामों के आधार पर, 0.1 एम ट्रिस-एचसीएल पीएच 7.0, 0.15 एम एमजीसीएल2, 20% (डब्ल्यू / वी) पीईजी 6,000 में उगाए गए क्रिस्टल को प्रोटोकॉल के अगले चरण में ले जाने का निर्णय लिया गया - बैच में संक्रमण। क्रिस्टल की आकृति विज्ञान स्वीकार्य था और इन क्रिस्टल से एक्स-रे विवर्तन और डेटा गुणवत्ता मैट्रिक्स के विश्लेषण ने सुझाव दिया कि एमजी2 + (चित्रा 9) की उपस्थिति में और बाहर उगाए गए क्रिस्टल के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं था।

बैच में परिवर्तन
कई सीरियल क्रिस्टलोग्राफी माइक्रो-क्रिस्टलाइजेशन ऑप्टिमाइज़ेशन के लिए, चरण 2 प्रारंभिक बिंदु होगा। रुचि के प्रोटीन को पहले से ही क्रायो-क्रिस्टलोग्राफी के लिए क्रिस्टलीकृत किया गया होगा और क्रिस्टलीकरण प्रोटोकॉल को अब माइक्रो-क्रिस्टल स्लरी बनाने के लिए बदलने की आवश्यकता होगी। इस प्रोटोकॉल ने बैच में परिवर्तन करने के लिए केवल 96-अच्छी तरह से वाष्प प्रसार प्लेटों का उपयोग किया है क्योंकि वाष्प प्रसार 95% पीडीबी प्रविष्टियों26 द्वारा उपयोग की जाने वाली क्रिस्टलीकरण विधि है। प्रोटोकॉल ने माइक्रोबैच34,35,37 में जाने से परहेज किया है क्योंकि यह संक्रमण अभी भी एक समान अनुकूलन कर सकता है। यह कहना नहीं है कि यह प्रोटोकॉल केवल वाष्प प्रसार प्लेटों में किया जा सकता है। प्रस्तुत सभी चरण, माइक्रोबैच में भी काम करेंगे यदि यह मूल क्रिस्टलीकरण विधि थी।

चुनी हुई स्थिति में एंडोथियापेप्सिन के क्रिस्टलीकरण का आकलन करने के लिए, एक मोर्फोग्राम - या एक मोटा चरण आरेख - बनाया गया था। मोर्फोग्राम प्रयोग का उद्देश्य तीन गुना है। सबसे पहले, चरण 3 - स्केलिंग में स्केलिंग मार्गों का आकलन करते समय मोर्फोग्राम का विश्लेषण बहुत उपयोगी है। दूसरे, मोर्फोग्राम एक अनुकूलन उपकरण के रूप में कार्य करता है, जो वाष्प प्रसार स्थितियों की खोज करने में मदद करता है जो बैच के माध्यम से क्रिस्टल को जन्म देते हैं [यानी, तेजी से दिखाई देने वाले क्रिस्टल (< 24 घंटे)]। तीसरा, यदि क्रिस्टल तेजी से दिखाई नहीं देते हैं, तो बीज की बूंदों का विश्लेषण क्रिस्टलोग्राफर को चरण आरेख पर वर्तमान स्थिति के अनुमानित स्थान का अंदाजा दे सकता है। उदाहरण के लिए, यदि बीज की स्थिति क्रिस्टल देती है लेकिन बिना बीज वाले नहीं देते हैं, तो उन स्थितियों के मेटास्टेबल क्षेत्र में होने की संभावना है।

एंडोथियापेप्सिन का मोर्फोग्राम प्रयोग 0.1 एम ट्रिस-एचसीएल पीएच 7.0, 0.15 एम एमजीसीएल2, 20% (डब्ल्यू / वी) पीईजी 6,000 स्थिति के आधार पर किया गया था। प्रोटीन और पीईजी सांद्रता क्रमशः 100 से 12.5 मिलीग्राम / एमएल और 5 से 40% (डब्ल्यू / वी) से भिन्न थी। बूंदों का विश्लेषण किया गया और प्रदान किए गए वर्कशीट (चित्रा 6 ए) का उपयोग करके परिणाम प्लॉट किए गए।

यह पहले से ही अनुकूलन क्रिस्टल आकृति विज्ञान चरण से स्पष्ट था कि इस स्थिति में एंडोथियापेप्सिन क्रिस्टल वृद्धि, और इन प्रोटीन सांद्रता में, 24 घंटे से कम समय में उगाए गए क्रिस्टल होंगे। इसने संकेत दिया कि क्रिस्टलीकरण वाष्प प्रसार संचालित प्रक्रिया के बजाय एक बैच के माध्यम से हो रहा था। इसलिए, इन स्थितियों में उगाए गए क्रिस्टल बड़ी मात्रा में स्केलिंग के लिए उपयुक्त थे।

यदि 24 घंटे के बाद बिना बीज वाली बूंदों में क्रिस्टल दिखाई नहीं देते हैं, तो यह संभावना है कि क्रिस्टलीकरण अभी भी एक संक्रमण (चित्रा 1 बी) पर निर्भर था और इसलिए, बैच नहीं। इस मामले में, मोर्फोग्राम प्रयोग के परिणाम अभी भी रुचि के हैं। वे चरण आरेख पर क्रिस्टलीकरण के लिए संभावित प्रारंभिक बिंदु का संकेत देते हैं और इसलिए, बाद के अनुकूलन को कैसे आगे बढ़ना चाहिए। बीज की बूंदों को देखो। बीज न्यूक्लियेशन की परवाह किए बिना मेटास्टेबल क्षेत्र में क्रिस्टल विकास की अनुमति देगा। उदाहरण के लिए, यदि बीज की बूंदों में 24 घंटे के भीतर क्रिस्टल दिखाई देते हैं, लेकिन बिना बीज वाली बूंदों में नहीं, तो यह इंगित करता है कि मेटास्टेबल क्षेत्र का हिस्सा देखा जा सकता है। यदि बीज या बिना बीज वाली बूंदों में कोई क्रिस्टल नहीं देखा जाता है, तो सभी कुएं असंतृप्त रहते हैं।

स्केलिंग
मोर्फोग्राम (चित्रा 6 ए) को देखते हुए, कई अवलोकन किए जा सकते हैं। न्यूक्लियेशन की मात्रा प्रोटीन और प्रीसिपेटेंट सांद्रता दोनों से प्रभावित होती है। बूंदों का एक बहुत ही स्पष्ट सीमांकन भी था जो प्रोटीन वर्षा का कारण बनता है, जिसमें बूंदों में या तो शामिल होते हैं: कुछ भी नहीं, क्रिस्टल या अवक्षेप (चित्रा 6 बी)। बीज के बिना बूंदों की तुलना में बीज (चित्रा 6 डी) के अतिरिक्त भी एक्सएन में बहुत वृद्धि हुई (चित्रा 6 सी)। इन सभी परिणामों को एक साथ लेते हुए, एक बैच और सीड-बैच प्रोटोकॉल दोनों को 30% (डब्ल्यू / वी) पीईजी 6,000 और 100 मिलीग्राम / एमएल एंडोथियापेप्सिन पर स्केल करने का प्रयास करने का निर्णय लिया गया।

प्रारंभिक परीक्षण स्केलिंग 24-अच्छी तरह से लटकने वाली ड्रॉप प्लेटों में की गई थी। ड्रॉप वॉल्यूम को धीरे-धीरे बढ़ाया गया ताकि क्रिस्टलीकरण व्यवहार में कोई बदलाव देखा जा सके (चित्रा 7)। जैसा कि देखा जा सकता है, बिना बीज वाली और बीज वाली बूंदों दोनों में क्रिस्टल वृद्धि हुई है। सभी बिना बीज वाली बूंदों ने क्रिस्टल आकार की एक श्रृंखला विकसित की, लेकिन मुख्य रूप से बड़े क्रिस्टल (100-200 μm - सबसे लंबा आयाम)। हालांकि, बीज की बूंदों ने छोटे क्रिस्टल (5 - 50 μm - सबसे लंबा आयाम) का उत्पादन किया। इन प्रारंभिक परीक्षणों ने सुझाव दिया कि एक्सएस को कम करने के लिए बीज की आवश्यकता होगी, लेकिन यह भी, यह स्थिति बड़ी मात्रा के लिए उपयुक्त होनी चाहिए।

जब मात्रा 200 μL में बढ़ गई थी, तो क्रिस्टल विकास के दौरान क्रिस्टलीकरण की मात्रा लगातार उत्तेजित थी। इस आंदोलन का मुख्य कारण यह सुनिश्चित करना था कि क्रिस्टलीकरण समाधान समरूप रहता है और बढ़ते क्रिस्टल ट्यूबों के तल या किनारों पर नहीं बसते हैं। क्रिस्टल के निपटान से बहुत बड़े और छोटे क्रिस्टल दोनों के साथ एक हेटरोजेनस क्रिस्टल आबादी हो सकती है। क्रिस्टलीकरण समाधान को उत्तेजित करना भी न्यूक्लियेशन44,45 को बढ़ावा दे सकता है।

दुर्भाग्य से, बिना बीज वाले 30% (डब्ल्यू / वी) पीईजी 6,000 ने कोई क्रिस्टल का उत्पादन नहीं किया, इसलिए पीईजी एकाग्रता को 35% (डब्ल्यू / वी) तक बढ़ा दिया गया था। इस वृद्धि ने क्रिस्टलीकरण में स्पष्ट रूप से सुधार किया, जिसमें अंतिम एक्सएन और एक्सएस रेंज क्रमशः 3.6 ± 1.2 x 106 क्रिस्टल-एमएल -1 और 42 ± 4.1 μm थी (चित्रा 8 ए और बी - काला)। हालांकि एक महत्वपूर्ण सुधार और एक स्वीकार्य क्रिस्टल एकाग्रता, अंतिम क्रिस्टल नियोजित प्रयोग के लिए बहुत बड़े थे, इसलिए आगे के अनुकूलन किए गए थे। अंतिम क्रिस्टल के आकार को कम करने के लिए दो रास्तों का पता लगाया गया (चित्रा 1 ई): अंतिम क्रिस्टल विकास (चित्रा 8 ए और बी - गर्म गुलाबी) को सीमित करने के लिए प्रोटीन एकाग्रता को कम करना, और न्यूक्लियेशन को बढ़ाने की कोशिश करने के लिए पीईजी एकाग्रता में वृद्धि (चित्रा 8 ए और बी - हरा)।

दुर्भाग्य से प्रोटीन एकाग्रता में कमी ने एक्सएन को नाटकीय रूप से कम कर दिया, जिसने अंततः बड़े क्रिस्टल का उत्पादन किया। पीईजी एकाग्रता को 40% तक बढ़ाने से क्रमशः 3.1 ± 0.7 x 106 क्रिस्टल-एमएल -1 और 39 ± 2.3 μm की अंतिम Xn और X एस रेंज प्राप्त हुई। ये 35% से काफी अलग नहीं थे, लेकिन चूंकि अंतिम क्रिस्टल आकार कम हो गया था, इसलिए इस स्थिति को आगे के अनुकूलन के साथ जारी रखा गया था।

एक्सएन को बढ़ाने के लिए, बीज जोड़े गए थे। इसने नाटकीय रूप से एक्सएन (1.1 ± 1.8 x 10 8 क्रिस्टल-एमएल -1) में वृद्धि की और एक छोटे एक्सएस (4.2 ± 4.0 μm) (चित्रा 8 ए और बी - डैश्ड बैंगनी) को जन्म दिया। ये क्रिस्टल, हालांकि कुछ सीरियल क्रिस्टलोग्राफी प्रयोगों के लिए बहुत उपयुक्त थे, उन्हें बहुत छोटा माना जाता था इसलिए अतिरिक्त बीजों की एकाग्रता बदल दी गई थी।

हालांकि, अतिरिक्त बीज स्टॉक की यह ट्यूनिंग विश्वसनीय रूप से दोहराना मुश्किल साबित हुआ; इसलिए, शमन का प्रयास किया गया था। एक बीज स्टॉक को जोड़ने के बाद, क्रिस्टल के आकार की निगरानी की गई और एक बार एक उपयुक्त क्रिस्टल आकार (लगभग 10 - 20 μm) प्राप्त होने के बाद, बैच क्रिस्टलीकरण बुझाया गया (चित्रा 8 सी और डी)। कुपिट्ज़ एट अल (2014)25 में सूक्ष्म-क्रिस्टलीकरण के संबंध में शमन प्रस्तावित किया गया था। हालांकि शायद एक आदर्श विधि नहीं है, क्योंकि प्रोटीन समाधान अंततः बर्बाद हो जाएगा26, तकनीक इस स्थिति में बहुत उपयोगी थी क्योंकि क्रिस्टल विकास को नियंत्रित करना मुश्किल था। शमन के पीछे विचार क्रिस्टलीकरण मिश्रण को तेजी से घुलनशीलता रेखा (चित्रा 1 एफ) के ठीक ऊपर एक बिंदु पर वापस करना है। एक बार जब समाधान घुलनशीलता रेखा पर वापस आ जाता है, तो समाधान एक स्थिर संतृप्त समाधान में लौट आया है और आगे कोई क्रिस्टल वृद्धि नहीं होगी।

क्रिस्टलीकरण प्रतिक्रिया को बुझाने का प्रयास जोखिम के बिना नहीं है। यदि बहुत अच्छा शमन समाधान जोड़ा जाता है, तो समाधान में प्रोटीन इतना पतला हो सकता है कि घुलनशीलता रेखा पारित हो जाए। इस मामले में, समाधान अंडरसैचुरेटेड हो जाएगा और क्रिस्टल घुलने लगेंगे। इसे रोकने के लिए, मोर्फोग्राम परिणामों के आधार पर आवश्यक शमन समाधान की मात्रा का अनुमान लगाना संभव है। शमन के बिंदु पर, प्रोटीन समाधान की एकाग्रता लें। घुलनशीलता लाइन पर प्रोटीन एकाग्रता और समाधान में प्रोटीन एकाग्रता की तुलना करके, आवश्यक कमजोर पड़ने का अनुमान लगाया जा सकता है।

40% (डब्ल्यू / वी) पीईजी 6,000, 10 एक्स पतला बीज प्रयोग के बुझाए गए संस्करण ने क्रमशः 2.6 ± 3.1 x 106 क्रिस्टल-एमएल -1 और 15 ± 3.9 μm की अंतिम क्रिस्टल एकाग्रता और आकार सीमा दी।

पूरी प्रक्रिया के दौरान, एंडोथियापेप्सिन क्रिस्टल के परीक्षण एक्स-रे डेटा संग्रह स्विस लाइट सोर्स PXII बीमलाइन पर 10 x 30 μm फ़ोकस का उपयोग करके एकत्र किए गए थे, 12.4 केवी की ऊर्जा 80% तक क्षीण हो गई थी, और क्रायो-स्थितियों के तहत। डेटा को डायल का उपयोग करके संसाधित किया गया था और चित्रा 9 सीसी1/2 की तुलना दिखाता है। अनुकूलन के दौरान सीसी1/2 में कोई नाटकीय परिवर्तन नहीं देखा गया था।

Figure 1
चित्रा 1: संक्रमण और बैच क्रिस्टलीकरण का अवलोकन, और स्केलिंग विधियों को एक चरण आरेख पर मैप किया गया। पुरातन प्रोटीन क्रिस्टलीकरण चरण आरेख के क्षेत्र और सीमाएं। प्रीसिपेटेंट और प्रोटीन सांद्रता को क्रमशः एक्स और वाई अक्षों पर प्लॉट किया जाता है, जिसमें मूल में शुद्ध जल बिंदु होता है। बैंगनी रेखा प्रोटीन की देखरेख सीमा को इंगित करती है, और मेटास्टेबल, न्यूक्लियेशन और वर्षा क्षेत्र क्रमशः नीले, हरे और गुलाबी रंग में दिखाए जाते हैं। बी। 'संक्रमण चरण' क्रिस्टलीकरण विधि की न्यूक्लियेशन ज़ोन प्रवेश सीमाओं का एक उदाहरण, जैसे वाष्प प्रसार। इस सैद्धांतिक प्रयोग में, ड्रॉप प्रीसिपेटेंट और प्रोटीन सांद्रता घुलनशीलता रेखा के ठीक नीचे शुरू होती है - अभी तक सुपरसैचुरेटेड नहीं। जबकि ड्रॉप समतुल्य होता है, ड्रॉप घटक सांद्रता इस तरह बढ़ जाती है कि बूंद सुपरसैचुरेटेड हो जाती है, और न्यूक्लियेशन ज़ोन में स्थानांतरित या संक्रमण जारी रखती है। क्रिस्टल न्यूक्लियेशन पर, समाधान में प्रोटीन एकाग्रता गिरना शुरू हो जाती है। एकाग्रता गिरती रहती है क्योंकि क्रिस्टल बढ़ते हैं जब तक कि अंततः घुलनशीलता रेखा पर रुक नहीं जाता। नीली बिंदीदार रेखा न्यूक्लियेशन क्षेत्र में संक्रमण की एक सैद्धांतिक सीमा को चिह्नित करती है। जैसे ही न्यूक्लियेशन शुरू होता है, प्रोटीन एकाग्रता गिर जाएगी, जिससे आगे प्रवेश को रोका जा सकेगा। सी। उदाहरण बैच और बीज-बैच क्रिस्टलीकरण प्रक्षेपवक्र। बैच में, प्रोटीन और प्रीसिपेटेंट के मिश्रण को न्यूक्लियेशन ज़ोन के भीतर एक सुपरसैचुरेटेड समाधान बनाना चाहिए ताकि क्रिस्टल विकास हो सके। बीज-बैच में, सूक्ष्म बीजों के अतिरिक्त के कारण न्यूक्लियेशन क्षेत्र में होना सख्ती से आवश्यक नहीं है, इसलिए मेटास्टेबल क्षेत्र में स्थानों का भी पता लगाया जा सकता है। डी। वाष्प प्रसार से बैच तक बी में दिखाए गए क्रिस्टलीकरण प्रयोग का एक काल्पनिक अनुकूलन। मूल वाष्प प्रसार प्रारंभिक बिंदु परिणामी अनुकूलन वेक्टर के माध्यम से , नई शुरुआत की स्थिति में बदल गया है; न्यूक्लियेशन क्षेत्र के अंदर। परिणामी वेक्टर दो अनुकूलन का उत्पाद है: प्रोटीन और प्रीसिपेटेंट सांद्रता दोनों में वृद्धि। ई। अंतिम Xn और X s को अनुकूलित करने के लिए बैच स्थितियों को स्केल करतेसमय उदाहरण अनुकूलन. एफ। क्रिस्टलीकरण बफर के अतिरिक्त क्रिस्टलीकरण प्रयोग को बुझाना। यह आवश्यक है कि शमन प्रोटीन एकाग्रता को मेटास्टेबल क्षेत्र से बाहर नहीं ले जाता है और इसलिए, प्रोटीन की देखरेख के बिंदु से नीचे है। अन्यथा, क्रिस्टल वापस घोल में घुलना शुरू कर देंगे। बी। और सी को लेखकों की अनुमति से बील एट अल (2019)26 से अनुकूलित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: Xn का बढ़ना और Xs का घटना। क्रिस्टलीकरण प्रयोग से उत्पादित क्रिस्टल की संख्या और उनके औसत सबसे लंबे आयाम के बीच आदर्श संबंध। इस ग्राफ को बनाने के लिए, एक काल्पनिक 10 केडीए मॉडल प्रोटीन के क्रिस्टलीकरण का उपयोग किया गया था। प्रोटीन 10 मिलीग्राम / एमएल की एकाग्रता पर क्रिस्टलीकृत हुआ और 49x50x51 A के आयामों के साथ P2 1 2 1 21क्रिस्टल उत्पन्न किया। प्रत्येक न्यूक्लियेशन घटना को एक क्रिस्टल उत्पन्न करने के लिए माना जाता था। क्रिस्टल विकास को हर चेहरे से सजातीय माना जाता था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: एक प्रवाह-चार्ट जो एक छोटी मात्रा (<500 एनएल), वाष्प प्रसार प्रयोग में उगाए गए क्रिस्टल को बड़े मात्रा (> 100 μL) बैच प्रयोग में अनुकूलित करने के चरणों को दर्शाता है। क्रिस्टल अनुकूलन को तीन चरणों में विभाजित किया गया है: (1) क्रिस्टल आकृति विज्ञान का अनुकूलन। (2) बैच में संक्रमण। (3) स्केलिंग। चरण 1 में सूक्ष्म-क्रिस्टलीकरण के लिए उपयुक्त क्रिस्टल की पहचान करना महत्वपूर्ण है। कुछ प्रोटीन क्रिस्टलीकरण की स्थिति की परवाह किए बिना केवल एक एकल क्रिस्टल आकृति विज्ञान में मौजूद होते हैं। हालांकि, यह उन स्थितियों की तलाश करने लायक है जो एकल, क्यूब जैसे क्रिस्टल को जन्म देते हैं, या मानवीय रूप से जितना संभव हो सके इनके करीब हैं। एकल, घन जैसे क्रिस्टल, काल्पनिक और उपाख्यानात्मक रूप से, आम तौर पर सीरियल क्रिस्टलोग्राफी प्रयोगों से बेहतर परिणामों को जन्म देंगे। एक बार जब एक क्रिस्टल आकृति विज्ञान का चयन किया जाता है और विवर्तन की पुष्टि की जाती है, तो क्रिस्टलीकरण प्रयोग को वाष्प प्रसार से बैच (चरण 2) में स्थानांतरित करना आवश्यक होता है। यहां, क्रिस्टल को उनके न्यूक्लियेशन समय द्वारा अनुकूलित किया जाना चाहिए। लक्ष्य उन स्थितियों को ढूंढना है जो तेजी से दिखाई देने वाले क्रिस्टल (> 24 घंटे) उत्पन्न करते हैं क्योंकि इन स्थितियों के तुरंत न्यूक्लियेशन क्षेत्र से टकराने की संभावना है, और इसलिए बैच हैं। एक बार न्यूक्लियेशन ज़ोन में एक स्थिति पाए जाने के बाद, एक मोर्फोग्राम बनाया जा सकता है। मोर्फोग्राम न्यूक्लियेशन ज़ोन के बहुमत को मैप करने और स्टेज 3 के लिए पहचाने जाने वाले संभावित स्केलिंग मार्गों की अनुमति देता है। एक पहचाने गए बैच की स्थिति की मात्रा को तब >100 μL की अंतिम मात्रा प्राप्त करने के लिए आकार में धीरे-धीरे या तेजी से बढ़ाया जा सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: पैक्ट विरल-मैट्रिक्स स्क्रीन से एंडोथियापेप्सिन क्रिस्टलीकरण स्थितियों का विश्लेषण। A और B क्रमशः PACT स्क्रीन से कुओं A4 और C10 के 24 घंटे के बाद की तस्वीरें हैं। क्रिस्टलीकरण बफर घटकों को आंकड़े पर हाइलाइट किया गया है। एसपीजी बफर सक्सिनिक एसिड, सोडियम डाइहाइड्रोजन फॉस्फेट और ग्लाइसिन है जो 2: 7: 7 मोलर अनुपात में मिश्रित है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: पैक्ट एमजीसीएल2 स्थितियों से एंडोथियापेप्सिन क्रिस्टलीकरण अनुकूलन का विश्लेषण। बफर पीएच, एमजीसीएल2 एकाग्रता, और प्रीसिपेटेंट एकाग्रता और वर्षा स्तर और क्रिस्टल गुणवत्ता के बीच पियर्सन के सहसंबंध विश्लेषण से परिणामों का एक गर्मी मानचित्र। वर्षा स्तर और क्रिस्टल की गुणवत्ता दोनों का मूल्यांकन मनमाने ढंग से 0-5 के पैमाने पर किया गया था (0 कोई क्रिस्टल या वर्षा नहीं है) 24 घंटे बी.सी. और डी तीन अलग-अलग बूंदों में क्रिस्टलीकरण और वर्षा के उदाहरण दिखाते हैं। क्रिस्टलीकरण की स्थिति और वर्षा स्तर और क्रिस्टल गुणवत्ता के आकलन भी दिखाए गए हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्र 6: एक एंडोथियापेप्सिन मोर्फोग्राम जब 0.1 एम ट्रिस-एचसीएल पीएच 7.0, 0.15 एम एमजीसीएल2 और पीईजी 6,000 में क्रिस्टलीकृत होता है। "चरण-आरेख-जनरेटर" स्प्रेडशीट से बनाया गया एक मोर्फोग्राम। प्रत्येक बूंद में क्रिस्टल की सापेक्ष संख्या को वृत्तों के आकार से दर्शाया जाता है, और ड्रॉप 1 (प्रोटीन और प्रीसिपेटेंट) और ड्रॉप 2 (प्रोटीन, प्रीसिपेटेंट और बीज) के परिणामों को क्रमशः हरे और नीले रंग में हाइलाइट किया जाता है। क्रमशः x और y अक्ष पर प्रोटीन और प्रीसिपेटेंट सांद्रता के मान, अंतिम मात्रा के बजाय प्रत्येक के पूर्व-मिश्रित मूल्यों को दर्शाते हैं। परिणामों के आधार पर, क्रमशः न्यूक्लियेशन ज़ोन और मेटास्टेबल ज़ोन की सीमाओं को दिखाने के लिए काली रेखाएं और एक बैंगनी रेखा खींची गई है। बी.सी. और डी प्रयोग से कुछ उदाहरण परिणाम दिखाएं। A पर चिह्नित लाल और नीले बिंदु B. और C के स्थानों को दर्शाते हैं। और डी, क्रमशः। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 7
चित्रा 7: 24-अच्छी तरह से लटकने वाली ड्रॉप प्लेटों में एंडोथियापेप्सिन के प्रारंभिक स्केलिंग परीक्षण। सभी ट्रेल्स के लिए एक ही प्रोटीन और प्रीसिपेटेंट सांद्रता का उपयोग किया गया था: 0.1 एम एनए एसीटेट पीएच 4.6 और 0.1 एम ट्रिस-एचसीएल पीएच 7.0, 0.15 एम एमजीसीएल2, और 30% (डब्ल्यू / वी) पीईजी 6,000 में क्रमशः 100 मिलीग्राम / एमएल एंडोथियापेप्सिन। सभी प्रदर्शित छवियों को 24 घंटे के बाद लिया गया था और प्रत्येक छवि पर अंतिम ड्रॉप वॉल्यूम लेबल किए गए हैं। बाएं पैनल (ए, डी, और जी) प्रोटीन और प्रीसिपेटेंट का 1: 1 मिश्रण हैं, मध्य पैनल (बी, ई, और एच) बीज, प्रीसिपेटेंट और प्रोटीन का 1: 2: 3 मिश्रण है और दाएं पैनल (सी, एफ, और आई) मध्य पैनल की आवर्धित छवियां हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 8
चित्रा 8: 200-300 μL वॉल्यूम में एंडोथियापेप्सिन माइक्रो-क्रिस्टलीकरण का विश्लेषण। A और C. दिखाते हैं कि प्रयोग के समय Xn कैसे बदल गया। बी। और डी. दिखाएं कि समय के साथ एक्सएस (सबसे लंबा आयाम) कैसे बदल गया। प्रयोगों के परिणामों को स्पष्टता के लिए अलग किया गया है। C और D पर लाल बिंदीदार रेखा उस बिंदु को दर्शाती है जिस पर शमन किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 9
चित्रा 9: सीसी1/2 परिणाम और विवर्तन गुणवत्ता का आकलन करने के लिए सूक्ष्म-क्रिस्टलीकरण प्रक्रिया के प्रत्येक चरण में प्राप्त क्रिस्टल की छवियां। सीसी 1/2 ने विकसित क्रिस्टल से एकत्र किए गए डेटा से रिज़ॉल्यूशन के खिलाफ प्लॉट किया: एमजी के साथ और बिना - स्टेज 1 अनुकूलन का हिस्सा, 200 एनएल वॉल्यूम, 10 μL वॉल्यूम और अंतिम 300 μL वॉल्यूम में। B.C. और D. क्रमशः 200 nL, 10 μL और 300 μL आयतन से क्रिस्टल दिखाते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

प्रोटीन की जानकारी
प्रोटीन एंडोथियापेप्सिन
आणविक भार (केडीए) 33.8
अंतरिक्ष समूह P121 1
a, b, c (A) 45.2, 73.3, 52.7
α, β, ɣ (°) 90.0, 109.2, 90.0
निश्चित-लक्ष्य पैरामीटर
प्रति चिप लोड मात्रा (μL) 150
प्रति चिप के हिसाब से 25,600
आवश्यक क्रिस्टल एकाग्रता (क्रिस्टल / एमएल) 500,000
नमूना जानकारी
प्रोटीन द्रव्यमान 200 μL नमूना (मिलीग्राम) बनाने के लिए उपयोग किया जाता है 10
क्रिस्टल सबसे लंबा आयाम (μm) 15
क्रिस्टल एकाग्रता (क्रिस्टल / एमएल) 2,500,000
प्रायोगिक चर
आवश्यक समय बिंदुओं की संख्या 5
प्रति समय बिंदु पर आवश्यक छवियों की संख्या 50,000
हिट दर (एकीकृत पैटर्न / चित्र एकत्र) 0.3
प्रति समय बिंदु के लिए आवश्यक निश्चित लक्ष्य (गोल किया गया) 7
नमूना आवश्यकताएँ
नमूना मात्रा प्रति समय बिंदु (μL) आवश्यक है 1,050
प्रयोग के लिए आवश्यक कुल नमूना मात्रा (एमएल) 5.25
आवश्यक प्रोटीन का कुल द्रव्यमान (मिलीग्राम) 52.5

तालिका 1: निश्चित लक्ष्यों का उपयोग करके किए गए एक काल्पनिक ऑप्टिकल पंप-जांच प्रयोग के लिए नमूना आवश्यकताओं का एक उदाहरण। इस सैद्धांतिक प्रयोग में इस्तेमाल किया गया प्रोटीन एंडोथियापेप्सिन था। निश्चित-लक्ष्य पैरामीटर इब्राहिम एट अल (2019)48 और डेवी एट अल (2019)49 में रिपोर्ट किए गए प्रयोगों पर आधारित थे। नमूना जानकारी इस वीडियो लेख में रिपोर्ट किए गए प्रोटोकॉल से आई थी और प्रयोगात्मक चर जीवित अनुभव के आधार पर रूढ़िवादी अनुमान थे। निम्नलिखित नमूना आवश्यकताओं की गणना बाद में पिछली मान्यताओं को देखते हुए की गई थी।

Discussion

प्रस्तुत विधि से पता चलता है कि बड़े क्रिस्टल (≥ 100 μm सबसे लंबा आयाम) से एंडोथियापेप्सिन के क्रिस्टलीकरण को कैसे अनुकूलित किया जाए, जो विरल-मैट्रिक्स 96-वेल स्क्रीन में उगाया जाता है, माइक्रो-क्रिस्टल, जो बैच के माध्यम से सेंट्रीफ्यूज ट्यूब (300 μL वॉल्यूम) में उगाया जाता है। प्रोटोकॉल के पीछे विचार यह है कि एंडोथियापेप्सिन को अनुकूलित करने के लिए उठाए गए कदमों का उपयोग अन्य प्रोटीनों के लिए भी किया जा सकता है। अंततः, एक्सएफईएल और सिंक्रोट्रॉन पर सीरियल क्रिस्टलोग्राफी प्रयोगों के लिए माइक्रो-क्रिस्टल (10-20 μm) की बड़ी मात्रा (>100 μL) बनाने की समस्या का जवाब देना।

प्रोटोकॉल बड़ी मात्रा में माइक्रो-क्रिस्टलीकरण के कार्य को तीन चरणों में विभाजित करता है: (1) क्रिस्टल आकृति विज्ञान का अनुकूलन, (2) बैच में संक्रमण, और (3) स्केलिंग। चरण 1 में, क्रिस्टल रूपों की सीमा जो एक प्रोटीन बना सकता है, वाष्प प्रसार प्लेटों में पता लगाया जाना चाहिए। ऐसी स्थितियां जो एकल, बॉक्स जैसे क्रिस्टल को जन्म देती हैं जो आवश्यक संकल्प से अलग होती हैं, लक्ष्य होना चाहिए। चरण 2 में, चयनित स्थितियों को वाष्प प्रसार से बैच में परिवर्तित किया जा सकता है। यहां, अनुकूलन मानदंड क्रिस्टल विकास समय है और उन स्थितियों को ढूंढना है जो 24 घंटे के भीतर प्रोटीन क्रिस्टल को जन्म देते हैं। एक मोर्फोग्राम को भी प्लॉट किया जा सकता है जिससे प्रयोगकर्ता को घुलनशीलता रेखा और न्यूक्लियेशन ज़ोन सीमाओं के स्थान का अंदाजा हो सके। यह मोर्फोग्राम चरण 3, स्केलिंग में बहुत उपयोगी है। मोर्फोग्राम इस बात का संकेत देगा कि क्या न्यूक्लियेशन अकेले एक्सएन को बढ़ा सकता है और एक्स एस को नीचे चलासकता है। जैसा कि प्रयोग की मात्रा में वृद्धि हुई है, एक्सएन और एक्सएस को स्केलिंग सफलता के प्रमुख मानदंडों के रूप में लगातार मूल्यांकन किया जा सकता है।

एंडोथियापेप्सिन के मामले में, चरण 1 ने एंडोथियापेप्सिन के लिए पहले से अज्ञात क्रिस्टल आकृति विज्ञान का पता लगाया। इस आकृति विज्ञान में वही अंतरिक्ष समूह था जो पहले रिपोर्ट किया गया था, लेकिन, महत्वपूर्ण रूप से सीरियल क्रिस्टलोग्राफी के लिए, एक अधिक बॉक्स जैसी आकृति थी। एकल क्रिस्टल भी एकल न्यूक्लियेशन बिंदुओं से बढ़ते प्रतीत होते थे, अन्य स्थितियों से बनाए गए प्रशंसकों के विपरीत (चित्रा 4)। चयनित स्थिति के लिए, चरण 2 पहले से ही आंशिक रूप से संतुष्ट था क्योंकि क्रिस्टल वृद्धि < 24 घंटे में हुई थी। मोर्फोग्राम ने संकेत दिया कि चरण 3 में स्केलिंग करते समय एक सीधे या बीज वाले बैच प्रोटोकॉल दोनों सफल हो सकते हैं। सीधे बैच में प्रारंभिक स्केलिंग ने एक ऐसी स्थिति पैदा की जिसने क्रमशः 3.6 ± 1.2 x 106 क्रिस्टल-एमएल -1 और 42 ± 4.1 μm की Xn और Xs रेंज के साथ क्रिस्टल का उत्पादन किया। ये क्रिस्टल, हालांकि कुछ सीरियल क्रिस्टलोग्राफी प्रयोगों के लिए स्वीकार्य थे, उन्हें बहुत बड़ा माना जाता था। इसलिए अतिरिक्त अनुकूलन किए गए थे। अंतिम प्रोटोकॉल ने क्रमशः 3.1 x 106 क्रिस्टल -1 और 15 ± 3.9 μm की एकाग्रता और आकार सीमा के साथ क्रिस्टल का उत्पादन किया। यह नियोजित प्रयोगों के लिए आदर्श से अधिक था।

विधि वाष्प प्रसार प्लेटों में उगाए गए 'घुलनशील' प्रोटीन क्रिस्टल के बैच में परिवर्तन पर केंद्रित है। इस फोकस का कारण यह है कि घुलनशील प्रोटीन क्रिस्टल का विशाल बहुमत वाष्प प्रसार26 के माध्यम से उगाया जाता है। हालांकि, प्रस्तुत अवधारणाओं को अन्य तरीकों, जैसे माइक्रो-बैच का उपयोग करके उगाए गए घुलनशील प्रोटीन क्रिस्टल पर भी लागू किया जा सकता है। अवधारणाएं एलसीपी में उगाए गए झिल्ली प्रोटीन क्रिस्टल पर भी लागू हो सकती हैं; चूंकि यह भी एक बैच क्रिस्टलीकरण प्रक्रिया है।

प्रोटोकॉल का एक महत्वपूर्ण पहलू वाष्प प्रसार प्लेटों में उगाए गए क्रिस्टल की स्थितियों को बदलने की प्रक्रिया है ताकि उन्हें बैच में उगाया जा सके। इस परिवर्तन के लिए, विधि बील एट अल (2019)26 द्वारा प्रस्तावित मानदंड का उपयोग करती है। एक बैच प्रक्रिया के माध्यम से उगाए गए क्रिस्टल, यहां तक कि वाष्प प्रसार प्लेटों में भी, तेजी से (< 24 घंटे) बनेंगे। यह मानदंड वाष्प प्रसार ड्रॉप संतुलन की गति के आधार पर एक अनुमान है, और पीईजी-आधारित प्रीसिपेटेंट स्थितियों के लिए सबसे अधिक सच है। हालांकि, क्रिस्टलीकरण की स्थिति में विभिन्न प्रकार के यौगिक शामिल होंगे जो संतुलन समय को प्रभावित करेंगे। नमक आधारित क्रिस्टलीकरण स्थितियों का संतुलन, उदाहरण के लिए अत्यधिक केंद्रित अमोनियम क्लोराइड, 1-2 दिनों में हो सकता है। इसलिए, नमक आधारित स्थितियों के लिए 24 घंटे का मानदंड सही नहीं हो सकता है। नमक-आधारित स्थितियों में अधिक जटिल चरण आरेख26,30 भी हो सकते हैं जो इस प्रोटोकॉल में प्रस्तुत आर्किटाइप के अनुरूप नहीं हो सकते हैं। नमक-आधारित स्थितियों के लिए समय मानदंड में 12 या 6 घंटे तक की कमी आवश्यक हो सकती है यदि बड़ी मात्रा में स्केलिंग असंभव साबित होती है।

इस विधि की एक और सीमा इसकी स्पष्ट जटिलता है। एंडोथियापेप्सिन के सूक्ष्म-क्रिस्टलीकरण को अनुकूलित करने के लिए जिस प्रोटोकॉल का पालन किया गया था, उसने वास्तव में विरल-मैट्रिक्स स्क्रीन से मूल स्थिति को अपेक्षाकृत कम बदल दिया। पैक्ट स्क्रीन में देखा गया पहला हिट 0.1 एचईपीईएस पीएच 7.0, 0.2 एम एमजीसीएल2, और 20% (डब्ल्यू / वी) पीईजी 6,000 था। अंतिम स्केल क्रिस्टलीकरण बफर 0.1 ट्रिस-एचसीएल पीएच 7.0, 0.15 एम एमजीसीएल2, और 40% (डब्ल्यू / वी) पीईजी 6,000 था। यह भी बहुत संभव है कि एचईपीईएस से ट्रिस-एचसीएल और एमजीसीएल2 एकाग्रता में बफर में परिवर्तन ने प्रक्रिया की सफलता में बहुत कम योगदान दिया। पीईजी 6,000 एकाग्रता में वृद्धि को एकमात्र अनुकूलन छोड़ दें, और एक जिसे काफी आसानी से हासिल किया जा सकता था।

हालांकि, यह आकलन भी बहुत सरल है। यह न केवल स्केलिंग (यानी, बीज और शमन के उपयोग) के दौरान आने वाली समस्याओं को छूट देता है, बल्कि यह तथ्य भी है कि सिर्फ इसलिए कि यह प्रोटीन सीधा साबित हुआ, इस बात की कोई गारंटी नहीं है कि अगला भी साबित होगा। प्रोटोकॉल में बताए गए कदम, तैयार किए गए थे क्योंकि प्रोटीन क्रिस्टलीकरण वॉल्यूम के स्केलिंग को अनुकूलित करना बहुत प्रोटीन महंगा हो सकता है। दिखाए गए सात एंडोथियापेप्सिन स्केलिंग परीक्षणों में, 100 मिलीग्राम प्रोटीन का सेवन किया गया था। बेशक इनमें से कुछ कदम इस प्रोटोकॉल के प्रकाश में उनके परिणामों को दिखाने के लिए किए गए थे। फिर भी, एक प्रयोग के दौरान खपत प्रोटीन के लिए 100 मिलीग्राम प्रोटीन, साथ ही संभावित रूप से 50 मिलीग्राम प्रोटीन (तालिका 1), समय या धन में एक महत्वपूर्ण निवेश हो सकता है।

सौभाग्य से, यह स्पष्ट नहीं है कि आवश्यक नमूने का यह द्रव्यमान सभी प्रोटीनों में सर्वव्यापी है। एंडोथियापेप्सिन अत्यधिक घुलनशील था, और इसलिए सुपरसेसमेंट तक पहुंचने के लिए एक बड़ी प्रोटीन एकाग्रता की आवश्यकता होती है। दूसरों में (वर्तमान में अनुकूलन के तहत), 10 या 5 मिलीग्राम / एमएल पर भी सूखा पहुंच सकता है। ऐसे चर प्रोटीन विशिष्ट होते हैं और जब वे दिखाई देते हैं तो उन्हें गले लगाने की आवश्यकता होती है।

विधि की अन्य सीमाओं में स्क्रीन और प्लेट निर्माण के लिए तरल हैंडलिंग रोबोट जैसे जटिल उपकरणों पर इसकी निर्भरता और आवश्यकता होने पर स्वचालित रूप से प्लेटों को चित्रित करने के लिए इमेजर्स शामिल हैं। उपकरणों के इन टुकड़ों में से कुछ की आवश्यकता को सीमित करने के लिए वैकल्पिक दिनचर्या की पेशकश की गई है, लेकिन प्रोटोकॉल उनके बिना पालन करने के लिए अधिक समय लेने वाला होगा। प्रोटोकॉल अनुकूलित क्रिस्टल के विवर्तन का परीक्षण करने का भी सुझाव देता है। सिंक्रोट्रॉन तक नियमित पहुंच के बिना क्रिस्टलोग्राफरों के लिए, ये परीक्षण चुनौतीपूर्ण साबित हो सकते हैं। हर कदम पर नियंत्रण आवश्यक नहीं हो सकता है, लेकिन हिट की पहचान होने के बाद, और प्री-और पोस्ट-स्केलिंग के बाद इन परीक्षणों की दृढ़ता से सिफारिश की जाती है। एक्सएफईएल में गैर-विच्छेदित क्रिस्टल, दुर्भाग्य से, एक असामान्य घटना नहीं है। इसे देखते हुए, क्रिस्टल विवर्तन के बारे में मान्यताओं के बारे में सावधानी के पक्ष में गलती करना बेहतर है।

अंततः, यह प्रोटोकॉल और यहां प्रस्तुत परिणाम सीरियल क्रिस्टलोग्राफी प्रयोगों के लिए नमूने बनाने के साथ संघर्ष करने वालों के लिए एक गाइड, विचार और एक उदाहरण प्रदान करेंगे। उम्मीद है, जैसा कि सीरियल क्रिस्टलोग्राफी को आगे विकसित किया गया है, तकनीक की नमूना मांगों को कम किया जाएगा ताकि इस तरह के प्रोटोकॉल की आवश्यकता कम हो जाए। हालांकि, इस घटना में भी, यहां प्रस्तुत रणनीतियां अभी भी उन लोगों के लिए उपयोगी होंगी जो अपने प्रोटीन के क्रिस्टलीकरण स्थान का पता लगाना चाहते हैं।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

इस परियोजना को यूरोपीय संघ के क्षितिज 2020 अनुसंधान और नवाचार कार्यक्रम से मैरी स्कोलोडोवस्का-क्यूरी अनुदान समझौते नंबर 701647 के तहत धन प्राप्त हुआ है। स्विस लाइट सोर्स बीमलाइन X10SA-PXII में बीमलाइन वैज्ञानिकों की सहायता और समर्थन के लिए बहुत धन्यवाद।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Swissci 96-well 2-Drop plates Molecular Dimensions MD11-002 96-well 2-drop crystallisation plate
Swissci 96-well 3-Drop plates Molecular Dimensions MD11-003 96-well 3-drop crystallisation plate
mosquito LCP liquid handling robot sptlabtech mosquito LCP Crystallisation robot
ClearVue Sheets Molecular Dimensions MD6-015 96-well crystallization plate seals
Safe-Tube 1.5 mL Eppendorf 30120086 1.5 mL centrifuge tubes
Scaple Swan and Morton No. 3 scalple and No. 3 handle Scalple for cutting open plate seals
MS 3 Vortex IKA 3319000 Vortex for mixing solution and making seed stocks
24-well XRL Plate Molecular Dimensions MD3-11 24-well hanging-drop plates
Tube revolver/rotator Thermo Fischer Scientific 88881001 Tube revolver for mixing solution during scaling
Eppendorf Research plus pipettes Eppendorf Range of manual pipettes, 0.5-10, 1-20, 10-100, 100-1000 µL
Eppendorf pipette tips Eppendorf Range of tip sizes for manual pipettes
Suparen 600 Prochem AG Suparen 600 Endothiapepsin solution
Sodium Acetate Sigma-Aldrich 241245-1KG Sodium Acetate
Tris Merck 8382T014 Tris
Magnesium Chloride Sigma-Aldrich M2670-1kg Magnesium Chloride
PEG 6,000 Sigma-Aldrich 81255-1kg PEG 6,000
Ethelyene glycol Sigma-Aldrich 324558-1L Ethelyene glycol for cyro-protecting the crystals
PACT Premier HT screen Molecular Dimensions MD1-36 PACT Premier 96-well crystal screen
DOW CORNING high vacuum grease Molecular Dimensions MD6-02 Grease for sealing 24-well plates
Hirschmann 22 x 22 mm glaser cover slides Hirschmann 8000104 Cover slides for sealing 24-well sitting drop plates
Crystal pins PSI Manufactured inhouse Thin-film supports for micro-crystals.
1-1.3 mm SiLibeads Type S Faust 6239547 Glass beads for making mico-seed stocks
Macbook Pro Apple Macbook Pro Computer for performing data analysis
CCP4 software suite CCP4 Diffraction pattern data processing software
Excel Microsoft Microsoft Office Plotting tool for phase diagram
Hausser Scientific Bright-Line counting chamber Thermo Fischer Scientific 02-671-51B Tool to calculate crystal concentration
PACT Premier Molecular Dimensions MD1-29-ECO Sparse-matrix crystallization screen
Rock Imager Formulatrix Rock Imager Temperature controlled crystal plate storage and imager
Rock MakerWeb Formulatrix Rock MakerWeb Crystal plate creation and image storage stoftware
Formulator Formulatrix Formulator 96-well crystal screen creation liquid handling robot
Leica MZ16 Microscope Leica Leica MZ16 Light microscope
LAS V4.6 Leica LAS V4.6 Software for Leica microscopes
Spectra/Por 3.5 kDa dialysis tubing Spectrumlabs Spectra/Por 3 Dialysis Membrane 3.5 kDa dialysis membrane
Dialysis tubing closures Spectrumlabs Spectra/Por 3 Duniversal Closures Clips to seal the dialysis tubing ends
Amicon 10 kDa centrifugal concentrator Merck-Millipore Amicon Ultra-15 10 kDa centrifugal concentrator 10 kDa centrifugal filter
5810 R swing bucket centrifuge Eppendorf 5810 R Centrifuge Swing bucket centrifuge

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Beale, J. H., Marsh, M. E. Optimizing the Growth of Endothiapepsin Crystals for Serial Crystallography Experiments. J. Vis. Exp. (168), e61896, doi:10.3791/61896 (2021).

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