Optimisation de la croissance des cristaux d’endothiapepsine pour les expériences de cristallographie en série

Summary

Le but de cet article est de donner au spectateur une solide compréhension de la façon de transformer leur protocole de diffusion de vapeur de petit volume, pour la croissance de gros cristaux de protéines uniques, en une méthode de micro-cristallisation par lots de grands volumes pour la cristallographie en série.

Abstract

Ici, un protocole est présenté pour faciliter la création de grands volumes (> 100 μL) de boues microcristallines adaptées aux expériences de cristallographie en série à la fois aux synchrotrons et aux XFEL. La méthode est basée sur une compréhension du diagramme de phase des cristaux de protéines et sur la façon dont ces connaissances peuvent être utilisées. La méthode est divisée en trois étapes: (1) optimisation de la morphologie cristalline, (2) transition vers le lot et (3) mise à l’échelle. L’étape 1 consiste à trouver des monocristaux bien diffractants, espérons-le mais pas nécessairement, se présentant dans une morphologie cubique. Au stade 2, la condition de stade 1 est optimisée par le temps de croissance des cristaux. Cette stratégie peut transformer les cristaux cultivés par diffusion de vapeur en lots. Une fois que la croissance des cristaux peut se produire dans environ 24 heures, un morphogramme du mélange de protéines et de précipitants peut être tracé et utilisé comme base pour une stratégie de mise à l’échelle (étape 3). Lorsque les cristaux peuvent être cultivés par lots, il est possible de tenter de mettre à l’échelle et d’optimiser la taille et la concentration des cristaux à mesure que le volume augmente. L’endothiapepsine a été utilisée comme protéine de démonstration pour ce protocole. Certaines des décisions présentées sont spécifiques à l’endothiapepsine. Cependant, on espère que la façon dont ils ont été appliqués inspirera une façon de penser cette procédure que d’autres pourront adapter à leurs propres projets.

Introduction

La cristallographie macromoléculaire à température ambiante (RT) est à nouveau populaire au sein de la communauté de la biologie structurale. Le développement de sources lumineuses à rayons X (XFEL) a stimulé le développement d’approches de livraison d’échantillons RT 1,2,3,4, et ces méthodes ont maintenant été appliquées aux synchrotrons 5,6,7,8. Non seulement les méthodes RT ouvrent la possibilité de stratégies expérimentales pompe-sonde 9,10,11,12, mais il y a aussi de plus en plus de preuves qu’elles favorisent des états conformationnels alternatifs dans les protéines 13,14,15,16,17.

Cependant, la principale raison pour laquelle les méthodes cryogéniques ont gagné du terrain par rapport aux approches RT à la fin des années 1990 était le ralentissement des dommages causés par les rayonnements par des températures cristallines inférieures à zéro¹⁸. Les méthodes cryogéniques¹⁹ ont commencé à permettre la collecte d’un ensemble de données complet à partir d’un seul cristal de protéine. Les méthodes modernes de RT dans les XFEL et les synchrotrons ont résolu le problème des dommages causés par le rayonnement monocristallin par le développement de stratégies d’administration rapide (> 100 Hz)^de cristaux 1,2,3,4. Ces méthodes permettent de collecter un ensemble de données complet à partir de milliers de cristaux exposés individuellement. Ces approches d’administration RT nécessitent donc la production de grandes quantités de solutions contenant des microcristaux homogènes (> 100 μL de cristaux < 50 μm). Cependant, étant donné que les cryo-méthodes ont tendance à ne nécessiter que des monocristaux, les méthodes de création de telles boues microcristallines ne sont actuellement pas omniprésentes dans les laboratoires de cristallographie des protéines.

Il existe des exemples dans la littérature sur la façon de faire des parties de la procédure d’optimisation de la microcristallisation pour les échantillons de cristallographie en série. Ici, une distinction doit être faite entre les protéines membranaires et solubles. Les protocoles visant à optimiser la croissance des cristaux de protéines micro-membranaires cultivés dans la monooléine (ou un autre lipide), pour la phase cubique lipidique (LCP), ont été bien décrits^20,21,22. Cependant, les méthodes de microcristallisation des protéines solubles, y compris les protéines membranaires cultivées dans des conditions non LCP, font généralement défaut. Des études antérieures se sont concentrées sur des parties spécifiques du processus, telles que le criblage de microcristaux 23,24, l’amélioration de la nucléation ²⁴ et la mise à l’échelle à l’aide de la diffusion à interface libre ^25, mais pas une méthode complète.

Cependant, une méthode a récemment été décrite²⁶ qui tente d’offrir un protocole complet. Comme beaucoup d’aspects de la cristallographie des protéines, elle n’est pas nouvelle. Bon nombre des idées proposées ont déjà été décrites par Rayment (2002)²⁷. La méthode vise à montrer aux cristallographes comment effectuer la conversion d’un seul cristal cultivé par diffusion de vapeur en une méthodologie de lot pour cultiver des milliers de microcristaux. La méthode se concentre sur la diffusion de vapeur comme point de départ commun, car 95% de tous les dépôts de banques de données sur les protéines (PDB) proviennent de cristaux cultivés dans des plaques de diffusion de vapeur²⁶. La diffusion de vapeur n’est cependant pas la méthode idéale pour la micro-cristallisation²⁶, c’est pourquoi une méthodologie est décrite pour convertir la diffusion de vapeur en cristallisation par lots. Une fois que les cristaux peuvent être cultivés par lots, les voies de mise à l’échelle vers de plus grands volumes deviennent plus pratiques. Compte tenu des aléas de la cristallisation des protéines, les auteurs soulignent que cette méthode n’est pas infaillible. Cependant, le protocole devrait, au moins, fournir un aperçu de « l’espace de cristallisation » d’une protéine.

Cette méthode repose sur le diagramme de phase de cristallisation des protéines et sur la façon dont la compréhension de ce diagramme peut servir de guide lors de l’optimisation de la micro-cristallisation. Un diagramme de phase protéique est généralement représenté comme un diagramme x/y avec des concentrations de précipitants et de protéines sur les axes x et y, respectivement (Figure 1A). À partir du point d’eau pure (coin inférieur gauche - Figure 1A), la concentration de protéines et de précipitants augmente jusqu’à ce que la ligne de solubilité soit atteinte. La ligne de solubilité marque le point de sursaturation (ligne violette - Figure 1A). Lorsqu’une protéine est sursaturée, la solution devient thermodynamiquement instable et commence à se séparer en deux phases: « riche en protéines » et une solution saturée stable. Cette séparation peut se produire n’importe où au-delà de la ligne de solubilité et sa cinétique dépend des propriétés de la protéine et des composants de la solution.

Lorsque les concentrations de protéines et de précipitants sont trop élevées, la protéine se décompose de manière instable hors de la solution et donne un précipité amorphe (région rose - Figure 1A). Cependant, une séparation de phase ordonnée peut se produire dans la région de nucléation [voir Garcia-Ruiz (2003)²⁸ pour une description détaillée] et les nucléants cristallins ont la propension à se former (région verte - Figure 1A). La nucléation et la croissance éliminent les protéines de la solution et déplacent la goutte dans la région métastable où la croissance peut se poursuivre jusqu’à ce que la ligne de solubilité soit atteinte [voir McPherson et Kuznetsov (2014)²⁹ pour une discussion détaillée]. Le diagramme est, pour la grande majorité des conditions de cristallisation, une simplification grossière³⁰. Indépendamment de cela, le diagramme est toujours d’une grande utilité pour les micro-cristallographes car la cartographie du diagramme permet de déterminer la ligne de solubilité et la cinétique de nucléation.

En termes de création de micro-cristaux, les deux facteurs lors de la cristallisation qui doivent être optimisés sont le nombre de cristaux (X_n) et leur dimension moyenne la plus longue (X_s). X n sera proportionnel au nombre d’événements de nucléation (_n ) (Eq. 1).

     Éq. 1

X s est proportionnelle à la concentration de protéines libres au-dessus de la ligne de solubilité (P_s) divisée par X_n (Eq. 2).

     Éq. 2

Dans une situation parfaite, chaque événement de nucléation produirait un cristal possible et chacun de ces cristaux aurait un accès égal à la protéine disponible en solution. La figure 2 est une représentation graphique d’un scénario idéal de la relation entre X_n et X_s. En pratique, le principal contrôle qu’un cristallographe a sur X_{n et X s} est en influençant la quantité de nucléation ou par l’ajout de cristaux graines. Le microcristallographe doit juger comment augmenter X_n de telle sorte qu’une concentration cristalline et une taille cristalline appropriées puissent être créées.

La majorité des techniques de cristallisation nécessitent une « période de transition » (Figure 1B). Par exemple, dans une expérience de diffusion de vapeur, lors du mélange de la protéine et des solutions précipitantes, les concentrations de chacune changeront à mesure que la goutte s’équilibre avec la solution du puits. On espère que ces changements feront progressivement passer la goutte dans la zone de nucléation où la propension à la cristallisation augmentera. Au fur et à mesure que les cristaux commencent à nucléer et à croître, la quantité de protéines en solution commence à diminuer, ce qui diminue la probabilité d’une nucléation supplémentaire. La quantité ultime de nucléation sera spécifique à la protéine et à la condition, et dépendra également de la profondeur de pénétration dans la zone de nucléation. Compte tenu de la pénétration limitée de la zone de nucléation des méthodes qui nécessitent une étape de transition, le niveau de nucléation sera finalement limité au taux de nucléation à la limite de la région de nucléation métastable.

En raison de l’importance de pouvoir améliorer le niveau de nucléation pour un micro-cristallographe, il est important de passer à une méthodologie de cristallisation par lots. Le lot peut tirer davantage parti de l’ensemble de la région de nucléation (Figure 1C). Dans les méthodes discontinues, l’idée est de mélanger la protéine et le précipitant ensemble de sorte qu’une solution sursaturée soit créée sans qu’il soit nécessaire de modifier les concentrations des composants. La nucléation devrait être possible immédiatement après le mélange. Les méthodes batch permettent donc d’atteindre théoriquement toute la zone de nucléation. Toute augmentation de la cinétique de nucléation au-delà de la limite de nucléation métastable peut alors être utilisée.

Si le niveau basal de nucléation cristalline n’est pas suffisant pour générer un grand X_n, des méthodes de micro-ensemencement peuvent être utilisées. Dans le micro-ensemencement, les cristaux pré-cultivés sont brisés pour créer une boue de fragments cristallins qui peut agir comme un échafaudage pour la croissance des cristaux frais^31,32. Le micro-ensemencement a été largement utilisé dans la préparation d’échantillons cristallographiques en série comme moyen d’augmenter X_n sans avoir besoin d’augmenter la nucléation cristalline (Figure 1C).

La transition de la diffusion de vapeur au lot peut être visualisée sur un diagramme de phase comme déplaçant le point de départ expérimental des régions non sursaturées ou métastables vers la zone de nucléation. Cela peut être fait en augmentant les concentrations de protéines et/ou de précipitants, et/ou le rapport des deux dans la goutte (Figure 1D), et en observant quelles conditions produisent des cristaux apparaissant rapidement (< 24 h)²⁶. L’équilibrage complet des gouttes de diffusion de vapeur peut prendre des jours ou des semaines³³. Par conséquent, en recherchant des conditions qui montrent des cristaux apparaissant rapidement, les conditions des lots peuvent être trouvées sans avoir à passer à d’autres formats de criblage de cristallisation tels que le micro-lot^34,35,36,37.

Une fois que la zone de nucléation a été trouvée, une condition de lot a été trouvée et un morphogramme - ici, un diagramme de phase approximatif - peut être créé. Le morphogramme est d’une grande utilité lorsqu’il s’agit d’utiliser un protocole de lot ensemencé ou de lot direct. En traçant le X_n en fonction de la concentration en protéines et en précipitants, on peut évaluer la cinétique de nucléation²⁶. Si X n reste faible dans toute la région de nucléation, un lot ensemencé peut être nécessaire pour rendre X_n assez grand pour limiter la croissance cristalline. Cette évaluation est la première étape du processus de mise à l’échelle vers des volumes plus importants (> 100 μL).

Cette méthode a été conçue de manière à pouvoir être réalisée dans la majorité des laboratoires de cristallisation en utilisant un équipement standard de cristallisation par diffusion de vapeur. De nombreuses études ont également été menées qui décrivent des techniques pour faciliter de nombreuses parties de ce processus, si l’équipement est disponible. Ceux-ci incluent, mais ne sont pas limités à, la diffusion dynamique de la lumière (DLS)25,27, l’imagerie non linéaire 20,24,25, la diffraction des poudres 20,24,27 et la microscopie électronique 26 [voir Cheng et al. (²⁰²⁰)⁴⁰ pour une belle revue].

L’objectif de ce travail est de fournir une démonstration visuelle de la méthode de transition de la cristallisation par diffusion de vapeur en petit volume (< 500 nL) à la cristallisation par lots à grand volume (> 100 μL). L’endothiapepsine de Cryphonectria parasitica a été utilisée comme exemple de système pour démontrer cette traduction. Le type d’expérience et la méthode d’administration d’échantillons pour lesquels les microcristaux sont nécessaires influenceront la sortie_{idéale de} X^{s 26}. Pour les expériences de mélange nécessitant une résolution temporelle de l’ordre de la milliseconde⁴¹ ou des buses virtuelles_{dynamiques en phase} gazeuse⁴², un X s final de < 5 μm peut être souhaitable. Dans ce cas, l’objectif était de produire des cristaux de protéines diffractés à environ 1,5 Å, pour une expérience pompe-sonde activée par photon, et en utilisant une approche de livraison à cible fixe.

Pour illustrer les besoins en échantillons d’une telle expérience de cristallographie en série utilisant l’endothiapepsine, le tableau 1 montre les paramètres expérimentaux d’une expérience hypothétique. L’échantillon d’information était basé sur le protocole décrit ci-dessous. Compte tenu de certaines estimations prudentes sur les taux de réussite et les exigences de collecte de données, 50 mg est l’estimation de la consommation totale de l’échantillon pour l’ensemble de l’expérience.

La figure 3 montre un organigramme du processus d’optimisation complet depuis la cristallisation initiale par diffusion de vapeur à petit volume jusqu’au lot à grande échelle. Pour la majorité des projets de cristallographie en série, ce protocole commencera à l’étape 2 : « transition vers le lot », puisque la protéine cible aura déjà été cristallisée. Cependant, l’étape 1 a été incluse pour être complète et pour rappeler aux lecteurs son importance. Trouver une condition qui donne lieu à un cristal simple, grand et bien diffractant est le meilleur point de départ pour l’optimisation des microcristaux. À l’étape 2, cette condition peut ensuite être optimisée de la diffusion de vapeur au lot, et un morphogramme des régions de nucléation et métastables peut être tracé. Une fois cette opération effectuée, la mise à l’échelle de la condition de lot à des volumes plus importants peut être effectuée à l’étape 3. À la fin de l’organigramme, un cristallographe aura créé un protocole de microcristallisation reproductible et de grand volume (> 100 μL) pour l’endothiapepsine. Cette méthode peut ensuite être appliquée à leur protéine d’intérêt particulière.

Protocol

NOTE: Toutes les expériences de cristallisation en goutte assise de 96 puits ont été configurées à l’aide de plaques à 2 ou 3 gouttes. Un robot de manipulation des liquides et un imageur/hôtel de cristallisation ont été utilisés pour faciliter la préparation et la surveillance de tous les cribles de 96 puits. Toutes les concentrations de réactifs pour les expériences de cristallisation sont données à leurs concentrations initiales avant le mélange.

1. Optimisation de la morphologie cristalline

REMARQUE : Étapes 1.1.1. et 1.1.6. Décrire comment les conditions de cristallisation de l’endothiapepsine ont été trouvées et comment ces conditions ont été optimisées pour trouver une seule condition qui a produit des cristaux uniques et bien diffractants.

1. Optimisation à matrice clairsemée
   1. Préparer une solution fraîche d’endothiapepsine.
      REMARQUE : L’endothiapepsine, lorsqu’elle est achetée sous le nom de Superan 600, doit être transférée hors de sa solution de stockage et concentrée.
      1. Préparer 3 L d’acétate de Na 0,1 M pH 4,6 à 4 °C.
      2. Couper 20 cm de tubulure de dialyse et laver brièvement dans le tampon. Scellez une extrémité de la tubulure à l’aide d’un clip, placez 50 mL de la solution d’endothiapepsine dans la tubulure, puis scellez l’autre extrémité.
      3. Laisser la solution dialyser pendant au moins 4 h (ou toute la nuit) à 4 °C dans 1 L du tampon acétate de Na. En raison des composants du tampon de stockage, la solution dans le sac de dialyse sera maintenant d’environ 100 mL.
      4. Transférer la poche de dialyse contenant l’endothiapepsine dans un litre frais de 4 °C, 0,1 M Na Acétate pH 4,6. Répétez cette étape une fois de plus de sorte que le tampon d’origine ait été dilué 2000x contre l’acétate de Na.
      5. L’endothiapepsine sera maintenant d’environ 10 mg/mL. Concentrer à 100 mg/mL à l’aide d’un concentrateur centrifuge de 10 kDa et d’une centrifugeuse.
      6. Refroidir rapidement la solution d’endothiapepsine dans de l’azote liquide dans des aliquotes de 50 μL et conserver à -80 °C.
   2. Préparez un écran à matrice clairsemée PACT Premier 96 puits.
      1. À l’aide d’un robot de manutention des liquides, distribuer 100 nL d’endothiapepsine à 70 mg/mL et 100 nL de solution de puits dans un seul puits secondaire par puits. Mélanger la protéine et la solution de puits 3 fois lors de l’ajout du tampon de cristallisation.
      2. Sceller la plaque et laisser reposer 28 jours à 20 °C en prenant des images tous les jours pendant la première semaine, puis toutes les semaines par la suite pendant 4 semaines.
   3. Analyse à matrice clairsemée
      1. Identifier les résultats qui produisent des cristaux d’endothiapepsine uniques. À partir de l’écran PACT, les conditions qui contenaient MgCl₂ se sont développées sous forme de singletons plutôt que de grappes d’aiguilles.
   4. Optimisation à matrice clairsemée
      1. À partir du MgCl₂ contenant les conditions identifiées à l’étape 1.1.3.1, créer un crible à 96 puits combinant et faisant varier au hasard les différents composants du puits.
      2. À l’aide d’un robot de manutention des liquides, distribuer 100 nL d’endothiapepsine à 70 mg/mL et 100 nL de solution de puits dans un seul puits secondaire par puits. Mélanger la protéine et la solution de puits 3 fois lors de l’ajout du tampon de cristallisation.
      3. Sceller la plaque et laisser reposer 28 jours à 20 °C en prenant des images tous les jours pendant la première semaine, puis toutes les semaines par la suite pendant 4 semaines.
   5. Analyse d’optimisation
      1. À l’aide d’un tableur approprié, classer les conditions de cristallisation qui donnent naissance aux cristaux en fonction de la qualité cristalline et du niveau de précipitation, sans cristaux (0) à idéal (5) et faible (0) à élevé (5), respectivement. En ce qui concerne la qualité des cristaux, les critères généraux sont les monocristaux avec une morphologie en forme de boîte.
      2. Effectuer une analyse de corrélation de Pearson entre le contenu des conditions de cristallisation et la quantité de cristaux et le niveau de précipitation.
      3. Tracez ces données sous forme de carte thermique. Recherchez les composantes et les conditions qui étaient corrélées avec les résultats préférés.
   6. Analyse de diffraction.
      1. Confirmer que les cristaux obtenus à partir des conditions identifiées à l’étape 1.1.5 conviennent à la cristallographie en série en effectuant une expérience de diffraction des rayons X.
      2. Charger un échantillon des cristaux d’endothiapepsine de chacune des conditions identifiées sur des supports qui permettent la collecte de données à 100 ou 293 K et effectuer une expérience de diffraction des rayons X. Si vous travaillez sous cryo, utilisez 25% d’éthylène glycol comme cryoprotecteur.
      3. Traitez ces données via une suite logicielle adaptée. Les cristaux d’endothiapepsine devraient diffracter au-delà de 1,5 Å. Vérifiez le jumelage, car les cristaux jumelés peuvent compliquer considérablement le traitement des données cristallographiques en série.
      4. Si les cristaux sont singletons et diffractent à 1,5 Å, passez à l’étape 2. Si ce n’est pas le cas, revenez à l’étape 1.1.2 et essayez des écrans à matrice clairsemée pour identifier les conditions prometteuses. Après les analyses effectuées aux étapes 1.1.5. et 1.1.6., une condition de cristallisation de 25 % (p/v) de PEG 6 000, 0,1 M Tris-HCl pH 7,0 et 0,15 M MgCl₂ aurait dû être trouvée comme idéal approximatif.

2. Passage au lot

1. Expérience morphogramme
   1. Créez un stock de semences de microcristaux.
      REMARQUE: Il est préférable lors de la fabrication de stocks de semences de fabriquer les graines à partir de cristaux spécialement cultivés pour la tâche. Cela aide grandement à la reproductibilité. D’autres idées présentées aux étapes 2.1.1.1 à 2.1.1.11 sont de toujours utiliser les cristaux cultivés à partir d’un nombre standard de puits - ici 5 - et d’aliquoter les stocks une fois qu’ils sont faits pour annuler les cycles de gel-dégel.
      1. Préparer une plaque de cristallisation à 96 puits avec des puits contenant le tampon de cristallisation : 25 % (p/v) PEG 6 000, 0,1 M Tris-HCl pH 7,0 et 0,15 M MgCl2_.
      2. À l’aide d’un robot de manutention des liquides, distribuer 200 nL d’endothiapepsine décongelée à 70 mg/mL et 200 nL de solution de puits dans un seul puits secondaire par puits. Mélanger la protéine et la solution de puits 3 fois lors de l’ajout du tampon de cristallisation.
      3. Sceller la plaque et laisser reposer 24 h.
      4. Remplissez un tube centrifuge de 1,5 mL avec 250 μL de tampon de cristallisation et 10-15 billes de verre de 1 mm. Laissez le tube centrifuge sur de la glace refroidir pendant 5 à 10 minutes.
      5. Sélectionnez 5 puits avec des cristaux, ouvrez les puits avec un scalpel et, à l’aide d’une pointe de pipette, écrasez les cristaux dans les puits.
      6. Aspirer 1 μL de tampon du tube centrifuge glacé et l’utiliser pour homogénéiser la boue de cristal broyée. Une fois homogène, aspirer la boue entière et recueillir dans le tube à centrifuger refroidi.
      7. Répétez l’étape 2.1.2.6 pour chacun des 5 sous-puits.
      8. Vortex le tube centrifuge contenant le tampon, les boues et les billes groupées à 1000 tr/min pendant 30 s.
      9. Remettre le tube à centrifuger sur glace pendant 30 s.
      10. Répétez les étapes 2.1.2.8 et 2.1.2.9 deux fois de plus.
      11. Le stock de semences est maintenant prêt et peut être aliquote en lots de 10 μL et stocké à -20 °C.
   2. Effectuer une expérience de morphogramme.
      1. Préparez un criblage quadrillé de 96 puits à 2 gouttes. Faire varier la concentration de PEG 6 000 de 5 à 40 % (p/v) le long des colonnes de plaques, en maintenant le tampon et le sel à 0,1 M Tris-HCl pH 7,0 et 0,15 M MgCl2_{, respectivement}.
      2. Préparer une dilution séquentielle de l’endothiapepsine dans 0,1 M Na Acétate pH 4,6 de 100 à 12,5 mg/mL sur 8 étapes. Une concentration différente d’endothiapepsine sera utilisée pour chaque rangée de la plaque.
      3. À l’aide d’un robot de manipulation de liquides, distribuer 150 nL d’endothiapepsine dans les sous-puits 1 et 2. Dans le sous-puits 1, distribuer 150 nL de la solution du puits. Dans le puits inférieur 2, aspirer plusieurs 50 nL de stock de semences décongelées et 100 nL de solution de puits, puis distribuer les deux dans la solution protéique. Mélanger les solutions 3 fois lors de l’ajout du tampon de cristallisation.
      4. Scellez la plaque et laissez à 20 °C en prenant des images toutes les 0, 3, 6, 12, 18, 24 h, puis tous les jours pendant la première semaine, et toutes les semaines pendant les quatre suivantes. Si l’imagerie automatique n’est pas possible, ne vous inquiétez pas de l’imagerie horaire du jour 1.
2. Analyse morphogramme
   1. En regardant les images prises après 24 h, estimez le nombre de cristaux présents dans chaque puits et notez ces estimations dans la feuille de travail « générateur de morphogramme » fournie. Ces estimations n’ont pas besoin d’être précises; Compter individuellement des milliers de microcristaux, s’ils sont présents, n’est ni pratique ni nécessaire. Essayez principalement de vous assurer que les estimations sont cohérentes sur l’ensemble de l’assiette.
      REMARQUE : La règle des 24 h était fondée sur les observations faites dans Beale et coll . (2019)²⁶. Les conditions de cristallisation par diffusion de vapeur peuvent prendre des jours ou des semaines à s’équilibrer. Les cristaux qui apparaissent rapidement sont plus susceptibles d’avoir grandi par un processus discontinu plutôt que par l’équilibrage progressif des composants de goutte. Le critère des 24 h est donc quelque peu arbitraire et un temps limite exact entre une expérience de diffusion de vapeur et un lot dépendra du mélange spécifique de la condition [voir Beale et al. (2019) ²⁶ pour plus de détails].
   2. Indiquer les concentrations initiales d’endothiapepsine et de PEG 6 000 dans les cases indiquées.
   3. La feuille de calcul tracera automatiquement les résultats dans le format traditionnel du diagramme de phase avec la concentration en précipitant et en protéines sur les axes x et y , respectivement. Les conditions de puits qui ne donnent lieu qu’à des cristaux dans leurs gouttes ensemencées indiquent la région métastable du diagramme (bleu transparent), tandis que les conditions qui ont des cristaux dans les gouttes ensemencées et non ensemencées indiquent la zone de nucléation (vert solide).
      REMARQUE : Idéalement, la majorité de la zone de nucléation devrait être présente sur le diagramme (c.-à-d. qu’il y a des puits clairs au bas du diagramme et qu’un certain précipité devrait être visible à des concentrations élevées de protéines et de précipitants). Si ce n’est pas le cas, répétez peut-être l’expérience, mais augmentez la concentration de protéines et/ou de précipitants (si possible).
   4. Si les cristaux sont apparus en moins de 24 heures, passez à l’étape 2.3.1. Si ce n’est pas le cas, passez à l’étape 2.4 et continuez l’optimisation vers le lot.
3. Analyse cristalline
   1. Comme indiqué à la fin de l’étape 1, avant de passer à l’étape suivante, assurez-vous que ces cristaux ont la morphologie et la qualité de diffraction souhaitées. En ce qui concerne la morphologie, les cristaux sont-ils visiblement déjumelés et se forment-ils comme des singletons plutôt que des structures en forme de boule d’aiguille ou d’éventail? En ce qui concerne la diffraction, recueillir des données de diffraction à partir des cristaux si possible. Si ces cristaux ne diffractent pas, il est improbable que les cristaux cultivés dans un plus grand volume diffractent.
   2. Charger un échantillon des cristaux d’endothiapepsine de l’expérience morphogramme sur des supports permettant la collecte de données à 100 ou 293 K et effectuer une expérience de diffraction des rayons X. Si vous travaillez sous cryo, utilisez 25% d’éthylène glycol comme cryoprotecteur.
   3. Traitez ces données via une suite logicielle adaptée. Les cristaux d’endothiapepsine devraient diffracter au-delà de 1,5 Å. À travers l’échantillon de cristaux, observez la taille de la cellule, le nombre total d’observations et la mosaïque; Ces mesures donneront une indication quant à l’homogénéité des cristaux diffractaires.
   4. Si la morphologie cristalline et la qualité de diffraction sont suffisantes, passez à l’étape 3.
4. Optimisez le temps de croissance des cristaux.
   REMARQUE : L’analyse morphogramme (étape 2.2) aura donné une indication du point de départ de la cristallisation (c.-à-d. la région du diagramme de phase où se trouve la goutte lorsque les solutions de précipitant et de protéines ont été mélangées). La chute est-elle dans la région métastable ou en dessous de la ligne de solubilité? La cristallisation par lots commence dans la zone de nucléation (Figure 1C). Le but de cette étape est de déplacer ce point de départ sous la ligne de solubilité ou la région métastable, dans la zone de nucléation (Figure 1D). Si les gouttes ensemencées de l’étape 2.2. ont produit des cristaux rapidement, c’est une indication que le mélange de gouttes est déjà dans la région métastable, sinon, il est probable que la goutte ne soit pas sursaturée.
   1. Optimisation du temps de croissance des cristaux.
      1. En utilisant le même tamis qu’à l’étape 2.1.3, préparer une expérience de cristallisation par diffusion de vapeur de 96 puits dans une plaque à 3 gouttes.
      2. Augmenter la concentration protéique initiale de l’endothiapepsine sur l’axe des y (c.-à-d. concentrer davantage la protéine, peut-être 120 mg/mL pour l’endothiapepsine).
      3. Effectuer une dilution en série, comme à l’étape 2.1.3.2, de telle sorte que chaque rangée de la plaque contienne une concentration séquentiellement plus faible en protéines.
      4. Utilisez différents rapports de goutte dans chacune des trois gouttes de l’assiette: 1: 1, 1: 2 et 2: 1, protéine: précipitant.
      5. Visualisez ou imagez la plaque le premier jour à 0, 3, 6, 12, 18, 24 h, puis tous les jours pendant la première semaine et chaque semaine pour les quatre suivantes. Si l’imagerie automatique n’est pas possible, ne vous inquiétez pas de l’imagerie horaire du jour 1.
      6. Identifier les gouttes qui produisent les cristaux qui apparaissent le plus rapidement et en fait les points de départ d’optimisations répétées jusqu’à ce que la croissance des cristaux se produise dans les 24 heures.
      7. Lorsqu’un état cristallin apparaissant rapidement a été identifié, revenez à l’étape 2.1 pour retracer le morphogramme comme prélude pour commencer la mise à l’échelle.

3. Mise à l’échelle

1. Classer les itinéraires de mise à l’échelle. À ce stade, il n’est pas nécessaire de décider d’une seule voie de mise à l’échelle, mais seulement d’identifier et de classer les options afin qu’elles puissent être explorées à leur tour. Au fur et à mesure que le volume du mélange de lots augmente au cours de la procédure de mise à l’échelle, des changements se produiront dans la vitesse de nucléation et la gamme de tailles de cristaux. Cependant, ceux-ci peuvent être surmontés en ajustant soigneusement les concentrations des composants à mesure que le volume mis à l’échelle augmente.
   REMARQUE : Les étapes 3.1.1 et 3.1.2 décrivent comment discerner, à partir du morphogramme, si un protocole de lot ou de lot ensemencé est plus approprié.
   1. Protocole de traitement par lots directs
      1. Le X_n dans la zone de nucléation est-il proportionnel à la concentration de protéines et/ou de précipitants ? C’est-à-dire que X_n augmente en fonction de la concentration en précipitant et/ou en protéines? -Oui? Passez à l’étape 3.1.1.2. Non? Passez à l’étape 3.1.2. 
      2. Localisez les conditions qui produisent des cristaux de la taille requise et passez à l’étape 3.2.
   2. Protocole de lot amorcé
      1. Le X_n est-il plat à travers la zone de nucléation? C’est-à-dire X_n n’augmente pas en fonction de la concentration en précipitant et/ou en protéines.
      2. Localisez les conditions d’ensemencement qui donnent des cristaux de la taille requise et passez à l’étape 3.2. Si tous les cristaux sont trop gros, passez à l’étape 3.1.2.3.
      3. Répétez l’expérience du morphogramme (étape 2.1), mais augmentez cette fois la concentration du stock de semences utilisé dans les puits ensemencés. Le stock de graines peut être augmenté en utilisant plus de cristaux dans sa création. Par exemple, au lieu de 5 puits à l’étape 2.1.1.5, utilisez 10 puits.
      4. Visualisez ou imagez la plaque sur les 0, 3, 6, 12, 18, 24 premières h.
      5. Le X_n aurait dû augmenter et le X s diminuer dans les_gouttes ensemencées. Répétez ce cycle si des cristaux plus petits sont nécessaires, puis suivez un protocole de lot ensemencé.
2. Mise à l’échelle progressive
   1. Mise à l’échelle dans des plaques de 96 puits. À partir du morphogramme de l’endothiapepsine, une méthode par lots simples utilisant la condition de cristallisation 0,1 M Tris-HCl pH 7,0, 0,15 M MgCl₂ et 30 % (p/v) PEG 6 000, a été initialement sélectionnée pour la mise à l’échelle. 100 mg/mL d’endothiapepsine mélangée au tampon de cristallisation dans un rapport de 1:1.
      1. Préparer 2-3 puits dans une plaque de goutte assise à 2 puits de 96 puits avec 100 μL de 0,1 M Tris-HCl pH 7,0, 0,15 M MgCl₂ et 30% (p/v) PEG 6,000.
      2. À l’aide d’une solution d’endothiapepsine à 100 mg/mL fraîchement décongelée, distribuer 0,5 μL de protéines et 0,5 μL de précipitant par puits, sceller et entreposer à 20 °C.
      3. Visualisez ou imagez la plaque sur les 0, 3, 6, 12, 18, 24 premières h. Notez tout changement dans la plage de X_s et X_n.
      4. Si des changements se sont produits, répéter les étapes 3.2.1.1 à 3.2.1.2, mais augmenter ou diminuer la concentration de protéines, de précipitants et/ou de graines pour rétablir tout changement dans la plage de X_s et X_n.
      5. Lorsque la plage de X_s et X_n est acceptable, passez à l’étape 3.2.2.
   2. Mise à l’échelle dans des plaques suspendues à 24 puits
      1. Préparez un seul puits d’une plaque de 24 puits en graissant les bords du puits avec de la graisse sous vide.
      2. Préparer 0,5 mL de 0,1 M de Tris-HCl pH 7,0, 0,15 M MgCl₂ et 30 % (p/v) PEG 6 000 et bien remplir le graissage.
      3. À l’aide d’une solution d’endothiapepsine fraîchement décongelée, introduire 1 μL de protéines sur la surface d’une lamelle de verre. Pipeter 1 μL de tampon de cristallisation sur la goutte de protéine et mélanger à l’aide de la pipette.
      4. Visualisez ou imagez la plaque sur les premières 0, 3, 6, 12, 24 h. Notez tout changement dans la plage de X_s et X_n.
      5. Si des changements se sont produits, répéter les étapes 3.2.2.1 à 3.2.2.4, mais augmenter ou diminuer la concentration en protéines, en précipitants et/ou en graines pour rétablir tout changement dans la plage de X_s et X_n.
      6. Lorsque/si la plage de X_s et X_n est acceptable, passez à l’étape 3.2.2.7.
      7. Répéter les étapes 3.2.2.1 à 3.2.2.5, en augmentant progressivement le volume total de l’expérience jusqu’à 10 μL.
      8. Une fois à un volume de 10 μL ou plus, passer aux tubes centrifugés à l’étape 3.2.3.
   3. Mise à l’échelle dans les tubes centrifuges
      REMARQUE : Le raffinement de l’état du lot d’endothiapepsine s’est produit principalement au point de volumes de 200 μL (voir Résultats, Mise à l’échelle). Le processus a commencé avec une condition de cristallisation de 0,1 M Tris-HCl pH 7,0, 0,15 M MgCl₂ et 30% (p/v) PEG 6 000. Cependant, la concentration de PEG est finalement passée à 40% (p / v). Les graines étaient également nécessaires pour contrôler le X_n, et pour empêcher les cristaux de devenir trop gros, la croissance des cristaux devait être éteinte. Les étapes 3.2.3.1 à 3.2.3.7 détaillent le processus d’optimisation de l’état. Étape 3.2.4. Décrire le protocole final du lot.
      1. Préparer un tampon de cristallisation de 1 mL : 0,1 M Tris-HCl pH 7,0, 0,15 M MgCl₂ et 30 % (p/v) PEG 6 000.
      2. En utilisant de l’endothiapepsine fraîchement décongelée de 100 mg/mL, ajoutez 25 μL de protéines dans un tube à centrifuger de 1,5 mL.
      3. Bien mélanger le tampon de cristallisation avec la solution protéique dans un rapport de 1:1 avec un embout de pipette. Placer le tube dans un revolver/rotateur à forte agitation à 20 °C.
      4. Prendre des aliquotes régulières (5, 10, 30, 60 min, 2, 5, 10, 24 h) de 2,5 μL et les visualiser dans un hémocytomètre. Enregistrez la plage X_n et X_s .
      5. Si des modifications ont eu lieu, répétez les étapes 3.2.3.1. au 3.2.3.4. mais augmenter ou diminuer la concentration en protéines, en précipitants et/ou en graines pour rétablir tout changement dans la plage de X_s et X_n
      6. Lorsque la plage de Xs et Xn est acceptable, passez à l’étape 3.2.3.7.
      7. Répéter les étapes 3.2.2.1 à 3.2.2.5, en augmentant graduellement le volume total de l’expérience jusqu’à 200 μL ou plus, au besoin.
   4. Protocole de lot ensemencé final
      1. Préparer le stock de semences.
         1. Préparer 2 mL de tampon de cristallisation : 0,1 M Tris-HCl pH 7,0, 0,15 M MgCl₂ et 40 % (p/v) PEG 6 000.
         2. En utilisant 100 mg/mL d’endothiapepsine fraîchement décongelée, ajoutez 100 μL de protéines dans un tube à centrifuger de 1,5 mL.
         3. Bien mélanger le tampon de cristallisation avec la solution protéique dans un rapport de 1:1 avec un embout de pipette. Placer le tube dans un revolver/rotateur à forte agitation à 20 °C pendant 24 h pour permettre la croissance de cristaux de 50 μm.
         4. Ajouter 10-15 perles de verre de 1 mm à la suspension de cristal de 50 μm.
         5. Vortex le tube centrifuge contenant la boue et les billes à 1000 tr/min pendant 30 s.
         6. Remettre le tube à centrifuger sur glace pendant 30 s.
         7. Répétez les étapes 3.2.4.1.5 et 3.2.4.1.6 10 fois de plus.
         8. C’est maintenant 200 μL d’un stock de semences 1x. Diluer le stock de graines 10x en ajoutant 1,8 mL de tampon de cristallisation. Aliquote le stock de semences 10x en lots de 50 μL et conserver à -20 °C.
      2. Protocole de lot amorcé.
         1. Préparer le tampon de cristallisation : 0,1 M Tris-HCl pH 7,0, 0,15 M MgCl₂ et 40 % (p/v) PEG 6 000.
         2. Dans un tube à centrifuger, mélanger 100 μL de tampon de cristallisation avec les 50 μL de 10x stock de graines fraîchement décongelé.
         3. En utilisant 100 mg/mL d’endothiapepsine fraîchement décongelée, ajoutez 150 μL de protéines dans un tube centrifuge de 1,5 mL.
         4. Bien mélanger le mélange tampon/graine de cristallisation avec la solution d’endothiapepsine à l’aide d’un embout de pipette et placer le tube dans un revolver/rotateur à forte agitation à 20 °C.
         5. Surveillez la cristallisation en prenant des aliquotes régulières de 2,5 μL et visualisez les cristaux dans un hémocytomètre. Enregistrez la plage X_n et X_s .
         6. Après environ 80 min, lorsque les cristaux ont atteint un X_s de 15 μm, éteindre la réaction par l’ajout de 150 μL de 0,05 M Na Acétate pH 4,6, 0,05 M Tris-HCl pH 7,0, 0,075 M MgCl₂ et 20% (p/v) PEG 6 000 (une solution composée d’un tampon d’endothiapepsine et d’un tampon de cristallisation, mélangé 1:1).
         7. Conservez les cristaux à 20 °C.
      3. Le protocole a-t-il produit une gamme et un nombre de cristaux acceptables pour l’expérience prévue? Oui - TERMINÉ - Non - revenez à l’étape 3.1. et essayez une autre option de mise à l’échelle. Par exemple, un rapport protéine/précipitant différent peut être possible ou ajouter des graines si cela n’a pas été fait auparavant. Lorsque ceux-ci sont tous épuisés, il peut être nécessaire de trouver une nouvelle condition à l’étape 1.

Representative Results

Optimisation de la morphologie cristalline
L’étape 1, optimisation de la morphologie des cristaux, a été incluse pour rappeler au lecteur son importance. Il peut être possible de créer des microcristaux parfaits à partir de boules d’aiguilles à diffraction faible; Cependant, les auteurs suggèrent qu’il est préférable d’optimiser les deux séparément. Tout d’abord, trouvez les conditions qui donnent lieu à un monocristal bien diffractant par diffusion de vapeur, puis convertissez ces conditions en lots plutôt que d’essayer de combiner les deux étapes ensemble. Il n’est pas nécessaire de découvrir des conditions hautement nucléantes, à ce stade; La morphologie et la qualité de la diffraction sont les principaux objectifs.

Avant de commencer la microcristallisation de l’endothiapepsine, une analyse des conditions de cristallisation de la structure déposée à partir de la PDB a été effectuée. Des conditions de cristallisation et des protocoles approximatifs ont pu être obtenus pour 47 des 48 dépôts d’enthothiapepsine. Celles-ci étaient largement toutes basées sur la première cristallisation de l’endothiapepsine menée par Moews et Bunn (1970)⁴⁶. Compte tenu des similitudes de ces conditions et de leur origine « classique », un criblage à 96 puits, à diffusion de vapeur et à matrice clairsemée, a été effectué pour explorer une plus grande variété de conditions de cristallisation. L’endothiapepsine a été concentrée à 70 mg/mL et un criblage PACT à matrice clairsemée⁴⁷ a été réalisé dans une plaque de 96 puits à 20 °C mélangeant 100 nL de protéines avec 100 nL de solution de puits. Chaque condition de cette expérience après 36 h a donné naissance à des cristaux. Cependant, une analyse de la morphologie cristalline a indiqué que certaines conditions pourraient s’avérer meilleures pour l’optimisation de la microcristallisation.

La figure 4A montre une chute par rapport à l’écran PACT qui était globalement représentative de celles observées dans la majorité de la plaque. À première vue, il peut être tentant de penser que ces cristaux pourraient valoir la peine d’être optimisés davantage pour la micro-cristallisation. Les cristaux sont gros et il semble y avoir une nucléation importante. Cependant, la morphologie cristalline globale n’est pas idéale. Tout d’abord, les cristaux ne sont pas des singletons observables car il semble que plusieurs cristaux se développent à partir de points de nucléation uniques. Deuxièmement, la taille du cristal est très asymétrique, la croissance se produisant principalement le long d’un seul axe. De tels cristaux sont théoriquement plus susceptibles de s’aligner préférentiellement lorsqu’ils sont délivrés au faisceau de rayons X. Ces deux caractéristiques posent des problèmes lors de la collecte et du traitement des données cristallographiques en série.

La figure 4B, cependant, montre des cristaux d’endothiapepsine cultivés en présence de MgCl₂. Cette morphologie était cohérente dans toutes les conditions contenant MgCl 2 et suggérait donc que leur morphologie était due à MgCl₂. Les conditions de MgCl₂ ont produit des cristaux uniques, ressemblant davantage à des boîtes, qui représentaient une meilleure cible pour les expériences en série ultimes.

Il y avait quatre conditions dans l’écran PACT qui contenaient MgCl₂. Pour mieux comprendre l’influence de tous les différents composants de ces conditions sur la cristallisation de l’endothiapepsine, une optimisation aléatoire a été réalisée. Un crible contenant une combinaison aléatoire de tampons et de précipitants a été créé à une gamme de concentrations et de pH. La concentration de MgCl₂ a également varié, puis les gouttes résultantes ont été arbitrairement classées de 0 à 5 (0 étant l’absence de cristaux ou de précipitations) en termes de qualité visuelle des cristaux et de niveau de précipitation.

La figure 5A montre une carte thermique des résultats d’une analyse de corrélation de Pearson entre le niveau de précipitation et la qualité des cristaux, et les variables de criblage (des exemples de gouttes de cette expérience sont présentés aux figures 5B, C et D). Les résultats ont indiqué que le pH de la solution était fortement corrélé au niveau de précipitation, les tampons alcalins entraînant une augmentation des précipitations. La concentration de MgCl₂ était légèrement corrélée au niveau de précipitation, tout comme le pH et la concentration de précipitants à la qualité des cristaux.

Sur la base de ces résultats, la décision a été prise de prendre les cristaux cultivés dans 0,1 M Tris-HCl pH 7,0, 0,15 M MgCl₂, 20% (p/v) PEG 6,000 à l’étape suivante du protocole - Passage au lot. La morphologie des cristaux était acceptable et une analyse de la diffraction des rayons X et des paramètres de qualité des données de ces cristaux a suggéré qu’il n’y avait pas de différence significative entre les cristaux cultivés dans et hors de la présence de Mg²⁺ (Figure 9).

Passage au traitement par lots
Pour de nombreuses optimisations de micro-cristallisation par cristallographie sérielle, l’étape 2 sera le point de départ. La protéine d’intérêt aura déjà été cristallisée pour la cryocristallographie et le protocole de cristallisation devra maintenant être transformé pour créer des boues de microcristaux. Ce protocole n’a utilisé que des plaques de diffusion de vapeur à 96 puits pour effectuer la transformation en lot puisque la diffusion de vapeur est la méthode de cristallisation utilisée par 95% des entrées PDB²⁶. Le protocole a évité de passer au microlot^34,35,37 car cette transition pourrait encore entraîner une optimisation similaire. Cela ne veut pas dire que ce protocole ne peut être fait que dans des plaques de diffusion de vapeur. Toutes les étapes présentées fonctionneraient également en microlot s’il s’agissait de la méthode de cristallisation originale.

Pour évaluer la cristallisation de l’endothiapepsine dans la condition choisie, un morphogramme - ou un diagramme de phase approximatif - a été créé. L’objectif de l’expérience morphogramme est triple. Tout d’abord, une analyse du morphogramme est d’une grande utilité lors de l’évaluation des voies de mise à l’échelle à l’étape 3 - Mise à l’échelle. Deuxièmement, le morphogramme agit comme un outil d’optimisation, aidant à découvrir les conditions de diffusion de vapeur qui donnent naissance à des cristaux par lots [c’est-à-dire des cristaux apparaissant rapidement (< 24 h)]. Troisièmement, si les cristaux ne sont pas apparus rapidement, une analyse des gouttes ensemencées peut donner au cristallographe une idée de l’emplacement approximatif de l’état actuel sur le diagramme de phase. Par exemple, si les conditions ensemencées donnent des cristaux mais pas les non-ensemencées, ces conditions sont susceptibles d’être dans la région métastable.

L’expérience morphogramme de l’endothiapepsine a été réalisée sur la base de l’état 0,1 M Tris-HCl pH 7,0, 0,15 M MgCl₂, 20% (p / v) PEG 6 000. Les concentrations de protéines et de PEG variaient de 100 à 12,5 mg/mL et de 5 à 40 % (p/v), respectivement. Les gouttes ont été analysées et les résultats ont été tracés à l’aide de la feuille de travail fournie (figure 6A).

Il était également déjà clair dès le stade de l’optimisation de la morphologie cristalline que la croissance des cristaux d’endothiapepsine dans cette condition, et à ces concentrations de protéines, entraînerait la croissance de cristaux en moins de 24 heures. Cela indiquait que la cristallisation se produisait par lot plutôt que par un processus entraîné par diffusion de vapeur. Le cristal cultivé dans ces conditions était donc adapté à une mise à l’échelle à des volumes plus importants.

Si les cristaux n’avaient pas été visibles dans les gouttes non ensemencées après 24 heures, il aurait été probable que la cristallisation dépendait encore d’une transition (Figure 1B) et, par conséquent, non d’un lot. Dans ce cas, les résultats de l’expérience morphogramme sont toujours intéressants. Ils donnent une indication du point de départ probable de la cristallisation sur le diagramme de phase et, par conséquent, comment l’optimisation ultérieure devrait se dérouler. Regardez les gouttes ensemencées. Les graines permettront la croissance des cristaux dans la région métastable, quelle que soit la nucléation. Par exemple, si des cristaux apparaissent dans les 24 heures dans les gouttes ensemencées mais pas dans les gouttes non ensemencées, cela indique qu’une partie de la région métastable peut être observée. Si aucun cristal n’est observé dans les gouttes ensemencées ou non ensemencées, tous les puits restent sous-saturés.

Détartrage
En regardant le morphogramme (Figure 6A), un certain nombre d’observations ont pu être faites. La quantité de nucléation semble être affectée à la fois par les concentrations de protéines et de précipitants. Il y avait aussi une démarcation très claire des gouttes qui conduisent à la précipitation des protéines, avec des gouttes contenant soit : rien, des cristaux ou du précipité (Figure 6B). L’ajout de graines (figure 6D) a également augmenté considérablement X_n par rapport aux gouttes sans graines (figure 6C). En prenant tous ces résultats ensemble, il a été décidé de tenter de mettre à l’échelle un protocole de lot et de lot ensemencé à 30% (p / v) PEG 6 000 et 100 mg / mL d’endothiapepsine.

Le test initial de mise à l’échelle a été effectué dans des plaques de chute suspendues à 24 puits. Les volumes de gouttes ont été progressivement augmentés afin d’observer tout changement de comportement de cristallisation (figure 7). Comme on peut le voir, dans les gouttes non ensemencées et ensemencées, une croissance cristalline s’est produite. Toutes les gouttes non ensemencées ont développé une gamme de tailles de cristaux, mais principalement de gros cristaux (100-200 μm - dimension la plus longue). Les gouttes ensemencées, cependant, ont produit des cristaux plus petits (5 - 50 μm - dimension la plus longue). Ces premiers tests suggéraient que les semences seraient nécessaires pour diminuer X_s, mais aussi, que cette condition devrait convenir à de plus grands volumes.

Lorsque le volume a été augmenté de 200 μL, le volume de cristallisation a été continuellement agité pendant la croissance des cristaux. La raison principale de cette agitation était de s’assurer que la solution de cristallisation reste homogène et que les cristaux en croissance ne se déposent pas sur le fond ou les côtés des tubes. La décantation des cristaux peut conduire à une population cristalline hétérogène avec des cristaux très grands et petits. L’agitation de la solution de cristallisation peut également favoriser la nucléation^44,45.

Malheureusement, les 30% (p/v) de PEG 6 000 non ensemencés n’ont produit aucun cristal, de sorte que la concentration de PEG a été augmentée à 35% (p/v). Cette augmentation a nettement amélioré la cristallisation, avec une plage finale X_n et X_s de 3,6 ± 1,2 x 10⁶ cristaux·mL-1 et 42 ± ^4,1 μm, respectivement (Figure 8A et B - noir). Bien qu’il s’agisse d’une amélioration significative et d’une concentration de cristaux acceptable, les cristaux finaux étaient trop grands pour l’expérience prévue, de sorte que d’autres optimisations ont été entreprises. Pour réduire la taille des cristaux finaux, deux pistes ont été explorées (Figure 1E) : diminuer la concentration en protéines pour tenter de limiter la croissance finale des cristaux (Figure 8A et B - rose vif), et augmenter la concentration de PEG pour essayer d’augmenter la nucléation (Figure 8A et B - vert).

La réduction de la concentration en protéines a malheureusement également considérablement réduit le X_n, qui a finalement produit des cristaux encore plus gros. L’augmentation de la concentration de PEG à 40% a donné une plage finale X_n et X_s de 3,1 ± 0,7 x 10⁶ cristaux·^mL-1 et 39 ± 2,3 μm, respectivement. Ceux-ci n’étaient pas significativement différents des 35%, mais comme la taille finale du cristal a été réduite, cette condition a été poursuivie avec les optimisations supplémentaires.

Pour augmenter le X_n, des graines ont été ajoutées. Cela a considérablement augmenté le X_n (1,1 ± 1,8 x 10⁸ cristaux ·mL-1) et a conduit à_{un X s} plus petit (4,2 ± 4,0 μm) (Figure 8A et B - en pointillés violet). Ces cristaux, bien que très appropriés pour certaines expériences de cristallographie en série, ont été jugés trop petits, de sorte que la concentration des graines ajoutées a été modifiée.

Cet ajustement du stock de semences ajouté s’est toutefois avéré difficile à répéter de manière fiable; Par conséquent, une trempe a été tentée. Après l’ajout d’un stock de graines, la taille des cristaux a été surveillée et une fois qu’une taille de cristal appropriée a été atteinte (environ 10 à 20 μm), la cristallisation du lot a été éteinte (Figure 8C et D). La trempe a été proposée, en ce qui concerne la microcristallisation, dans Kupitz et al. (2014)²⁵. Bien que ce ne soit peut-être pas une méthode idéale, car la solution protéique sera finalement gaspillée²⁶, la technique a été très utile dans cette situation car la croissance des cristaux était difficile à contrôler. L’idée derrière la trempe est de ramener rapidement le mélange de cristallisation à un point juste au-dessus de la ligne de solubilité (Figure 1F). Une fois que la solution est revenue à la ligne de solubilité, la solution est revenue à une solution saturée stable et aucune autre croissance cristalline ne se produira.

Tenter d’éteindre une réaction de cristallisation n’est pas sans risque. Si une solution de trempe trop grande est ajoutée, la protéine en solution peut être diluée à tel point que la ligne de solubilité est passée. Dans ce cas, la solution deviendra sous-saturée et les cristaux commenceront à se dissoudre. Pour éviter cela, il est possible d’estimer la quantité de solution de trempe requise en fonction des résultats du morphogramme. Au moment de la trempe, prenez la concentration de la solution protéique. En comparant la concentration en protéines à la ligne de solubilité et la concentration en protéines en solution, on peut estimer la dilution requise.

La version trempée de l’expérience de graines diluées à 40% (p / v) PEG 6,000, 10 x a donné une concentration cristalline finale et une plage de taille de 2,6 ± 3,1 x 10⁶ cristaux ·^mL-1 et 15 ± 3,9 μm, respectivement.

Tout au long du processus, des collectes de données de test de rayons X des cristaux d’endothiapepsine ont été collectées sur la ligne de faisceau PXII de la Source de Lumière Suisse en utilisant un foyer de 10 x 30 μm, une énergie de 12,4 keV atténuée de 80% et dans des conditions cryogéniques. Les données ont été traitées à l’aide de cadrans et la figure 9 montre une comparaison de CC_1/2. Aucun changement spectaculaire de CC_1/2 n’a été observé au cours de l’optimisation.

Figure 1 : Vue d’ensemble de la cristallisation transitoire et discontinue, et des méthodes de mise à l’échelle mappées sur un diagramme de phase. A. Les zones et les limites du diagramme de phase de cristallisation des protéines archétypal. Les concentrations de précipitant et de protéines sont tracées sur les axes x et y, respectivement, avec le point d’eau pure à l’origine. La ligne violette indique la limite de sursaturation des protéines, et les zones métastable, de nucléation et de précipitation sont indiquées en bleu, vert et rose, respectivement. B. Un exemple des limites de pénétration de la zone de nucléation d’une méthode de cristallisation en « phase transitionnelle », telle que la diffusion de vapeur. Dans cette expérience théorique, les concentrations de précipitant de goutte et de protéines commencent juste en dessous de la ligne de solubilité - pas encore sursaturées. Pendant que la goutte s’équilibre, les concentrations des composants de la goutte augmentent de telle sorte que la goutte devient sursaturée et continue de se déplacer - ou de faire la transition - dans la zone de nucléation. Lors de la nucléation cristalline, la concentration de protéines en solution commence à baisser. La concentration continue de diminuer à mesure que les cristaux se développent jusqu’à s’arrêter finalement à la ligne de solubilité. La ligne pointillée bleue marque une limite théorique de la transition dans la zone de nucléation. Dès que la nucléation commence, la concentration en protéines diminue, empêchant une pénétration ultérieure. C. Exemples de trajectoires de cristallisation par lots et par lots ensemencés. En lot, le mélange de la protéine et du précipitant doit créer une solution sursaturée dans la zone de nucléation afin que la croissance des cristaux puisse se produire. Dans le lot ensemencé, il n’est pas strictement nécessaire d’être dans la zone de nucléation en raison de l’ajout de micro-graines, de sorte que les emplacements dans la région métastable peuvent également être explorés. D. Une optimisation hypothétique de l’expérience de cristallisation montrée en B de la diffusion de vapeur au lot. Le point de départ original de la diffusion de vapeur est passé, via le vecteur d’optimisation résultant, à la nouvelle position de départ; à l’intérieur de la zone de nucléation. Le vecteur résultant est le produit de deux optimisations : une augmentation des concentrations de protéines et de précipitants. E. Exemples d’optimisations lors de la mise à l’échelle des conditions de lot pour adapter les X_n et X_finaux. F. Extinction de l’expérience de cristallisation par l’ajout d’un tampon de cristallisation. Il est essentiel que la trempe ne retire pas la concentration protéique de la région métastable et, par conséquent, en dessous du point de sursaturation protéique. Sinon, les cristaux commenceront à se dissoudre en solution. B. et C. ont été adaptés de Beale et al. (2019)²⁶ avec la permission des auteurs. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Augmentation de X_n et diminution de X_s. La relation idéalisée entre le nombre de cristaux produits à partir d’une expérience de cristallisation et leur dimension moyenne la plus longue. Pour créer ce graphique, la cristallisation d’une protéine modèle hypothétique de 10 kDa a été utilisée. La protéine cristallisait à une concentration de 10 mg/mL et donnait des cristaux P2₁2 1 2₁de dimensions de 49x50x51 Å. Chaque événement de nucléation était supposé produire un cristal. La croissance cristalline a été supposée être homogène de toutes les faces. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Un organigramme montrant les étapes à suivre pour optimiser un cristal cultivé dans une expérience de diffusion de vapeur de petit volume (<500 nL) dans une expérience de grand volume (> 100 μL). L’optimisation cristalline est divisée en trois étapes: (1) Optimisation de la morphologie cristalline. (2) Passage au lot. (3) Mise à l’échelle. Au stade 1, il est important d’identifier les cristaux appropriés pour la microcristallisation. Certaines protéines ne sont présentes que dans une morphologie monocristalline, quelle que soit la condition de cristallisation. Cependant, il vaut la peine de rechercher des conditions qui donnent naissance à des cristaux uniques, semblables à des cubes, ou aussi proches de ceux-ci que possible. Les cristaux simples ressemblant à des cubes, hypothétiquement et anecdotiquement, donneront généralement lieu à de meilleurs résultats des expériences de cristallographie en série. Une fois qu’une morphologie cristalline a été sélectionnée et que la diffraction a été confirmée, il est alors nécessaire de déplacer l’expérience de cristallisation de la diffusion de vapeur au lot (étape 2). Ici, les cristaux doivent être optimisés par leur temps de nucléation. L’objectif est de trouver des conditions qui donnent des cristaux apparaissant rapidement (> 24 h) car ces conditions sont susceptibles de frapper immédiatement la zone de nucléation, et sont donc discontinues. Une fois qu’une condition dans la zone de nucléation a été trouvée, un morphogramme peut être créé. Le morphogramme permet à la majorité de la zone de nucléation de cartographier et d’identifier les voies de mise à l’échelle potentielles pour l’étape 3. Le volume d’une condition de lot identifiée peut ensuite être mis à l’échelle progressivement ou rapidement pour obtenir un volume final de > 100 μL. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Analyse des conditions de cristallisation de l’endothiapepsine à partir d’un criblage à matrice clairsemée PACT. A. et B. sont des photos après 24 h des puits A4 et C10, respectivement de l’écran PACT. Les composants du tampon de cristallisation sont mis en évidence sur la figure. Le tampon SPG est constitué d’acide succinique, de dihydrogénophosphate de sodium et de glycine mélangés dans un rapport molaire de 2:7:7. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : Analyse de l’optimisation de la cristallisation de l’endothiapepsine à partir des conditions PACT MgCl₂. Une carte thermique des résultats d’une analyse de corrélation de Pearson entre le pH tampon, la concentration de MgCl₂ et la concentration de précipitant et le niveau de précipitation et la qualité des cristaux. Le niveau de précipitation et la qualité des cristaux ont tous deux été évalués arbitrairement sur une échelle de 0 à 5 (0 étant l’absence de cristaux ou de précipitations) après 24 h av. J.-C. et D. montrent des exemples de cristallisation et de précipitation en trois gouttes différentes. L’état de cristallisation et les évaluations du niveau de précipitation et de la qualité cristalline sont également présentés. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6 : Morphogramme de l’endothiapepsine cristallisée dans 0,1 M Tris-HCl pH 7,0, 0,15 M MgCl2 et PEG 6 000. A. Un morphogramme créé à partir de la feuille de calcul « phase-diagramme-générateur » fournie. Le nombre relatif de cristaux dans chaque goutte est indiqué par la taille des cercles, et les résultats de la goutte 1 (protéine et précipitant) et de la goutte 2 (protéine, précipitant et graines) sont mis en évidence en vert et en bleu, respectivement. Les valeurs des concentrations de protéines et de précipitants, sur les axes x et y, respectivement, indiquent les valeurs prémélangées de chaque volume plutôt que les volumes finaux. Sur la base des résultats, des lignes noires et une ligne violette ont été dessinées pour montrer les limites de la zone de nucléation et de la zone métastable, respectivement. J.-C. et D. montrent quelques exemples de résultats de l’expérience. Les points rouges et bleus marqués sur A. indiquent les emplacements de B. et C. et D., respectivement. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 7 : Essais initiaux de mise à l’échelle de l’endothiapepsine dans des plaques de chute suspendues à 24 puits. Les mêmes concentrations de protéines et de précipitants ont été utilisées pour toutes les pistes : 100 mg/mL d’endothiapepsine dans 0,1 M d’acétate de Na pH 4,6 et 0,1 M Tris-HCl pH 7,0, 0,15 M MgCl₂ et 30 % (p/v) de PEG 6 000, respectivement. Toutes les images affichées ont été prises après 24 heures et les volumes de chute finaux sont étiquetés sur chaque image. Le panneau gauche (A, D et G) est un mélange 1:1 de protéines et de précipitant, le panneau du milieu (B, E et H) est un mélange 1:2:3 de graines, de précipitant et de protéines et le panneau de droite (C, F et I) sont des images agrandies du panneau du milieu. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 8 : Analyse de la microcristallisation de l’endothiapepsine dans des volumes de 200 à 300 μL. A. et C. montrent comment X_n a changé au cours de l’expérience. B. et D. montrent comment X_s (dimension la plus longue) a changé au fil du temps. Les résultats des expériences ont été séparés pour plus de clarté. La ligne pointillée rouge sur C. et D. indique le point auquel la trempe a été effectuée. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 9 : Résultats CC_1/2 et images de cristaux obtenus à chaque étape du processus de microcristallisation pour évaluer la qualité de la diffraction. A. CC_1/2 a été tracé en fonction de la résolution à partir de données recueillies à partir de cristaux cultivés: avec et sans Mg - partie de l’optimisation de l’étape 1, dans un volume de 200 nL, un volume de 10 μL et le volume final de 300 μL. B.C. et D. montrent les cristaux des volumes de 200 nL, 10 μL et 300 μL, respectivement. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Informations sur les protéines
Protéine	Endothiapepsine
Poids moléculaire (kDa)	33.8
Groupe d’espace	P12 11
a, b, c (Å)	45.2, 73.3, 52.7
α, β, ɣ (°)	90.0, 109.2, 90.0
Paramètres cibles fixes
Volume chargé par puce (μL)	150
Ouvertures par puce	25,600
Concentration cristalline requise (cristaux/mL)	500,000
Exemple d’informations
Masse protéique utilisée pour fabriquer 200 μL d’échantillon (mg)	10
Cristal plus longue dimension (μm)	15
Concentration en cristaux (cristaux/mL)	2,500,000
Variables expérimentales
Nombre de points temporels requis	5
Nombre d’images requises par point de temps	50,000
Taux de réussite (modèles intégrés/images collectés)	0.3
Objectifs fixes requis par point temporel (arrondis à la valeur supérieure)	7
Exigences relatives aux échantillons
Volume d’échantillon requis par point temporel (μL)	1,050
Volume total de l’échantillon requis pour l’expérience (mL)	5.25
Masse totale de protéines requise (mg)	52.5

Tableau 1 : Exemple des besoins en échantillons pour une expérience hypothétique de pompe-sonde optique réalisée à l’aide de cibles fixes. La protéine utilisée dans cette expérience théorique était l’endothiapepsine. Les paramètres cibles fixes étaient basés sur des expériences rapportées dans Ebrahim et al. (2019)⁴⁸ et Davy et al. (2019)⁴⁹. Les informations de l’échantillon provenaient du protocole rapporté dans cet article vidéo et les variables expérimentales étaient des estimations prudentes basées sur l’expérience vécue. Les besoins suivants ont été calculés par la suite en fonction des hypothèses précédentes.

Discussion

La méthode présentée montre comment optimiser la cristallisation de l’endothiapepsine à partir de gros cristaux (≥ dimension la plus longue de 100 μm), cultivés dans des cribles à 96 puits à matrice clairsemée, à des microcristaux, cultivés dans des tubes à centrifuger (volume de 300 μL) par lots. L’idée derrière le protocole est que les mesures prises pour optimiser l’endothiapepsine pourraient également être utilisées pour d’autres protéines. En fin de compte, répondre au problème de la création de grands volumes (>100 μL) de microcristaux (10-20 μm) pour des expériences de cristallographie en série dans des XFEL et des synchrotrons.

Le protocole divise la tâche de microcristallisation à grand volume en trois étapes: (1) optimisation de la morphologie cristalline, (2) transition vers le lot et (3) mise à l’échelle. À l’étape 1, la gamme de formes cristallines qu’une protéine peut créer doit être explorée dans des plaques de diffusion de vapeur. Les conditions qui donnent naissance à des cristaux uniques en forme de boîte qui diffractent à la résolution requise devraient être l’objectif. À l’étape 2, les conditions sélectionnées peuvent ensuite être transformées de la diffusion de vapeur en lot. Ici, le critère d’optimisation est le temps de croissance des cristaux et de trouver des conditions qui donnent naissance à des cristaux de protéines dans les 24 heures. Un morphogramme peut également être tracé donnant à l’expérimentateur une idée de l’emplacement de la ligne de solubilité et des limites de la zone de nucléation. Ce morphogramme est d’une grande utilité à l’étape 3, Mise à l’échelle. Le morphogramme indiquera si la nucléation seule peut augmenter X_n et faire descendre X_s. Au fur et à mesure que le volume de l’expérience augmente, X_n et X_s peuvent être continuellement évalués comme les critères clés du succès de la mise à l’échelle.

Dans le cas de l’endothiapepsine, l’étape 1 a mis au jour ce qui était potentiellement une morphologie cristalline jusqu’alors inconnue pour l’endothiapepsine. Cette morphologie avait le même groupe spatial que ceux précédemment rapportés mais, ce qui est important pour la cristallographie en série, une forme plus en forme de boîte. Les monocristaux semblaient également se développer à partir de points de nucléation simples, contrairement aux ventilateurs créés à partir d’autres conditions (Figure 4). Pour la condition sélectionnée, l’étape 2 était déjà partiellement satisfaite car la croissance des cristaux s’est produite en < 24 heures. Le morphogramme indiquait qu’un protocole de lot direct ou ensemencé pouvait réussir lors de la mise à l’échelle à l’étape 3. La mise à l’échelle initiale en lot direct, a créé une condition qui a produit des cristaux avec une gamme X_n et X_s de 3,6 ± 1,2 x 10⁶ cristaux ·^mL-1 et 42 ± 4,1 μm, respectivement. Ces cristaux, bien qu’acceptables pour certaines expériences de cristallographie en série, ont été jugés trop gros. Des optimisations supplémentaires ont donc été effectuées. Le protocole final a produit des cristaux avec une concentration et une gamme de taille de 3,1 x 10⁶ cristaux·^mL-1 et 15 ± 3,9 μm, respectivement. C’était plus qu’idéal pour les expériences prévues.

La méthode se concentre sur la transformation en lots de cristaux de protéines « solubles » cultivés dans des plaques de diffusion de vapeur. La raison de cette focalisation est que la grande majorité des cristaux de protéines solubles sont cultivés par diffusion de vapeur²⁶. Cependant, les concepts présentés pourraient également être appliqués à des cristaux de protéines solubles cultivés à l’aide d’autres méthodes, telles que les micro-lots. Les concepts peuvent également s’appliquer aux cristaux de protéines membranaires cultivés en LCP; car il s’agit également d’un processus de cristallisation par lots.

Un aspect clé du protocole est le processus de transformation des conditions des cristaux cultivés dans des plaques de diffusion de vapeur afin qu’ils puissent être cultivés par lots. Pour cette transformation, la méthode utilise le critère proposé par Beale et al. (2019)²⁶. Les cristaux cultivés par un procédé discontinu, même dans des plaques de diffusion de vapeur, se formeront rapidement (< 24 h). Ce critère est une approximation basée sur la vitesse d’équilibration des gouttes de diffusion de vapeur, et est particulièrement vrai pour les conditions précipitantes basées sur le PEG. Cependant, les conditions de cristallisation contiendront une grande variété de composés qui influenceront le temps d’équilibre. L’équilibrage des conditions de cristallisation à base de sel, par exemple le chlorure d’ammonium hautement concentré, peut se produire en 1-2 jours. Par conséquent, le critère des 24 h peut ne pas être vrai pour les conditions à base de sel. Les conditions à base de sel peuvent également avoir des diagrammes de phase plus complexes^26,30 qui peuvent ne pas être conformes à l’archétype présenté dans ce protocole. Une réduction du critère de temps pour les conditions à base de sel à 12 ou 6 heures peut être nécessaire si la mise à l’échelle en plus grands volumes s’avère impossible.

Une autre limite de cette méthode est sa complexité apparente. Le protocole qui a été suivi pour optimiser la micro-cristallisation de l’endothiapepsine a en fait changé relativement peu l’état d’origine du criblage à matrice clairsemée. Le premier résultat observé dans le criblage PACT était de 0,1 HEPES pH 7,0, 0,2 M MgCl₂ et 20% (p/v) PEG 6 000. Le tampon de cristallisation à l’échelle finale était de 0,1 Tris-HCl pH 7,0, 0,15 M MgCl₂ et 40 % (p/v) PEG 6 000. Il est également très possible que le changement de tampon de HEPES à Tris-HCl, et la concentration de MgCl₂ , aient peu contribué au succès du processus. Laisser l’augmentation de la concentration de PEG 6 000 comme seule optimisation, et celle qui aurait pu être réalisée tout simplement.

Cependant, cette évaluation est également trop simpliste. Cela ne tient pas compte seulement des problèmes rencontrés lors du détartrage (c’est-à-dire l’utilisation de graines et la trempe), mais aussi du fait que ce n’est pas parce que cette protéine s’est avérée simple que la prochaine s’avérera également être. Les étapes conseillées dans le protocole ont été conçues parce que l’optimisation de la mise à l’échelle des volumes de cristallisation des protéines peut être très coûteuse en protéines. Au cours des sept essais de détartrage de l’endothiapepsine qui sont montrés, 100 mg de protéines ont été consommés. Certes, certaines de ces étapes ont été effectuées pour montrer leurs conséquences à la lumière de ce protocole. Même ainsi, 100 mg d’une protéine, plus potentiellement 50 mg supplémentaires pour les protéines consommées au cours d’une expérience (tableau 1), peuvent être un investissement important en temps ou en argent.

Heureusement, il n’est pas clair que cette masse d’échantillon requis soit omniprésente dans toutes les protéines. L’endothiapepsine était très soluble et nécessitait donc une forte concentration de protéines pour atteindre la sursaturation. Dans d’autres (actuellement en cours d’optimisation), la sursaturation peut être atteinte à 10 voire 5 mg/mL. Ces variables sont spécifiques aux protéines et doivent être adoptées lorsqu’elles apparaissent.

Parmi les autres limites de la méthode, citons sa dépendance à l’égard d’équipements complexes tels que des robots de manipulation de liquides pour la création de cribles et de plaques, et des imageurs pour imager automatiquement les plaques en cas de besoin. Des routines alternatives ont été proposées pour limiter le besoin de certains de ces équipements, mais le protocole prendra plus de temps à suivre sans elles. Le protocole suggère également de tester la diffraction de cristaux optimisés. Pour les cristallographes qui n’ont pas d’accès régulier à un synchrotron, ces tests pourraient s’avérer difficiles. Des contrôles à chaque étape peuvent ne pas être nécessaires, mais ces tests sont fortement recommandés une fois qu’un résultat positif a été identifié, ainsi qu’avant et après la mise à l’échelle. Les cristaux non diffractés dans un XFEL ne sont malheureusement pas rares. Compte tenu de cela, il est préférable de pécher par excès de prudence en ce qui concerne les hypothèses sur la diffraction cristalline.

En fin de compte, ce protocole et les résultats présentés ici offriront un guide, des idées et un exemple à ceux qui luttent avec la production d’échantillons pour des expériences de cristallographie en série. Espérons qu’au fur et à mesure que la cristallographie en série sera développée, les demandes d’échantillons de la technique seront réduites de sorte que le besoin de protocoles comme celui-ci sera réduit. Cependant, même dans cet événement, les stratégies présentées ici seront toujours utiles à ceux qui souhaitent explorer l’espace de cristallisation de leur protéine.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Swissci 96-well 2-Drop plates	Molecular Dimensions	MD11-002	96-well 2-drop crystallisation plate
Swissci 96-well 3-Drop plates	Molecular Dimensions	MD11-003	96-well 3-drop crystallisation plate
mosquito LCP liquid handling robot	sptlabtech	mosquito LCP	Crystallisation robot
ClearVue Sheets	Molecular Dimensions	MD6-015	96-well crystallization plate seals
Safe-Tube 1.5 mL	Eppendorf	30120086	1.5 mL centrifuge tubes
Scaple	Swan and Morton	No. 3 scalple and No. 3 handle	Scalple for cutting open plate seals
MS 3 Vortex	IKA	3319000	Vortex for mixing solution and making seed stocks
24-well XRL Plate	Molecular Dimensions	MD3-11	24-well hanging-drop plates
Tube revolver/rotator	Thermo Fischer Scientific	88881001	Tube revolver for mixing solution during scaling
Eppendorf Research plus pipettes	Eppendorf		Range of manual pipettes, 0.5-10, 1-20, 10-100, 100-1000 µL
Eppendorf pipette tips	Eppendorf		Range of tip sizes for manual pipettes
Suparen 600	Prochem AG	Suparen 600	Endothiapepsin solution
Sodium Acetate	Sigma-Aldrich	241245-1KG	Sodium Acetate
Tris	Merck	8382T014	Tris
Magnesium Chloride	Sigma-Aldrich	M2670-1kg	Magnesium Chloride
PEG 6,000	Sigma-Aldrich	81255-1kg	PEG 6,000
Ethelyene glycol	Sigma-Aldrich	324558-1L	Ethelyene glycol for cyro-protecting the crystals
PACT Premier HT screen	Molecular Dimensions	MD1-36	PACT Premier 96-well crystal screen
DOW CORNING high vacuum grease	Molecular Dimensions	MD6-02	Grease for sealing 24-well plates
Hirschmann 22 x 22 mm glaser cover slides	Hirschmann	8000104	Cover slides for sealing 24-well sitting drop plates
Crystal pins	PSI	Manufactured inhouse	Thin-film supports for micro-crystals.
1-1.3 mm SiLibeads Type S	Faust	6239547	Glass beads for making mico-seed stocks
Macbook Pro	Apple	Macbook Pro	Computer for performing data analysis
CCP4 software suite	CCP4		Diffraction pattern data processing software
Excel	Microsoft	Microsoft Office	Plotting tool for phase diagram
Hausser Scientific Bright-Line counting chamber	Thermo Fischer Scientific	02-671-51B	Tool to calculate crystal concentration
PACT Premier	Molecular Dimensions	MD1-29-ECO	Sparse-matrix crystallization screen
Rock Imager	Formulatrix	Rock Imager	Temperature controlled crystal plate storage and imager
Rock MakerWeb	Formulatrix	Rock MakerWeb	Crystal plate creation and image storage stoftware
Formulator	Formulatrix	Formulator	96-well crystal screen creation liquid handling robot
Leica MZ16 Microscope	Leica	Leica MZ16	Light microscope
LAS V4.6	Leica	LAS V4.6	Software for Leica microscopes
Spectra/Por 3.5 kDa dialysis tubing	Spectrumlabs	Spectra/Por 3 Dialysis Membrane	3.5 kDa dialysis membrane
Dialysis tubing closures	Spectrumlabs	Spectra/Por 3 Duniversal Closures	Clips to seal the dialysis tubing ends
Amicon 10 kDa centrifugal concentrator	Merck-Millipore	Amicon Ultra-15 10 kDa centrifugal concentrator	10 kDa centrifugal filter
5810 R swing bucket centrifuge	Eppendorf	5810 R Centrifuge	Swing bucket centrifuge