Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Optimera tillväxten av endotiapepsinkristaller för seriella kristallografiexperiment

Published: February 4, 2021 doi: 10.3791/61896
Automatic Translation
1, 1
1Swiss Light Source, Paul Scherrer Institut

Summary

Syftet med denna artikel är att ge betraktaren en gedigen förståelse för hur man omvandlar sitt ångdiffusionsprotokoll med liten volym, för odling av stora, enkla proteinkristaller, till en mikrokristallisationsmetod för stor volym för seriell kristallografi.

Abstract

Här presenteras ett protokoll för att underlätta skapandet av stora volymer (> 100 μL) mikrokristallina uppslamningar lämpliga för seriella kristallografiexperiment vid både synkrotroner och XFEL. Metoden bygger på en förståelse av proteinkristallfasdiagrammet, och hur den kunskapen kan utnyttjas. Metoden är indelad i tre steg: (1) optimering av kristallmorfologi, (2) övergång till batch och (3) skalning. Steg 1 innebär att hitta väl diffrakterande, enstaka kristaller, förhoppningsvis men inte nödvändigtvis, som presenterar i en kubliknande morfologi. I steg 2 optimeras steg 1-tillståndet av kristalltillväxttiden. Denna strategi kan omvandla kristaller som odlas genom ångdiffusion till sats. När kristalltillväxt kan ske inom cirka 24 timmar kan ett morfogram av proteinet och fällningsblandningen plottas och användas som grund för en skalningsstrategi (steg 3). När kristaller kan odlas i batch kan skalning försökas och kristallstorleken och koncentrationen optimeras när volymen ökar. Endothiapepsin har använts som demonstrationsprotein för detta protokoll. Några av de beslut som presenteras är specifika för endothiapepsin. Förhoppningen är dock att det sätt på vilket de har tillämpats kommer att inspirera till ett sätt att tänka på detta förfarande som andra kan anpassa till sina egna projekt.

Introduction

Rumstemperatur (RT) makromolekylär kristallografi är populär igen inom strukturbiologin. Utvecklingen av röntgenfrielektronlaser (XFEL) ljuskällor har stimulerat utvecklingen av RT-provleveransmetoder 1,2,3,4, och dessa metoder har nu tillämpats på synkrotroner 5,6,7,8. RT-metoder öppnar inte bara möjligheten för experimentella svågstubbar 9,10,11,12, utan det finns också ökande bevis för att de främjar alternativa konformationstillstånd inom proteinerna 13,14,15,16,17.

Den främsta anledningen till att kryometoder fick dragkraft över RT-tillvägagångssätt i slutet av 1990-talet var dock att strålningsskador bromsades av kristalltemperaturer under noll18. Kryometoder19 började möjliggöra insamling av ett komplett dataset från en enda proteinkristall. Moderna RT-metoder vid XFEL och synkrotroner löste problemet med enkristallstrålningsskador genom utveckling av snabba (> 100 Hz) kristallleveransstrategier 1,2,3,4. Dessa metoder möjliggör insamling av en komplett datauppsättning från tusentals individuellt exponerade kristaller. Dessa RT-leveransmetoder kräver därför produktion av stora mängder lösningar som innehåller homogena mikrokristaller (> 100 μL < 50 μm kristaller). Men eftersom kryometoder tenderar att endast kräva enstaka kristaller, är metoder för att skapa sådana mikrokristallina uppslamningar för närvarande inte allestädes närvarande i proteinkristallografilaboratorier.

Det finns exempel i litteraturen på hur man gör delar av mikrokristallisationsoptimeringsproceduren för seriella kristallografiprover. Här bör man skilja mellan membran och lösliga proteiner. Protokoll för att optimera tillväxten av mikromembranproteinkristaller odlade i monoolein (eller någon annan lipid), för lipidisk kubisk fas (LCP), har beskrivits väl 20,21,22. Metoder för mikrokristallisation av lösliga proteiner, inklusive membranproteiner odlade under icke-LCP-förhållanden, saknas dock i allmänhet. Tidigare studier har fokuserat på specifika delar av processen, såsom mikrokristallscreening 23,24, förbättrad kärnbildning24 och skalning med fri gränssnittsdiffusion 25, men inte en komplett metod.

En metod beskrevs docknyligen 26 som försöker erbjuda ett komplett protokoll. Liksom många aspekter av proteinkristallografi är det inte nytt. Många av de föreslagna idéerna beskrevs redan av Rayment (2002)27. Metoden syftar till att visa kristallografer hur man utför omvandlingen från en enda kristall odlad med ångdiffusion, till en batchmetodik för att odla tusentals mikrokristaller. Metoden fokuserar på ångdiffusion som en vanlig utgångspunkt, eftersom 95% av alla Protein Data Bank (PDB) depositioner kommer från kristaller odlade i ångdiffusionsplattor26. Ångdiffusion är dock inte den ideala metoden för mikrokristallisation26, så en metod beskrivs för att omvandla ångdiffusion till satskristallisation. När kristaller kan odlas i batch blir skalningsvägar till större volymer mer praktiska. Med tanke på vagarierna för proteinkristallisering skulle författarna betona att denna metod inte är felsäker. Protokollet bör dock åtminstone ge en inblick i ett proteins "kristallisationsutrymme".

Denna metod bygger på proteinkristallisationsfasdiagrammet och hur en förståelse av det diagrammet kan fungera som en guide under optimering av mikrokristallisation. Ett proteinfasdiagram avbildas vanligen som ett x/y-diagram med utfällnings- och proteinkoncentrationer på x- respektive y-axlarna (figur 1A). Från den rena vattenpunkten (nedre vänstra hörnet - figur 1A) ökar koncentrationen av både protein och fällningsmedel tills löslighetslinjen uppnås. Löslighetslinjen markerar punkten för övermättnad (lila linje - figur 1A). När ett protein övermättas blir lösningen termodynamiskt instabil och börjar separeras i två faser: "proteinrik" och en stabil mättad lösning. Denna separation kan ske var som helst bortom löslighetslinjen och dess kinetik är beroende av proteinets egenskaper och komponenterna i lösningen.

När protein- och fällningskoncentrationerna är för stora sönderdelas proteinet instabilt ur lösningen och resulterar i amorf fällning (rosa område - figur 1A). Ordnad fasseparation kan emellertid ske i kärnbildningsregionen [se Garcia-Ruiz (2003) 28 för detaljerad beskrivning] och kristallnukleanter har benägenhet att bildas (grön region - figur 1A). Kärnbildning och tillväxt tar bort protein från lösningen och flyttar droppen in i den metastabila regionen där tillväxten kan fortsätta tills löslighetslinjen nås [se McPherson and Kuznetsov (2014) 29 för detaljerad diskussion]. Diagrammet är, för de allra flesta kristallisationsförhållanden, en grov förenkling30. Oavsett detta är diagrammet fortfarande till stor nytta för mikrokristallografer, eftersom kartläggningen av diagrammet gör det möjligt att bestämma löslighetslinjen och kinetiken för kärnbildning.

När det gäller att skapa mikrokristaller är de två faktorerna under kristallisation som måste optimeras antalet kristaller (Xn) och deras medel, längsta dimension (Xs). X n kommer att vara proportionell mot antalet kärnbildningshändelser (n ) (Ekv. 1).

Equation 1     1 kv.

X s är proportionell mot koncentrationen av fritt protein ovanför löslighetslinjen (Ps) dividerat med Xn (Eq. 2).

Equation 2     Kv. 2

I en perfekt situation skulle varje kärnbildningshändelse ge en möjlig kristall och var och en av dessa kristaller skulle ha lika tillgång till det tillgängliga proteinet i lösning. Figur 2 är en grafisk representation från ett idealiskt scenario av förhållandet mellan Xn och Xs. I praktiken är den huvudsakliga kontrollen en kristallograf har över Xn och Xs genom att påverka mängden kärnbildning eller genom tillsats av frökristaller. Mikrokristallografen måste bedöma hur man ökar Xn så att en lämplig kristallkoncentration och kristallstorlek båda kan skapas.

De flesta kristallisationstekniker kräver en "övergångsperiod" (figur 1B). Till exempel, i ett ångdiffusionsexperiment, vid blandning av protein- och fällningslösningarna, kommer koncentrationerna av var och en att förändras när droppen balanserar med brunnslösningen. Man hoppas att dessa förändringar gradvis kommer att överföra droppen till kärnbildningszonen där benägenheten för kristallisation kommer att öka. När kristaller börjar kärna och växa, kommer mängden protein i lösning att börja falla, vilket minskar sannolikheten för ytterligare kärnbildning. Den ultimata mängden kärnbildning kommer att vara protein- och tillståndsspecifik, och också beroende av penetrationsdjupet i kärnbildningszonen. Med tanke på den begränsade kärnbildningszonpenetrationen av metoder som kräver ett övergångssteg, kommer kärnbildningsnivån i slutändan att begränsas till kärnbildningshastigheten vid gränsen mellan metastabil kärnbildningsregion.

På grund av vikten av att kunna förbättra kärnbildningsnivån för en mikrokristallograf är det viktigt att flytta till en satskristallisationsmetodik. Batch kan dra större nytta av hela kärnbildningsregionen (figur 1C). I batchmetoder är tanken att blanda proteinet och fällningsmedlet så att en övermättad lösning skapas utan att komponentkoncentrationerna behöver förändras. Kärnbildning bör vara möjlig omedelbart efter blandning. Batchmetoder gör det därför möjligt att teoretiskt nå hela kärnbildningszonen. Varje ökning av kärnbildningskinetiken bortom metastabil-kärnbildningsgränsen kan sedan utnyttjas.

Om den basala nivån av kristallkärnbildning inte räcker för att generera en stor Xn kan mikrosåddmetoder användas. Vid mikrosådd bryts förodlade kristaller upp för att skapa en uppslamning av kristallina fragment som kan fungera som en byggnadsställning för färsk kristalltillväxt31,32. Mikrosådd har använts i stor utsträckning vid seriell kristallografisk provberedning som ett sätt att öka Xn utan att behöva öka kristallkärnbildningen (figur 1C).

Övergången från ångdiffusion till sats kan visualiseras på ett fasdiagram som att flytta den experimentella startpunkten från antingen de icke-övermättade eller metastabila regionerna till kärnbildningszonen. Detta kan göras genom att öka protein- och/eller utfällningskoncentrationerna och/eller förhållandet mellan de två i droppen (figur 1D) och observera vilka förhållanden som ger kristaller som uppträder snabbt (< 24 timmar)26. Fullständig jämvikt för ångdiffusionsfall kan ta dagar eller veckor33. Därför, genom att leta efter förhållanden som visar snabbt framträdande kristaller, kan satsförhållanden hittas utan att behöva flytta till alternativa kristallisationsscreeningsformat som mikrosats34,35,36,37.

När kärnbildningszonen har hittats har ett satsförhållande hittats och ett morfogram - här ett grovt fasdiagram - kan skapas. Morfolimet är till stor nytta när man överväger om man ska använda ett seeded-batch eller straight batch-protokoll. Genom att plottaXn som en funktion av proteinet och fällningskoncentrationen kan en bedömning av kärnbildningskinetiken göras26. Om X n förblir låg över hela kärnbildningsområdet kan såddsats krävas för att göra Xn tillräckligt stor för att begränsa kristalltillväxten. Denna bedömning är det första steget i processen att skala till större volymer (> 100 μL).

Denna metod utformades så att den kunde utföras i de flesta kristallisationslaboratorier med hjälp av standard ångdiffusionskristallisationsutrustning. Många studier har också genomförts som beskriver tekniker för att underlätta många delar av denna process, om utrustningen finns tillgänglig. Dessa inkluderar, men är inte begränsade till, dynamisk ljusspridning (DLS) 25,27, icke-linjär avbildning 20,24,25, pulverdiffraktion 20,24,27 och elektronmikroskopi 26 [se Cheng et al. (2020) 40 för en fin recension].

Syftet med detta arbete är att ge en visuell demonstration av metoden för övergång från liten volym (< 500 nL) ångdiffusionskristallisation till stor volym (> 100 μL) satskristallisation. Endothiapepsin från Cryphonectria parasitica har använts som ett exempelsystem för att demonstrera denna översättning. Den typ av experiment och provleveransmetod som mikrokristallerna krävs för kommer att påverka den idealaX-utgången 26. Förblandningsexperiment som kräver en millisekunds tidsupplösning41 eller gasdynamiska virtuella munstycken42 kan ett slutligt X s på < 5 μm vara önskvärt. I det här fallet var målet att producera proteinkristaller som diffrakterar till cirka 1,5 Å, för ett fotonaktiverat pump-sondexperiment, och med hjälp av en fast målleveransmetod.

För att ge en illustration av provkraven för ett sådant seriellt kristallografiexperiment med användning av endothiapepsin, visar tabell 1 de experimentella parametrarna för ett hypotetiskt experiment. Provinformationen baserades på det protokoll som beskrivs nedan. Med tanke på vissa konservativa uppskattningar av träfffrekvenser och datainsamlingskrav är 50 mg den totala provförbrukningsuppskattningen för hela experimentet.

Figur 3 visar ett flödesschema över hela optimeringsprocessen från initial kristallisation av ångdiffusion i liten volym till storskalig sats. För de flesta seriella kristallografiprojekt kommer detta protokoll att börja vid steg 2: "övergång till batch", eftersom målproteinet redan har kristalliserats. Steg 1 har dock inkluderats för fullständighet och för att påminna läsarna om dess betydelse. Att hitta ett tillstånd som ger upphov till en väl diffrakterande, enkel, stor kristall är den bästa utgångspunkten för mikrokristalloptimering. I steg 2 kan detta tillstånd sedan optimeras från ångdiffusion till sats, och ett morfogram av kärnbildningen och metastabila regioner kan plottas. När detta har gjorts kan skalning av batchvillkoret till större volymer utföras i steg 3. I slutet av flödesschemat kommer en kristallograf att ha skapat ett repeterbart, stort volymprotokoll (> 100 μL), mikrokristallisation, batchprotokoll för endothiapepsin. Denna metod kan sedan tillämpas på deras speciella protein av intresse.

Protocol

OBS: Alla 96-brunns sittande droppkristallisationsexperiment installerades med antingen 2 eller 3-droppplattor. En vätskehanteringsrobot och en kristallisationskamera/hotell användes för att underlätta förberedelse och övervakning av alla 96-brunnsskärmar. Alla reagenskoncentrationer för kristallisationsexperiment anges vid sina startkoncentrationer före blandning.

1. Optimera kristallmorfologi

OBS: Steg 1.1.1. och 1.1.6. beskriva hur endothiapepsinkristallisationsförhållanden hittades, och hur dessa förhållanden optimerades för att hitta ett enda tillstånd som gav enstaka, väldiffracting kristaller.

  1. Optimering av glesmatris
    1. Förbered färsk endothiapepsinlösning.
      OBS: Endothiapepsin, när den anskaffas som Superan 600, måste buffras överföras från sin lagringslösning och koncentreras.
      1. Bered 3 l 0,1 M Na-acetat pH 4,6 vid 4 °C.
      2. Skär 20 cm dialysslang och tvätta kort i bufferten. Försegla ena änden av slangen med en klämma, placera 50 ml av endothiapepsinlösningen i slangen och försegla sedan den andra änden.
      3. Låt lösningen dialysera i minst 4 timmar (eller över natten) vid 4 °C i 1 l av Na-acetatbufferten. På grund av komponenterna i lagringsbufferten kommer lösningen i dialyspåsen nu att vara cirka 100 ml.
      4. Överför dialyspåsen som innehåller entiapepsin till en färsk liter 4 °C, 0,1 M Na-acetat pH 4,6. Upprepa detta steg en gång till så att den ursprungliga bufferten har spätts 2000x mot Na-acetatet.
      5. Endothiapepsin kommer nu att vara cirka 10 mg/ml. Koncentrera till 100 mg/ml med en 10 kDa centrifugalkoncentrator och en centrifug.
      6. Snabbkyl endotiapepsinlösningen i flytande kväve i 50 μl alikvoter och förvara vid -80 °C.
    2. Förbered en PACT Premier 96-brunns glesmatrisskärm.
      1. Använd en vätskehanteringsrobot och fördela 100 nL 70 mg/ml endotiapepsin och 100 nL brunnslösning i en enda delbrunn per brunn. Blanda proteinet och brunnslösningen 3 gånger efter tillsats av kristallisationsbufferten.
      2. Försegla plattan och låt verka i 28 dagar vid 20 °C, ta bilder varje dag under den första veckan och därefter varje vecka i 4 veckor.
    3. Analys av glesmatris
      1. Identifiera träffar som producerar enstaka endothiapepsinkristaller. Från PACT-skärmen växte förhållanden som innehöll MgCl2 som singletons snarare än nålkluster.
    4. Optimering av glesmatris
      1. Från MgCl2 som innehåller förhållanden som identifierades i steg 1.1.3.1, skapa en 96-brunnsskärm som slumpmässigt kombinerar och varierar de olika brunnskomponenterna.
      2. Använd en vätskehanteringsrobot och fördela 100 nL 70 mg/ml endotiapepsin och 100 nL brunnslösning i en enda delbrunn per brunn. Blanda proteinet och brunnslösningen 3 gånger efter tillsats av kristallisationsbufferten.
      3. Försegla plattan och låt verka i 28 dagar vid 20 °C, ta bilder varje dag under den första veckan och därefter varje vecka i 4 veckor.
    5. Optimering analys
      1. Med hjälp av lämplig kalkylprogramvara rangordnar du kristallisationsförhållandena som ger upphov till kristaller baserat på kristallkvalitet och utfällningsnivå, inga kristaller (0) till ideal (5) respektive låga (0) till höga (5). När det gäller kristallkvalitet är de breda kriterierna enstaka kristaller med en lådliknande morfologi.
      2. Utför en Pearsons korrelationsanalys mellan kristallisationstillståndets innehåll och kristallkvantiteten och nederbördsnivån.
      3. Rita dessa data som en värmekarta. Leta efter komponenter och villkor som korrelerades med de önskade resultaten.
    6. Diffraktionsanalys.
      1. Bekräfta att kristallerna som odlats från de identifierade förhållandena i steg 1.1.5 är lämpliga för seriell kristallografi genom att utföra ett röntgendiffraktionsexperiment.
      2. Ladda ett prov av endothiapepsinkristallerna från vart och ett av de identifierade förhållandena på stöd som möjliggör datainsamling vid antingen 100 eller 293 K och utför ett röntgendiffraktionsexperiment. Om du arbetar under kryo, använd 25% etylenglykol som kryoskyddsmedel.
      3. Bearbeta dessa data via en lämplig programvarusvit. Endothiapepsinkristaller bör diffraktera till över 1,5 Å. Kontrollera om det finns vänorter, eftersom tvillingkristaller avsevärt kan komplicera seriell kristallografisk databehandling.
      4. Om kristaller är singletons och diffrakterade till 1,5 Å fortsätt till steg 2. Om inte, gå tillbaka till steg 1.1.2 och prova mer glesa matrisskärmar för att identifiera lovande förhållanden. Efter de analyser som utförts i steg 1.1.5. och 1.1.6., ett kristallisationstillstånd på 25% (w/v) PEG 6 000, 0,1 M Tris-HCl pH 7,0 och 0,15 M MgCl2 borde ha hittats som det ungefärliga idealet.

2. Övergång till batch

  1. Morfogram experiment
    1. Skapa ett mikrokristallfrölager.
      OBS: Det är bästa praxis när man gör fröstammar, att göra frön från kristaller speciellt odlade för uppgiften. Detta hjälper i hög grad till reproducerbarhet. Andra idéer som presenteras i steg 2.1.1.1 till 2.1.1.11 är att alltid använda kristallerna som odlas från ett standardantal brunnar - här 5 - och alikvotera bestånden när de har gjorts för att upphäva frys-tina cykler.
      1. Bered en kristallisationsplatta med 96 brunnar med brunnar innehållande kristallisationsbufferten: 25% (w/v) PEG 6 000, 0,1 M Tris-HCl pH 7,0 och 0,15 M MgCl2.
      2. Använd en vätskehanteringsrobot och fördela 200 nL tinad 70 mg/ml endotiapepsin och 200 nL brunnslösning i en enda delbrunn per brunn. Blanda proteinet och brunnslösningen 3 gånger efter tillsats av kristallisationsbufferten.
      3. Försegla plattan och låt stå i 24 timmar.
      4. Fyll ett 1,5 ml centrifugrör med 250 μL kristallisationsbuffert och 10-15 1 mm glaspärlor. Låt centrifugröret stå på is för att svalna i 5-10 min.
      5. Välj 5 brunnar med kristaller, öppna brunnarna med en skalpell och krossa kristallerna i brunnarna med en pipettspets.
      6. Aspirera 1 μL buffert från iscentrifugröret och använd för att homogenisera den krossade kristalluppslamningen. När den är homogen, aspirera hela uppslamningen och samla i det kylda centrifugröret.
      7. Upprepa steg 2.1.2.6 för var och en av de 5 delbrunnarna.
      8. Virvla centrifugröret som innehåller bufferten, poolade uppslamningar och pärlor vid 1000 rpm i 30 s.
      9. Sätt tillbaka centrifugröret i is i 30 sekunder.
      10. Upprepa steg 2.1.2.8 och 2.1.2.9 ytterligare två gånger.
      11. Fröstocken är nu klar och kan alikvoteras i satser om 10 μl och lagras vid -20 °C.
    2. Utför morfogramexperiment.
      1. Förbered en rutnätskärm med 2 droppar, 96 brunnar. Variera koncentrationen av PEG 6 000 från 5 till 40 % (w/v) längs plattkolonnerna och håll bufferten och saltet vid 0,1 M Tris-HCl pH 7,0 respektive 0,15 M MgCl2.
      2. Bered en sekventiell utspädning av entiapepsin i 0,1 M Na-acetat pH 4,6 från 100 till 12,5 mg/ml i 8 steg. En annan koncentration av endothiapepsin kommer att användas för varje rad på plattan.
      3. Använd en vätskehanteringsrobot och dosera 150 nL endothiapepsin i både delbrunnarna 1 och 2. I delbrunn 1, fördela 150 nL av brunnslösningen. I delbrunn 2 multipliceras 50 nL tinad fröstam och 100 nL brunnslösning och dispenserar sedan båda i proteinlösningen. Blanda lösningarna 3 gånger efter tillsats av kristallisationsbufferten.
      4. Försegla plattan och låt den stå vid 20 °C och ta bilder var 0:e plats, 3, 6, 12, 18, 24:e timme, därefter varje dag under den första veckan och varje vecka under de följande fyra. Om automatisk avbildning inte är möjlig, oroa dig inte för timbilden på dag 1.
  2. Morfogram analys
    1. Titta på bilderna tagna efter 24 timmar, uppskatta antalet kristaller som finns i varje brunn och registrera dessa uppskattningar i kalkylbladet "morfogramgenerator". Dessa uppskattningar behöver inte vara exakta. Att individuellt räkna tusentals mikrokristaller, om de finns, är inte praktiskt eller nödvändigt. Försök i första hand att se till att uppskattningarna är konsekventa över hela plattan.
      OBS: 24-timmarsregeln baserades på observationerna i Beale et al . (2019) 26. Ångdiffusionskristallisationsförhållanden kan ta dagar eller veckor att balansera. Kristaller som uppträder snabbt är mer benägna att ha vuxit via en satsprocess snarare än genom gradvis jämvikt av droppkomponenterna. 24-timmarskriteriet är därför något godtyckligt och en exakt bryttid mellan ett sats- och ångdiffusionsexperiment beror på den specifika blandningen av tillståndet [se Beale et al. (2019) 26 för fullständig information].
    2. Ange startkoncentrationerna av endotiapepsin och PEG 6 000 i de angivna rutorna.
    3. Kalkylbladet plottar automatiskt resultaten i det traditionella fasdiagramformatet med fällnings- och proteinkoncentration på x- respektive y-axlarna. Brunnsförhållanden som endast ger upphov till kristaller i sina sådda droppar indikerar diagrammets metastabila region (transparent blå), medan förhållanden som har kristaller i både de sådda och icke-seedade dropparna indikerar kärnbildningszonen (fast grön).
      OBS: Helst bör majoriteten av kärnbildningszonen vara närvarande på diagrammet (dvs det finns några klara brunnar på botten av diagrammet och en viss fällning bör vara synlig vid höga protein- och fällningskoncentrationer). Om så inte är fallet, kanske upprepa experimentet men öka protein- och / eller fällningskoncentrationen (om möjligt).
    4. Om kristall har uppstått på mindre än 24 timmar, fortsätt till steg 2.3.1. Om inte, fortsätt till steg 2.4 och fortsätt optimera mot batch.
  3. Kristallanalys
    1. Som sagt i slutet av steg 1, innan du går vidare till nästa steg, se till att dessa kristaller har önskad morfologi och diffraktionskvalitet. När det gäller morfologi, är kristallerna observerbart oflätade och bildar som singletons snarare än nålbollliknande eller fläktliknande strukturer? När det gäller diffraktion, samla in diffraktionsdata från kristallerna om möjligt. Om dessa kristaller inte diffrakterar är det osannolikt att kristallerna som odlas i en större volym kommer att diffraktera.
    2. Ladda ett prov av endothiapepsinkristallerna från morfogramexperimentet på stöd som möjliggör datainsamling vid antingen 100 eller 293 K och utför ett röntgendiffraktionsexperiment. Om du arbetar under kryo, använd 25% etylenglykol som kryoskyddsmedel.
    3. Bearbeta dessa data via en lämplig programvarusvit. Endothiapepsinkristaller bör diffraktera till över 1,5 Å. Över provet av kristaller, observera cellstorleken, det totala antalet observationer och mosaiken; Dessa åtgärder kommer att ge en indikation på homogeniteten hos de diffraktrande kristallerna.
    4. Om kristallmorfologin och diffraktionskvaliteten är tillräcklig, fortsätt till steg 3.
  4. Optimera kristalltillväxttiden.
    OBS: Morfolitoanalysen (steg 2.2) kommer att ha gett en indikation på kristallisationens startpunkt (dvs. området i fasdiagrammet där droppen är belägen när fällnings- och proteinlösningarna blandades). Är nedgången i den metastabila regionen eller under löslighetslinjen? Satskristallisation börjar i kärnbildningszonen (figur 1C). Målet med detta steg är att flytta denna startpunkt från antingen under löslighetslinjen eller metastabil region till kärnbildningszonen (figur 1D). Om seeded-drops från steg 2.2. har gett kristaller snabbt, detta är en indikation på att droppblandningen redan finns i det metastabila området, om inte, är det troligt att droppen inte är övermättad.
    1. Optimera kristalltillväxttiden.
      1. Använd samma skärm som i steg 2.1.3, förbered ett 96-brunns ångdiffusionskristallisationsexperiment i en 3-droppplatta.
      2. Öka startproteinkoncentrationen av endotiapepsin på y-axeln (dvs koncentrera proteinet ytterligare, kanske 120 mg / ml för endothiapepsin).
      3. Utför en serieutspädning, som i steg 2.1.3.2, så att varje rad på plattan innehåller en sekventiellt lägre proteinkoncentration.
      4. Använd olika droppförhållanden i var och en av de tre dropparna på plattan: 1: 1, 1: 2 och 2: 1, protein: fällningsmedel.
      5. Visa eller avbilda plattan den första dagen vid 0, 3, 6, 12, 18, 24 h och sedan varje dag under den första veckan och varje vecka under de kommande fyra. Om automatisk avbildning inte är möjlig, oroa dig inte för timbilden på dag 1.
      6. Identifiera droppar som producerar de snabbast förekommande kristallerna och gör dessa till utgångspunkterna för upprepade optimeringar tills kristalltillväxt sker inom 24 timmar.
      7. När ett snabbt kristalltillstånd har identifierats går du tillbaka till steg 2.1 för att rita om morfogrammet som ett förspel för att börja skala.

3. Skalning

  1. Rangordna skalningsvägar. I detta skede är det inte nödvändigt att besluta om en enda skalningsväg, bara för att identifiera och rangordna alternativen så att de kan utforskas i tur och ordning. När volymen av satsblandningen ökas under skalningsproceduren kommer förändringar att ske i kärnbildningshastigheten och kristallstorleksområdet. Dessa kan dock övervinnas genom noggrann justering av komponentkoncentrationer när den skalade volymen ökar.
    Anmärkning: Steg 3.1.1 och 3.1.2 beskriver hur man från morfogrammet kan urskilja om ett batchprotokoll eller seeded-batch-protokoll är lämpligare.
    1. Rakt batchprotokoll
      1. Är Xn i kärnbildningszonen proportionell mot protein- och/eller utfällningskoncentrationen? Dvs ökar X n som en funktion av antingen fällnings- och/eller proteinkoncentrationen? -Ja? Gå till steg 3.1.1.2. Nej? Gå till steg 3.1.2. 
      2. Leta reda på förhållanden som ger kristaller av önskad storlek och gå till steg 3.2.
    2. Seeded-batch-protokoll
      1. Är Xn platt över kärnbildningszonen? Dvs. Xn ökar inte som en funktion av vare sig fällnings- och/eller proteinkoncentrationen.
      2. Leta reda på seedade förhållanden som ger kristaller av önskad storlek och gå till steg 3.2. Om alla kristaller är för stora – gå till steg 3.1.2.3.
      3. Upprepa morfogramexperimentet (steg 2.1) men öka denna gång koncentrationen av fröstammen som används i de sådda brunnarna. Fröbeståndet kan ökas genom att använda fler kristaller i skapandet. Använd till exempel 10 brunnar i steg 2.1.1.5 i stället för 5 brunnar.
      4. Visa eller avbilda plattan under de första 0, 3, 6, 12, 18, 24 h.
      5. Xn borde ha ökat och Xs minskade i seeded-drops. Upprepa denna cykel om mindre kristaller behövs och följ sedan ett seeded-batch-protokoll.
  2. Gradvis skalning
    1. Skalning i 96-brunnsplattor. Från endothiapepsin-morfogrammet valdes ursprungligen en rak satsmetod med kristallisationsvillkoret 0,1 M Tris-HCl pH 7,0, 0,15 M MgCl2 och 30% (w/v) PEG 6 000 för skalning. 100 mg/ml endotiapepsin blandat med kristallisationsbufferten i förhållandet 1:1.
      1. Förbered 2-3 brunnar i en 2-brunns 96-brunns-sittplatta-droppplatta med 100 μL 0,1 M Tris-HCl pH 7,0, 0,15 M MgCl2 och 30% (w/v) PEG 6,000.
      2. Använd nyligen tinad 100 mg/ml endotiapepsinlösning, dosera 0,5 μL protein och 0,5 μL fällningsmedel per brunn, försegla och förvara vid 20 °C.
      3. Visa eller avbilda plattan under de första 0, 3, 6, 12, 18, 24 h. Observera eventuella ändringar i intervallet Xs och Xn.
      4. Om förändringar har inträffat, upprepa steg 3.2.1.1 till 3.2.1.2 men öka eller minska protein-, fällnings- och/eller frökoncentrationen för att återställa eventuella förändringar i intervallet Xs och Xn.
      5. När intervallet Xs och Xn är acceptabla fortsätter du till steg 3.2.2.
    2. Skalning i 24-brunnshängande plattor
      1. Förbered en enda brunn på en 24-brunns hängande droppplatta genom att smörja brunnens kanter med vakuumfett.
      2. Bered 0,5 ml 0,1 M Tris-HCl pH 7,0, 0,15 M MgCl2 och 30% (w/v) PEG 6,000 och fyll den smorda brunnen.
      3. Använd nyligen upptinad endothiapepsinlösning och pipettera in 1 μL protein på ytan av ett glastäckglas. Pipettera 1 μL kristallisationsbuffert på proteindroppen och blanda med pipetten.
      4. Visa eller avbilda plattan under de första 0, 3, 6, 12, 24 timmarna. Observera eventuella ändringar i intervallet Xs och Xn.
      5. Om förändringar har inträffat, upprepa steg 3.2.2.1 till 3.2.2.4 men öka eller minska protein-, fällnings- och/eller frökoncentrationen för att återställa eventuella förändringar i intervallet Xs och Xn.
      6. När/om intervallet Xs och Xn är godtagbart, fortsätt till steg 3.2.2.7.
      7. Upprepa steg 3.2.2.1 till 3.2.2.5 och öka experimentets totala volym gradvis till 10 μl.
      8. En gång vid en volym på 10 μL eller större, fortsätt till centrifugrören i steg 3.2.3.
    3. Skalning i centrifugrör
      OBS: Förfiningen av satstillståndet för endothiapepsin skedde huvudsakligen vid punkten 200 μL volymer (se Resultat, skalning). Processen började med ett kristallisationstillstånd på 0,1 M Tris-HCl pH 7,0, 0,15 M MgCl2 och 30% (w/v) PEG 6 000. PEG-koncentrationen ändrades dock slutligen till 40 % (w/v). Frön krävdes också för att kontrollera Xn, och för att förhindra att kristaller växte för stora måste kristalltillväxten släckas. Steg 3.2.3.1 till 3.2.3.7 beskriver processen för tillståndsoptimering. Steg 3.2.4. Beskriv det slutliga batchprotokollet.
      1. Förbered 1 ml kristallisationsbuffert: 0,1 M Tris-HCl pH 7,0, 0,15 M MgCl2 och 30% (w/v) PEG 6,000.
      2. Tillsätt 25 μL protein till ett 1,5 ml centrifugrör med nyupptinad 100 mg/ml endotiapepsin.
      3. Blanda kristallisationsbufferten noggrant med proteinlösningen i förhållandet 1:1 med en pipettspets. Placera röret i en revolver/rotator med hög omrörning vid 20 °C.
      4. Ta regelbundna (5, 10, 30, 60 min, 2, 5, 10, 24 timmar) 2,5 μL alikvoter och se i en hemocytometer. Spela in X-, n -och X-s-intervallet.
      5. Om ändringar har inträffat, upprepa steg 3.2.3.1. till 3.2.3.4. men öka eller minska protein-, fällnings- och/eller frökoncentrationen för att återställa eventuella förändringar i intervallet Xs och Xn
      6. När intervallet Xs och Xn är acceptabelt fortsätter du till steg 3.2.3.7.
      7. Upprepa steg 3.2.2.1 till 3.2.2.5 och öka experimentets totala volym gradvis till 200 μl eller större efter behov.
    4. Slutligt protokoll för seedad batch
      1. Förbered fröstock.
        1. Bered 2 ml kristallisationsbuffert: 0,1 M Tris-HCl pH 7,0, 0,15 M MgCl2 och 40% (w/v) PEG 6,000.
        2. Tillsätt 100 μl protein till ett 1,5 ml centrifugrör med nyupptinad 100 mg/ml endotiapepsin.
        3. Blanda kristallisationsbufferten noggrant med proteinlösningen i förhållandet 1:1 med en pipettspets. Placera röret i en revolver/rotator med hög omrörning vid 20 °C i 24 timmar så att 50 μm kristaller kan växa.
        4. Tillsätt 10-15 1 mm glaspärlor till 50 μm kristalluppslamning.
        5. Virvel centrifugröret som innehåller uppslamningen och pärlorna vid 1000 rpm i 30 s.
        6. Sätt tillbaka centrifugröret i is i 30 sekunder.
        7. Upprepa steg 3.2.4.1.5 och 3.2.4.1.6 10 gånger till.
        8. Detta är nu 200 μL av en 1x fröstock. Späd fröstammen 10x genom tillsats av 1,8 ml kristallisationsbuffert. Alikvot 10x utsädesstammen i satser om 50 μl och lagra vid -20 °C.
      2. Seeded-batch protokoll.
        1. Förbered kristallisationsbuffert: 0,1 M Tris-HCl pH 7,0, 0,15 M MgCl2 och 40% (w/v) PEG 6,000.
        2. Blanda 100 μL kristallisationsbuffert med 50 μL nytinad 10x fröstam i ett centrifugrör.
        3. Tillsätt 150 μL protein till ett 1,5 ml centrifugrör med nyupptinad 100 mg/ml endotiapepsin.
        4. Blanda kristallisationsbufferten/fröblandningen noggrant med endotiapepsinlösningen med en pipettspets och placera röret i en revolver/rotator med hög omrörning vid 20 °C.
        5. Övervaka kristallisationen genom att ta regelbundna 2,5 μL alikvoter och se kristallerna i en hemocytometer. Spela in X-, n -och X-s-intervallet.
        6. Efter cirka 80 minuter, när kristallerna har nåttett X s på 15 μm, släck reaktionen genom tillsats av 150 μL 0,05 M Na-acetat pH 4,6, 0,05 M Tris-HCl pH 7,0, 0,075 M MgCl2 och 20% (w/v) PEG 6 000 (en lösning bestående av endotiapepsinbuffert och kristallisationsbuffert, blandad 1:1).
        7. Förvara kristallerna vid 20 °C.
      3. Har protokollet producerat ett acceptabelt kristallstorleksintervall och antal för det avsedda experimentet? Ja - KLAR - Nej - återgå till steg 3.1. och prova ett alternativt skalningsalternativ. Till exempel kan ett annat protein-utfällningsförhållande vara möjligt eller lägga till frön om detta inte gjordes tidigare. När alla dessa är uttömda kan det vara nödvändigt att hitta ett nytt tillstånd i steg 1.

Representative Results

Optimering av kristallmorfologi
Steg 1, optimering av kristallmorfologi, har inkluderats för att påminna läsaren om dess betydelse. Det kan vara möjligt att skapa perfekta mikrokristaller från dåligt diffraktionsnålkulor; Författarna skulle dock föreslå att det är bättre att optimera de två separat. Hitta först förhållanden som ger upphov till väldiffrakterande, enkristall via ångdiffusion, och konvertera sedan dessa förhållanden till sats snarare än att försöka kombinera de två stegen tillsammans. Att upptäcka mycket kärnbildande förhållanden i detta skede är inte nödvändigt; Morfologi och diffraktionskvalitet är de viktigaste målen.

Innan mikrokristallisationen av endotiapepsin påbörjades genomfördes en analys av deponerade strukturkristallisationsförhållanden från PDB. Kristallisationsbetingelser och ungefärliga protokoll kunde erhållas för 47 av de 48 deponeringarna av enthothiapepsin. Dessa var i stort sett alla baserade på den första kristallisationen av endothiapepsin utförd av Moews och Bunn (1970)46. Med tanke på likheterna mellan dessa förhållanden och deras "klassiska" ursprung utfördes en 96-brunns, ångdiffusion, glesmatrisskärm för att utforska en större variation av kristallisationsförhållanden. Endothiapepsin koncentrerades till 70 mg/ml och en PACT glesmatrisskärm47 utfördes i en 96-brunns sittplatta, vid 20 °C, blandade 100 nL protein med 100 nL brunnslösning. Varje tillstånd från detta experiment efter 36 timmar gav upphov till kristaller. En analys av kristallmorfologin indikerade dock att vissa förhållanden kan visa sig vara bättre för optimering av mikrokristallisation.

Figur 4A visar en droppe från PACT-skärmen som i stort sett var representativ för de som observerades i majoriteten av plattan. Vid första anblicken kan det vara frestande att tro att dessa kristaller kan vara värda att optimera ytterligare för mikrokristallisation. Kristallerna är stora och det verkar finnas betydande kärnbildning. Den övergripande kristallmorfologin är dock inte idealisk. För det första är kristallerna inte observerbart singletons eftersom det verkar som om flera kristaller växer från enstaka kärnbildningspunkter. För det andra är kristallstorleken mycket asymmetrisk med tillväxt som huvudsakligen sker längs en enda axel. Sådana kristaller är teoretiskt mer benägna att företrädesvis anpassa sig när de levereras till röntgenstrålen. Båda egenskaperna ger problem vid insamling och bearbetning av seriella kristallografiska data.

Figur 4B visar emellertid endotiapepsinkristaller odlade i närvaro av MgCl2. Denna morfologi var konsekvent över alla förhållanden som innehöll MgCl 2 och föreslog därför att deras morfologi berodde på MgCl2. MgCl2-förhållandena producerade enstaka, mer lådliknande kristaller som representerade ett bättre mål för de ultimata seriella experimenten.

Det fanns fyra villkor inom PACT-skärmen som innehöll MgCl2. För att bättre förstå påverkan av alla de olika komponenterna i dessa tillstånd på endothiapepsinkristallisation utfördes en slumpmässig optimering. En skärm skapades som innehöll en slumpmässig kombination av buffertar och fällningar vid en rad koncentrationer och pH. MgCl2-koncentrationen varierades också och sedan graderades de resulterande dropparna godtyckligt från 0-5 (0 är inga kristaller eller nederbörd) när det gäller deras visuella kristallkvalitet och nederbördsnivå.

Figur 5A visar en värmekarta över resultaten från en Pearsons korrelationsanalys mellan nederbördsnivån och kristallkvaliteten och skärmvariablerna (exempel på dropparna från detta experiment visas i figur 5B, C och D). Resultaten indikerade att lösningens pH var starkt korrelerat med utfällningsnivån, med alkaliska buffertar som resulterade i mer nederbörd. MgCl2-koncentrationen var något korrelerad till utfällningsnivån, liksom pH och fällningskoncentration till kristallkvalitet.

Baserat på dessa resultat togs beslutet att ta kristallerna odlade i 0,1 M Tris-HCl pH 7,0, 0,15 M MgCl2, 20% (w/v) PEG 6 000 till nästa steg i protokollet - Övergång till batch. Kristallernas morfologi var acceptabel och en analys av röntgendiffraktion och datakvalitetsmått från dessa kristaller föreslog att det inte fanns någon signifikant skillnad mellan kristallerna som odlades in och ut ur närvaron av Mg2+ (figur 9).

Övergång till batch
För många mikrokristallisationsoptimeringar av seriell kristallografi är steg 2 utgångspunkten. Proteinet av intresse kommer redan att ha kristalliserats för kryokristallografi och kristallisationsprotokollet kommer nu att behöva omvandlas för att skapa mikrokristalluppslamningar. Detta protokoll har endast använt ångdiffusionsplattor med 96 brunnar för att utföra omvandlingen till sats eftersom ångdiffusion är kristallisationsmetoden som används av 95% av PDB-posterna26. Protokollet har undvikit att flytta in i mikrobatch34,35,37 eftersom denna övergång fortfarande kan medföra en liknande optimering. Detta är inte att säga att detta protokoll endast kan göras i ångdiffusionsplattor. Alla steg som presenteras skulle också fungera i mikrobatch om detta var den ursprungliga kristallisationsmetoden.

För att bedöma kristallisationen av endothiapepsin i det valda tillståndet skapades ett morfogram - eller ett grovt fasdiagram. Syftet med morfogramexperimentet är trefaldigt. För det första är en analys av morfogrammet till stor nytta vid bedömning av skalningsvägar i Steg 3 - Skalning. För det andra fungerar morfogrammet som ett optimeringsverktyg som hjälper till att upptäcka ångdiffusionsförhållanden som ger upphov till kristaller via sats [dvs. snabbt framträdande kristaller (< 24 timmar)]. För det tredje, om kristaller inte har dykt upp snabbt, kan en analys av de sådda dropparna ge kristallografen en uppfattning om den ungefärliga platsen för det aktuella tillståndet på fasdiagrammet. Till exempel, om de seedade förhållandena ger kristaller men de oseedade inte gör det, kommer dessa förhållanden sannolikt att vara i den metastabila regionen.

Morfogramexperimentet med endiapepsin utfördes baserat på tillståndet 0,1 M Tris-HCl pH 7,0, 0,15 M MgCl2, 20% (w/v) PEG 6 000. Protein- och PEG-koncentrationerna varierade från 100 till 12,5 mg/ml respektive 5 till 40 % (vikt/volym). Dropparna analyserades och resultaten plottades med hjälp av kalkylbladet (figur 6A).

Det var också redan klart från optimeringskristallmorfologistadiet att endotiapepsinkristalltillväxt i detta tillstånd, och vid dessa proteinkoncentrationer, skulle resultera i kristaller odlade på under 24 timmar. Detta indikerade att kristallisation skedde via en sats snarare än en ångdiffusionsdriven process. Kristallen som odlades under dessa förhållanden var därför lämplig för skalning till större volymer.

Om kristaller inte hade varit synliga i de oseedade dropparna efter 24 timmar, skulle det ha varit troligt att kristallisationen fortfarande var beroende av en övergång (figur 1B) och därför inte sats. I detta fall är resultaten från morfogramexperimentet fortfarande av intresse. De ger en indikation på den troliga utgångspunkten för kristallisation på fasdiagrammet och därmed hur den efterföljande optimeringen bör fortsätta. Titta på de sådda dropparna. Fröna kommer att möjliggöra kristalltillväxt i det metastabila området oavsett kärnbildning. Till exempel, om kristaller uppträder inom 24 timmar i de sådda dropparna men inte de oseedade dropparna, indikerar detta att en del av det metastabila området kan observeras. Om inga kristaller observeras i antingen de sådda eller oseedade dropparna, förblir alla brunnar undermättade.

Skalning
Om man tittar på morfogrammet (figur 6A) kan ett antal observationer göras. Mängden kärnbildning tycktes påverkas av både protein- och fällningskoncentrationerna. Det fanns också en mycket tydlig avgränsning av droppar som leder till proteinutfällning, med droppar som antingen innehåller: ingenting, kristaller eller fällning (figur 6B). Tillsatsen av frön (figur 6D) ökade också kraftigt Xn jämfört med dropparna utan frön (figur 6C). Med alla dessa resultat tillsammans beslutades att försöka skala både ett batch- och seeded-batch-protokoll vid 30% (w / v) PEG 6,000 och 100 mg / ml endothiapepsin.

Den första testskalningen gjordes i 24-brunns hängande droppplattor. Droppvolymerna ökades gradvis så att eventuella förändringar i kristallisationsbeteendet kunde observeras (figur 7). Som framgår har kristalltillväxt skett i både de oseedade och fröade dropparna. Alla oseedade droppar växte en rad kristallstorlekar, men övervägande stora kristaller (100-200 μm - längsta dimensionen). De fröade dropparna producerade dock mindre kristaller (5 - 50 μm - längsta dimensionen). Dessa inledande tester föreslog att frön skulle krävas för att minska Xs, men också att detta tillstånd skulle vara lämpligt för större volymer.

När volymen ökades i 200 μL omrördes kristallisationsvolymen kontinuerligt under kristalltillväxt. Den främsta orsaken till denna omrörning var att säkerställa att kristallisationslösningen förblir homogen och att växande kristaller inte sätter sig på rörens botten eller sidor. Sedimentering av kristaller kan leda till en heterogen kristallpopulation med både mycket stora och små kristaller. Omrörning av kristallisationslösningen kan också främja kärnbildning44,45.

Tyvärr producerade den oseedade 30% (w/v) PEG 6,000 inga kristaller, så PEG-koncentrationen ökades till 35% (w/v). Denna ökning förbättrade kristallisationen markant, med ett slutligtX-n-och X-s-intervall på 3,6 ± 1,2 x 106 kristaller · ml-1 respektive 42 ± 4,1 μm (figur 8A och B - svart). Även om det var en signifikant förbättring och en acceptabel kristallkoncentration var de slutliga kristallerna för stora för det planerade experimentet, så ytterligare optimeringar genomfördes. För att minska storleken på de slutliga kristallerna undersöktes två vägar (Figur 1E): minska proteinkoncentrationen för att försöka begränsa den slutliga kristalltillväxten (Figur 8A och B - varmrosa) och öka PEG-koncentrationen för att försöka öka kärnbildningen (Figur 8A och B - grön).

Minskningen av proteinkoncentrationen minskade tyvärr också dramatisktXn, vilket i slutändan gav ännu större kristaller. En ökning av PEG-koncentrationen till 40% gav ett slutligt X-, n- ochX-s-intervall på 3,1 ± 0,7 x 10,6 kristaller·ml-1 respektive 39 ±2,3 μm. Dessa skilde sig inte signifikant från 35%, men eftersom den slutliga kristallstorleken minskades fortsatte detta tillstånd med ytterligare optimeringar.

För att öka Xn tillsattes frön. Detta ökade dramatiskt Xn (1,1 ± 1,8 x 10 8 kristaller · ml-1) och ledde till ett mindre Xs (4,2 ± 4,0 μm) (figur 8A och B - streckad lila). Dessa kristaller, även om de var mycket lämpliga för vissa seriella kristallografiexperiment, ansågs för små så koncentrationen av de tillsatta fröna ändrades.

Denna inställning av det tillsatta frölagret visade sig dock vara svår att på ett tillförlitligt sätt upprepa; Därför försökte man släcka. Efter tillsats av en fröstam övervakades kristallstorleken och när en lämplig kristallstorlek uppnåddes (cirka 10 - 20 μm) släcktes satskristallisationen (figur 8C och D). Släckning föreslogs, med avseende på mikrokristallisation, i Kupitz et al. (2014) 25. Även om det kanske inte är en idealisk metod, eftersom proteinlösning i slutändan kommer att slösas bort26, var tekniken mycket användbar i denna situation eftersom kristalltillväxt var svår att kontrollera. Tanken bakom släckning är att snabbt återföra kristallisationsblandningen till en punkt strax ovanför löslighetslinjen (figur 1F). När lösningen har återgått till löslighetslinjen har lösningen återgått till en stabil mättad lösning och ingen ytterligare kristalltillväxt kommer att ske.

Att försöka släcka en kristallisationsreaktion är inte utan risk. Om en för stor släckningslösning tillsätts kan proteinet i lösningen spädas så mycket att löslighetslinjen passeras. I detta fall blir lösningen undermättad och kristallerna börjar lösas upp. För att förhindra detta är det möjligt att uppskatta mängden erforderlig släckningslösning baserat på morfogramresultaten. Vid släckningspunkten, ta koncentrationen av proteinlösningen. Genom att jämföra proteinkoncentrationen vid löslighetslinjen och proteinkoncentrationen i lösning kan en uppskattning av den erforderliga utspädningen göras.

Den släckta versionen av 40% (w/v) PEG 6,000, 10 x utspädd fröexperiment gav en slutlig kristallkoncentration och storleksintervall på 2,6 ± 3,1 x 106 kristaller·ml-1 respektive 15 ± 3,9 μm.

Under hela processen samlades teströntgendatainsamlingar av endothiapepsinkristallerna in vid den schweiziska ljuskällan PXII strålrör med ett fokus på 10 x 30 μm, en energi på 12,4 keV dämpad med 80% och under kryoförhållanden. Uppgifterna bearbetades med hjälp av rattar och figur 9 visar en jämförelse av CC1/2. Ingen dramatisk förändring i CC1/2 observerades under optimeringen.

Figure 1
Figur 1: En översikt över övergångs- och batchkristallisation och skalningsmetoder mappade till ett fasdiagram. A. Zonerna och gränserna för det arketypiska proteinkristallisationsfasdiagrammet. Fällnings- och proteinkoncentrationerna plottas på x- respektive y-axlarna med den rena vattenpunkten vid ursprunget. Den lila linjen indikerar proteinövermättnadsgränsen, och metastabila, kärnbildnings- och utfällningszoner visas i blått, grönt respektive rosa. B. Ett exempel på kärnbildningszonens penetrationsgränser för en "övergångsfas" -kristallisationsmetod, såsom ångdiffusion. I detta teoretiska experiment börjar droppfällningen och proteinkoncentrationerna strax under löslighetslinjen - ännu inte övermättad. Medan droppen balanserar ökar droppkomponentkoncentrationerna så att droppen blir övermättad och fortsätter att röra sig - eller övergå - till kärnbildningszonen. Vid kristallkärnbildning börjar proteinkoncentrationen i lösning att sjunka. Koncentrationen fortsätter att falla när kristaller växer tills de slutligen stannar vid löslighetslinjen. Den blå prickade linjen markerar en teoretisk gräns för övergången till kärnbildningszonen. Så snart kärnbildning börjar, kommer proteinkoncentrationen att sjunka, vilket förhindrar ytterligare penetration. C. Exempel på batch- och seeded-batch-kristallisationsbanor. I sats måste blandningen av proteinet och fällningsmedlet skapa en övermättad lösning inom kärnbildningszonen så att kristalltillväxt kan uppstå. I sådd sats är det inte absolut nödvändigt att vara i kärnbildningszonen på grund av tillsats av mikrofrön, så platser i den metastabila regionen kan också utforskas. D. En hypotetisk optimering av kristallisationsexperimentet som visas i B från ångdiffusion till sats. Den ursprungliga startpunkten för ångdiffusion har övergått, via den resulterande optimeringsvektorn, till den nya startpositionen; inuti kärnbildningszonen. Den resulterande vektorn är produkten av två optimeringar: en ökning av både protein- och fällningskoncentrationer. E. Exempel på optimeringar vid skalning av batchvillkor för att skräddarsy de slutliga X, n och Xs. F. Släckning av kristallisationsexperimentet genom tillsats av kristallisationsbuffert. Det är viktigt att släckningen inte tar proteinkoncentrationen ur det metastabila området och därför under punkten för proteinövermättnad. Annars börjar kristaller lösas upp i lösning. B. och C . har anpassats från Beale et al. (2019)26 med författarnas tillstånd. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Öka Xn och minska Xs. Det idealiserade förhållandet mellan antalet kristaller som produceras från ett kristallisationsexperiment och deras genomsnittliga längsta dimension. För att skapa denna graf användes kristallisationen av ett hypotetiskt 10 kDa-modellprotein. Proteinet kristalliserades vid en koncentration av 10 mg/ml och gav P2 1 2 1 21 kristaller meddimensionerna 49x50x51 Å. Varje kärnbildningshändelse antogs ge en kristall. Kristalltillväxt antogs vara homogen från alla ansikten. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: Ett flödesschema som visar stegen för att optimera en kristall odlad i ett litet volymexperiment (<500 nL), ångdiffusionsexperiment till ett batchexperiment med stor volym (> 100 μL). Kristalloptimering är uppdelad i tre steg: (1) Optimering av kristallmorfologi. (2) Övergång till batch. (3) Skalning. I steg 1 är det viktigt att identifiera lämpliga kristaller för mikrokristallisation. Vissa proteiner förekommer endast i en enda kristallmorfologi oavsett kristallisationstillståndet. Det är dock värt att leta efter förhållanden som ger upphov till enkla, kubliknande kristaller, eller så nära dessa som mänskligt möjligt. Enkla, kubliknande kristaller, hypotetiskt och anekdotiskt, kommer i allmänhet att ge upphov till bättre resultat från seriella kristallografiexperiment. När en kristallmorfologi har valts och diffraktionen bekräftats är det nödvändigt att flytta kristallisationsexperimentet från ångdiffusion till sats (steg 2). Här bör kristaller optimeras av deras kärnbildningstid. Målet är att hitta förhållanden som ger snabbt framträdande kristaller (> 24 timmar) eftersom dessa förhållanden sannolikt kommer att träffa kärnbildningszonen omedelbart och därför satsas. När ett tillstånd i kärnbildningszonen har hittats kan ett morfogram skapas. Morfolitomet gör det möjligt för majoriteten av kärnbildningszonen att kartlägga och potentiella skalningsvägar identifierade för steg 3. Volymen av ett identifierat satsförhållande kan sedan antingen gradvis eller snabbt skalas i storlek för att ge en slutlig volym på >100 μL. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 4
Figur 4: En analys av endotiapepsinkristallisationsförhållanden från en PACT-glesmatrisskärm. A . och B. är foton efter 24 timmar av brunnarna A4 respektive C10 från PACT-skärmen . Kristallisationsbuffertkomponenterna markeras på figuren. SPG-bufferten är bärnstenssyra, natriumdivätefosfat och glycin blandat i ett molförhållande på 2: 7: 7. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 5
Figur 5: En analys av optimering av endotiapepsinkristallisation från PACT MgCl2-förhållandena. A. En värmekarta över resultaten från en Pearsons korrelationsanalys mellan buffert pH, MgCl2-koncentration och fällningskoncentration och nederbördsnivå och kristallkvalitet. Nederbördsnivån och kristallkvaliteten bedömdes båda godtyckligt på en skala från 0-5 (där 0 inte var kristaller eller nederbörd) efter 24 h. B. C. och D. visar exempel på kristallisation och utfällning i tre olika droppar. Kristallisationstillståndet och bedömningar av nederbördsnivå och kristallkvalitet visas också. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 6
Figur 6: Ett endotiapepsinmorfogram när det kristalliseras i 0,1 M Tris-HCl pH 7,0, 0,15 M MgCl2 och PEG 6 000. A. Ett morfogram skapat från kalkylbladet "fasdiagramgenerator" som tillhandahålls. Det relativa antalet kristaller i varje droppe betecknas med cirklarnas storlek, och resultaten från droppe 1 (protein och fällningsmedel) och droppe 2 (protein, fällningsmedel och frön) markeras i grönt respektive blått. Värdena för protein- och fällningskoncentrationerna på x- respektive y-axeln anger förblandade värden för varje snarare än slutliga volymer. Baserat på resultaten har svarta linjer och en lila linje ritats för att visa gränserna för kärnbildningszonen respektive metastabil zon. B. C. och D. visa några exempelresultat från experimentet. De röda och blå prickarna markerade på A. anger platserna för B. och C. respektive D. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 7
Figur 7: Inledande skalningsförsök av endiapepsin i 24-brunnshängande droppplattor. Samma protein- och fällningskoncentrationer användes för alla spår: 100 mg/ml endotiapepsin i 0,1 M Na-acetat pH 4,6 och 0,1 M Tris-HCl pH 7,0, 0,15 M MgCl2 respektive 30 % (vikt/volym) PEG 6 000. Alla visade bilder togs efter 24 timmar och de slutliga droppvolymerna är märkta på varje bild. Den vänstra panelen (A, D och G) är en 1: 1-blandning av protein och fällningsmedel, mittpanelen (B, E och H) är en 1: 2: 3-blandning av frön, fällningsmedel och protein och den högra panelen (C, F och I) är förstorade bilder av mittpanelen. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 8
Figur 8: Analys av endotiapepsinmikrokristallisationen i 200-300 μL volymer. A. och C . visar hur Xn förändrades under experimenttiden. B. och D . visar hur Xs (längsta dimensionen) förändrats över tid. Resultaten av experimenten har separerats för tydlighetens skull. Den röda streckade linjen på C . och D . visar den punkt där släckningen utfördes. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 9
Figur 9: CC1/2 resultat och bilder av kristaller erhållna vid varje steg i mikrokristallisationsprocessen för att bedöma diffraktionskvaliteten. A. CC1/2 plottad mot upplösning från data som samlats in från odlade kristaller: med och utan Mg - en del av steg 1-optimeringen, i en volym på 200 nL, en volym på 10 μL och den slutliga volymen på 300 μL. B.C. och D. visar kristallerna från volymen 200 nL, 10 μL respektive 300 μL. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Protein Information
Protein Endothiapepsin
Molekylvikt (kDa) 33.8
Rymdgrupp P12 11
a, b, c (Å) 45.2, 73.3, 52.7
α, β, ɣ (°) 90.0, 109.2, 90.0
Parametrar med fasta mål
Belastningsvolym per chip (μL) 150
Aperaturer per chip 25,600
Erforderlig kristallkoncentration (kristaller/ml) 500,000
Exempel på information
Proteinmassa som används för att tillverka 200 μl prov (mg) 10
Kristallens längsta dimension (μm) 15
Kristallkoncentration (kristaller/ml) 2,500,000
Experimentella variabler
Antal tidpunkter som krävs 5
Antal bilder som krävs per tidpunkt 50,000
Träfffrekvens (integrerade mönster/insamlade bilder) 0.3
Fastställda mål som krävs per tidpunkt (avrundat uppåt) 7
Exempel på krav
Provvolym som krävs per tidpunkt (μL) 1,050
Total provvolym som krävs för experiment (ml) 5.25
Total proteinmassa som krävs (mg) 52.5

Tabell 1: Ett exempel på provkraven för ett hypotetiskt optiskt pump-sondexperiment utfört med fasta mål. Proteinet som användes i detta teoretiska experiment var entiapepsin. De fasta målparametrarna baserades på experiment som rapporterats i Ebrahim et al. (2019) 48 och Davy et al. (2019) 49. Provinformationen kom från protokollet som rapporterades i denna videoartikel och de experimentella variablerna var konservativa uppskattningar baserade på levd erfarenhet. Följande urvalsbehov beräknades därefter mot bakgrund av tidigare antaganden.

Discussion

Metoden som presenteras visar hur man optimerar kristallisationen av endotiapepsin från stora kristaller (≥ 100 μm längsta dimensionen), odlade i glesmatris 96-brunnsskärmar, till mikrokristaller, odlade i centrifugrör (300 μL volym) via batch. Tanken bakom protokollet är att de åtgärder som vidtagits för att optimera entiapepsin även skulle kunna användas för andra proteiner. I slutändan svarar problemet med att skapa stora volymer (>100 μL) mikrokristaller (10-20 μm) för seriella kristallografiexperiment vid XFEL och synkrotroner.

Protokollet delar upp uppgiften för mikrokristallisation i stora volymer i tre steg: (1) Optimera kristallmorfologi, (2) Övergång till batch och (3) Skalning. I steg 1 bör utbudet av kristallformer som ett protein kan skapa undersökas i ångdiffusionsplattor. Förhållanden som ger upphov till enkla, lådliknande kristaller som diffrakterar till önskad upplösning bör vara målet. I steg 2 kan valda förhållanden sedan omvandlas från ångdiffusion till batch. Här är optimeringskriteriet kristalltillväxttid och att hitta förhållanden som ger upphov till proteinkristaller inom 24 h. Ett morfogram kan också plottas, vilket ger experimenten en uppfattning om placeringen av löslighetslinjen och kärnbildningszongränserna. Detta morfogram är till stor nytta i steg 3, skalning. Morfolimet kommer att ge en indikation på om kärnbildning ensam kan öka Xn och driva ner Xs. När experimentets volym ökas kan Xn och Xs kontinuerligt bedömas som de viktigaste kriterierna för skalningsframgång.

När det gäller Endothiapepsin avslöjade steg 1 vad som potentiellt var en tidigare okänd kristallmorfologi för endothiapepsin. Denna morfologi hade samma rymdgrupp som de som tidigare rapporterats men, viktigt för seriell kristallografi, en mer lådliknande form. Enstaka kristaller tycktes också växa från enstaka kärnbildningspunkter, till skillnad från fläktarna skapade från andra förhållanden (figur 4). För det valda villkoret var steg 2 redan delvis uppfyllt eftersom kristalltillväxt inträffade under < 24 timmar. Morfogrammet indikerade att både ett rakt eller seedat batchprotokoll kan lyckas vid skalning i steg 3. Initial skalning i rak sats skapade ett tillstånd som producerade kristaller med ett X-n-och X-s-intervall på 3,6 ± 1,2 x 106 kristaller ·ml-1 respektive 42 ± 4,1 μm. Dessa kristaller, även om de var acceptabla för vissa seriella kristallografiexperiment, ansågs för stora. Så ytterligare optimeringar utfördes. Det slutliga protokollet producerade kristaller med en koncentration och storleksintervall på 3,1 x 106 kristaller · ml-1 respektive 15 ± 3,9 μm. Detta var mer än idealiskt för de planerade experimenten.

Metoden fokuserar på omvandling av "lösliga" proteinkristaller odlade i ångdiffusionsplattor till batch. Anledningen till detta fokus är att de allra flesta lösliga proteinkristaller odlas via ångdiffusion26. De koncept som presenteras kan emellertid också tillämpas på lösliga proteinkristaller odlade med andra metoder, såsom mikrosats. Koncepten kan också vara tillämpliga på membranproteinkristaller odlade i LCP; eftersom detta också är en satskristallisationsprocess.

En viktig aspekt av protokollet är processen att omvandla förhållandena för kristaller odlade i ångdiffusionsplattor så att de kan odlas i sats. För denna omvandling använder metoden det kriterium som föreslagits av Beale et al. (2019) 26. Kristaller som odlas via en satsprocess, även i ångdiffusionsplattor, bildas snabbt (< 24 timmar). Detta kriterium är en approximation baserad på hastigheten för ångdiffusionsfalljämvikt och är mest sant för PEG-baserade fällningsförhållanden. Kristallisationsbetingelserna kommer emellertid att innehålla en mängd olika föreningar som kommer att påverka jämviktstiden. Jämvikten av saltbaserade kristallisationsförhållanden, t.ex. högkoncentrerad ammoniumklorid, kan ske inom 1-2 dagar. Därför kanske 24-timmarskriteriet inte är sant för saltbaserade förhållanden. Saltbaserade förhållanden kan också ha mer komplexa fasdiagram26,30 som kanske inte överensstämmer med arketypen som presenteras i detta protokoll. En minskning av tidskriteriet för saltbaserade förhållanden till 12 eller 6 timmar kan vara nödvändig om det visar sig omöjligt att skala till större volymer.

En annan begränsning av denna metod är dess uppenbara komplexitet. Protokollet som följdes för att optimera mikrokristallisationen av endothiapepsin förändrade faktiskt det ursprungliga tillståndet från glesmatrisskärmen relativt lite. Den första träffen som observerades på PACT-skärmen var 0,1 HEPES pH 7,0, 0,2 M MgCl2 och 20% (w/v) PEG 6 000. Den slutliga skalade kristallisationsbufferten var 0,1 Tris-HCl pH 7,0, 0,15 M MgCl2 och 40% (w/v) PEG 6 000. Det är också mycket möjligt att förändringen i buffert från HEPES till Tris-HCl och MgCl2-koncentration bidrog lite till processens framgång. Att lämna ökningen av PEG 6,000-koncentrationen den enda optimeringen, och en som kunde ha uppnåtts helt enkelt.

Denna bedömning är emellertid också alltför förenklad. Det diskonterar inte bara de problem som uppstår under skalning (dvs. användning av frön och släckning), utan också det faktum att bara för att detta protein visade sig vara enkelt, finns det ingen garanti för att nästa också kommer att visa sig vara. Stegen som rekommenderas i protokollet utformades eftersom optimering av skalningen av proteinkristallisationsvolymer kan vara mycket proteindyrt. Under de sju endothiapepsinskalningsförsök som visas konsumeras 100 mg protein. Visserligen utfördes några av dessa steg för att visa deras konsekvenser mot bakgrund av detta protokoll. Ändå kan 100 mg av ett protein, plus potentiellt ytterligare 50 mg för protein som konsumeras under ett experiment (tabell 1), vara en betydande investering i antingen tid eller pengar.

Lyckligtvis är det inte klart att denna massa av erforderligt prov är allestädes närvarande över alla proteiner. Endothiapepsin var mycket lösligt och krävde därför en stor proteinkoncentration för att nå övermättnad. I andra (för närvarande under optimering) kan övermättnad uppnås vid 10 eller till och med 5 mg / ml. Sådana variabler är proteinspecifika och måste omfamnas när de dyker upp.

Andra begränsningar av metoden inkluderar dess beroende av komplex utrustning som vätskehanteringsrobotar för skärm- och plattskapande och kameror för att automatiskt avbilda plattor vid behov. Alternativa rutiner har erbjudits för att begränsa behovet av vissa av dessa utrustningar, men protokollet blir mer tidskrävande att följa utan dem. Protokollet föreslår också att man testar diffraktionen av optimerade kristaller. För kristallografer utan regelbunden tillgång till en synkrotron kan dessa tester visa sig vara utmanande. Kontroller i varje steg kanske inte är nödvändiga, men dessa tester rekommenderas starkt när en träff har identifierats och före och efter skalning. Icke-diffracting kristaller vid en XFEL är tyvärr inte en ovanlig förekomst. Med tanke på detta är det bättre att fela på försiktighetssidan när det gäller antaganden om kristalldiffraktion.

I slutändan kommer detta protokoll och resultat som presenteras här att erbjuda en guide, idéer och ett exempel för dem som kämpar med att producera prover för seriella kristallografiexperiment. Förhoppningsvis, när seriell kristallografi vidareutvecklas, kommer provkraven för tekniken att minskas så att behovet av protokoll som detta kommer att minska. Men även i denna händelse kommer de strategier som presenteras här fortfarande att vara användbara för dem som vill utforska kristallisationsutrymmet för deras protein.

Disclosures

Författarna har inga intressekonflikter att avslöja.

Acknowledgments

Detta projekt har fått finansiering från Europeiska unionens forsknings- och innovationsprogram Horizon 2020 under Marie Skłodowska-Curie-bidragsavtalet No 701647. Stort tack för hjälp och stöd från strålrörsforskare vid Swiss Light Source beamline X10SA-PXII.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Swissci 96-well 2-Drop plates Molecular Dimensions MD11-002 96-well 2-drop crystallisation plate
Swissci 96-well 3-Drop plates Molecular Dimensions MD11-003 96-well 3-drop crystallisation plate
mosquito LCP liquid handling robot sptlabtech mosquito LCP Crystallisation robot
ClearVue Sheets Molecular Dimensions MD6-015 96-well crystallization plate seals
Safe-Tube 1.5 mL Eppendorf 30120086 1.5 mL centrifuge tubes
Scaple Swan and Morton No. 3 scalple and No. 3 handle Scalple for cutting open plate seals
MS 3 Vortex IKA 3319000 Vortex for mixing solution and making seed stocks
24-well XRL Plate Molecular Dimensions MD3-11 24-well hanging-drop plates
Tube revolver/rotator Thermo Fischer Scientific 88881001 Tube revolver for mixing solution during scaling
Eppendorf Research plus pipettes Eppendorf Range of manual pipettes, 0.5-10, 1-20, 10-100, 100-1000 µL
Eppendorf pipette tips Eppendorf Range of tip sizes for manual pipettes
Suparen 600 Prochem AG Suparen 600 Endothiapepsin solution
Sodium Acetate Sigma-Aldrich 241245-1KG Sodium Acetate
Tris Merck 8382T014 Tris
Magnesium Chloride Sigma-Aldrich M2670-1kg Magnesium Chloride
PEG 6,000 Sigma-Aldrich 81255-1kg PEG 6,000
Ethelyene glycol Sigma-Aldrich 324558-1L Ethelyene glycol for cyro-protecting the crystals
PACT Premier HT screen Molecular Dimensions MD1-36 PACT Premier 96-well crystal screen
DOW CORNING high vacuum grease Molecular Dimensions MD6-02 Grease for sealing 24-well plates
Hirschmann 22 x 22 mm glaser cover slides Hirschmann 8000104 Cover slides for sealing 24-well sitting drop plates
Crystal pins PSI Manufactured inhouse Thin-film supports for micro-crystals.
1-1.3 mm SiLibeads Type S Faust 6239547 Glass beads for making mico-seed stocks
Macbook Pro Apple Macbook Pro Computer for performing data analysis
CCP4 software suite CCP4 Diffraction pattern data processing software
Excel Microsoft Microsoft Office Plotting tool for phase diagram
Hausser Scientific Bright-Line counting chamber Thermo Fischer Scientific 02-671-51B Tool to calculate crystal concentration
PACT Premier Molecular Dimensions MD1-29-ECO Sparse-matrix crystallization screen
Rock Imager Formulatrix Rock Imager Temperature controlled crystal plate storage and imager
Rock MakerWeb Formulatrix Rock MakerWeb Crystal plate creation and image storage stoftware
Formulator Formulatrix Formulator 96-well crystal screen creation liquid handling robot
Leica MZ16 Microscope Leica Leica MZ16 Light microscope
LAS V4.6 Leica LAS V4.6 Software for Leica microscopes
Spectra/Por 3.5 kDa dialysis tubing Spectrumlabs Spectra/Por 3 Dialysis Membrane 3.5 kDa dialysis membrane
Dialysis tubing closures Spectrumlabs Spectra/Por 3 Duniversal Closures Clips to seal the dialysis tubing ends
Amicon 10 kDa centrifugal concentrator Merck-Millipore Amicon Ultra-15 10 kDa centrifugal concentrator 10 kDa centrifugal filter
5810 R swing bucket centrifuge Eppendorf 5810 R Centrifuge Swing bucket centrifuge

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. DePonte, D. P., et al. Gas dynamic virtual nozzle for generation of microscopic droplet streams. Journal of Physics D: Applied Physics. 41 (19), 195505 (2008).
  2. Hunter, M. S., et al. Fixed-target protein serial microcrystallography with an x-ray free electron laser. Scientific Reports. 4 (1), 6026 (2014).
  3. Weierstall, U., et al. Lipidic cubic phase injector facilitates membrane protein serial femtosecond crystallography. Nature Communications. 5 (1), 1-6 (2014).
  4. Roessler, C. G. G., et al. Acoustic Injectors for Drop-On-Demand Serial Femtosecond Crystallography. Structure. 24 (4), 631-640 (2016).
  5. Sherrell, D. A., et al. A modular and compact portable mini-endstation for high-precision, high-speed fixed target serial crystallography at FEL and synchrotron sources. Journal of Synchrotron Radiation. 22 (6), 1372-1378 (2015).
  6. Roedig, P., et al. A micro-patterned silicon chip as sample holder for macromolecular crystallography experiments with minimal background scattering. Scientific Reports. 5 (1), 1-11 (2015).
  7. Botha, S., et al. Room-temperature serial crystallography at synchrotron X-ray sources using slowly flowing free-standing high-viscosity microstreams. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 71 (2), 387-397 (2015).
  8. Weinert, T., et al. Serial millisecond crystallography for routine room-temperature structure determination at synchrotrons. Nature Communications. 8 (1), 542 (2017).
  9. Tenboer, J., et al. Time-resolved serial crystallography captures high-resolution intermediates of photoactive yellow protein. Science. 346 (6214), 1242-1246 (2014).
  10. Nango, E., et al. A three-dimensionalmovie of structural changes in bacteriorhodopsin. Science. 354 (6319), 1552-1557 (2016).
  11. Suga, M., et al. Light-induced structural changes and the site of O=O bond formation in PSII caught by XFEL. Nature. 543 (7643), 131-135 (2017).
  12. Mehrabi, P., et al. Liquid application method for time-resolved analyses by serial synchrotron crystallography. Nature Methods. 16 (10), 979-982 (2019).
  13. Halle, B. Biomolecular cryocrystallography: structural changes during flash-cooling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (14), 4793-4798 (2004).
  14. Fraser, J. S., et al. Hidden alternative structures of proline isomerase essential for catalysis. Nature. 462 (7273), 669-673 (2009).
  15. Fenwick, R. B., van den Bedem, H., Fraser, J. S., Wright, P. E. Integrated description of protein dynamics from room-temperature X-ray crystallography and NMR. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (4), 445-454 (2014).
  16. Keedy, D. A., et al. Mapping the conformational landscape of a dynamic enzyme by multitemperature and XFEL crystallography. Elife. 4, (2015).
  17. Thomaston, J. L., et al. XFEL structures of the influenza M2 proton channel: Room temperature water networks and insights into proton conduction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (51), 13357-13362 (2017).
  18. Haas, D. J., Rossmann, M. G. Crystallographic studies on lactate dehydrogenase at -75 °C. Acta Crystallographica Section B Structural Crystallography and Crystal Chemistry. 26 (7), 998-1004 (1970).
  19. Hope, H. Cryocrystallography of biological macromolecules: a generally applicable method. Acta Crystallographica Section B Structural Science. 44 (1), 22-26 (1988).
  20. Wu, W., et al. Batch crystallization of rhodopsin for structural dynamics using an X-ray free-electron laser. Acta Crystallographica Section:F Structural Biology Communications. 71 (7), 856-860 (2015).
  21. Ishchenko, A., Cherezov, V., Liu, W. Preparation and delivery of protein microcrystals in lipidic cubic phase for serial femtosecond crystallography. Journal of Visualized Experiments. (115), e54463 (2016).
  22. Andersson, R., et al. Well-based crystallization of lipidic cubic phase microcrystals for serial X-ray crystallography experiments. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 75 (10), 937-946 (2019).
  23. Luft, J. R., et al. The detection and subsequent volume optimization of biological nanocrystals. Structural Dynamics. 2 (4), 041710 (2015).
  24. Lee, D. B., et al. Supersaturation-controlled microcrystallization and visualization analysis for serial femtosecond crystallography. Scientific Reports. 8 (1), 1-10 (2018).
  25. Kupitz, C., et al. Microcrystallization techniques for serial femtosecond crystallography using photosystem II from Thermosynechococcus elongatus as a model system. Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 369 (1647), 20130316 (2014).
  26. Beale, J. H., et al. Successful sample preparation for serial crystallography experiments. Journal of Applied Crystallography. 52, Pt 6 1385-1396 (2019).
  27. Rayment, I. Small-scale batch crystallization of proteins revisited: An underutilized way to grow large protein crystals. Structure. 10 (2), 147-151 (2002).
  28. García-Ruiz, J. M. Nucleation of protein crystals. Journal of Structural Biology. 142 (1), 22-31 (2003).
  29. McPherson, A., Kuznetsov, Y. G. Mechanisms, kinetics, impurities and defects: Consequences in macromolecular crystallization. Acta Crystallographica Section F:Structural Biology Communications. 70 (4), 384-403 (2014).
  30. Rupp, B. Origin and use of crystallization phase diagrams. Acta crystallographica. Section F, Structural biology communications. 71, Pt 3 247-260 (2015).
  31. Luft, J. R., DeTitta, G. T. A method to produce microseed stock for use in the crystallization of biological macromolecules. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 55 (5), 988-993 (1999).
  32. Ireton, G. C., Stoddard, B. L. Microseed matrix screening to improve crystals of yeast cytosine deaminase. Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 60 (3), 601-605 (2004).
  33. Forsythe, E. L., Maxwell, D. L., Pusey, M. Vapor diffusion, nucleation rates and the reservoir to crystallization volume ratio. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 58 (10), 1601-1605 (2002).
  34. Chayen, N. E., Shaw Stewart, P. D., Maeder, D. L., Blow, D. M. IUCr An automated system for micro-batch protein crystallization and screening. Journal of Applied Crystallography. 23 (4), 297-302 (1990).
  35. Chayen, N. E., Shaw Stewart, P. D., Blow, D. M. Microbatch crystallization under oil - a new technique allowing many small-volume crystallization trials. Journal of Crystal Growth. 122 (1-4), 176-180 (1992).
  36. Chayen, N. E. Comparative studies of protein crystallization by vapour-diffusion and microbatch techniques. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 54 (1), 8-15 (1998).
  37. D'Arcy, A., Mac Sweeney, A., Stihle, M., Haber, A. The advantages of using a modified microbatch method for rapid screening of protein crystallization conditions. Acta Crystallographica - Section D Biological Crystallography. 59 (2), 396-399 (2003).
  38. Darmanin, C., et al. Protein crystal screening and characterization for serial femtosecond nanocrystallography. Scientific Reports. 6, 25345 (2016).
  39. Gati, C., et al. Atomic structure of granulin determined from native nanocrystalline granulovirus using an X-ray free-electron laser. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (9), 2247-2252 (2017).
  40. Cheng, R. K. Y. Towards an optimal sample delivery method for serial crystallography at XFEL. Crystals. 10 (3), 215 (2020).
  41. Schmidt, M. Mix and Inject: Reaction Initiation by Diffusion for Time-Resolved Macromolecular Crystallography. Advances in Condensed Matter Physics. 2013, 1-10 (2013).
  42. Oberthuer, D., et al. Double-flow focused liquid injector for efficient serial femtosecond crystallography. Scientific Reports. 7 (1), 44628 (2017).
  43. McPherson, A., Gavira, J. A. Introduction to protein crystallization. Acta crystallographica. Section F, Structural biology communications. 70, Pt 1 2-20 (2014).
  44. Yaoi, M., et al. Effect of stirring method on protein crystallization. Japanese Journal of Applied Physics, Part 2: Letters. 43 (10), 1318 (2004).
  45. Castro, F., Ferreira, A., Teixeira, J. J., Rocha, F. Influence of Mixing Intensity on Lysozyme Crystallization in a Meso Oscillatory Flow Reactor. Crystal Growth & Design. 18 (10), 5940-5946 (2018).
  46. Moews, P. C., Bunn, C. W. An X-ray crystallographic study of the rennin-like enzyme of Endothia parasitica. Journal of Molecular Biology. 54 (2), 395-397 (1970).
  47. Newman, J., et al. Towards rationalization of crystallization screening for small- to medium-sized academic laboratories: the PACT/JCSG+ strategy. Acta crystallographica. Section D, Biological. 61, Pt 10 1426-1431 (2005).
  48. Ebrahim, A., et al. Resolving polymorphs and radiation-driven effects in microcrystals using fixed-target serial synchrotron crystallography. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 75, Pt 2 151-159 (2019).
  49. Davy, B., et al. Reducing sample consumption for serial crystallography using acoustic drop ejection. Journal of Synchrotron Radiation. 26 (5), (2019).

Tags

Denna månad i JoVE nummer 168 seriell kristallografi satskristallisation mikrokristallisation XFEL ångdiffusion endiapepsin
Optimera tillväxten av endotiapepsinkristaller för seriella kristallografiexperiment
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Beale, J. H., Marsh, M. E.… More

Beale, J. H., Marsh, M. E. Optimizing the Growth of Endothiapepsin Crystals for Serial Crystallography Experiments. J. Vis. Exp. (168), e61896, doi:10.3791/61896 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter