Optimaliseren van de groei van endothiapepsine kristallen voor seriële kristallografie experimenten

Summary

Het doel van dit artikel is om de kijker een goed begrip te geven van hoe ze hun kleine volume, dampdiffusieprotocol, voor het kweken van grote, enkele eiwitkristallen, kunnen transformeren in een grote batch microkristallisatiemethode voor seriële kristallografie.

Abstract

Hier wordt een protocol gepresenteerd om het maken van grote volumes (> 100 μL) van microkristallijne slurries die geschikt zijn voor seriële kristallografie-experimenten bij zowel synchrotrons als XFELs te vergemakkelijken. De methode is gebaseerd op een goed begrip van het eiwitkristalfasediagram en hoe die kennis kan worden gebruikt. De methode is verdeeld in drie fasen: (1) het optimaliseren van de kristalmorfologie, (2) de overgang naar batch en (3) het schalen. Fase 1 omvat het vinden van goed diffracterende, enkelvoudige kristallen, hopelijk maar niet noodzakelijkerwijs, presenterend in een kubusachtige morfologie. In fase 2 wordt de fase 1-conditie geoptimaliseerd door de kristalgroeitijd. Deze strategie kan kristallen die door dampdiffusie zijn gegroeid, omzetten in batches. Zodra kristalgroei binnen ongeveer 24 uur kan plaatsvinden, kan een morfogram van het eiwit- en precipitantmengsel worden uitgezet en gebruikt als basis voor een schaalstrategie (fase 3). Wanneer kristallen in batch kunnen worden gekweekt, kan worden geprobeerd te schalen en de kristalgrootte en -concentratie worden geoptimaliseerd naarmate het volume wordt verhoogd. Endothiapepsine is gebruikt als demonstratie-eiwit voor dit protocol. Sommige van de gepresenteerde beslissingen zijn specifiek voor endothiapepsine. Het is echter te hopen dat de manier waarop ze zijn toegepast een manier van denken over deze procedure zal inspireren die anderen kunnen aanpassen aan hun eigen projecten.

Introduction

Kamertemperatuur (RT) macromoleculaire kristallografie is weer populair binnen de structurele biologie gemeenschap. De ontwikkeling van X-ray Free Electron Laser (XFEL) lichtbronnen heeft de ontwikkeling van RT-monsterafgiftebenaderingen 1,2,3,4 gestimuleerd en deze methoden zijn nu toegepast op synchrotrons 5,6,7,8. RT-methoden openen niet alleen de mogelijkheid van pomp-sonde experimentele strageties 9,10,11,12, maar er is ook steeds meer bewijs dat ze alternatieve conformatietoestanden bevorderen binnen eiwitten 13,14,15,16,17.

De belangrijkste reden waarom cryo-methoden in de late jaren 1990 tractie kregen ten opzichte van RT-benaderingen, was echter de vertraging van stralingsschade door kristaltemperaturen onder nul¹⁸. Cryo-methoden¹⁹ begonnen het verzamelen van een complete dataset van een enkel eiwitkristal mogelijk te maken. Moderne RT-methoden bij XFELs en synchrotrons losten het probleem van single-crystal stralingsschade op door de ontwikkeling van snelle (> 100 Hz) kristalafgiftestrategieën 1,2,3,4. Deze methoden maken het mogelijk om een complete dataset te verzamelen van duizenden individueel blootgestelde kristallen. Deze RT-toedieningsbenaderingen vereisen daarom de productie van grote hoeveelheden oplossingen die homogene microkristallen bevatten (> 100 μL < 50 μm kristallen). Omdat cryo-methoden echter meestal alleen enkele kristallen vereisen, zijn methoden om dergelijke microkristallijne slurries te maken momenteel niet alomtegenwoordig in eiwitkristallografielaboratoria.

Er zijn voorbeelden in de literatuur van hoe delen van de microkristallisatie-optimalisatieprocedure voor seriële kristallografiemonsters moeten worden uitgevoerd. Hier moet een onderscheid worden gemaakt tussen membraan en oplosbare eiwitten. Protocollen om de groei van micromembraaneiwitkristallen gekweekt in monooleïne (of een ander lipide) voor lipide kubische fase (LCP) te optimaliseren, zijn goed beschreven^20,21,22. Methoden voor de microkristallisatie van oplosbare eiwitten, waaronder membraaneiwitten die in niet-LCP-omstandigheden worden gekweekt, ontbreken echter over het algemeen. Eerdere studies hebben zich gericht op specifieke delen van het proces, zoals microkristalscreening 23,24, het verbeteren van nucleatie²⁴ en schalen met behulp van vrije interfacediffusie ²⁵, maar geen volledige methode.

Onlangs werd echter een methode^{beschreven 26} die probeert een compleet protocol aan te bieden. Zoals veel aspecten van eiwitkristallografie is het niet nieuw. Veel van de voorgestelde ideeën werden al beschreven door Rayment (2002)²⁷. De methode is bedoeld om kristallografen te laten zien hoe ze de conversie kunnen uitvoeren van een enkel, kristal gekweekt met behulp van dampdiffusie, naar een batchmethodologie om duizenden microkristallen te laten groeien. De methode richt zich op dampdiffusie als een gemeenschappelijk uitgangspunt, aangezien 95% van alle Protein Data Bank (PDB) -afzettingen afkomstig zijn van kristallen die zijn gekweekt in dampdiffusieplaten²⁶. Dampdiffusie is echter niet de ideale methode voor microkristallisatie²⁶, dus wordt een methodologie beschreven om dampdiffusie om te zetten in batchkristallisatie. Zodra kristallen in batch kunnen worden gekweekt, wordt het schalen van routes naar grotere volumes praktischer. Gezien de grillen van eiwitkristallisatie, zouden de auteurs benadrukken dat deze methode niet failsafe is. Het protocol moet echter op zijn minst inzicht geven in de 'kristallisatieruimte' van een eiwit.

Deze methode is gebaseerd op het eiwitkristallisatiefasediagram en hoe een goed begrip van dat diagram als leidraad kan dienen tijdens microkristallisatie-optimalisatie. Een eiwitfasediagram wordt gewoonlijk weergegeven als een x/y-plot met precipitant- en eiwitconcentraties op respectievelijk de x- en y-as (figuur 1A). Vanaf het zuiverwaterpunt (linkerbenedenhoek - figuur 1A) neemt de concentratie van zowel eiwit als precipitant toe totdat de oplosbaarheidslijn is bereikt. De oplosbaarheidslijn markeert het punt van oververzadiging (paarse lijn - Figuur 1A). Wanneer een eiwit oververzadigd is, wordt de oplossing thermodynamisch instabiel en begint te scheiden in twee fasen: 'eiwitrijk' en een stabiele verzadigde oplossing. Deze scheiding kan overal buiten de oplosbaarheidslijn plaatsvinden en de kinetiek ervan is afhankelijk van de eigenschappen van het eiwit en de componenten van de oplossing.

Wanneer de eiwit- en precipitantconcentraties te groot zijn, zal het eiwit onstabiel uit de oplossing uiteenvallen en resulteren in amorf neerslag (roze gebied - Figuur 1A). Geordende fasescheiding kan echter optreden in het nucleatiegebied [zie Garcia-Ruiz (2003)²⁸ voor een gedetailleerde beschrijving] en kristalkernen hebben de neiging zich te vormen (groen gebied - Figuur 1A). Nucleatie en groei verwijdert eiwit uit de oplossing en verplaatst de druppel naar het metastabiele gebied waar de groei kan doorgaan totdat de oplosbaarheidslijn is bereikt [zie McPherson en Kuznetsov (2014) ²⁹ voor gedetailleerde bespreking]. Het diagram is, voor de overgrote meerderheid van de kristallisatiecondities, een grove oversimplificatie³⁰. Hoe dan ook, het diagram is nog steeds van groot nut voor microkristallografen, omdat de mapping van het diagram het mogelijk maakt om de oplosbaarheidslijn en de kinetiek van nucleatie te bepalen.

In termen van het maken van microkristallen zijn de twee factoren tijdens kristallisatie die moeten worden geoptimaliseerd het aantal kristallen (X_n) en hun gemiddelde, langste dimensie (X_s). X n zal evenredig zijn met het aantal nucleatiegebeurtenissen (_n ) (Eq. 1).

     Eq. 1

X s is evenredig met de concentratie van vrij eiwit boven de oplosbaarheidslijn (P_s) gedeeld door X_n (Eq. 2).

     Eq. 2

In een perfecte situatie zou elke nucleatiegebeurtenis een mogelijk kristal opleveren en elk van deze kristallen zou gelijke toegang hebben tot het beschikbare eiwit in oplossing. Figuur 2 is een grafische weergave van een ideaalscenario van de relatie tussen X_n en X_s. Praktisch gezien is de belangrijkste controle die een kristallograaf heeft over X_n en X_s door de hoeveelheid nucleatie te beïnvloeden of door de toevoeging van zaadkristallen. De microkristallograaf moet beoordelen hoe X_n zodanig kan worden verhoogd dat een geschikte kristalconcentratie en kristalgrootte beide kunnen worden gecreëerd.

De meeste kristallisatietechnieken vereisen een 'overgangsperiode' (figuur 1B). Bijvoorbeeld, in een dampdiffusie-experiment, bij het mengen van het eiwit en de precipiterende oplossingen, zullen de concentraties van elk veranderen als de druppel in evenwicht is met de putoplossing. Men hoopt dat deze veranderingen de daling geleidelijk zullen overbrengen naar de nucleatiezone waar de neiging tot kristallisatie zal toenemen. Naarmate kristallen beginnen te nucleeren en groeien, zal de hoeveelheid eiwit in oplossing beginnen te dalen, waardoor de kans op verdere nucleatie afneemt. De uiteindelijke hoeveelheid nucleatie zal eiwit- en conditiespecifiek zijn, en ook afhankelijk van de diepte van penetratie in de nucleatiezone. Gezien de beperkte nucleatiezonepenetratie van methoden die een overgangsstap vereisen, zal het niveau van nucleatie uiteindelijk beperkt zijn tot de snelheid van nucleatie op de grens van het metastabiele-nucleatiegebied.

Vanwege het belang van het kunnen verbeteren van het niveau van nucleatie voor een microkristallograaf, is het belangrijk om over te stappen op een batchkristallisatiemethodologie. Batch kan meer voordeel halen uit het hele nucleatiegebied (figuur 1C). Bij batchmethoden is het idee om het eiwit en het precipitant zodanig te mengen dat een oververzadigde oplossing ontstaat zonder dat er veranderingen in de componentconcentraties nodig zijn. Nucleatie moet onmiddellijk na het mengen mogelijk zijn. Batchmethoden maken het daarom mogelijk om de hele nucleatiezone theoretisch te bereiken. Elke toename van de nucleatiekinetiek voorbij de metastabiele-nucleatiegrens kan dan worden gebruikt.

Als het basale niveau van kristalkernvorming niet voldoende is om een grote X_n te genereren, kunnen micro-seedingmethoden worden gebruikt. Bij microzaaien worden voorgekweekte kristallen afgebroken tot een brij van kristallijne fragmenten die kunnen fungeren als een steiger voor verse kristalgroei^31,32. Microzaaien is op grote schaal gebruikt in seriële kristallografische monstervoorbereiding als een manier om X_n te vergroten zonder de noodzaak van toenemende kristalkernvorming (figuur 1C).

De overgang van dampdiffusie naar batch kan op een fasediagram worden gevisualiseerd als het verplaatsen van het experimentele startpunt van de niet-oververzadigde of metastabiele gebieden naar de nucleatiezone. Dit kan door de eiwit- en/of precipitantconcentraties en/of de verhouding van de twee binnen de druppel te verhogen (figuur 1D) en te observeren welke omstandigheden kristallen opleveren die snel verschijnen (< 24 uur)²⁶. Volledige dampdiffusiedruppel kan dagen of weken duren³³. Daarom, door te zoeken naar omstandigheden die snel verschijnende kristallen laten zien, kunnen batchcondities worden gevonden zonder over te stappen op alternatieve kristallisatiescreeningformaten zoals micro-batch^34,35,36,37.

Zodra de nucleatiezone is gevonden, is een batchconditie gevonden en kan een morfogram - hier een ruw fasediagram - worden gemaakt. Het morfogram is van groot nut bij het overwegen of een seeded-batch of straight batch protocol moet worden gebruikt. Door de X_n uit te zetten als functie van de eiwit- en precipitantconcentratie kan een beoordeling van de nucleatiekinetiek worden gemaakt²⁶. Als X n laag blijft over het hele nucleatiegebied, kan seeded-batch nodig zijn om X_n groot genoeg te maken om de kristalgroei te beperken. Deze beoordeling is de eerste stap in het proces van schaalvergroting naar grotere volumes (> 100 μL).

Deze methode is zo ontworpen dat deze in de meeste kristallisatielaboratoria kon worden uitgevoerd met behulp van standaard dampdiffusiekristallisatieapparatuur. Er zijn ook veel studies uitgevoerd die technieken beschrijven om veel delen van dit proces te vergemakkelijken, mocht de apparatuur beschikbaar zijn. Deze omvatten, maar zijn niet beperkt tot, dynamische lichtverstrooiing (DLS) 25,27, niet-lineaire beeldvorming 20,24,25, poederdiffractie 20,24,27 en elektronenmicroscopie²⁶ [zie Cheng et al. (²⁰²⁰)⁴⁰ voor een mooie beoordeling].

Het doel van dit werk is om een visuele demonstratie te geven van de methode om over te schakelen van kleine volume (< 500 nL) dampdiffusiekristallisatie naar grote volume (> 100 μL) batchkristallisatie. Endothiapepsine van Cryphonectria parasitica is gebruikt als een voorbeeldsysteem om deze vertaling aan te tonen. Het type experiment en de monsterafgiftemethode waarvoor de microkristallen nodig zijn, zal de ideale X_s-uitgang ²⁶ beïnvloeden. Voor mengexperimenten die een milliseconde tijdresolutie⁴¹ of gasdynamische virtuele nozzles⁴² vereisen, kan een uiteindelijke X_s van < 5 μm wenselijk zijn. In dit geval was het doel om eiwitkristallen te produceren die diffracten tot ongeveer 1,5 Å, voor een foton-geactiveerd pomp-sonde-experiment, en met behulp van een fixed-target delivery benadering.

Om een illustratie te geven van de monstervereisten van een dergelijk serieel kristallografie-experiment met endothiapepsine, toont tabel 1 de experimentele parameters van een hypothetisch experiment. De voorbeeldinformatie was gebaseerd op het hieronder beschreven protocol. Gezien enkele conservatieve schattingen over hit rates en vereisten voor gegevensverzameling, is 50 mg de totale schatting van het monsterverbruik voor het hele experiment.

Figuur 3 toont een stroomschema van het volledige optimalisatieproces van de initiële kleine volume dampdiffusiekristallisatie tot grootschalige batch. Voor de meeste seriële kristallografieprojecten begint dit protocol bij stap 2: 'overgang naar batch', omdat het doeleiwit al is gekristalliseerd. Stap 1 is echter opgenomen voor de volledigheid en om de lezers te herinneren aan het belang ervan. Het vinden van een toestand die aanleiding geeft tot een goed diffracterend, enkel, groot kristal is het beste startpunt voor microkristaloptimalisatie. In stap 2 kan deze toestand vervolgens worden geoptimaliseerd van dampdiffusie tot batch en kan een morfogram van de nucleatie en metastabiele gebieden worden uitgezet. Zodra dit is gebeurd, kan de batchconditie worden geschaald naar grotere volumes in stap 3. Tegen het einde van het stroomdiagram heeft een kristallograaf een herhaalbaar, groot volume (> 100 μL), microkristallisatie, batchprotocol voor endothiapepsine gemaakt. Deze methode kan vervolgens worden toegepast op hun specifieke eiwit van belang.

Protocol

OPMERKING: Alle 96-well sitting-drop kristallisatie-experimenten werden opgezet met behulp van 2- of 3-dropplaten. Een vloeistofbehandelingsrobot en een kristallisatiebeeldcamera / hotel werden gebruikt om de voorbereiding en monitoring van alle 96-putschermen te vergemakkelijken. Alle reagensconcentraties voor kristallisatie-experimenten worden gegeven in hun beginconcentraties voorafgaand aan het mengen.

1. Optimaliseren van kristalmorfologie

OPMERKING: Stappen 1.1.1. en 1.1.6. Beschrijf hoe endothiapepsinekristallisatiecondities werden gevonden en hoe deze omstandigheden werden geoptimaliseerd om een enkele aandoening te vinden die enkele, goed diffracterende kristallen opleverde.

1. Sparse-matrix optimalisatie
   1. Bereid verse endothiapepsine-oplossing.
      OPMERKING: Endothiapepsine, wanneer verkregen als Superan 600, moet worden overgebracht buffer uit de opslagoplossing en geconcentreerd.
      1. Bereid 3 l van 0,1 m na acetaat pH 4,6 bij 4 °C.
      2. Snijd 20 cm dialyseslang en was kort in de buffer. Sluit het ene uiteinde van de slang af met een clip, plaats 50 ml van de endothiapepsine-oplossing in de slang en sluit vervolgens het andere uiteinde af.
      3. Laat de oplossing gedurende ten minste 4 uur (of een nacht) dialyseren bij 4 °C in 1 l van de Na-acetaatbuffer. Door de componenten van de opslagbuffer zal de oplossing in de dialysezak nu ongeveer 100 ml zijn.
      4. Breng de dialysezak met het endothiapepsine over in een verse liter van 4 °C, 0,1 M Na Acetaat pH 4,6. Herhaal deze stap nogmaals zodat de oorspronkelijke buffer 2000x is verdund ten opzichte van het Na-acetaat.
      5. De endothiapepsine zal nu ongeveer 10 mg / ml zijn. Concentraat tot 100 mg/ml met behulp van een centrifugaalconcentrator van 10 kDa en een centrifuge.
      6. Flash koel de endothiapepsine-oplossing in vloeibare stikstof in aliquots van 50 μL en bewaar bij -80 °C.
   2. Bereid een PACT Premier 96-well sparse-matrix scherm voor.
      1. Doseer met behulp van een vloeistofbehandelingsrobot 100 nL van 70 mg / ml endothiapepsine en 100 nL putoplossing in een enkele subput per put. Meng het eiwit en de putoplossing 3 keer na toevoeging van de kristallisatiebuffer.
      2. Verzegel de plaat en laat 28 dagen bij 20 °C 28 dagen staan, waarbij u de eerste week elke dag foto's maakt en daarna elke week gedurende 4 weken.
   3. Sparse-matrix analyse
      1. Identificeer hits die enkele endothiapepsinekristallen produceren. Uit het PACT-scherm groeiden omstandigheden die MgCl₂ bevatten als singletons in plaats van naaldclusters.
   4. Sparse-matrix optimalisatie
      1. Maak van de MgCl_2-bevattende voorwaarden die in stap 1.1.3.1 zijn geïdentificeerd, een scherm met 96 putten dat de verschillende putcomponenten willekeurig combineert en varieert.
      2. Doseer met behulp van een vloeistofbehandelingsrobot 100 nL van 70 mg / ml endothiapepsine en 100 nL putoplossing in een enkele subput per put. Meng het eiwit en de putoplossing 3 keer na toevoeging van de kristallisatiebuffer.
      3. Verzegel de plaat en laat 28 dagen bij 20 °C 28 dagen staan, waarbij u de eerste week elke dag foto's maakt en daarna elke week gedurende 4 weken.
   5. Optimalisatie analyse
      1. Rangschik met behulp van geschikte spreadsheetsoftware de kristallisatieomstandigheden die aanleiding geven tot kristallen op basis van de kristalkwaliteit en het neerslagniveau, respectievelijk geen kristallen (0) tot ideaal (5) en laag (0) tot hoog (5). Met betrekking tot kristalkwaliteit zijn de brede criteria enkelvoudige kristallen met een doosachtige morfologie.
      2. Voer een Pearson's correlatieanalyse uit tussen de kristallisatieconditie-inhoud en de kristalhoeveelheid en het neerslagniveau.
      3. Plot deze gegevens als een heatmap. Zoek naar componenten en voorwaarden die gecorreleerd waren met de gewenste uitkomsten.
   6. Diffractie-analyse.
      1. Bevestig dat de kristallen die zijn gekweekt uit de geïdentificeerde omstandigheden in stap 1.1.5 geschikt zijn voor seriële kristallografie door een röntgendiffractie-experiment uit te voeren.
      2. Laad een monster van de endothiapepsinekristallen van elk van de geïdentificeerde omstandigheden op steunen die gegevensverzameling bij 100 of 293 K mogelijk maken en voer een röntgendiffractie-experiment uit. Als u onder cryo werkt, gebruik dan 25% ethyleenglycol als cryo-beschermer.
      3. Verwerk deze gegevens via een geschikte softwaresuite. Endothiapepsine kristallen moeten diffract tot meer dan 1,5 Å. Controleer op jumelages, omdat tweelingkristallen de verwerking van seriële kristallografische gegevens aanzienlijk kunnen bemoeilijken.
      4. Als kristallen singletons zijn en diffract tot 1,5 Å ga dan verder met stap 2. Zo niet, ga dan terug naar stap 1.1.2 en probeer meer sparse-matrix schermen om veelbelovende omstandigheden te identificeren. Na de analyses uitgevoerd in stap 1.1.5. en 1.1.6., had een kristallisatieconditie van 25% (w/v) PEG 6.000, 0,1 M Tris-HCl pH 7,0 en 0,15 M MgCl₂ als benaderend ideaal moeten worden gevonden.

2. Overgang naar batch

1. Morfogram experiment
   1. Maak een microkristalzaadbouillon.
      OPMERKING: Het is de beste praktijk bij het maken van zaadvoorraden om de zaden te maken van kristallen die speciaal voor de taak zijn gekweekt. Dit helpt enorm bij de reproduceerbaarheid. Andere ideeën die in de stappen 2.1.1.1 tot en met 2.1.1.11 worden gepresenteerd, zijn om altijd de kristallen te gebruiken die uit een standaardaantal putten zijn gegroeid - hier 5 - en de voorraden te aliquoteren zodra ze zijn gemaakt om vries-dooicycli teniet te doen.
      1. Bereid een kristallisatieplaat met 96 putten die de kristallisatiebuffer bevatten: 25% (w / v) PEG 6.000, 0,1 M Tris-HCl pH 7,0 en 0,15 M MgCl₂.
      2. Doseer met behulp van een vloeistofbehandelingsrobot 200 nL ontdooid 70 mg / ml endothiapepsine en 200 nL putoplossing in een enkele subput per put. Meng het eiwit en de putoplossing 3 keer na toevoeging van de kristallisatiebuffer.
      3. Sluit de plaat af en laat 24 uur staan.
      4. Vul een centrifugebuis van 1,5 ml met 250 μL kristallisatiebuffer en 10-15 glasparels van 1 mm. Laat de centrifugebuis 5-10 minuten op ijs afkoelen.
      5. Selecteer 5 putjes met kristallen, open de putjes met een scalpel en verpletter met behulp van een pipetpunt de kristallen in de putjes.
      6. Zuig 1 μL buffer uit de ijscentrifugebuis en gebruik om de gemalen kristallen brij te homogeniseren. Eenmaal homogeen, zuig de hele slurry op en verzamel in de gekoelde centrifugebuis.
      7. Herhaal stap 2.1.2.6 voor elk van de 5 subputten.
      8. Vortex de centrifugebuis met daarin de buffer, gepoolde slurries en kralen bij 1000 rpm gedurende 30 s.
      9. Breng de centrifugebuis gedurende 30 s terug op ijs.
      10. Herhaal stap 2.1.2.8 en 2.1.2.9 nog twee keer.
      11. De zaadvoorraad is nu klaar en kan worden gealiquoteerd in batches van 10 μL en worden opgeslagen bij -20 °C.
   2. Voer een morfogramexperiment uit.
      1. Bereid een 2-drop 96-well rasterscherm voor. Varieer de concentratie van PEG 6.000 van 5 tot 40% (w/v) langs de plaatkolommen, waarbij de buffer en het zout op respectievelijk 0,1 M Tris-HCl pH 7,0 en 0,15 M MgCl₂ worden gehouden.
      2. Bereid een sequentiële verdunning van endothiapepsine in 0,1 M Na Acetaat pH 4,6 van 100 tot 12,5 mg / ml gedurende 8 stappen. Voor elke rij van de plaat wordt een andere concentratie endothiapepsine gebruikt.
      3. Doseer met behulp van een vloeistofbehandelingsrobot 150 nL endothiapepsine in zowel subputten 1 als 2. Doseer in subput 1 150 nL van de putoplossing. In subput 2, multi-aspiraat 50 nL ontdooide zaadvoorraad en 100 nL putoplossing, en vervolgens beide in de eiwitoplossing doseren. Meng de oplossingen 3 keer na toevoeging van de kristallisatiebuffer.
      4. Sluit de plaat af en laat bij 20 °C foto's maken om de 0, 3, 6, 12, 18, 24 uur, vervolgens elke dag gedurende de eerste week en elke week gedurende de volgende vier. Als automatische beeldvorming niet mogelijk is, maak je dan geen zorgen over de beeldvorming per uur op dag 1.
2. Morfogram analyse
   1. Kijkend naar de beelden die na 24 uur zijn gemaakt, schat u het aantal kristallen dat in elke put aanwezig is en noteert u deze schattingen in het meegeleverde werkblad "morfogramgenerator". Deze schattingen hoeven niet precies te zijn; Het individueel tellen van duizenden microkristallen, indien aanwezig, is niet praktisch of noodzakelijk. Probeer er vooral voor te zorgen dat de schattingen consistent zijn over het hele bord.
      OPMERKING: De 24-uursregel was gebaseerd op de waarnemingen in Beale et al . (2019)²⁶. Dampdiffusiekristallisatiecondities kunnen dagen of weken duren om in evenwicht te komen. Kristallen die snel verschijnen, zijn eerder gegroeid via een batchproces dan door de geleidelijke equilibratie van de druppelcomponenten. Het 24-uurscriterium is daarom enigszins willekeurig en een exacte cut-off tijd tussen een batch- en dampdiffusie-experiment zal afhangen van het specifieke mengsel van de aandoening [zie Beale et al. (2019) ²⁶ voor volledige details].
   2. Voer de startconcentraties van endothiapepsine en PEG 6.000 in de aangegeven vakken in.
   3. Het werkblad plot de resultaten automatisch in het traditionele fasediagramformaat met precipitant- en eiwitconcentratie op respectievelijk de x - en y-as . Welnu, omstandigheden die alleen aanleiding geven tot kristallen in hun gezaaide druppels geven het metastabiele gebied van het diagram aan (transparant blauw), terwijl omstandigheden met kristallen in zowel de gezaaide als niet-gezaaide druppels de nucleatiezone (effen groen) aangeven.
      OPMERKING: Idealiter zou het grootste deel van de nucleatiezone aanwezig moeten zijn op het diagram (d.w.z. er zijn enkele duidelijke putten aan de onderkant van het diagram en er moet wat neerslag zichtbaar zijn bij hoge eiwit- en precipitantconcentraties). Als dit niet het geval is, herhaal dan misschien het experiment, maar verhoog de eiwit- en / of precipitantconcentratie (indien mogelijk).
   4. Als er in minder dan 24 uur kristallen zijn verschenen, gaat u verder met stap 2.3.1. Zo niet, ga dan verder met stap 2.4 en ga verder met optimaliseren naar batch.
3. Kristalanalyse
   1. Zoals gezegd aan het einde van stap 1, voordat u naar de volgende stap gaat, moet u ervoor zorgen dat deze kristallen de gewenste morfologie en diffractiekwaliteit hebben. Met betrekking tot morfologie, zijn de kristallen waarneembaar ongebonden en vormen ze zich als singletons in plaats van naaldbalachtige of waaierachtige structuren? Met betrekking tot diffractie, verzamel indien mogelijk diffractiegegevens van de kristallen. Als deze kristallen niet diffracten, is het onwaarschijnlijk dat de kristallen die in een groter volume worden gekweekt, zullen diffracten.
   2. Laad een monster van de endothiapepsinekristallen uit het morfogramexperiment op steunen die gegevensverzameling bij 100 of 293 K mogelijk maken en voer een röntgendiffractie-experiment uit. Als u onder cryo werkt, gebruik dan 25% ethyleenglycol als cryo-beschermer.
   3. Verwerk deze gegevens via een geschikte softwaresuite. Endothiapepsine kristallen moeten diffract tot meer dan 1,5 Å. Observeer over het monster van kristallen de celgrootte, het totale aantal waarnemingen en de mozaïciteit; Deze metingen geven een indicatie van de homogeniteit van de diffractende kristallen.
   4. Als de kristalmorfologie en diffractiekwaliteit voldoende is, gaat u verder met stap 3.
4. Optimaliseer de groeitijd van kristallen.
   OPMERKING: De morfogramanalyse (stap 2.2) zal een indicatie hebben gegeven van het startpunt van de kristallisatie (d.w.z. het gebied van het fasediagram waar de druppel zich bevindt wanneer de precipitant en eiwitoplossingen werden gemengd). Is de daling in het metastabiele gebied of onder de oplosbaarheidslijn? Batchkristallisatie begint in de nucleatiezone (figuur 1C). Het doel van deze stap is om dit startpunt te verplaatsen van onder de oplosbaarheidslijn of het metastabiele gebied, naar de nucleatiezone (figuur 1D). Als de seeded-drops van stap 2.2. snel kristallen hebben opgeleverd, dit is een indicatie dat het druppelmengsel zich al in het metastabiele gebied bevindt, zo niet, dan is het waarschijnlijk dat de druppel niet oververzadigd is.
   1. Het optimaliseren van de kristalgroeitijd.
      1. Gebruik hetzelfde scherm als in stap 2.1.3 en bereid een 96-well dampdiffusiekristallisatie-experiment voor in een 3-druppelplaat.
      2. Verhoog de starteiwitconcentratie van endothiapepsine op de y-as (d.w.z. concentreer het eiwit verder, misschien 120 mg / ml voor endothiapepsine).
      3. Voer een seriële verdunning uit, zoals in stap 2.1.3.2, zodat elke rij van de plaat een sequentieel lagere eiwitconcentratie bevat.
      4. Gebruik verschillende druppelverhoudingen in elk van de drie druppels op de plaat: 1: 1, 1: 2 en 2: 1, eiwit: precipitant.
      5. Bekijk of beeld de plaat op de eerste dag op 0, 3, 6, 12, 18, 24 uur en vervolgens elke dag voor de eerste week, en elke week voor de volgende vier. Als automatische beeldvorming niet mogelijk is, maak je dan geen zorgen over de beeldvorming per uur op dag 1.
      6. Identificeer druppels die de snelst verschijnende kristallen produceren en maakt deze de startpunten van herhaalde optimalisaties totdat kristalgroei binnen 24 uur optreedt.
      7. Wanneer een snel verschijnende kristalconditie is geïdentificeerd, keert u terug naar stap 2.1 om het morfogram opnieuw te plotten als een opmaat om te beginnen met schalen.

3. Schalen

1. Rangschik schaalroutes. In dit stadium is het niet nodig om te beslissen over een enkele schaalroute, alleen om de opties te identificeren en te rangschikken, zodat ze op hun beurt kunnen worden verkend. Naarmate het volume van het batchmengsel tijdens de schaalprocedure wordt verhoogd, zullen er veranderingen optreden in de snelheid van nucleatie en het bereik van kristalgroottes. Deze kunnen echter worden ondervangen door de componentconcentraties zorgvuldig aan te passen naarmate het geschaalde volume wordt verhoogd.
   OPMERKING: In de stappen 3.1.1 en 3.1.2 wordt beschreven hoe uit het morfogram kan worden afgemeten of een batch- of seeded-batchprotocol geschikter is.
   1. Straight batch protocol
      1. Is de X_n in de nucleatiezone evenredig met de eiwit- en/of precipitantconcentratie? D.w.z. neemt X_n toe als functie van de precipitant- en/of eiwitconcentratie? -Ja? Ga naar stap 3.1.1.2. Nee? Ga naar stap 3.1.2. 
      2. Zoek de omstandigheden die kristallen van de vereiste grootte opleveren en ga naar stap 3.2.
   2. Seeded-batch protocol
      1. Is de X_n vlak over de nucleatiezone? Dwz. X_n neemt niet toe als functie van de precipitant- en/of eiwitconcentratie.
      2. Zoek gezaaide omstandigheden die kristallen van de vereiste grootte opleveren en ga naar stap 3.2. Als alle kristallen te groot zijn, ga dan naar stap 3.1.2.3.
      3. Herhaal het morfogramexperiment (stap 2.1), maar verhoog deze keer de concentratie van de zaadvoorraad die in de gezaaide putten wordt gebruikt. De zaadvoorraad kan worden vergroot door meer kristallen te gebruiken bij de creatie ervan. Gebruik bijvoorbeeld in plaats van 5 putten in stap 2.1.1.5 10 putjes.
      4. Bekijk of beeld de plaat over de eerste 0, 3, 6, 12, 18, 24 uur.
      5. De X_n zou moeten zijn toegenomen en de X_s in de gezaaide druppels. Herhaal deze cyclus als er kleinere kristallen nodig zijn en volg dan een seeded-batch protocol.
2. Geleidelijk schalen
   1. Schalen in 96-putplaten. Uit het endothiapepsinemorfogram werd aanvankelijk een rechte batchmethode met behulp van de kristallisatieconditie 0,1 M Tris-HCl pH 7,0, 0,15 M MgCl₂ en 30% (w/v) PEG 6.000 geselecteerd voor schaalvergroting. 100 mg/ml endothiapepsine gemengd met de kristallisatiebuffer in een verhouding van 1:1.
      1. Bereid 2-3 putjes voor in een 2-well 96-well zit-drop plaat met 100 μL van 0,1 M Tris-HCl pH 7,0, 0,15 M MgCl₂ en 30% (w/v) PEG 6.000.
      2. Gebruik vers ontdooide 100 mg/ml endothiapepsine-oplossing, geef 0,5 μL eiwit en 0,5 μL precipitant per put, sluit af en bewaar bij 20°C.
      3. Bekijk of beeld de plaat over de eerste 0, 3, 6, 12, 18, 24 uur. Let op eventuele wijzigingen in het bereik van X_s en X_n.
      4. Als er veranderingen zijn opgetreden, herhaalt u stap 3.2.1.1 tot en met 3.2.1.2, maar verhoogt of verlaagt u de eiwit-, precipitant- en/of zaadconcentratie om eventuele wijzigingen in het bereik van X_s en X_n te herstellen.
      5. Wanneer het bereik van X_s en X_n acceptabel is, gaat u verder met stap 3.2.2.
   2. Schalen in 24-well hanging-drop platen
      1. Bereid een enkele put van een 24-well hang-drop plaat voor door de randen van de put in te smeren met vacuümvet.
      2. Bereid 0,5 ml van 0,1 M Tris-HCl pH 7,0, 0,15 M MgCl₂ en 30% (w/v) PEG 6.000 en vul het ingevette goed.
      3. Met behulp van vers ontdooide endothiapepsine-oplossing, pipetteer 1 μL eiwit op het oppervlak van een glazen dekplaat. Pipetteer 1 μL kristallisatiebuffer op de eiwitdruppel en meng met behulp van de pipet.
      4. Bekijk of beeld de plaat over de eerste 0, 3, 6, 12, 24 uur. Let op eventuele wijzigingen in het bereik van X_s en X_n.
      5. Als er veranderingen zijn opgetreden, herhaalt u stap 3.2.2.1 tot en met 3.2.2.4, maar verhoogt of verlaagt u de eiwit-, precipitant- en/of zaadconcentratie om eventuele wijzigingen in het bereik van X_s en X_n te herstellen.
      6. Wanneer/als het bereik van X_s en X_n acceptabel is, gaat u verder met stap 3.2.2.7.
      7. Herhaal stap 3.2.2.1 tot en met 3.2.2.5, waarbij het totale volume van het experiment geleidelijk wordt verhoogd tot 10 μl.
      8. Eenmaal bij een volume van 10 μL of groter, gaat u verder met centrifugebuizen in stap 3.2.3.
   3. Schalen in centrifugebuizen
      OPMERKING: De verfijning van de endothiapepsine batchconditie vond voornamelijk plaats op het punt van 200 μL volumes (zie Resultaten, Schaling). Het proces begon met een kristallisatieconditie van 0,1 M Tris-HCl pH 7,0, 0,15 M MgCl₂ en 30% (w/v) PEG 6.000. De PEG-concentratie veranderde echter uiteindelijk naar 40% (w/v). Zaden waren ook nodig om de X_n te beheersen, en om te voorkomen dat kristallen te groot werden, moest kristalgroei worden geblust. In de stappen 3.2.3.1 tot en met 3.2.3.7 wordt het proces van conditieoptimalisatie beschreven. Stap 3.2.4. Beschrijf het uiteindelijke batchprotocol.
      1. Bereid 1 ml kristallisatiebuffer voor: 0,1 M Tris-HCl pH 7,0, 0,15 M MgCl₂ en 30% (w/v) PEG 6.000.
      2. Voeg met behulp van vers ontdooide 100 mg / ml endothiapepsine 25 μL eiwit toe aan een centrifugebuis van 1,5 ml.
      3. Meng de kristallisatiebuffer grondig met de eiwitoplossing in een verhouding van 1:1 met een pipetpunt. Plaats de buis in een revolver/rotator met hoge beweging bij 20 °C.
      4. Neem regelmatig (5, 10, 30, 60 min, 2, 5, 10, 24 uur) 2,5 μL aliquots en bekijk in een hemocytometer. Noteer het X-n_{- en het X} s-bereik.
      5. Als er wijzigingen zijn opgetreden, herhaalt u stap 3.2.3.1. tot en met 3.2.3.4. maar verhoog of verlaag de eiwit-, precipitant- en/of zaadconcentratie om eventuele veranderingen in het bereik van X_s en X_n te herstellen
      6. Wanneer het bereik van Xs en Xn acceptabel is, gaat u verder met stap 3.2.3.7.
      7. Herhaal stap 3.2.2.1 tot en met 3.2.2.5, waarbij het totale volume van het experiment naar behoefte geleidelijk wordt verhoogd tot 200 μl of groter.
   4. Definitief seeded-batch protocol
      1. Maak zaadbouillon klaar.
         1. Bereid 2 ml kristallisatiebuffer voor: 0,1 M Tris-HCl pH 7,0, 0,15 M MgCl₂ en 40% (w/v) PEG 6.000.
         2. Voeg met behulp van vers ontdooide 100 mg / ml endothiapepsine 100 μL eiwit toe aan een centrifugebuis van 1,5 ml.
         3. Meng de kristallisatiebuffer grondig met de eiwitoplossing in een verhouding van 1:1 met een pipetpunt. Plaats de buis gedurende 24 uur in een revolver/rotator met hoge agitatie bij 20 °C om kristallen van 50 μm te laten groeien.
         4. Voeg 10-15 glasparels van 1 mm toe aan de kristalbrij van 50 μm.
         5. Vortex de centrifugebuis met de slurry en kralen bij 1000 rpm gedurende 30 s.
         6. Breng de centrifugebuis gedurende 30 s terug op ijs.
         7. Herhaal stap 3.2.4.1.5 en 3.2.4.1.6 nog 10 keer.
         8. Dit is nu 200 μL van een 1x zaadvoorraad. Verdun de zaadvoorraad 10x door toevoeging van 1,8 ml kristallisatiebuffer. Aliquoteer de 10x zaadvoorraad in batches van 50 μL en bewaar bij -20 °C.
      2. Seeded-batch protocol.
         1. Bereid kristallisatiebuffer voor: 0,1 M Tris-HCl pH 7,0, 0,15 M MgCl₂ en 40% (w/v) PEG 6.000.
         2. Meng in een centrifugebuis 100 μL kristallisatiebuffer met de 50 μL vers ontdooide 10x zaadvoorraad.
         3. Voeg met behulp van vers ontdooide 100 mg / ml endothiapepsine 150 μL eiwit toe aan een centrifugebuis van 1,5 ml.
         4. Meng de kristallisatiebuffer/het zaadmengsel grondig met de endothiapepsine-oplossing met een pipetpunt en plaats de buis in een revolver/rotator met hoge agitatie bij 20 °C.
         5. Controleer de kristallisatie door regelmatig 2,5 μL aliquots te nemen en bekijk de kristallen in een hemocytometer. Noteer het X-n_{- en het X} s-bereik.
         6. Na ongeveer 80 minuten, wanneer de kristallen een X_s van 15 μm hebben bereikt, dooft u de reactie door toevoeging van 150 μL van 0,05 M Na Acetaat pH 4,6, 0,05 M Tris-HCl pH 7,0, 0,075 M MgCl₂ en 20% (w/v) PEG 6.000 (een oplossing bestaande uit endothiapepsinebuffer en kristallisatiebuffer, gemengd 1:1).
         7. Bewaar de kristallen bij 20 °C.
      3. Heeft het protocol een acceptabel kristalgroottebereik en -getal opgeleverd voor het beoogde experiment? Ja - GEREED - Nee - terug naar stap 3.1. en probeer een alternatieve schaaloptie. Een andere eiwit-/precipitantverhouding kan bijvoorbeeld mogelijk zijn of het toevoegen van zaden als dit niet eerder is gedaan. Wanneer deze allemaal uitgeput zijn, kan het nodig zijn om een nieuwe conditie te vinden bij stap 1.

Representative Results

Kristalmorfologie optimaliseren
Stap 1, het optimaliseren van kristalmorfologie, is opgenomen om de lezer te herinneren aan het belang ervan. Het is misschien mogelijk om perfecte microkristallen te maken van slecht diffractie naaldballen; De auteurs suggereren echter dat het beter is om de twee afzonderlijk te optimaliseren. Zoek eerst omstandigheden die aanleiding geven tot goed diffracterend, enkel kristal via dampdiffusie en zet deze omstandigheden vervolgens om in batch in plaats van te proberen de twee stappen samen te combineren. Het ontdekken van zeer nucleaire omstandigheden is in dit stadium niet nodig; morfologie en diffractiekwaliteit zijn de belangrijkste doelen.

Voordat met de microkristallisatie van endothiapepsine werd begonnen, werd een analyse van de afgezette structuurkristallisatiecondities uit de VOB uitgevoerd. Kristallisatiecondities en benaderende protocollen konden worden verkregen voor 47 van de 48 afzettingen van enthothiapepsine. Deze waren in grote lijnen allemaal gebaseerd op de eerste kristallisatie van endothiapepsine uitgevoerd door Moews en Bunn (1970)⁴⁶. Gezien de overeenkomsten van deze omstandigheden en hun 'klassieke' oorsprong, werd een 96-well, dampdiffusie, sparse-matrix scherm uitgevoerd om een grotere verscheidenheid aan kristallisatieomstandigheden te verkennen. Endothiapepsine werd geconcentreerd tot 70 mg/ml en een PACT sparse-matrix screen⁴⁷ werd uitgevoerd in een 96-well sitting-drop plate bij 20 °C waarbij 100 nL eiwit werd gemengd met 100 nL putoplossing. Elke toestand uit dit experiment na 36 uur gaf aanleiding tot kristallen. Een analyse van de kristalmorfologie gaf echter aan dat sommige omstandigheden beter zouden kunnen zijn voor microkristallisatie-optimalisatie.

Figuur 4A toont een daling van het PACT-scherm die in grote lijnen representatief was voor die waargenomen in het grootste deel van de plaat. Op het eerste gezicht kan het verleidelijk zijn om te denken dat deze kristallen de moeite waard zijn om verder te optimaliseren voor microkristallisatie. De kristallen zijn groot en er lijkt sprake te zijn van aanzienlijke nucleatie. De algehele kristalmorfologie is echter niet ideaal. Ten eerste zijn de kristallen niet waarneembaar singleton, omdat het erop lijkt dat er meerdere kristallen groeien vanuit enkele nucleatiepunten. Ten tweede is de kristalgrootte zeer asymmetrisch, waarbij de groei voornamelijk langs een enkele as plaatsvindt. Dergelijke kristallen hebben theoretisch meer kans om bij voorkeur uit te lijnen wanneer ze aan de röntgenstraal worden afgeleverd. Beide kenmerken leveren problemen op tijdens het verzamelen en verwerken van seriële kristallografische gegevens.

Figuur 4B toont echter endothiapepsinekristallen gekweekt in de aanwezigheid van MgCl₂. Deze morfologie was consistent in alle omstandigheden die MgCl 2 bevatten en suggereerde daarom dat hun morfologie te wijten was aan MgCl₂. De MgCl_{2-omstandigheden} produceerden enkele, meer doosachtige kristallen die een beter doelwit vormden voor de ultieme seriële experimenten.

Er waren vier voorwaarden in het PACT-scherm die MgCl₂ bevatten. Om de invloed van alle verschillende componenten van deze aandoeningen op endothiapepsinekristallisatie beter te begrijpen, werd een willekeurige optimalisatie uitgevoerd. Er werd een scherm gemaakt met een willekeurige combinatie van de buffers en precipitanten bij een reeks concentraties en pH's. De MgCl_{2-concentratie} werd ook gevarieerd en vervolgens werden de resulterende druppels willekeurig beoordeeld van 0-5 (0 is geen kristallen of neerslag) in termen van hun visuele kristalkwaliteit en neerslagniveau.

Figuur 5A toont een heatmap van de resultaten van een Pearson's correlatieanalyse tussen het neerslagniveau en de kristalkwaliteit, en de schermvariabelen (voorbeelden van de druppels uit dit experiment worden getoond in figuur 5B, C en D). De resultaten gaven aan dat de pH van de oplossing sterk gecorreleerd was met het neerslagniveau, waarbij alkalische buffers resulteerden in meer neerslag. De MgCl_{2-concentratie} was enigszins gecorreleerd met het neerslagniveau, net als de pH- en precipitantconcentratie tot kristalkwaliteit.

Op basis van deze resultaten werd besloten om de kristallen gekweekt in 0,1 M Tris-HCl pH 7,0, 0,15 M MgCl₂, 20% (w/v) PEG 6.000 naar de volgende stap van het protocol te brengen - Overgang naar batch. De morfologie van kristallen was acceptabel en een analyse van de röntgendiffractie en gegevenskwaliteitsmetingen van deze kristallen suggereerde dat er geen significant verschil was tussen de kristallen die in en uit de aanwezigheid van Mg²⁺ werden gekweekt (figuur 9).

Overschakelen naar batch
Voor veel seriële kristallografie microkristallisatie optimalisaties zal Stap 2 het startpunt zijn. Het eiwit van belang zal al zijn gekristalliseerd voor cryo-kristallografie en het kristallisatieprotocol zal nu moeten worden getransformeerd om microkristal slurries te creëren. Dit protocol heeft alleen 96-well dampdiffusieplaten gebruikt om de transformatie naar batch uit te voeren, aangezien dampdiffusie de kristallisatiemethode is die door 95% van de PDB-vermeldingen²⁶ wordt gebruikt. Het protocol heeft vermeden om naar microbatch^34,35,37 te gaan, omdat deze overgang nog steeds een vergelijkbare optimalisatie kan veroorzaken. Dit wil niet zeggen dat dit protocol alleen in dampdiffusieplaten kan worden gedaan. Alle gepresenteerde stappen zouden ook in microbatch werken als dit de oorspronkelijke kristallisatiemethode was.

Om de kristallisatie van endothiapepsine in de gekozen toestand te beoordelen, werd een morfogram - of een ruw fasediagram - gemaakt. Het doel van het morfogramexperiment is drieledig. Ten eerste is een analyse van het morfogram van groot nut bij het beoordelen van schaalroutes in Stap 3 - Schalen. Ten tweede fungeert het morfogram als een optimalisatietool en helpt het bij het ontdekken van dampdiffusieomstandigheden die aanleiding geven tot kristallen via batch [d.w.z. snel verschijnende kristallen (< 24 uur)]. Ten derde, als kristallen niet snel zijn verschenen, kan een analyse van de gezaaide druppels de kristallograaf een idee geven van de geschatte locatie van de huidige toestand op het fasediagram. Als de gezaaide omstandigheden bijvoorbeeld kristallen geven, maar de niet-gezaaide niet, bevinden die omstandigheden zich waarschijnlijk in het metastabiele gebied.

Het morfogramexperiment van endothiapepsine werd uitgevoerd op basis van de 0,1 M Tris-HCl pH 7,0, 0,15 M MgCl₂, 20% (w/v) PEG 6.000 conditie. De eiwit- en PEG-concentraties varieerden van respectievelijk 100 tot 12,5 mg / ml en 5 tot 40% (w / v). De druppels werden geanalyseerd en de resultaten werden uitgezet met behulp van het bijgeleverde werkblad (figuur 6A).

Het was ook al duidelijk uit het stadium van het optimaliseren van kristalmorfologie dat endothiapepsine kristalgroei in deze toestand, en bij deze eiwitconcentraties, zou resulteren in kristallen die binnen 24 uur zouden groeien. Dit gaf aan dat kristallisatie plaatsvond via een batch in plaats van een dampdiffusiegedreven proces. Het kristal dat in deze omstandigheden werd gekweekt, was daarom geschikt om naar grotere volumes te schalen.

Als kristallen na 24 uur niet zichtbaar waren geweest in de niet-gezaaide druppels, dan zou het waarschijnlijk zijn geweest dat kristallisatie nog steeds afhankelijk was van een overgang (figuur 1B) en dus niet batch. In dit geval zijn de resultaten van het morfogramexperiment nog steeds van belang. Ze geven een indicatie van het waarschijnlijke startpunt voor kristallisatie op het fasediagram en dus hoe de daaropvolgende optimalisatie moet verlopen. Kijk naar de gezaaide druppels. De zaden zullen kristalgroei in het metastabiele gebied mogelijk maken, ongeacht de nucleatie. Als bijvoorbeeld kristallen binnen 24 uur in de gezaaide druppels verschijnen, maar niet in de ongezaaide druppels, geeft dit aan dat een deel van het metastabiele gebied kan worden waargenomen. Als er geen kristallen worden waargenomen in de gezaaide of niet-gezaaide druppels, blijven alle putten onderverzadigd.

Schalen
Kijkend naar het morfogram (figuur 6A) konden een aantal waarnemingen worden gedaan. De hoeveelheid nucleatie bleek te worden beïnvloed door zowel de eiwit- als de precipitantconcentraties. Er was ook een zeer duidelijke afbakening van druppels die leiden tot eiwitprecipitatie, waarbij druppels ofwel bevatten: niets, kristallen of neerslag (figuur 6B). De toevoeging van zaden (figuur 6D) nam ook sterk toe X_n in vergelijking met de druppels zonder zaden (figuur 6C). Al deze resultaten samen genomen, werd besloten om te proberen zowel een batch- als een seeded-batch-protocol te schalen op 30% (w / v) PEG 6.000 en 100 mg / ml endothiapepsine.

De eerste testschaling werd uitgevoerd in 24-goed hangende valplaten. De dalingsvolumes werden geleidelijk verhoogd, zodat eventuele veranderingen in kristallisatiegedrag konden worden waargenomen (figuur 7). Zoals te zien is, heeft in zowel de ongezaaide als de gezaaide druppels kristalgroei plaatsgevonden. Alle ongezaaide druppels groeiden een reeks kristalgroottes, maar overwegend grote kristallen (100-200 μm - langste dimensie). De gezaaide druppels produceerden echter kleinere kristallen (5 - 50 μm - langste dimensie). Deze eerste tests suggereerden dat zaden nodig zouden zijn om X_s te verminderen, maar ook dat deze aandoening geschikt zou moeten zijn voor grotere volumes.

Wanneer het volume in 200 μL werd verhoogd, werd het kristallisatievolume voortdurend geroerd tijdens de kristalgroei. De belangrijkste reden voor deze agitatie was om ervoor te zorgen dat de kristallisatieoplossing homogeen blijft en dat groeiende kristallen zich niet op de bodem of zijkanten van de buizen nestelen. Bezinking van kristallen kan leiden tot een heterogene kristalpopulatie met zowel zeer grote als kleine kristallen. Het roeren van de kristallisatieoplossing kan ook nucleatie^{bevorderen 44,45}.

Helaas produceerde de ongezaaide 30% (w / v) PEG 6.000 geen kristallen, dus de PEG-concentratie werd verhoogd tot 35% (w / v). Deze toename verbeterde de kristallisatie aanzienlijk, met een laatste X_n en X_s bereik van 3,6 ± 1,2 x 10⁶ kristallen · ml-1 en 42 ± ^4,1 μm, respectievelijk (figuur 8A en B - zwart). Hoewel een aanzienlijke verbetering en een acceptabele kristalconcentratie, waren de uiteindelijke kristallen te groot voor het geplande experiment, dus werden verdere optimalisaties ondernomen. Om de grootte van de uiteindelijke kristallen te verkleinen, werden twee wegen verkend (figuur 1E): het verlagen van de eiwitconcentratie om te proberen de uiteindelijke kristalgroei te beperken (figuur 8A en B - hot pink), en het verhogen van de PEG-concentratie om te proberen de nucleatie te verhogen (figuur 8A en B - groen).

De verlaging van de eiwitconcentratie verminderde helaas ook de X_n dramatisch, waardoor uiteindelijk nog grotere kristallen ontstonden. Het verhogen van de PEG-concentratie tot 40% leverde een eindbereik_van X_n en X s op van respectievelijk 3,1 ± 0,7 x 10⁶ kristallen·^ml-1 en 39 ± 2,3 μm. Deze verschilden niet significant van de 35%, maar omdat de uiteindelijke kristalgrootte was verminderd, werd deze voorwaarde voortgezet met de verdere optimalisaties.

Om de X_n te vergroten, werden zaden toegevoegd. Dit verhoogde de X_n (1,1 ± 1,8 x 10⁸ kristallen·^ml-1) dramatisch en leidde tot een kleinere X_s (4,2 ± 4,0 μm) (figuur 8A en B - paars onderbroken). Deze kristallen, hoewel zeer geschikt voor sommige seriële kristallografie-experimenten, werden te klein geacht, zodat de concentratie van de toegevoegde zaden werd veranderd.

Deze afstemming van de toegevoegde zaadvoorraad bleek echter moeilijk betrouwbaar te herhalen; daarom werd geprobeerd te blussen. Na de toevoeging van een zaadvoorraad werd de kristalgrootte gecontroleerd en zodra een geschikte kristalgrootte was bereikt (ongeveer 10 - 20 μm), werd de batchkristallisatie geblust (figuur 8C en D). Quenching werd voorgesteld, met betrekking tot microkristallisatie, in Kupitz et al. (2014)²⁵. Hoewel misschien geen ideale methode, omdat eiwitoplossing uiteindelijk zal worden verspild²⁶, was de techniek in deze situatie zeer nuttig omdat kristalgroei moeilijk te beheersen was. Het idee achter blussen is om het kristallisatiemengsel snel terug te brengen naar een punt net boven de oplosbaarheidslijn (figuur 1F). Zodra de oplossing is teruggekeerd naar de oplosbaarheidslijn, is de oplossing teruggekeerd naar een stabiele verzadigde oplossing en zal er geen verdere kristalgroei optreden.

Een poging om een kristallisatiereactie te blussen is niet zonder risico. Als een te grote blusoplossing wordt toegevoegd, kan het eiwit in oplossing zo sterk worden verdund dat de oplosbaarheidslijn wordt gepasseerd. In dit geval zal de oplossing onderverzadigd raken en zullen de kristallen beginnen op te lossen. Om dit te voorkomen, is het mogelijk om de hoeveelheid benodigde blusoplossing te schatten op basis van de morfogramresultaten. Neem op het punt van blussen de concentratie van de eiwitoplossing. Door de eiwitconcentratie op de oplosbaarheidslijn en de eiwitconcentratie in oplossing te vergelijken, kan een schatting van de benodigde verdunning worden gemaakt.

De uitgebluste versie van het 40% (w/v) PEG 6.000, 10 x verdund zaadexperiment gaf een uiteindelijke kristalconcentratie en groottebereik van respectievelijk 2,6 ± 3,1 x 10⁶ kristallen·^ml-1 en 15 ± 3,9 μm.

Gedurende het hele proces werden test-röntgengegevensverzamelingen van de endothiapepsinekristallen verzameld op de Zwitserse lichtbron PXII-bundellijn met behulp van een focus van 10 x 30 μm, een energie van 12,4 keV verzwakt door 80% en onder cryo-omstandigheden. De gegevens werden verwerkt met behulp van wijzerplaten en figuur 9 toont een vergelijking van CC_1/2. Er werd geen dramatische verandering in CC_1/2 waargenomen in de loop van de optimalisatie.

Figuur 1: Een overzicht van overgangs- en batchkristallisatie en schaalmethoden die zijn toegewezen aan een fasediagram . A. De zones en limieten van het archetypische eiwitkristallisatiefasediagram. De precipitant- en eiwitconcentraties worden respectievelijk uitgezet op de x - en y-as , met het zuiverwaterpunt aan de oorsprong. De paarse lijn geeft de grens van de eiwitoververzadiging aan en de metastabiele, nucleatie- en neerslagzones worden respectievelijk in blauw, groen en roze weergegeven. B. Een voorbeeld van de penetratiegrenzen van de nucleatiezone van een 'overgangsfase'-kristallisatiemethode, zoals dampdiffusie. In dit theoretische experiment beginnen de druppelprecipitant- en eiwitconcentraties net onder de oplosbaarheidslijn - nog niet oververzadigd. Terwijl de daling in evenwicht is, nemen de concentraties van de druppelcomponenten zodanig toe dat de druppel oververzadigd raakt en blijft bewegen - of overgaan - in de nucleatiezone. Bij kristalkernvorming begint de eiwitconcentratie in oplossing te dalen. De concentratie blijft dalen naarmate kristallen groeien totdat ze uiteindelijk stoppen bij de oplosbaarheidslijn. De blauwe stippellijn markeert een theoretische grens van de overgang naar de nucleatiezone. Zodra de nucleatie begint, zal de eiwitconcentratie dalen, waardoor verdere penetratie wordt voorkomen. C. Voorbeeld batch en seeded-batch kristallisatie trajecten. In batch moet het mengen van het eiwit en het precipitant een oververzadigde oplossing in de nucleatiezone creëren, zodat kristalgroei kan optreden. In seeded-batch is het niet strikt noodzakelijk om in de nucleatiezone te zijn vanwege de toevoeging van microzaden, dus locaties in het metastabiele gebied kunnen ook worden verkend. D. Een hypothetische optimalisatie van het kristallisatie-experiment getoond in B van dampdiffusie tot batch. Het oorspronkelijke dampdiffusiestartpunt is via de resulterende optimalisatievector overgegaan naar de nieuwe startpositie; binnen de nucleatiezone. De resulterende vector is het product van twee optimalisaties: een toename van zowel eiwit- als precipitantconcentraties. E. Voorbeeldoptimalisaties bij het schalen van batchcondities om de uiteindelijke X_n en X_s aan te passen. F. Het blussen van het kristallisatie-experiment door de toevoeging van kristallisatiebuffer. Het is essentieel dat het blussen de eiwitconcentratie niet uit het metastabiele gebied haalt en dus onder het punt van eiwitoververzadiging. Anders zullen kristallen weer beginnen op te lossen in oplossing. B. en C . zijn met toestemming van de auteurs overgenomen uit Beale et al. (2019)²⁶ . Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: X_n vergroten en X_s verlagen. De geïdealiseerde relatie tussen het aantal kristallen geproduceerd uit een kristallisatie-experiment en hun gemiddelde langste dimensie. Om deze grafiek te maken, werd de kristallisatie van een hypothetisch 10 kDa-modeleiwit gebruikt. Het eiwit kristalliseerde in een concentratie van 10 mg/ml en leverde P2 1 2₁21_{1 kristallen} op met afmetingen van 49x50x51 Å. Elke nucleatiegebeurtenis werd verondersteld een kristal op te leveren. Van kristalgroei werd aangenomen dat ze homogeen was van elk gezicht. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Een stroomdiagram met de stappen om een kristal dat in een klein volume (<500 nL) is gegroeid, dampdiffusie-experiment te optimaliseren in een batchexperiment met een groot volume (> 100 μL). Kristaloptimalisatie is verdeeld in drie fasen: (1) Het optimaliseren van kristalmorfologie. (2) Overgang naar batch. (3) Schalen. In fase 1 is het belangrijk om geschikte kristallen te identificeren voor microkristallisatie. Sommige eiwitten zijn alleen aanwezig in een enkele kristalmorfologie, ongeacht de kristallisatieconditie. Het is echter de moeite waard om te zoeken naar omstandigheden die aanleiding geven tot enkele, kubusachtige kristallen, of zo dicht mogelijk bij deze als menselijk mogelijk is. Enkele, kubusachtige kristallen, hypothetisch en anekdotisch, zullen over het algemeen leiden tot betere resultaten van seriële kristallografie-experimenten. Zodra een kristalmorfologie is geselecteerd en de diffractie is bevestigd, is het vervolgens noodzakelijk om het kristallisatie-experiment van dampdiffusie naar batch te verplaatsen (fase 2). Hier moeten kristallen worden geoptimaliseerd door hun nucleatietijd. Het doel is om omstandigheden te vinden die snel verschijnende kristallen opleveren (> 24 uur), omdat deze omstandigheden waarschijnlijk onmiddellijk de nucleatiezone raken en daarom batch zijn. Zodra een aandoening in de nucleatiezone is gevonden, kan een morfogram worden gemaakt. Het morfogram maakt het mogelijk om het grootste deel van de nucleatiezone in kaart te brengen en potentiële schaalroutes te identificeren voor fase 3. Het volume van een geïdentificeerde batchconditie kan vervolgens geleidelijk of snel in grootte worden geschaald om een eindvolume van > 100 μL te verkrijgen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Een analyse van endothiapepsine kristallisatiecondities van een PACT sparse-matrix screen. A . en B. zijn foto's na 24 uur van de putjes A4 en C10, respectievelijk van het PACT-scherm . De kristallisatiebuffercomponenten zijn gemarkeerd op de figuur. De SPG-buffer is barnsteenzuur, natriumdiwaterstoffosfaat en glycine gemengd in een molaire verhouding van 2:7:7. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: Een analyse van de endothiapepsine kristallisatie optimalisatie van de PACT MgCl₂ condities . A. Een heatmap van de resultaten van een Pearson's correlatieanalyse tussen buffer pH, MgCl_{2-concentratie} en precipitantconcentratie en het neerslagniveau en de kristalkwaliteit. Het neerslagniveau en de kristalkwaliteit werden beide willekeurig beoordeeld op een schaal van 0-5 (waarbij 0 geen kristallen of neerslag is) na 24 uur voor Christus. en D . tonen voorbeelden van de kristallisatie en neerslag in drie verschillende druppels. De kristallisatieconditie en beoordelingen van het neerslagniveau en de kristalkwaliteit worden ook getoond. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 6: Een endothiapepsine morfogram bij kristallisatie in 0,1 M Tris-HCl pH 7,0, 0,15 M MgCl₂ en PEG 6.000. Een morfogram gemaakt van de meegeleverde spreadsheet "fasediagram-generator". Het relatieve aantal kristallen in elke druppel wordt aangegeven door de grootte van de cirkels en de resultaten van druppel 1 (eiwit en precipitant) en druppel 2 (eiwit, precipitant en zaden) worden respectievelijk in groen en blauw gemarkeerd. De waarden van de eiwit- en precipitantconcentraties, respectievelijk op de x- en y-as, geven vooraf gemengde waarden van elk in plaats van eindvolumes aan. Op basis van de resultaten zijn zwarte lijnen en een paarse lijn getekend om de grenzen van respectievelijk de nucleatiezone en de metastabiele zone aan te geven. B. C. en D. tonen enkele voorbeeldresultaten van het experiment. De rode en blauwe stippen gemarkeerd op A. geven de locaties van B. en C. aan. en D., respectievelijk. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 7: Eerste schaalproeven met endothiapepsine in 24-goed hangende druppelplaten. Dezelfde eiwit- en precipitantconcentraties werden gebruikt voor alle sporen: 100 mg / ml endothiapepsine in 0,1 M Na Acetaat pH 4,6 en 0,1 M Tris-HCl pH 7,0, 0,15 M MgCl₂ en 30% (w / v) PEG 6.000, respectievelijk. Alle weergegeven afbeeldingen zijn na 24 uur gemaakt en de uiteindelijke druppelvolumes zijn op elke afbeelding gelabeld. Het linkerpaneel (A, D en G) is een 1:1 mix van eiwit en precipitant, het middelste paneel (B, E en H) is een 1:2:3 mix van zaden, precipitant en eiwit en het rechterpaneel (C, F en I) zijn uitvergrote afbeeldingen van het middelste paneel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 8: Analyse van de endothiapepsine microkristallisatie in volumes van 200-300 μL. A. en C . laten zien hoe X_n veranderde gedurende de experimenttijd. B. en D . laten zien hoe X s (langste dimensie) in_de loop van de tijd veranderde. De resultaten van de experimenten zijn voor de duidelijkheid gescheiden. De rode stippellijn op C . en D . geeft het punt aan waarop het blussen werd uitgevoerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 9: CC_1/2 resultaten en afbeeldingen van kristallen verkregen in elke fase van het microkristallisatieproces om de diffractiekwaliteit te beoordelen. A. CC_1/2 uitgezet tegen resolutie van gegevens verzameld uit gekweekte kristallen: met en zonder Mg - onderdeel van de Fase 1-optimalisatie, in een volume van 200 nL, een volume van 10 μL en het uiteindelijke volume van 300 μL. B.C. en D. tonen de kristallen van respectievelijk het volume van 200 nL, 10 μL en 300 μL. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Eiwit informatie
Eiwit	Endothiapepsine
Molecuulgewicht (kDa)	33.8
Ruimtegroep	P12 11
a, b, c (Å)	45.2, 73.3, 52.7
α, β, ɣ (°)	90.0, 109.2, 90.0
Parameters met een vast doel
Volume geladen per chip (μL)	150
Aperaturen per chip	25,600
Vereiste kristalconcentratie (kristallen/ml)	500,000
Voorbeeld informatie
Eiwitmassa gebruikt om 200 μL monster (mg) te maken	10
Kristallen langste dimensie (μm)	15
Kristalconcentratie (kristallen/ml)	2,500,000
Experimentele variabelen
Aantal benodigde tijdpunten	5
Aantal benodigde afbeeldingen per tijdstip	50,000
Hit rate (geïntegreerde patronen/afbeeldingen verzameld)	0.3
Vaste doelen vereist per tijdspunt (afgerond naar boven)	7
Vereisten voor voorbeelden
Benodigd monstervolume per tijdstip (μL)	1,050
Totaal monstervolume dat nodig is voor het experiment (ml)	5.25
Totale massa van het benodigde eiwit (mg)	52.5

Tabel 1: Een voorbeeld van de monstervereisten voor een hypothetisch optisch pomp-sonde-experiment uitgevoerd met vaste doelen. Het eiwit dat in dit theoretische experiment werd gebruikt, was endothiapepsine. De fixed-target parameters waren gebaseerd op experimenten gerapporteerd in Ebrahim et al. (2019)⁴⁸ en Davy et al. (2019)⁴⁹. De steekproefinformatie kwam uit het protocol dat in dit videoartikel werd gerapporteerd en de experimentele variabelen waren conservatieve schattingen op basis van geleefde ervaring. De volgende steekproefvereisten zijn vervolgens berekend op basis van de eerdere aannames.

Discussion

De gepresenteerde methode laat zien hoe de kristallisatie van endothiapepsine kan worden geoptimaliseerd van grote kristallen (≥ langste afmeting van 100 μm), gekweekt in schermen met een dunne matrix 96 put, tot microkristallen, gekweekt in centrifugebuizen (300 μL volume) via batch. Het idee achter het protocol is dat de stappen die worden genomen om endothiapepsine te optimaliseren ook voor andere eiwitten kunnen worden gebruikt. Uiteindelijk het oplossen van het probleem van het creëren van grote volumes (>100 μL) microkristallen (10-20 μm) voor seriële kristallografie-experimenten bij XFELs en synchrotrons.

Het protocol verdeelt de taak van microkristallisatie met groot volume in drie stappen: (1) Het optimaliseren van kristalmorfologie, (2) Overschakelen naar batch en (3) Schalen. In stap 1 moet het bereik van kristalvormen dat een eiwit kan creëren, worden onderzocht in dampdiffusieplaten. Omstandigheden die aanleiding geven tot enkele, doosachtige kristallen die diffracten tot de vereiste resolutie moeten het doel zijn. In stap 2 kunnen geselecteerde omstandigheden vervolgens worden omgezet van dampdiffusie in batch. Hier is het optimalisatiecriterium de kristalgroeitijd en om omstandigheden te vinden die binnen 24 uur aanleiding geven tot eiwitkristallen. Een morfogram kan ook worden uitgezet om de experimentator een idee te geven van de locatie van de oplosbaarheidslijn en nucleatiezonegrenzen. Dit morfogram is van groot nut in stap 3, Schalen. Het morfogram geeft een indicatie van de vraag of nucleatie alleen X_n kan verhogen en X_s kan verlagen. Naarmate het volume van het experiment toeneemt, kunnen X_n en X_s voortdurend worden beoordeeld als de belangrijkste criteria voor schaalsucces.

In het geval van endothiapepsine onthulde stap 1 wat mogelijk een voorheen onbekende kristalmorfologie voor endothiapepsine was. Deze morfologie had dezelfde ruimtegroep als die eerder gemeld, maar, belangrijk voor seriële kristallografie, een meer doosachtige vorm. Enkele kristallen leken ook te groeien uit enkele nucleatiepunten, in tegenstelling tot de ventilatoren die uit andere omstandigheden werden gecreëerd (figuur 4). Voor de geselecteerde voorwaarde was stap 2 al gedeeltelijk vervuld omdat kristalgroei in < 24 uur plaatsvond. Het morfogram gaf aan dat zowel een straight als seeded-batch protocol succesvol zou kunnen zijn bij het schalen in stap 3. Initiële schaling in rechte batch, creëerde een toestand die kristallen produceerde met een X_n en X_s bereik van 3,6 ± 1,2 x 10⁶ kristallen · ^ml-1 en 42 ± 4,1 μm, respectievelijk. Deze kristallen, hoewel acceptabel voor sommige seriële kristallografie-experimenten, werden te groot geacht. Er werden dus extra optimalisaties uitgevoerd. Het uiteindelijke protocol produceerde kristallen met een concentratie en groottebereik van respectievelijk 3,1 x 10⁶ kristallen·^ml-1 en 15 ± 3,9 μm. Dit was meer dan ideaal voor de geplande experimenten.

De methode richt zich op de transformatie van 'oplosbare' eiwitkristallen gekweekt in dampdiffusieplaten naar batch. De reden voor deze focus is dat de overgrote meerderheid van oplosbare eiwitkristallen wordt gekweekt via dampdiffusie²⁶. De gepresenteerde concepten kunnen echter ook worden toegepast op oplosbare eiwitkristallen die zijn gekweekt met behulp van andere methoden, zoals microbatches. De concepten kunnen ook van toepassing zijn op membraaneiwitkristallen gekweekt in LCP; want ook dit is een batchkristallisatieproces.

Een belangrijk aspect van het protocol is het proces van het transformeren van de omstandigheden van kristallen die in dampdiffusieplaten worden gekweekt, zodat ze in batch kunnen worden gekweekt. Voor deze transformatie maakt de methode gebruik van het criterium voorgesteld door Beale et al. (2019)²⁶. Kristallen die via een batchproces worden gekweekt, zelfs in dampdiffusieplaten, zullen zich snel vormen (< 24 uur). Dit criterium is een benadering op basis van de snelheid van dampdiffusiedruppelevenwicht en is het meest waar voor peg-gebaseerde precipitantcondities. Kristallisatiecondities zullen echter een grote verscheidenheid aan verbindingen bevatten die de evenwichtstijd zullen beïnvloeden. De equilibratie van kristallisatiecondities op basis van zout, bijvoorbeeld sterk geconcentreerd ammoniumchloride, kan in 1-2 dagen plaatsvinden. Daarom is het 24-uurscriterium mogelijk niet waar voor op zout gebaseerde omstandigheden. Op zout gebaseerde omstandigheden kunnen ook complexere fasediagrammen^26,30 hebben die mogelijk niet voldoen aan het archetype dat in dit protocol wordt gepresenteerd. Een verkorting van het tijdscriterium voor op zout gebaseerde omstandigheden tot 12 of 6 uur kan nodig zijn als schalen naar grotere volumes onmogelijk blijkt.

Een andere beperking van deze methode is de schijnbare complexiteit. Het protocol dat werd gevolgd om de microkristallisatie van endothiapepsine te optimaliseren, veranderde de oorspronkelijke toestand van het sparse-matrixscherm relatief weinig. De eerste treffer die werd waargenomen in het PACT-scherm was 0,1 HEPES pH 7,0, 0,2 M MgCl₂ en 20% (w / v) PEG 6.000. De uiteindelijke geschaalde kristallisatiebuffer was 0,1 Tris-HCl pH 7,0, 0,15 M MgCl₂ en 40% (w/v) PEG 6.000. Het is ook heel goed mogelijk dat de verandering in buffer van HEPES naar Tris-HCl, en MgCl_{2-concentratie} , weinig heeft bijgedragen aan het succes van het proces. De toename van de PEG 6.000-concentratie is de enige optimalisatie, en een die heel eenvoudig had kunnen worden bereikt.

Deze beoordeling is echter ook te simplistisch. Het verdisconteert niet alleen de problemen die zich voordoen tijdens het schalen (d.w.z. het gebruik van zaden en het doven), maar ook het feit dat alleen omdat dit eiwit eenvoudig bleek, er geen garantie is dat het volgende ook zal blijken te zijn. De stappen die in het protocol worden geadviseerd, zijn bedacht omdat het optimaliseren van de schaal van eiwitkristallisatievolumes erg eiwitduur kan zijn. Tijdens de zeven endothiapepsine-schaalproeven die worden aangetoond, werd 100 mg eiwit geconsumeerd. Toegegeven, sommige van deze stappen zijn uitgevoerd om hun gevolgen in het licht van dit protocol aan te tonen. Toch kan 100 mg van een eiwit, plus mogelijk nog eens 50 mg eiwit dat tijdens een experiment wordt geconsumeerd (tabel 1), een aanzienlijke investering in tijd of geld zijn.

Gelukkig is het niet duidelijk dat deze massa van het vereiste monster alomtegenwoordig is in alle eiwitten. Endothiapepsine was zeer oplosbaar en had daarom een grote eiwitconcentratie nodig om oververzadiging te bereiken. In andere (momenteel onder optimalisatie) kan oververzadiging worden bereikt bij 10 of zelfs 5 mg / ml. Dergelijke variabelen zijn eiwitspecifiek en moeten worden omarmd wanneer ze verschijnen.

Andere beperkingen van de methode zijn onder meer de afhankelijkheid van complexe apparatuur zoals vloeistofbehandelingsrobots voor het maken van schermen en platen, en imagers om platen automatisch in beeld te brengen wanneer dat nodig is. Er zijn alternatieve routines aangeboden om de behoefte aan sommige van deze apparaten te beperken, maar het protocol zal tijdrovender zijn om zonder hen te volgen. Het protocol stelt ook voor om de diffractie van geoptimaliseerde kristallen te testen. Voor kristallografen zonder regelmatige toegang tot een synchrotron kunnen deze tests een uitdaging zijn. Controles bij elke stap zijn misschien niet nodig, maar deze tests worden sterk aanbevolen zodra een treffer is geïdentificeerd en voor en na het schalen. Niet-diffracterende kristallen bij een XFEL zijn helaas niet ongewoon. Gezien dit, is het beter om voorzichtig te zijn met betrekking tot aannames over kristaldiffractie.

Uiteindelijk zullen dit protocol en de hier gepresenteerde resultaten een gids, ideeën en een voorbeeld bieden aan degenen die worstelen met het produceren van monsters voor seriële kristallografie-experimenten. Hopelijk, naarmate seriële kristallografie verder wordt ontwikkeld, zullen de monstervereisten van de techniek zodanig worden verminderd dat de behoefte aan protocollen zoals deze zal worden verminderd. Maar zelfs in dit geval zullen de hier gepresenteerde strategieën nog steeds nuttig zijn voor diegenen die de kristallisatieruimte van hun eiwit willen verkennen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Swissci 96-well 2-Drop plates	Molecular Dimensions	MD11-002	96-well 2-drop crystallisation plate
Swissci 96-well 3-Drop plates	Molecular Dimensions	MD11-003	96-well 3-drop crystallisation plate
mosquito LCP liquid handling robot	sptlabtech	mosquito LCP	Crystallisation robot
ClearVue Sheets	Molecular Dimensions	MD6-015	96-well crystallization plate seals
Safe-Tube 1.5 mL	Eppendorf	30120086	1.5 mL centrifuge tubes
Scaple	Swan and Morton	No. 3 scalple and No. 3 handle	Scalple for cutting open plate seals
MS 3 Vortex	IKA	3319000	Vortex for mixing solution and making seed stocks
24-well XRL Plate	Molecular Dimensions	MD3-11	24-well hanging-drop plates
Tube revolver/rotator	Thermo Fischer Scientific	88881001	Tube revolver for mixing solution during scaling
Eppendorf Research plus pipettes	Eppendorf		Range of manual pipettes, 0.5-10, 1-20, 10-100, 100-1000 µL
Eppendorf pipette tips	Eppendorf		Range of tip sizes for manual pipettes
Suparen 600	Prochem AG	Suparen 600	Endothiapepsin solution
Sodium Acetate	Sigma-Aldrich	241245-1KG	Sodium Acetate
Tris	Merck	8382T014	Tris
Magnesium Chloride	Sigma-Aldrich	M2670-1kg	Magnesium Chloride
PEG 6,000	Sigma-Aldrich	81255-1kg	PEG 6,000
Ethelyene glycol	Sigma-Aldrich	324558-1L	Ethelyene glycol for cyro-protecting the crystals
PACT Premier HT screen	Molecular Dimensions	MD1-36	PACT Premier 96-well crystal screen
DOW CORNING high vacuum grease	Molecular Dimensions	MD6-02	Grease for sealing 24-well plates
Hirschmann 22 x 22 mm glaser cover slides	Hirschmann	8000104	Cover slides for sealing 24-well sitting drop plates
Crystal pins	PSI	Manufactured inhouse	Thin-film supports for micro-crystals.
1-1.3 mm SiLibeads Type S	Faust	6239547	Glass beads for making mico-seed stocks
Macbook Pro	Apple	Macbook Pro	Computer for performing data analysis
CCP4 software suite	CCP4		Diffraction pattern data processing software
Excel	Microsoft	Microsoft Office	Plotting tool for phase diagram
Hausser Scientific Bright-Line counting chamber	Thermo Fischer Scientific	02-671-51B	Tool to calculate crystal concentration
PACT Premier	Molecular Dimensions	MD1-29-ECO	Sparse-matrix crystallization screen
Rock Imager	Formulatrix	Rock Imager	Temperature controlled crystal plate storage and imager
Rock MakerWeb	Formulatrix	Rock MakerWeb	Crystal plate creation and image storage stoftware
Formulator	Formulatrix	Formulator	96-well crystal screen creation liquid handling robot
Leica MZ16 Microscope	Leica	Leica MZ16	Light microscope
LAS V4.6	Leica	LAS V4.6	Software for Leica microscopes
Spectra/Por 3.5 kDa dialysis tubing	Spectrumlabs	Spectra/Por 3 Dialysis Membrane	3.5 kDa dialysis membrane
Dialysis tubing closures	Spectrumlabs	Spectra/Por 3 Duniversal Closures	Clips to seal the dialysis tubing ends
Amicon 10 kDa centrifugal concentrator	Merck-Millipore	Amicon Ultra-15 10 kDa centrifugal concentrator	10 kDa centrifugal filter
5810 R swing bucket centrifuge	Eppendorf	5810 R Centrifuge	Swing bucket centrifuge