Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Optimalisering av veksten av endothiapepsinkrystaller for serielle krystallografieksperimenter

Published: February 4, 2021 doi: 10.3791/61896
Automatic Translation
1, 1
1Swiss Light Source, Paul Scherrer Institut

Summary

Målet med denne artikkelen er å gi betrakteren en solid forståelse av hvordan man transformerer deres små volum, dampdiffusjonsprotokoll, for dyrking av store, enkeltproteinkrystaller, til en storvolumbatchmikrokrystallisasjonsmetode for seriell krystallografi.

Abstract

Her presenteres en protokoll for å lette dannelsen av store volumer (> 100 μL) mikrokrystallinske oppslemminger egnet for serielle krystallografieksperimenter ved både synkrotroner og XFELer. Metoden er basert på en forståelse av proteinkrystallfasediagrammet, og hvordan denne kunnskapen kan utnyttes. Metoden er delt inn i tre faser: (1) optimalisering av krystallmorfologi, (2) overgang til batch og (3) skalering. Fase 1 innebærer å finne godt diffracting, enkeltkrystaller, forhåpentligvis, men ikke nødvendigvis, presentere i en kubelignende morfologi. I trinn 2 optimaliseres trinn 1-tilstanden med krystallveksttid. Denne strategien kan forvandle krystaller dyrket ved dampdiffusjon til batch. Når krystallvekst kan skje innen ca. 24 timer, kan et morfogram av proteinet og utfellingsblandingen plottes og brukes som grunnlag for en skaleringsstrategi (trinn 3). Når krystaller kan dyrkes i batch, kan skalering forsøkes, og krystallstørrelsen og konsentrasjonen optimaliseres når volumet økes. Endothiapepsin har blitt brukt som demonstrasjonsprotein for denne protokollen. Noen av beslutningene som presenteres er spesifikke for endothiapepsin. Det er imidlertid håpet at måten de har blitt brukt på, vil inspirere til en måte å tenke på denne prosedyren som andre kan tilpasse til sine egne prosjekter.

Introduction

Romtemperatur (RT) makromolekylær krystallografi er populært igjen innen strukturbiologi samfunnet. Utviklingen av X-ray Free Electron Laser (XFEL) lyskilder har ansporet utviklingen av RT-prøveleveringsmetoder 1,2,3,4, og disse metodene har nå blitt brukt på synkrotroner 5,6,7,8. Ikke bare åpner RT-metoder muligheten for pumpesondeeksperimentelle strageties 9,10,11,12, men det er også økende bevis på at de fremmer alternative konformasjonstilstander innen proteiner 13,14,15,16,17.

Imidlertid var hovedårsaken til at kryo-metoder fikk trekkraft over RT-tilnærminger på slutten av 1990-tallet bremset strålingsskader ved krystalltemperaturer undernull 18. Kryo-metoder19 begynte å tillate innsamling av et komplett datasett fra en enkelt proteinkrystall. Moderne RT-metoder ved XFEL og synkrotroner løste problemet med enkeltkrystallstrålingsskader ved utvikling av raske (> 100 Hz) krystallleveringsstrategier 1,2,3,4. Disse metodene tillater innsamling av et komplett datasett fra tusenvis av individuelt eksponerte krystaller. Disse RT-leveringsmetodene krever derfor produksjon av store mengder løsninger som inneholder homogene mikrokrystaller (> 100 μL < 50 μm krystaller). Men siden kryo-metoder har en tendens til å bare kreve enkeltkrystaller, er metoder for å lage slike mikrokrystallinske oppslemminger for tiden ikke allestedsnærværende på tvers av proteinkrystallografilaboratorier.

Det finnes eksempler i litteraturen på hvordan man utfører deler av mikrokrystallisasjonsoptimaliseringsprosedyren for seriekrystallografiprøver. Her bør det skilles mellom membran og løselige proteiner. Protokoller for å optimalisere veksten av mikromembranproteinkrystaller dyrket i monoolein (eller et annet lipid), for lipidisk kubisk fase (LCP), har blitt godt beskrevet20,21,22. Imidlertid mangler metoder for mikrokrystallisering av løselige proteiner, inkludert membranproteiner dyrket under ikke-LCP-forhold, generelt. Tidligere studier har fokusert på spesifikke deler av prosessen, for eksempel mikrokrystallscreening 23,24, forbedring av nukleering24 og skalering ved bruk av fri grensesnittdiffusjon 25, men ikke en komplett metode.

Imidlertid ble det nylig beskrevet en metode26 som forsøker å tilby en komplett protokoll. Som mange aspekter av proteinkrystallografi er det ikke nytt. Mange av de foreslåtte ideene ble allerede beskrevet av Rayment (2002) 27. Metoden tar sikte på å vise krystallografer hvordan man utfører konverteringen fra en enkelt krystall dyrket ved hjelp av dampdiffusjon, til en batchmetodikk for å dyrke tusenvis av mikrokrystaller. Metoden fokuserer på dampdiffusjon som et vanlig utgangspunkt, da 95% av alle Protein Data Bank (PDB) avsetninger kommer fra krystaller dyrket i dampdiffusjonsplater26. Dampdiffusjon er imidlertid ikke den ideelle metoden for mikrokrystallisering26, så en metodikk er beskrevet for å konvertere dampdiffusjon til batchkrystallisering. Når krystaller kan dyrkes i batch, blir skaleringsruter til større volumer mer praktisk. Gitt vagaries av proteinkrystallisering, vil forfatterne understreke at denne metoden ikke er feilsikker. Imidlertid bør protokollen i det minste gi et innblikk i "krystallisasjonsrommet" til et protein.

Denne metoden er avhengig av proteinkrystallisasjonsfasediagrammet og hvordan en forståelse av diagrammet kan fungere som en veiledning under mikrokrystallisasjonsoptimalisering. Et proteinfasediagram er ofte avbildet som et x/y-plott med utfellings- og proteinkonsentrasjoner på henholdsvis x- og y-aksen (figur 1A). Fra rentvannspunktet (nederst i venstre hjørne - figur 1A) øker konsentrasjonen av både protein og utfelling til løselighetslinjen er nådd. Løselighetslinjen markerer overmetningspunktet (lilla linje - figur 1A). Når et protein er overmettet, blir løsningen termodynamisk ustabil og vil begynne å separere seg i to faser: "proteinrik" og en stabil mettet løsning. Denne separasjonen kan forekomme hvor som helst utover løselighetslinjen, og dens kinetikk er avhengig av egenskapene til proteinet og komponentene i løsningen.

Når protein- og utfellingskonsentrasjonene er for store, vil proteinet brytes ustabilt ut av løsningen og resultere i amorft bunnfall (rosa region - figur 1A). Imidlertid kan bestilt faseseparasjon forekomme i kjerneområdet [se Garcia-Ruiz (2003) 28 for detaljert beskrivelse] og krystallkjerner har tilbøyelighet til å danne (grønn region - figur 1A). Nukleering og vekst fjerner protein fra løsningen og beveger dråpen inn i den metastabile regionen hvor veksten kan fortsette til løselighetslinjen er nådd [se McPherson and Kuznetsov (2014) 29 for detaljert diskusjon . Diagrammet er for de aller fleste krystallisasjonsforhold en grov overforenkling30. Uavhengig av dette er diagrammet fortsatt til stor nytte for mikrokrystallografer, da kartleggingen av diagrammet gjør det mulig å bestemme løselighetslinjen og kinetikken for kjernedannelse.

Når det gjelder å lage mikrokrystaller, er de to faktorene under krystallisering som må optimaliseres, antall krystaller (Xn) og deres gjennomsnittlige, lengste dimensjon (Xs). X n vil være proporsjonal med antall nukleasjonshendelser (n ) (Eq. 1).

Equation 1     Ekv. 1

X s er proporsjonal med konsentrasjonen av fritt protein overløselighetslinjen (Ps) delt på Xn (Eq. 2).

Equation 2     Tilsvarende 2

I en perfekt situasjon ville hver nukleasjonshendelse gi en mulig krystall, og hver og en av disse krystallene ville ha lik tilgang til det tilgjengelige proteinet i oppløsning. Figur 2 er en grafisk fremstilling fra et ideelt scenario av forholdet mellom Xn og Xs. I praksis er hovedkontrollen en krystallograf har over X,n og Xs ved å påvirke mengden kjernedannelse eller ved tilsetning av frøkrystaller. Mikrokrystallografen må bedømme hvordan man kan øke Xn slik at en passende krystallkonsentrasjon og krystallstørrelse begge kan opprettes.

De fleste krystallisasjonsteknikker krever en "overgangsperiode" (figur 1B). For eksempel, i et dampdiffusjonseksperiment, ved blanding av protein- og utfellingsløsninger, vil konsentrasjonene av hver endre seg når dråpen likevekter med brønnløsningen. Man håper at disse endringene gradvis vil overføre dråpen til nukleasjonssonen hvor tilbøyeligheten til krystallisering vil øke. Når krystaller begynner å kjerne og vokse, vil mengden protein i oppløsning begynne å falle, noe som reduserer sannsynligheten for ytterligere nukleering. Den endelige mengden kjernedannelse vil være protein- og tilstandsspesifikk, og også avhengig av dybden av penetrasjon av inn i nukleasjonssonen. Gitt den begrensede nukleasjonssonepenetrasjonen av metoder som krever et overgangstrinn, vil nukleasjonsnivået til slutt være begrenset til nukleasjonshastigheten ved grensen for metastabil-nukleasjonsområdet.

På grunn av viktigheten av å kunne øke nivået av nukleering for en mikrokrystallograf, er det viktig å flytte til en batchkrystallisasjonsmetodikk. Batch kan dra større nytte av hele nukleasjonsområdet (figur 1C). I batchmetoder er ideen å blande protein og utfelling sammen slik at en overmettet løsning opprettes uten behov for endringer i komponentkonsentrasjoner. Nukleering bør være mulig umiddelbart etter blanding. Batchmetoder tillater derfor at hele nukleeringssonen teoretisk nås. Enhver økning i nukleasjonskinetikken utover den metastabile nukleasjonsgrensen kan deretter utnyttes.

Hvis basalnivået av krystallkjernedannelse ikke er nok til å generere en stor Xn, kan mikrosåingsmetoder brukes. I mikrosåing brytes forvokste krystaller opp for å lage en oppslemming av krystallinske fragmenter som kan fungere som et stillas for frisk krystallvekst31,32. Mikrosåing har blitt mye brukt i seriell krystallografisk prøvepreparering som en måte å øke Xn uten behov for økende krystallkjernedannelse (figur 1C).

Overgangen fra dampdiffusjon til batch kan visualiseres på et fasediagram som å flytte det eksperimentelle utgangspunktet fra enten de ikke-overmettede eller metastabile områdene til nukleeringssonen. Dette kan gjøres ved å øke protein- og/eller utfellingskonsentrasjonene, og/eller forholdet mellom de to i dråpen (figur 1D), og observere hvilke forhold som gir krystaller som opptrer raskt (< 24 timer)26. Fullstendig dampdiffusjonsdråpebalanse kan ta dager eller uker33. Derfor, ved å lete etter forhold som viser raskt forekommende krystaller, kan batchforhold bli funnet uten å måtte flytte til alternative krystallisasjonsscreeningsformater som mikrobatch34,35,36,37.

Når nukleasjonssonen er funnet, er det funnet en batchtilstand og et morfogram - her et grovfasediagram - kan opprettes. Morfogrammet er til stor nytte når du vurderer om du skal bruke en sådd batch eller rett batchprotokoll. Ved å plotte Xn som funksjon av protein- og utfellingskonsentrasjonen, kan det gjøres en vurdering av nukleasjonskinetikken26. Hvis X n forblir lav over hele kjerneområdet, kan det være nødvendig med frøbatch for å gjøre Xn stor nok til å begrense krystallveksten. Denne vurderingen er det første trinnet i prosessen med å skalere til større volumer (> 100 μL).

Denne metoden ble utformet slik at den kunne utføres i de fleste krystallisasjonslaboratorier ved bruk av standard dampdiffusjonskrystallisasjonsutstyr. Det er også gjennomført mange studier som beskriver teknikker for å legge til rette for mange deler av denne prosessen, dersom utstyret skulle være tilgjengelig. Disse inkluderer, men er ikke begrenset til, dynamisk lysspredning (DLS) 25,27, ikke-lineær avbildning 20,24,25, pulverdiffraksjon 20,24,27 og elektronmikroskopi 26 [se Cheng et al. (2020) 40 for en fin gjennomgang].

Målet med dette arbeidet er å gi en visuell demonstrasjon av metoden for overgang fra lite volum (< 500 nL) dampdiffusjonskrystallisering til stort volum (> 100 μL) batchkrystallisering. Endothiapepsin fra Cryphonectria parasitica har blitt brukt som et eksempelsystem for å demonstrere denne oversettelsen. Typen eksperiment og prøveleveringsmetode som mikrokrystallene er nødvendige for, vil påvirke den ideelleXs utgang26. For blandingsforsøk som krever en millisekunds tidsoppløsning41 eller gassdynamiske virtuelle dyser42, kan en endelig Xs på < 5 μm være ønskelig. I dette tilfellet var målet å produsere proteinkrystaller som diffrakterer til ca. 1, 5 Å, for et fotonaktivert pumpesondeeksperiment, og ved hjelp av en fast målleveringsmetode.

For å gi en illustrasjon av prøvekravene til et slikt seriekrystallografieksperiment ved bruk av endothiapepsin, viser tabell 1 de eksperimentelle parametrene til et hypotetisk eksperiment. Eksempelinformasjonen var basert på protokollen beskrevet nedenfor. Gitt noen konservative estimater på trefffrekvenser og datainnsamlingskrav, er 50 mg det totale prøveforbruksestimatet for hele eksperimentet.

Figur 3 viser et flytskjema over hele optimaliseringsprosessen fra første lille volum dampdiffusjonskrystallisering til storskala batch. For de fleste seriekrystallografiprosjekter vil denne protokollen begynne på trinn 2: "overgang til batch", siden målproteinet allerede vil ha blitt krystallisert. Trinn 1 er imidlertid inkludert for fullstendighet og for å minne leserne om dens betydning. Å finne en tilstand som gir opphav til en brønndiffracting, enkelt, stor krystall er det beste utgangspunktet for mikrokrystalloptimalisering. I trinn 2 kan denne tilstanden deretter optimaliseres fra dampdiffusjon til batch, og et morfogram av nukleerings- og metastabile regioner kan plottes. Når dette er gjort, kan skalering av batchbetingelsen til større volumer utføres i trinn 3. Ved slutten av flytskjemaet vil en krystallograf ha opprettet en repeterbar, storvolum (> 100 μL), mikrokrystallisering, batchprotokoll for endothiapepsin. Denne metoden kan deretter brukes på deres spesielle protein av interesse.

Protocol

MERK: Alle 96-brønns sittedråpekrystallisasjonseksperimenter ble satt opp ved hjelp av enten 2 eller 3-dråpeplater. En væskehåndteringsrobot og et krystallisasjonsbilde/hotell ble brukt for å lette klargjøring og overvåking av alle 96-brønns skjermer. Alle reagenskonsentrasjoner for krystallisasjonseksperimenter er gitt ved startkonsentrasjonene før blanding.

1. Optimalisering av krystallmorfologi

MERK: Trinn 1.1.1. og 1.1.6. beskrive hvordan endothiapepsinkrystallisasjonsbetingelser ble funnet, og hvordan disse forholdene ble optimalisert for å finne en enkelt tilstand som ga enkle, godt diffraksjonerende krystaller.

  1. Optimalisering av sparsomme matriser
    1. Forbered fersk endothiapepsin løsning.
      MERK: Endothiapepsin, når anskaffet som Superan 600, må bufferoverføres ut av lagringsløsningen og konsentreres.
      1. Tilbered 3 l med 0,1 m Na-acetat pH 4,6 ved 4 °C.
      2. Klipp 20 cm dialyseslange og vask kort i bufferen. Forsegl den ene enden av slangen med et klips, plasser 50 ml av endothiapepsinoppløsningen i slangen og forsegl deretter den andre enden.
      3. La oppløsningen dialysere i minst 4 timer (eller over natten) ved 4 °C i 1 liter av Na-acetatbufferen. På grunn av komponentene i lagringsbufferen vil løsningen i dialyseposen nå være ca. 100 ml.
      4. Overfør dialyseposen med endothiapepsin til en frisk liter på 4 °C, 0,1 M Na-acetat pH 4,6. Gjenta dette trinnet en gang til slik at den opprinnelige bufferen har blitt fortynnet 2000x mot Na-acetatet.
      5. Endothiapepsin vil nå være på ca. 10 mg/ml. Konsentrer til 100 mg/ml ved hjelp av en 10 kDa sentrifugalkonsentrator og en sentrifuge.
      6. Blits avkjøl endothiapepsinoppløsningen i flytende nitrogen i 50 μL alikoter og oppbevar ved -80 °C.
    2. Forbered en PACT Premier 96-brønns sparsommelig matriseskjerm.
      1. Ved hjelp av en væskehåndteringsrobot dispenserer du 100 nL 70 mg/ml endothiapepsin og 100 nL brønnløsning i en enkelt underbrønn per brønn. Bland protein- og brønnoppløsningen 3 ganger ved tilsetning av krystallisasjonsbufferen.
      2. Forsegle tallerkenen og la den stå i 28 dager ved 20 °C, ta bilder hver dag den første uken og deretter hver uke i 4 uker.
    3. Sparsom matriseanalyse
      1. Identifiser treff som produserer enkle endothiapepsinkrystaller. Fra PACT-skjermen vokste forhold som inneholdt MgCl2 som singletoner i stedet for nålklynger.
    4. Optimalisering av sparsomme matriser
      1. Fra MgCl2 som inneholder forhold identifisert i trinn 1.1.3.1, lag en 96-brønners skjerm som tilfeldig kombinerer og varierer de forskjellige brønnkomponentene.
      2. Ved hjelp av en væskehåndteringsrobot dispenserer du 100 nL 70 mg/ml endothiapepsin og 100 nL brønnløsning i en enkelt underbrønn per brønn. Bland protein- og brønnoppløsningen 3 ganger ved tilsetning av krystallisasjonsbufferen.
      3. Forsegle tallerkenen og la den stå i 28 dager ved 20 °C, ta bilder hver dag den første uken og deretter hver uke i 4 uker.
    5. Analyse av optimalisering
      1. Ved hjelp av egnet regnearkprogramvare rangerer du krystallisasjonsbetingelsene som gir opphav til krystaller basert på krystallkvalitet og nedbørsnivå, henholdsvis ingen krystaller (0) til ideelle (5) og lave (0) til høye (5). Med hensyn til krystallkvalitet er de brede kriteriene enkeltkrystaller med en bokslignende morfologi.
      2. Utføre en Pearsons korrelasjonsanalyse mellom krystallisasjonsbetingelsens innhold og krystallmengde og nedbørsnivå.
      3. Plott disse dataene som et varmekart. Se etter komponenter og forhold som var korrelert med de foretrukne resultatene.
    6. Diffraksjon analyse.
      1. Bekreft at krystallene dyrket fra de identifiserte forholdene i trinn 1.1.5 er egnet for seriell krystallografi ved å utføre et røntgendiffraksjonseksperiment.
      2. Legg inn en prøve av endothiapepsinkrystallene fra hver av de identifiserte forholdene på støtter som tillater datainnsamling ved enten 100 eller 293 K og utfør et røntgendiffraksjonseksperiment. Hvis du arbeider under kryo, bruk 25% etylenglykol som kryobeskyttelsesmiddel.
      3. Behandle disse dataene via en passende programvarepakke. Endothiapepsinkrystaller skal difffrakteres til over 1,5 Å. Sjekk for twinning, da tvillingkrystaller kan komplisere seriell krystallografisk databehandling betydelig.
      4. Hvis krystaller er singletoner og difffraktorer til 1,5 Å, fortsett til trinn 2. Hvis ikke, gå tilbake til trinn 1.1.2 og prøv mer sparsomme matriseskjermer for å identifisere lovende forhold. Etter analysene utført i trinn 1.1.5. og 1.1.6., en krystallisasjonstilstand på 25% (w / v) PEG 6,000, 0,1 M Tris-HCl pH 7,0 og 0,15 M MgCl2 burde ha blitt funnet som det omtrentlige idealet.

2. Overgang til batch

  1. Morfogram eksperiment
    1. Lag en mikrokrystallfrøbestand.
      MERK: Det er beste praksis når du lager frølagre, for å gjøre frøene fra krystaller spesielt dyrket for oppgaven. Dette hjelper sterkt med reproduserbarhet. Andre ideer som presenteres i trinn 2.1.1.1 til 2.1.1.11 er å alltid bruke krystallene dyrket fra et standard antall brønner - her 5 - og aliquot lagrene når de er laget for å fryse-tine sykluser.
      1. Forbered en 96-brønns krystallisasjonsplate med brønner som inneholder krystallisasjonsbufferen: 25% (w / v) PEG 6,000, 0,1 M Tris-HCl pH 7,0 og 0,15 M MgCl2.
      2. Ved hjelp av en væskehåndteringsrobot dispenserer du 200 nL tint 70 mg/ml endothiapepsin og 200 nL brønnløsning i en enkelt underbrønn per brønn. Bland protein- og brønnoppløsningen 3 ganger ved tilsetning av krystallisasjonsbufferen.
      3. Forsegl platen og la den stå i 24 timer.
      4. Fyll et 1,5 ml sentrifugerør med 250 μL krystalliseringsbuffer og 10-15 1 mm glassperler. La sentrifugerøret ligge på is for å avkjøles i 5-10 min.
      5. Velg 5 brønner med krystaller, åpne brønnene med en skalpell og, knus krystallene i brønnene ved hjelp av en pipettespiss.
      6. Aspirer 1 μL buffer fra det islagte sentrifugerøret og bruk til å homogenisere den knuste krystalloppslemmingen. Når den er homogen, aspirerer du hele oppslemmingen og samler den i det avkjølte sentrifugerøret.
      7. Gjenta trinn 2.1.2.6 for hver av de 5 delbrønnene.
      8. Vortex sentrifugerøret som inneholder bufferen, samlede oppslemminger og perler ved 1000 o / min i 30 s.
      9. Sett sentrifugerøret tilbake til is i 30 s.
      10. Gjenta trinn 2.1.2.8 og 2.1.2.9 to ganger til.
      11. Frølageret er nå klart og kan aliseres i 10 μL batcher og lagres ved -20 °C.
    2. Utfør morfogrameksperiment.
      1. Forbered en 2-dråpe 96-brønns rutenettskjerm. Varier konsentrasjonen av PEG 6000 fra 5 til 40 % (w/v) langs platekolonnene, og hold bufferen og saltet ved henholdsvis 0,1 M Tris-HCl pH 7,0 og 0,15 M MgCl2.
      2. Forbered en sekvensiell fortynning av endothiapepsin i 0,1 M Na-acetat pH 4,6 fra 100 til 12,5 mg / ml over 8 trinn. En annen konsentrasjon av endothiapepsin vil bli brukt for hver rad av platen.
      3. Ved hjelp av en væskehåndteringsrobot dispenserer du 150 nL endothiapepsin i begge delbrønnene 1 og 2. I brønn 1 dispenserer 150 nL av brønnløsningen. I sub-brønn 2, multi-aspirat 50 nL tint frølager og 100 nL brønnløsning, og dispenser deretter begge i proteinoppløsningen. Bland oppløsningene 3 ganger ved tilsetning av krystallisasjonsbufferen.
      4. Forsegle tallerkenen og la den stå ved 20 °C og ta bilder hver 0, 3, 6, 12, 18, 24 timer, deretter hver dag den første uken og hver uke de neste fire. Hvis automatisk bildebehandling ikke er mulig, ikke bekymre deg for timeavbildningen på dag 1.
  2. Morfogram analyse
    1. Når du ser på bildene tatt etter 24 timer, estimerer du antall krystaller som er tilstede i hver brønn og registrerer disse estimatene i regnearket "morfogramgenerator" som følger med. Disse estimatene trenger ikke å være presise; Å telle tusenvis av mikrokrystaller, hvis de finnes, er ikke praktisk eller nødvendig. Prøv hovedsakelig å sikre at estimatene er konsistente over hele platen.
      MERK: 24-timersregelen var basert på observasjonene gjort i Beale et al . (2019) 26. Dampdiffusjonskrystallisasjonsbetingelser kan ta dager eller uker å balansere. Krystaller som vises raskt, er mer sannsynlig å ha vokst via en batchprosess i stedet for ved gradvis likevekt av dråpekomponentene. 24-timerskriteriet er derfor noe vilkårlig, og en nøyaktig avskjæringstid mellom et batch- og dampdiffusjonseksperiment vil avhenge av den spesifikke blandingen av tilstanden [se Beale et al. (2019) 26 for fullstendige detaljer].
    2. Skriv inn startkonsentrasjonene av endothiapepsin og PEG 6000 i boksene som er angitt.
    3. Regnearket vil automatisk plotte resultatene i det tradisjonelle fasediagramformatet med utfellings- og proteinkonsentrasjon på henholdsvis x - og y-aksene . Brønnforhold som bare gir opphav til krystaller i frødråpene indikerer det metastabile området av diagrammet (gjennomsiktig blått), mens forhold som har krystaller i både frøede og ikke-frøede dråper indikerer nukleeringssonen (solid grønn).
      MERK: Ideelt sett bør flertallet av nukleeringssonen være til stede på diagrammet (dvs. det er noen klare brønner på bunnen av diagrammet, og noe bunnfall skal være synlig ved høye protein- og utfellingskonsentrasjoner). Hvis dette ikke er tilfelle, gjenta kanskje eksperimentet, men øk proteinet og / eller utfellingskonsentrasjonen (hvis mulig).
    4. Hvis krystall har dukket opp på mindre enn 24 timer, fortsett til trinn 2.3.1. Hvis ikke, fortsett til trinn 2.4 og fortsett å optimalisere mot batch.
  3. Krystall analyse
    1. Som sagt på slutten av trinn 1, før du går videre til neste trinn, må du sørge for at disse krystallene har ønsket morfologi og diffraksjonskvalitet. Med hensyn til morfologi, er krystallene observerbart untwinned og dannes som singletons snarere enn nål-ball-lignende eller vifte-lignende strukturer? Med hensyn til diffraksjon, samle diffraksjonsdata fra krystallene hvis mulig. Hvis disse krystallene ikke diffrakterer, er det usannsynlig at krystallene dyrket i et større volum vil diffundere.
    2. Last inn en prøve av endothiapepsinkrystallene fra morfogrameksperimentet på støtter som muliggjør datainnsamling ved enten 100 eller 293 K og utfør et røntgendiffraksjonseksperiment. Hvis du arbeider under kryo, bruk 25% etylenglykol som kryobeskyttelsesmiddel.
    3. Behandle disse dataene via en passende programvarepakke. Endothiapepsinkrystaller skal difffrakteres til over 1,5 Å. Over prøven av krystaller, observere cellestørrelsen, det totale antall observasjoner og mosaicity; Disse tiltakene vil gi en indikasjon på homogeniteten til de diffraksjonerende krystallene.
    4. Hvis krystallmorfologien og diffraksjonskvaliteten er tilstrekkelig, fortsett til trinn 3.
  4. Optimaliser krystallveksttiden.
    MERK: Morfogramanalysen (trinn 2.2) vil ha gitt en indikasjon på krystallisasjonsutgangspunktet (dvs. regionen av fasediagrammet der dråpen befinner seg når bunnfallet og proteinoppløsningene ble blandet). Er dråpen i den metastabile regionen eller under løselighetslinjen? Batchkrystallisering begynner i nukleeringssonen (figur 1C). Målet med dette trinnet er å flytte dette startpunktet fra enten under løselighetslinjen eller metastabil region, inn i nukleeringssonen (figur 1D). Hvis frøet faller fra trinn 2.2. har gitt krystaller raskt, dette er en indikasjon på at dråpeblandingen allerede er i den metastabile regionen, hvis ikke, er det sannsynlig at dråpen ikke er overmettet.
    1. Optimalisering av krystallveksttid.
      1. Bruk samme skjerm som i trinn 2.1.3, og forbered et 96-brønns dampdiffusjonskrystallisasjonseksperiment i en 3-dråpeplate.
      2. Øk startproteinkonsentrasjonen av endothiapepsin på y-aksen (dvs. konsentrere proteinet ytterligere, kanskje 120 mg/ml for endothiapepsin).
      3. Utfør en seriell fortynning, som i trinn 2.1.3.2, slik at hver rad av platen inneholder en sekvensielt lavere proteinkonsentrasjon.
      4. Bruk forskjellige dråpeforhold i hver av de tre dråpene på tallerkenen: 1: 1, 1: 2 og 2: 1, protein: utfelling.
      5. Se eller avbilde tallerkenen den første dagen klokken 0, 3, 6, 12, 18, 24 timer og deretter hver dag den første uken, og hver uke de neste fire. Hvis automatisk bildebehandling ikke er mulig, ikke bekymre deg for timeavbildningen på dag 1.
      6. Identifiser dråper som produserer de raskest forekommende krystallene og gjør disse til utgangspunkt for gjentatte optimaliseringer til krystallvekst skjer innen 24 timer.
      7. Når en krystalltilstand som raskt opptrer er identifisert, går du tilbake til trinn 2.1 for å relotere morfogrammet som et forspill for å begynne skaleringen.

3. Skalering

  1. Ranger skaleringsruter. På dette stadiet er det ikke nødvendig å bestemme seg for en enkelt skaleringsrute, bare for å identifisere og rangere alternativene slik at de kan utforskes etter tur. Etter hvert som volumet av batchblandingen økes under skaleringsprosedyren, vil det oppstå endringer i nukleeringshastigheten og krystallstørrelsen. Disse kan imidlertid overvinnes ved forsiktig justering av komponentkonsentrasjoner etter hvert som det skalerte volumet økes.
    MERK: Trinn 3.1.1 og 3.1.2 beskriver hvordan man skjelner, fra morfogrammet, om en batch- eller frøbatchprotokoll er mer passende.
    1. Rett batchprotokoll
      1. Er Xn i nukleasjonssonen proporsjonal med protein- og/eller utfellingskonsentrasjonen? Dvs. øker X n som funksjon av enten utfellings- og/eller proteinkonsentrasjon? -Ja? Gå til trinn 3.1.1.2. Nei? Gå til trinn 3.1.2. 
      2. Finn forhold som gir krystaller av ønsket størrelse, og gå til trinn 3.2.
    2. Seededed-batch protokoll
      1. Er Xn flat over kjernesonen? Dvs. Xn øker ikke som funksjon av verken utfellings- og/eller proteinkonsentrasjon.
      2. Finn frøede forhold som gir krystaller av ønsket størrelse, og gå til trinn 3.2. Hvis alle krystaller er for store - gå til trinn 3.1.2.3.
      3. Gjenta morfogrameksperimentet (trinn 2.1), men øk denne gangen konsentrasjonen av frøbestanden som brukes i de sådde brønnene. Frøbestanden kan økes ved å bruke flere krystaller i opprettelsen. For eksempel, i stedet for 5 brønner i trinn 2.1.1.5, bruk 10 brønner.
      4. Se eller bilde platen over de første 0, 3, 6, 12, 18, 24 timene.
      5. Xn skal ha økt og Xs redusert i frødråpene. Gjenta denne syklusen hvis mindre krystaller er nødvendig, og følg deretter en seeded-batch-protokoll.
  2. Gradvis skalering
    1. Skalering i 96-brønnsplater. Fra endothiapepsinmorfogrammet ble en rett batchmetode ved bruk av krystallisasjonsbetingelsen 0,1 M Tris-HCl pH 7,0, 0,15 M MgCl2 og 30% (w / v) PEG 6,000, opprinnelig valgt for skalering. 100 mg/ml endotiapepsin blandet med krystallisasjonsbufferen i forholdet 1:1.
      1. Forbered 2-3 brønner i en 2-brønns 96-brønns sittedråpeplate med 100 μL 0,1 M Tris-HCl pH 7,0, 0,15 M MgCl2 og 30% (w / v) PEG 6,000.
      2. Bruk nytint 100 mg/ml endothiapepsinoppløsning, dispenser 0,5 μl protein og 0,5 μl bunnfall per brønn, forsegl og oppbevar ved 20 °C.
      3. Se eller bilde platen over de første 0, 3, 6, 12, 18, 24 timene. Legg merke til eventuelle endringer i området X, s og X,n.
      4. Hvis det har skjedd endringer, gjenta trinn 3.2.1.1 til 3.2.1.2, men øk eller reduser protein-, utfellings- og/eller frøkonsentrasjonen for å gjenopprette eventuelle endringer i området Xs og Xn.
      5. Når området Xs og Xn er akseptabelt, fortsett til trinn 3.2.2.
    2. Skalering i 24-brønns hengende fallplater
      1. Forbered en enkelt brønn med en 24-brønns hengende dråpeplate ved å smøre kantene på brønnen med vakuumfett.
      2. Tilbered 0,5 ml 0,1 m Tris-HCl pH 7,0, 0,15 m MgCl2 og 30 % (w/v) PEG 6000 og fyll den smurte brønnen.
      3. Bruk nytint endothiapepsinløsning, pipett 1 μL protein på overflaten av et glassdeksel. Pipett 1 μL krystallisasjonsbuffer på proteindråpen og blandes med pipetten.
      4. Se eller avbilde platen over de første 0, 3, 6, 12, 24 timene. Legg merke til eventuelle endringer i området X, s og X,n.
      5. Hvis det har skjedd endringer, gjenta trinn 3.2.2.1 til 3.2.2.4, men øk eller reduser protein-, utfellings- og/eller frøkonsentrasjonen for å gjenopprette eventuelle endringer i området Xs og Xn.
      6. Når/hvis området Xs og Xn er akseptabelt, gå videre til trinn 3.2.2.7.
      7. Gjenta trinn 3.2.2.1 til 3.2.2.5, og øk det totale volumet av eksperimentet gradvis til 10 μL.
      8. Når du har et volum på 10 μL eller større, fortsett til sentrifugerør i trinn 3.2.3.
    3. Skalering i sentrifugerør
      MERK: Forbedringen av endothiapepsin-batchtilstanden skjedde hovedsakelig ved punktet på 200 μL-volumer (se Resultater, Skalering). Prosessen begynte med en krystallisasjonstilstand på 0,1 M Tris-HCl pH 7,0, 0,15 M MgCl2 og 30 % (w/v) PEG 6000. Imidlertid endret PEG-konsentrasjonen til slutt til 40% (w / v). Frø var også nødvendig for å kontrollere Xn, og for å forhindre at krystaller vokste seg for store, måtte krystallveksten slukkes. Trinn 3.2.3.1 til 3.2.3.7 beskriver prosessen med tilstandsoptimalisering. Trinn 3.2.4. Beskriv den endelige batchprotokollen.
      1. Forbered 1 ml krystallisasjonsbuffer: 0,1 M Tris-HCl pH 7,0, 0,15 M MgCl2 og 30 % (w/v) PEG 6000.
      2. Ved bruk av nytint 100 mg / ml endothiapepsin tilsett 25 μL protein til et 1,5 ml sentrifugerør.
      3. Bland krystallisasjonsbufferen grundig med proteinløsningen i forholdet 1:1 med en pipettespiss. Plasser røret i en revolver/rotator med høy omrøring ved 20 °C.
      4. Ta regelmessige (5, 10, 30, 60 minutter, 2, 5, 10, 24 timer) 2,5 μL alikoter og se i et hemocytometer. Ta opp Xn og Xs-området .
      5. Hvis det har skjedd endringer, gjentar du trinn 3.2.3.1. til 3.2.3.4. men øke eller redusere protein-, utfellings- og/eller frøkonsentrasjonen for å gjenopprette eventuelle endringer i området Xs og Xn
      6. Når området Xs og Xn er akseptabelt, fortsett til trinn 3.2.3.7.
      7. Gjenta trinn 3.2.2.1 til 3.2.2.5, og øk det totale volumet av eksperimentet gradvis til 200 μL eller større, etter behov.
    4. Endelig seeded-batch-protokoll
      1. Forbered frølager.
        1. Forbered 2 ml krystallisasjonsbuffer: 0,1 M Tris-HCl pH 7,0, 0,15 M MgCl2 og 40% (w / v) PEG 6000.
        2. Ved bruk av nytint 100 mg / ml endothiapepsin tilsett 100 μL protein til et 1,5 ml sentrifugerør.
        3. Bland krystallisasjonsbufferen grundig med proteinløsningen i forholdet 1:1 med en pipettespiss. Plasser røret i en revolver/rotator med høy omrøring ved 20 °C i 24 timer slik at 50 μm krystaller kan vokse.
        4. Tilsett 10-15 1 mm glassperler til 50 μm krystalloppslemmingen.
        5. Vortex sentrifugerøret som inneholder slammet og perlene ved 1000 o / min i 30 s.
        6. Sett sentrifugerøret tilbake til is i 30 s.
        7. Gjenta trinn 3.2.4.1.5 og 3.2.4.1.6 10 ganger til.
        8. Dette er nå 200 μL av en 1x frøbestand. Fortynn frøstokken 10x ved tilsetning av 1,8 ml krystalliseringsbuffer. Aliquot 10x frølager i 50 μL batcher og lagre ved -20 ° C.
      2. Seededed-batch protokoll.
        1. Forbered krystallisasjonsbuffer: 0,1 M Tris-HCl pH 7,0, 0,15 M MgCl2 og 40% (w / v) PEG 6,000.
        2. I et sentrifugerør blander du 100 μL krystalliseringsbuffer med 50 μL nytint 10x frølager.
        3. Ved bruk av nytint 100 mg / ml endothiapepsin tilsett 150 μL protein til et 1,5 ml sentrifugerør.
        4. Bland krystallisasjonsbufferen/frøblandingen grundig med endothiapepsinoppløsningen med en pipettespiss og plasser røret i en revolver/rotator med høy omrøring ved 20 °C.
        5. Overvåk krystalliseringen ved å ta vanlige 2,5 μL alikoter og se krystallene i et hemocytometer. Ta opp Xn og Xs-området .
        6. Etter ca. 80 minutter, når krystallene har nådd en Xs på 15 μm, slukkes reaksjonen ved tilsetning av 150 μL av 0,05 M Na-acetat pH 4,6, 0,05 M Tris-HCl pH 7,0, 0,075 M MgCl2 og 20% (w / v) PEG 6,000 (en løsning sammensatt av endothiapepsinbuffer og krystallisasjonsbuffer, blandet 1: 1).
        7. Oppbevar krystallene ved 20 °C.
      3. Har protokollen produsert et akseptabelt krystallstørrelsesområde og antall for det tiltenkte eksperimentet? Ja - FERDIG - Nei - gå tilbake til trinn 3.1. og prøv et alternativt skaleringsalternativ. For eksempel kan et annet protein:utfellingsforhold være mulig eller tilsetning av frø hvis dette ikke ble gjort tidligere. Når alle disse er oppbrukt, kan det være nødvendig å finne en ny tilstand i trinn 1.

Representative Results

Optimalisering av krystallmorfologi
Trinn 1, optimalisering av krystallmorfologi, er inkludert for å minne leseren om dens betydning. Det kan være mulig å lage perfekte mikrokrystaller fra dårlig diffraksjon nål-baller; Forfatterne vil imidlertid foreslå at det er bedre å optimalisere de to separat. Finn først forhold som gir opphav til godt diffracting, enkeltkrystall via dampdiffusjon, og konverter deretter disse forholdene til batch i stedet for å prøve å kombinere de to trinnene sammen. Å oppdage svært kjernende forhold, på dette stadiet, er ikke nødvendig; Morfologi og diffraksjonskvalitet er de viktigste målene.

Før begynnelsen av mikrokrystalliseringen av endothiapepsin ble det utført en analyse av deponerte strukturkrystallisasjonsbetingelser fra PDB. Krystallisasjonsbetingelser og omtrentlige protokoller kunne oppnås for 47 av de 48 avsetningene av enthothiapepsin. Disse var stort sett alle basert på den første krystalliseringen av endothiapepsin utført av Moews og Bunn (1970)46. Gitt likhetene mellom disse forholdene og deres "klassiske" opprinnelse, ble en 96-brønn, dampdiffusjon, sparsom matriseskjerm utført for å utforske et bredere utvalg av krystallisasjonsforhold. Endothiapepsin ble konsentrert til 70 mg/ml og en PACT sparse-matrix screen47 ble utført i en 96-brønns sittedråpeplate ved 20 °C som blandet 100 nL protein med 100 nL brønnløsning. Hver tilstand fra dette eksperimentet etter 36 timer ga opphav til krystaller. En analyse av krystallmorfologien indikerte imidlertid at noen forhold kan vise seg å være bedre for mikrokrystallisasjonsoptimalisering.

Figur 4A viser et fall fra PACT-skjermen som stort sett var representativt for de som ble observert i flertallet av platen. Ved første øyekast kan det være fristende å tenke at disse krystallene kan være verdt å optimalisere ytterligere for mikrokrystallisering. Krystallene er store og det ser ut til å være betydelig nukleering. Den generelle krystallmorfologien er imidlertid ikke ideell. For det første er krystallene ikke observerbare singletoner, da det ser ut til at flere krystaller vokser fra enkle nukleasjonspunkter. For det andre er krystallstørrelsen svært asymmetrisk med vekst som hovedsakelig forekommer nedover en enkelt akse. Slike krystaller er teoretisk mer sannsynlig å fortrinnsvis justere når de leveres til røntgenstrålen. Begge egenskapene gir problemer under innsamling og behandling av serielle krystallografiske data.

Figur 4B viser imidlertid endothiapepsinkrystaller dyrket i nærvær av MgCl2. Denne morfologien var konsistent på tvers av alle tilstander som inneholdt MgCl 2 og antydet derfor at morfologien skyldtes MgCl2. MgCl2-betingelsene produserte enkle, mer bokslignende krystaller som representerte et bedre mål for de ultimate serielle eksperimentene.

Det var fire forhold i PACT-skjermen som inneholdt MgCl2. For bedre å forstå påvirkningen av alle de forskjellige komponentene i disse forholdene på endothiapepsinkrystallisering ble det utført en tilfeldig optimalisering. Det ble laget en skjerm som inneholder en tilfeldig kombinasjon av buffere og utfellingsmidler ved en rekke konsentrasjoner og pH-verdier. MgCl2-konsentrasjonen var også variert, og deretter ble de resulterende dråpene vilkårlig gradert fra 0-5 (0 er ingen krystaller eller nedbør) med hensyn til deres visuelle krystallkvalitet og nedbørsnivå.

Figur 5A viser et varmekart over resultatene fra en Pearsons korrelasjonsanalyse mellom nedbørsnivå og krystallkvalitet, og skjermvariablene (eksempler på dråpene fra dette eksperimentet er vist i figur 5B, C og D). Resultatene indikerte at pH i løsningen var sterkt korrelert med nedbørsnivået, med alkaliske buffere som resulterte i mer nedbør. MgCl2-konsentrasjonen var litt korrelert med nedbørsnivået, og det samme var pH- og utfellingskonsentrasjonen til krystallkvaliteten.

Basert på disse resultatene ble det besluttet å ta krystallene dyrket i 0,1 M Tris-HCl pH 7,0, 0,15 M MgCl2, 20% (w / v) PEG 6,000 til neste trinn i protokollen - Overgang til batch. Morfologien til krystaller var akseptabel, og en analyse av røntgendiffraksjon og datakvalitetsmålinger fra disse krystallene antydet at det ikke var noen signifikant forskjell mellom krystallene dyrket inn og ut av tilstedeværelsen av Mg2+ (figur 9).

Overgang til parti
For mange serielle krystallografimikrokrystallisasjonsoptimaliseringer vil trinn 2 være utgangspunktet. Proteinet av interesse vil allerede ha blitt krystallisert for kryokrystallografi, og krystallisasjonsprotokollen vil nå trenge transformasjon for å skape mikrokrystalloppslemminger. Denne protokollen har bare brukt 96-brønns dampdiffusjonsplater for å utføre transformasjonen til batch siden dampdiffusjon er krystallisasjonsmetoden som brukes av 95% av PDB-oppføringene26. Protokollen har unngått å flytte inn i microbatch34,35,37 siden denne overgangen fortsatt kan medføre en lignende optimalisering. Dette er ikke å si at denne protokollen bare kan gjøres i dampdiffusjonsplater. Alle trinnene som presenteres, ville også fungere i microbatch hvis dette var den opprinnelige krystallisasjonsmetoden.

For å vurdere krystalliseringen av endothiapepsin i den valgte tilstanden ble det opprettet et morfogram - eller et grovfasediagram. Formålet med morfogrameksperimentet er tredelt. For det første er en analyse av morfogrammet til stor nytte ved vurdering av skaleringsruter i trinn 3 - Skalering. For det andre fungerer morfogrammet som et optimaliseringsverktøy som bidrar til å oppdage dampdiffusjonsforhold som gir opphav til krystaller via batch [dvs. raskt opptredende krystaller (< 24 timer)]. For det tredje, hvis krystaller ikke har dukket opp raskt, kan en analyse av frødråpene gi krystallografen en ide om den omtrentlige plasseringen av den nåværende tilstanden på fasediagrammet. For eksempel, hvis de frøede forholdene gir krystaller, men de usedede ikke gjør det, vil disse forholdene sannsynligvis være i den metastabile regionen.

Morfogramforsøket med endothiapepsin ble utført basert på 0,1 M Tris-HCl pH 7,0, 0,15 M MgCl2, 20 % (w/v) PEG 6000 tilstand. Protein- og PEG-konsentrasjonene varierte fra henholdsvis 100 til 12,5 mg/ml og 5 til 40 % (w/v). Dråpene ble analysert og resultatene plottet ved hjelp av regnearket som ble gitt (figur 6A).

Det var også allerede klart fra Optimalisering av krystallmorfologistadiet at endothiapepsinkrystallvekst i denne tilstanden, og ved disse proteinkonsentrasjonene, ville resultere i krystaller dyrket på under 24 timer. Dette indikerte at krystallisering skjedde via en batch i stedet for en dampdiffusjonsdrevet prosess. Krystallen som ble dyrket under disse forholdene var derfor egnet for skalering til større volumer.

Hvis krystaller ikke hadde vært synlige i de usådde dråpene etter 24 timer, ville det ha vært sannsynlig at krystallisasjonen fortsatt var avhengig av en overgang (figur 1B) og derfor ikke batch. I dette tilfellet er resultatene fra morfogramforsøket fortsatt av interesse. De gir en indikasjon på det sannsynlige utgangspunktet for krystallisering på fasediagrammet og dermed hvordan den påfølgende optimaliseringen skal foregå. Se på frødråpene. Frøene vil tillate krystallvekst i den metastabile regionen uavhengig av nukleering. For eksempel, hvis krystaller vises innen 24 timer i frødråpene, men ikke de ufrøede dråpene, indikerer dette at en del av den metastabile regionen kan observeres. Hvis det ikke observeres krystaller i verken sådde eller useedede dråper, forblir alle brønner undermettede.

Skalering
Ser man på morfogrammet (figur 6A), kunne man gjøre en rekke observasjoner. Mengden kjernedannelse så ut til å være påvirket av både protein- og utfellingskonsentrasjonene. Det var også en veldig klar avgrensning av dråper som fører til proteinutfelling, med dråper som enten inneholder: ingenting, krystaller eller bunnfall (figur 6B). Tilsetningen av frø (figur 6D) økte også kraftig Xn sammenlignet med dråpene uten frø (figur 6C). Ved å ta alle disse resultatene sammen, ble det besluttet å forsøke å skalere både en batch- og seeded-batch-protokoll ved 30% (w / v) PEG 6,000 og 100 mg / ml endothiapepsin.

Den første testskaleringen ble gjort i 24-brønns hengende slippplater. Dråpevolumene ble gradvis økt slik at eventuelle endringer i krystallisasjonsoppførselen kunne observeres (figur 7). Som det kan sees, har det forekommet krystallvekst i både de useedede og frøede dråpene. Alle de ufrøede dråpene vokste en rekke krystallstørrelser, men overveiende store krystaller (100-200 μm - lengste dimensjon). De frøede dråpene produserte imidlertid mindre krystaller (5 - 50 μm - lengste dimensjon). Disse innledende testene antydet at frø ville være nødvendig for å redusere Xs, men også at denne tilstanden skulle være egnet for større volumer.

Når volumet ble økt i 200 μL, ble krystallisasjonsvolumet kontinuerlig omrørt under krystallvekst. Hovedårsaken til denne omrøringen var å sikre at krystallisasjonsløsningen forblir homogen og at voksende krystaller ikke legger seg på bunnen eller sidene av rørene. Sedimentering av krystaller kan føre til en heterogen krystallpopulasjon med både veldig store og små krystaller. Omrøring av krystallisasjonsløsningen kan også fremme nukleering44,45.

Dessverre produserte den useedede 30% (w / v) PEG 6000 ingen krystaller, så PEG-konsentrasjonen ble økt til 35% (w / v). Denne økningen forbedret krystallisasjonen markant, med et endeligX-n- ogXs-område på henholdsvis 3,6 ± 1,2 x 106 krystaller·mL-1 og 42 ± 4,1 μm (figur 8A og B - svart). Selv om det var en betydelig forbedring og en akseptabel krystallkonsentrasjon, var de endelige krystallene for store for det planlagte eksperimentet, så ytterligere optimaliseringer ble gjennomført. For å redusere størrelsen på de endelige krystallene ble to veier utforsket (figur 1E): redusere proteinkonsentrasjonen for å prøve å begrense den endelige krystallveksten (figur 8A og B - varmrosa), og øke PEG-konsentrasjonen for å prøve å øke kjernedannelsen (figur 8A og B - grønn).

Reduksjonen av proteinkonsentrasjonen reduserte dessverre også Xn, som til slutt produserte enda større krystaller. Å øke PEG-konsentrasjonen til 40 % ga et endeligXn- og Xs-område på henholdsvis 3,1 ± 0,7 x 106 krystaller·mL-1 og 39 ± 2,3 μm. Disse var ikke signifikant forskjellige fra 35%, men siden den endelige krystallstørrelsen ble redusert, ble denne tilstanden fortsatt med ytterligere optimaliseringer.

For å øke Xn ble frø tilsatt. Dette økte Xn (1,1 ± 1,8 x 10 8 krystaller·mL-1) dramatisk og førte til en mindre Xs (4,2 ± 4,0 μm) (figur 8A og B - stiplet lilla). Disse krystallene, selv om de var svært egnet for noen serielle krystallografieksperimenter, ble ansett for små, så konsentrasjonen av de tilsatte frøene ble endret.

Denne justeringen av den tilsatte frøbeholdningen viste seg imidlertid vanskelig å gjenta pålitelig; Derfor ble slukking forsøkt. Etter tilsetning av en frøbestand ble krystallstørrelsen overvåket, og når en passende krystallstørrelse ble oppnådd (ca. 10 - 20 μm), ble batchkrystalliseringen slukket (figur 8C og D). Slukking ble foreslått, med hensyn til mikrokrystallisering, i Kupitz et al. (2014) 25. Selv om det kanskje ikke er en ideell metode, da proteinløsning til slutt vil bli bortkastet26, var teknikken veldig nyttig i denne situasjonen, da krystallvekst var vanskelig å kontrollere. Tanken bak slukking er å raskt returnere krystallisasjonsblandingen til et punkt like over løselighetslinjen (figur 1F). Når løsningen har returnert til løselighetslinjen, har løsningen returnert til en stabil mettet løsning, og ingen ytterligere krystallvekst vil oppstå.

Forsøk på å slukke en krystallisasjonsreaksjon er ikke uten risiko. Hvis det tilsettes for stor slukkeløsning, kan proteinet i oppløsningen fortynnes så mye at løselighetslinjen passeres. I dette tilfellet vil løsningen bli undermettet og krystallene begynner å oppløse. For å forhindre dette er det mulig å estimere mengden nødvendig slukkeløsning basert på morfogramresultatene. Ved slukkepunktet, ta konsentrasjonen av proteinoppløsningen. Ved å sammenligne proteinkonsentrasjonen ved løselighetslinjen og proteinkonsentrasjonen i oppløsning, kan det gjøres et estimat av den nødvendige fortynningen.

Den slukkede versjonen av 40% (w / v) PEG 6,000, 10 x fortynnet frøeksperiment ga en endelig krystallkonsentrasjon og størrelsesområde på henholdsvis 2,6 ± 3,1 x 106 krystaller · ml-1 og 15 ± 3,9 μm.

Gjennom hele prosessen ble testrøntgendatainnsamlinger av endothiapepsinkrystallene samlet inn ved den sveitsiske lyskilden PXII-strålelinjen ved hjelp av et 10 x 30 μm fokus, en energi på 12,4 keV dempet med 80%, og under kryoforhold. Dataene ble bearbeidet ved hjelp av skiver, og figur 9 viser en sammenligning av CC1/2. Ingen dramatisk endring i CC1/2 ble observert i løpet av optimaliseringen.

Figure 1
Figur 1: Oversikt over overgangs- og batchkrystallisasjon, og skaleringsmetoder kartlagt i et fasediagram. A. Sonene og grensene til det arketypiske proteinkrystallisasjonsfasediagrammet. Utfellings- og proteinkonsentrasjonene plottes på henholdsvis x - og y-aksen med rentvannspunktet ved opprinnelsen. Den lilla linjen indikerer proteinovermetningsgrensen, og metastabile, nukleasjons- og nedbørssoner vises i henholdsvis blått, grønt og rosa. B. Et eksempel på nukleasjonssonens penetrasjonsgrenser for en "overgangsfase" krystallisasjonsmetode, for eksempel dampdiffusjon. I dette teoretiske eksperimentet begynner dråpeutfellingen og proteinkonsentrasjonene like under løselighetslinjen - ennå ikke overmettet. Mens dråpen balanserer, øker dråpekomponentkonsentrasjonene slik at dråpen blir overmettet, og fortsetter å bevege seg - eller overgang - inn i nukleasjonssonen. Ved krystallkjernedannelse begynner proteinkonsentrasjonen i oppløsning å falle. Konsentrasjonen fortsetter å falle etter hvert som krystaller vokser til den til slutt stopper ved løselighetslinjen. Den blå stiplede linjen markerer en teoretisk grense for overgangen til nukleasjonssonen. Så snart nukleering begynner, vil proteinkonsentrasjonen falle, og forhindre ytterligere penetrasjon. C. Eksempel på batch- og frøbatchkrystalliseringsbaner. I batch må blandingen av protein og utfelling skape en overmettet løsning innenfor nukleeringssonen slik at krystallvekst kan oppstå. I seeded-batch er det ikke strengt nødvendig å være i nukleasjonssonen på grunn av tilsetning av mikrofrø, så steder i den metastabile regionen kan også utforskes. D. En hypotetisk optimalisering av krystallisasjonseksperimentet vist i B fra dampdiffusjon til batch. Det opprinnelige dampdiffusjonsutgangspunktet har gått over, via den resulterende optimaliseringsvektoren, til den nye startposisjonen; inne i nukleasjonssonen. Den resulterende vektoren er produktet av to optimaliseringer: en økning i både protein- og utfellingskonsentrasjoner. E. Eksempel på optimaliseringer ved skalering av partibetingelser for å skreddersy den endelige X, n og Xs. F. Slokking av krystallisasjonseksperimentet ved tilsetning av krystallisasjonsbuffer. Det er viktig at slukkingen ikke tar proteinkonsentrasjonen ut av den metastabile regionen og derfor under punktet for proteinovermetning. Ellers vil krystaller begynne å oppløses tilbake i løsningen. B. og C . er tilpasset fra Beale et al. (2019) 26 med tillatelse fra forfatterne. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Økende Xn og avtagende Xs. Det idealiserte forholdet mellom antall krystaller produsert fra et krystallisasjonseksperiment og deres gjennomsnittlige lengste dimensjon. For å lage denne grafen ble krystalliseringen av et hypotetisk 10 kDa modellprotein brukt. Proteinet krystalliserte i en konsentrasjon på 10 mg/ml og ga P2 1 2 1 21 krystaller med dimensjoner på49x50x51 Å. Hver nukleasjonshendelse ble antatt å gi en krystall. Krystallveksten ble antatt å være homogen fra alle ansikter. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Et flytskjema som viser trinnene for å optimalisere en krystall dyrket i et lite volum (<500 nL), dampdiffusjonseksperiment i et stort volum (> 100 μL) batcheksperiment. Krystalloptimalisering er delt inn i tre faser: (1) Optimalisering av krystallmorfologi. (2) Overgang til batch. (3) Skalering. I trinn 1 er det viktig å identifisere egnede krystaller for mikrokrystallisering. Noen proteiner er bare tilstede i en enkelt krystallmorfologi uavhengig av krystallisasjonsbetingelsen. Det er imidlertid verdt å lete etter forhold som gir opphav til enkle, kubelignende krystaller, eller så nær disse som menneskelig mulig. Enkle, kubelignende krystaller, hypotetisk og anekdotisk, vil generelt gi opphav til bedre resultater fra serielle krystallografieksperimenter. Når en krystallmorfologi er valgt og diffraksjonen bekreftet, er det nødvendig å flytte krystallisasjonseksperimentet fra dampdiffusjon til batch (trinn 2). Her bør krystaller optimaliseres ved deres nukleasjonstid. Målet er å finne forhold som gir raskt opptredende krystaller (> 24 timer), da disse forholdene sannsynligvis vil treffe nukleasjonssonen umiddelbart, og derfor er batch. Når en tilstand i nukleasjonssonen er funnet, kan et morfogram opprettes. Morfogrammet tillater størstedelen av nukleasjonssonen å kartlegge og potensielle skaleringsruter identifisert for trinn 3. Volumet av en identifisert batchtilstand kan deretter enten skaleres gradvis eller raskt i størrelse for å gi et endelig volum på >100 μL. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: En analyse av endothiapepsinkrystallisasjonsbetingelser fra en PACT sparsommelig matriseskjerm. A . og B . er bilder etter 24 timer med brønnene A4 og C10, henholdsvis fra PACT-skjermen. Krystallisasjonsbufferkomponentene er uthevet på figuren. SPG-bufferen er ravsyre, natriumdihydrogenfosfat og glycin blandet i et 2: 7: 7 molforhold. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: En analyse av endothiapepsinkrystallisasjonsoptimalisering fra PACT MgCl 2-betingelsene. A. Et varmekart over resultatene fra en Pearsons korrelasjonsanalyse mellom buffer pH, MgCl2 konsentrasjon og utfellingskonsentrasjon og nedbørsnivå og krystallkvalitet. Både nedbørsnivå og krystallkvalitet ble vurdert vilkårlig på en skala fra 0-5 (der 0 ikke var krystaller eller nedbør) etter 24 timer B. C. og D. viser eksempler på krystallisering og nedbør i tre forskjellige dråper. Krystallisasjonstilstanden og vurderinger av nedbørsnivå og krystallkvalitet er også vist. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Et endothiapepsinmorfogram ved krystallisering i 0,1 M Tris-HCl pH 7,0, 0,15 MMgCl2 og PEG 6000. A. Et morfogram opprettet fra regnearket "fasediagram-generator" som følger med. Det relative antall krystaller i hver dråpe er betegnet med sirklenes størrelse, og resultatene fra dråpe 1 (protein og utfelling) og dråpe 2 (protein, utfelling og frø) er uthevet i henholdsvis grønt og blått. Verdiene av protein- og utfellingskonsentrasjonene, på henholdsvis x - og y-aksen , angir forhåndsblandede verdier for hvert i stedet for endelige volumer. Basert på resultatene er det tegnet svarte linjer og en lilla linje for å vise grensene for henholdsvis nukleasjonssonen og metastabil sone. B. C. og D . viser noen eksempelresultater fra eksperimentet. De røde og blå prikkene merket på A . angir plasseringen av B. og C. og D., henholdsvis. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 7
Figur 7: Innledende skaleringsforsøk av endothiapepsin i 24-brønns hengende dråpeplater. Samme protein- og utfellingskonsentrasjoner ble brukt for alle spor: henholdsvis 100 mg/ml endothiapepsin i 0,1 M Na-acetat pH 4,6 og 0,1 M Tris-HCl pH 7,0, 0,15 M MgCl2 og 30 % (w/v) PEG 6000. Alle de viste bildene ble tatt etter 24 timer, og de siste dråpevolumene er merket på hvert bilde. Det venstre panelet (A, D og G) er en 1: 1-blanding av protein og utfelling, midtpanelet (B, E og H) er en 1: 2: 3-blanding av frø, utfelling og protein, og det høyre panelet (C, F og I) er forstørrede bilder av midtpanelet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 8
Figur 8: Analyse av endothiapepsin mikrokrystallisering i 200-300 μL volumer. A. og C. viser hvordan Xn endret seg over forsøkstiden. B. og D. viser hvordan Xs (lengste dimensjon) endret seg over tid. Resultatene av forsøkene er skilt for klarhet. Den røde stiplede linjen på C. og D. viser punktet der slukkingen ble utført. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 9
Figur 9: CC1/2 resultater og bilder av krystaller oppnådd i hvert trinn av mikrokrystallisasjonsprosessen for å vurdere diffraksjonskvalitet. A. CC1/2 plottet mot oppløsning fra data samlet fra krystaller dyrket: med og uten Mg - en del av trinn 1-optimaliseringen, i et 200 nL-volum, et 10 μL-volum og det endelige 300 μL-volumet. B.C. og D. viser krystallene fra henholdsvis 200 nL, 10 μL og 300 μL volum. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Protein Informasjon
Protein Endothiapepsin
Molekulær vekt (kDa) 33.8
Romgruppe P12 11
a, b, c (Å) 45.2, 73.3, 52.7
α, β, ɣ (°) 90.0, 109.2, 90.0
Parametere for faste mål
Volum lastet per brikke (μL) 150
Aperaturer per brikke 25,600
Nødvendig krystallkonsentrasjon (krystaller/ml) 500,000
Eksempel på informasjon
Proteinmasse som brukes til å lage 200 μL prøve (mg) 10
Krystall lengste dimensjon (μm) 15
Krystallkonsentrasjon (krystaller/ml) 2,500,000
Eksperimentelle variabler
Antall tidspunkter som kreves 5
Antall bilder som kreves per tidspunkt 50,000
Treffprosent (integrerte mønstre/bilder samlet) 0.3
Faste mål kreves per tidspunkt (avrundet) 7
Krav til eksempel
Prøvevolum kreves per tidspunkt (μL) 1,050
Totalt prøvevolum som kreves for eksperiment (ml) 5.25
Total masse protein nødvendig (mg) 52.5

Tabell 1: Et eksempel på prøvekravene for et hypotetisk optisk pumpesondeeksperiment utført ved bruk av faste mål. Proteinet som ble brukt i dette teoretiske eksperimentet var endothiapepsin. Fastmålsparametrene var basert på eksperimenter rapportert i Ebrahim et al. (2019)48 og Davy et al. (2019)49. Eksempelinformasjonen kom fra protokollen rapportert i denne videoartikkelen, og de eksperimentelle variablene var konservative estimater basert på levd erfaring. Følgende utvalgskrav ble deretter beregnet på bakgrunn av tidligere forutsetninger.

Discussion

Metoden som presenteres viser hvordan man optimaliserer krystalliseringen av endothiapepsin fra store krystaller (≥ 100 μm lengste dimensjon), dyrket i sparsomme matriser 96-brønns skjermer, til mikrokrystaller, dyrket i sentrifugerør (300 μL volum) via batch. Tanken bak protokollen er at trinnene som er tatt for å optimalisere endothiapepsin, også kan brukes til andre proteiner. Til slutt svarer du på problemet med å skape store volumer (>100 μL) mikrokrystaller (10-20 μm) for serielle krystallografieksperimenter ved XFEL og synkrotroner.

Protokollen deler oppgaven med mikrokrystallisering med stort volum i tre trinn: (1) Optimalisering av krystallmorfologi, (2) Overgang til batch og (3) Skalering. I trinn 1 bør rekkevidden av krystallformer som et protein kan opprette, utforskes i dampdiffusjonsplater. Forhold som gir opphav til enkle, bokslignende krystaller som diffrakterer til ønsket oppløsning bør være målet. I trinn 2 kan valgte betingelser deretter transformeres fra dampdiffusjon til batch. Her er optimaliseringskriteriet krystallveksttid og å finne forhold som gir opphav til proteinkrystaller innen 24 timer. Et morfogram kan også plottes, noe som gir eksperimentøren en ide om plasseringen av løselighetslinjen og nukleasjonssonegrensene. Dette morfogrammet er til stor nytte i trinn 3, skalering. Morfogrammet vil gi en indikasjon på om kjernedannelse alene kan øke Xn og drive ned Xs. Etter hvert som volumet av eksperimentet økes, kan X,n og Xs kontinuerlig vurderes som nøkkelkriteriene for skaleringssuksess.

Når det gjelder Endothiapepsin, avdekket trinn 1 det som potensielt var en tidligere ukjent krystallmorfologi for endothiapepsin. Denne morfologien hadde samme romgruppe som de tidligere rapporterte, men viktigst for seriekrystallografi, en mer bokslignende form. Enkeltkrystaller syntes også å vokse fra enkle nukleasjonspunkter, i motsetning til viftene opprettet fra andre forhold (figur 4). For den valgte tilstanden var trinn 2 allerede delvis tilfredsstilt da krystallveksten skjedde i < 24 timer. Morfogrammet indikerte at både en rett eller sådd batchprotokoll kan være vellykket ved skalering i trinn 3. Innledende skalering i rett batch, skapte en tilstand som produserte krystaller med et Xn og Xs område på henholdsvis 3,6 ± 1,2 x 106 krystaller · ml-1 og 42 ± 4,1 μm. Disse krystallene, selv om de var akseptable for noen serielle krystallografieksperimenter, ble ansett for store. Så ytterligere optimaliseringer ble utført. Den endelige protokollen produserte krystaller med en konsentrasjon og størrelsesområde på henholdsvis 3,1 x 106 krystaller·mL-1 og 15 ± 3,9 μm. Dette var mer enn ideelt for de planlagte eksperimentene.

Metoden fokuserer på transformasjon av "løselige" proteinkrystaller dyrket i dampdiffusjonsplater til batch. Årsaken til dette fokuset er at de aller fleste løselige proteinkrystaller dyrkes via dampdiffusjon26. Imidlertid kan konseptene som presenteres også brukes på løselige proteinkrystaller dyrket ved hjelp av andre metoder, for eksempel mikrobatch. Konseptene kan også gjelde membranproteinkrystaller dyrket i LCP; da dette også er en batchkrystallisasjonsprosess.

Et sentralt aspekt ved protokollen er prosessen med å transformere forholdene til krystaller dyrket i dampdiffusjonsplater slik at de kan dyrkes i batch. For denne transformasjonen bruker metoden kriteriet foreslått av Beale et al. (2019) 26. Krystaller dyrket via en batchprosess, selv i dampdiffusjonsplater, vil dannes raskt (< 24 timer). Dette kriteriet er en tilnærming basert på hastigheten på dampdiffusjonsdråpelikevekten, og er mest sant for PEG-baserte utfellingsforhold. Imidlertid vil krystallisasjonsbetingelsene inneholde et bredt utvalg av forbindelser som vil påvirke likevektstiden. Likevekten av saltbaserte krystallisasjonsbetingelser, f.eks. høykonsentrert ammoniumklorid, kan skje i løpet av 1-2 dager. Derfor kan 24-timerskriteriet ikke være sant for saltbaserte forhold. Saltbaserte forhold kan også ha mer komplekse fasediagrammer26,30 som kanskje ikke samsvarer med arketypen presentert i denne protokollen. En reduksjon av tidskriteriet for saltbaserte forhold til 12 eller 6 timer kan være nødvendig dersom skalering til større volumer viser seg umulig.

En annen begrensning ved denne metoden er dens tilsynelatende kompleksitet. Protokollen som ble fulgt for å optimalisere mikrokrystalliseringen av endothiapepsin, endret faktisk den opprinnelige tilstanden fra den sparsomme matriseskjermen relativt lite. Det første treffet observert i PACT-skjermen var 0,1 HEPES pH 7,0, 0,2 M MgCl2 og 20 % (w/v) PEG 6000. Den endelige skalerte krystallisasjonsbufferen var 0,1 Tris-HCl pH 7,0, 0,15 M MgCl2 og 40 % (w/v) PEG 6000. Det er også meget mulig at endringen i buffer fra HEPES til Tris-HCl, og MgCl2-konsentrasjon , bidro lite til prosessens suksess. Å forlate økningen i PEG 6,000-konsentrasjonen er den eneste optimaliseringen, og en som kunne vært oppnådd ganske enkelt.

Denne vurderingen er imidlertid også for forenklet. Det diskonterer ikke bare problemene som oppstår under skalering (dvs . bruk av frø og slukking), men også det faktum at bare fordi dette proteinet viste seg å være greit, er det ingen garanti for at det neste også vil vise seg å være. Trinnene som anbefales i protokollen, ble utarbeidet fordi optimalisering av skalering av proteinkrystallisasjonsvolumer kan være veldig proteindyrt. I løpet av de syv endothiapepsin-skaleringsforsøkene som er vist, ble 100 mg protein konsumert. Riktignok ble noen av disse trinnene utført for å vise konsekvensene i lys av denne protokollen. Likevel kan 100 mg av et protein, pluss potensielt ytterligere 50 mg for protein konsumert under et eksperiment (tabell 1), være en betydelig investering i enten tid eller penger.

Heldigvis er det ikke klart at denne massen av nødvendig prøve er allestedsnærværende på tvers av alle proteiner. Endothiapepsin var høyløselig og krevde derfor stor proteinkonsentrasjon for å nå overmetning. I andre (for tiden under optimalisering) kan overmetning nås ved 10 eller til og med 5 mg / ml. Slike variabler er proteinspesifikke og må omfavnes når de vises.

Andre begrensninger av metoden inkluderer dens avhengighet av komplekst utstyr som væskehåndteringsroboter for skjerm- og plateoppretting, og bildeapparater for automatisk bildeplater når det er nødvendig. Alternative rutiner har blitt tilbudt for å begrense behovet for noen av disse utstyrene, men protokollen vil være mer tidkrevende å følge uten dem. Protokollen foreslår også å teste diffraksjonen av optimaliserte krystaller. For krystallografer uten regelmessig tilgang til en synkrotron, kan disse testene vise seg å være utfordrende. Kontroller på hvert trinn er kanskje ikke nødvendig, men disse testene anbefales på det sterkeste når et treff er identifisert, og før og etter skalering. Ikke-diffraksjonerende krystaller ved en XFEL er dessverre ikke en uvanlig forekomst. Gitt dette er det bedre å feile på siden av forsiktighet angående antagelser om krystalldiffraksjon.

Til syvende og sist vil denne protokollen og resultatene som presenteres her, gi en veiledning, ideer og et eksempel til de som sliter med å produsere prøver for serielle krystallografieksperimenter. Forhåpentligvis, etter hvert som seriell krystallografi videreutvikles, vil prøvekravene til teknikken reduseres slik at behovet for protokoller som dette vil bli redusert. Men selv i dette tilfellet vil strategiene som presenteres her fortsatt være nyttige for de som ønsker å utforske krystallisasjonsrommet til proteinet deres.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter å opplyse.

Acknowledgments

Dette prosjektet har mottatt finansiering fra EUs Horizon 2020 forsknings- og innovasjonsprogram under Marie Skłodowska-Curie grant agreement No 701647. Mange takk for hjelp og støtte fra strålelinjeforskere ved den sveitsiske lyskildestrålelinjen X10SA-PXII.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Swissci 96-well 2-Drop plates Molecular Dimensions MD11-002 96-well 2-drop crystallisation plate
Swissci 96-well 3-Drop plates Molecular Dimensions MD11-003 96-well 3-drop crystallisation plate
mosquito LCP liquid handling robot sptlabtech mosquito LCP Crystallisation robot
ClearVue Sheets Molecular Dimensions MD6-015 96-well crystallization plate seals
Safe-Tube 1.5 mL Eppendorf 30120086 1.5 mL centrifuge tubes
Scaple Swan and Morton No. 3 scalple and No. 3 handle Scalple for cutting open plate seals
MS 3 Vortex IKA 3319000 Vortex for mixing solution and making seed stocks
24-well XRL Plate Molecular Dimensions MD3-11 24-well hanging-drop plates
Tube revolver/rotator Thermo Fischer Scientific 88881001 Tube revolver for mixing solution during scaling
Eppendorf Research plus pipettes Eppendorf Range of manual pipettes, 0.5-10, 1-20, 10-100, 100-1000 µL
Eppendorf pipette tips Eppendorf Range of tip sizes for manual pipettes
Suparen 600 Prochem AG Suparen 600 Endothiapepsin solution
Sodium Acetate Sigma-Aldrich 241245-1KG Sodium Acetate
Tris Merck 8382T014 Tris
Magnesium Chloride Sigma-Aldrich M2670-1kg Magnesium Chloride
PEG 6,000 Sigma-Aldrich 81255-1kg PEG 6,000
Ethelyene glycol Sigma-Aldrich 324558-1L Ethelyene glycol for cyro-protecting the crystals
PACT Premier HT screen Molecular Dimensions MD1-36 PACT Premier 96-well crystal screen
DOW CORNING high vacuum grease Molecular Dimensions MD6-02 Grease for sealing 24-well plates
Hirschmann 22 x 22 mm glaser cover slides Hirschmann 8000104 Cover slides for sealing 24-well sitting drop plates
Crystal pins PSI Manufactured inhouse Thin-film supports for micro-crystals.
1-1.3 mm SiLibeads Type S Faust 6239547 Glass beads for making mico-seed stocks
Macbook Pro Apple Macbook Pro Computer for performing data analysis
CCP4 software suite CCP4 Diffraction pattern data processing software
Excel Microsoft Microsoft Office Plotting tool for phase diagram
Hausser Scientific Bright-Line counting chamber Thermo Fischer Scientific 02-671-51B Tool to calculate crystal concentration
PACT Premier Molecular Dimensions MD1-29-ECO Sparse-matrix crystallization screen
Rock Imager Formulatrix Rock Imager Temperature controlled crystal plate storage and imager
Rock MakerWeb Formulatrix Rock MakerWeb Crystal plate creation and image storage stoftware
Formulator Formulatrix Formulator 96-well crystal screen creation liquid handling robot
Leica MZ16 Microscope Leica Leica MZ16 Light microscope
LAS V4.6 Leica LAS V4.6 Software for Leica microscopes
Spectra/Por 3.5 kDa dialysis tubing Spectrumlabs Spectra/Por 3 Dialysis Membrane 3.5 kDa dialysis membrane
Dialysis tubing closures Spectrumlabs Spectra/Por 3 Duniversal Closures Clips to seal the dialysis tubing ends
Amicon 10 kDa centrifugal concentrator Merck-Millipore Amicon Ultra-15 10 kDa centrifugal concentrator 10 kDa centrifugal filter
5810 R swing bucket centrifuge Eppendorf 5810 R Centrifuge Swing bucket centrifuge

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. DePonte, D. P., et al. Gas dynamic virtual nozzle for generation of microscopic droplet streams. Journal of Physics D: Applied Physics. 41 (19), 195505 (2008).
  2. Hunter, M. S., et al. Fixed-target protein serial microcrystallography with an x-ray free electron laser. Scientific Reports. 4 (1), 6026 (2014).
  3. Weierstall, U., et al. Lipidic cubic phase injector facilitates membrane protein serial femtosecond crystallography. Nature Communications. 5 (1), 1-6 (2014).
  4. Roessler, C. G. G., et al. Acoustic Injectors for Drop-On-Demand Serial Femtosecond Crystallography. Structure. 24 (4), 631-640 (2016).
  5. Sherrell, D. A., et al. A modular and compact portable mini-endstation for high-precision, high-speed fixed target serial crystallography at FEL and synchrotron sources. Journal of Synchrotron Radiation. 22 (6), 1372-1378 (2015).
  6. Roedig, P., et al. A micro-patterned silicon chip as sample holder for macromolecular crystallography experiments with minimal background scattering. Scientific Reports. 5 (1), 1-11 (2015).
  7. Botha, S., et al. Room-temperature serial crystallography at synchrotron X-ray sources using slowly flowing free-standing high-viscosity microstreams. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 71 (2), 387-397 (2015).
  8. Weinert, T., et al. Serial millisecond crystallography for routine room-temperature structure determination at synchrotrons. Nature Communications. 8 (1), 542 (2017).
  9. Tenboer, J., et al. Time-resolved serial crystallography captures high-resolution intermediates of photoactive yellow protein. Science. 346 (6214), 1242-1246 (2014).
  10. Nango, E., et al. A three-dimensionalmovie of structural changes in bacteriorhodopsin. Science. 354 (6319), 1552-1557 (2016).
  11. Suga, M., et al. Light-induced structural changes and the site of O=O bond formation in PSII caught by XFEL. Nature. 543 (7643), 131-135 (2017).
  12. Mehrabi, P., et al. Liquid application method for time-resolved analyses by serial synchrotron crystallography. Nature Methods. 16 (10), 979-982 (2019).
  13. Halle, B. Biomolecular cryocrystallography: structural changes during flash-cooling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (14), 4793-4798 (2004).
  14. Fraser, J. S., et al. Hidden alternative structures of proline isomerase essential for catalysis. Nature. 462 (7273), 669-673 (2009).
  15. Fenwick, R. B., van den Bedem, H., Fraser, J. S., Wright, P. E. Integrated description of protein dynamics from room-temperature X-ray crystallography and NMR. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (4), 445-454 (2014).
  16. Keedy, D. A., et al. Mapping the conformational landscape of a dynamic enzyme by multitemperature and XFEL crystallography. Elife. 4, (2015).
  17. Thomaston, J. L., et al. XFEL structures of the influenza M2 proton channel: Room temperature water networks and insights into proton conduction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (51), 13357-13362 (2017).
  18. Haas, D. J., Rossmann, M. G. Crystallographic studies on lactate dehydrogenase at -75 °C. Acta Crystallographica Section B Structural Crystallography and Crystal Chemistry. 26 (7), 998-1004 (1970).
  19. Hope, H. Cryocrystallography of biological macromolecules: a generally applicable method. Acta Crystallographica Section B Structural Science. 44 (1), 22-26 (1988).
  20. Wu, W., et al. Batch crystallization of rhodopsin for structural dynamics using an X-ray free-electron laser. Acta Crystallographica Section:F Structural Biology Communications. 71 (7), 856-860 (2015).
  21. Ishchenko, A., Cherezov, V., Liu, W. Preparation and delivery of protein microcrystals in lipidic cubic phase for serial femtosecond crystallography. Journal of Visualized Experiments. (115), e54463 (2016).
  22. Andersson, R., et al. Well-based crystallization of lipidic cubic phase microcrystals for serial X-ray crystallography experiments. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 75 (10), 937-946 (2019).
  23. Luft, J. R., et al. The detection and subsequent volume optimization of biological nanocrystals. Structural Dynamics. 2 (4), 041710 (2015).
  24. Lee, D. B., et al. Supersaturation-controlled microcrystallization and visualization analysis for serial femtosecond crystallography. Scientific Reports. 8 (1), 1-10 (2018).
  25. Kupitz, C., et al. Microcrystallization techniques for serial femtosecond crystallography using photosystem II from Thermosynechococcus elongatus as a model system. Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 369 (1647), 20130316 (2014).
  26. Beale, J. H., et al. Successful sample preparation for serial crystallography experiments. Journal of Applied Crystallography. 52, Pt 6 1385-1396 (2019).
  27. Rayment, I. Small-scale batch crystallization of proteins revisited: An underutilized way to grow large protein crystals. Structure. 10 (2), 147-151 (2002).
  28. García-Ruiz, J. M. Nucleation of protein crystals. Journal of Structural Biology. 142 (1), 22-31 (2003).
  29. McPherson, A., Kuznetsov, Y. G. Mechanisms, kinetics, impurities and defects: Consequences in macromolecular crystallization. Acta Crystallographica Section F:Structural Biology Communications. 70 (4), 384-403 (2014).
  30. Rupp, B. Origin and use of crystallization phase diagrams. Acta crystallographica. Section F, Structural biology communications. 71, Pt 3 247-260 (2015).
  31. Luft, J. R., DeTitta, G. T. A method to produce microseed stock for use in the crystallization of biological macromolecules. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 55 (5), 988-993 (1999).
  32. Ireton, G. C., Stoddard, B. L. Microseed matrix screening to improve crystals of yeast cytosine deaminase. Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 60 (3), 601-605 (2004).
  33. Forsythe, E. L., Maxwell, D. L., Pusey, M. Vapor diffusion, nucleation rates and the reservoir to crystallization volume ratio. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 58 (10), 1601-1605 (2002).
  34. Chayen, N. E., Shaw Stewart, P. D., Maeder, D. L., Blow, D. M. IUCr An automated system for micro-batch protein crystallization and screening. Journal of Applied Crystallography. 23 (4), 297-302 (1990).
  35. Chayen, N. E., Shaw Stewart, P. D., Blow, D. M. Microbatch crystallization under oil - a new technique allowing many small-volume crystallization trials. Journal of Crystal Growth. 122 (1-4), 176-180 (1992).
  36. Chayen, N. E. Comparative studies of protein crystallization by vapour-diffusion and microbatch techniques. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 54 (1), 8-15 (1998).
  37. D'Arcy, A., Mac Sweeney, A., Stihle, M., Haber, A. The advantages of using a modified microbatch method for rapid screening of protein crystallization conditions. Acta Crystallographica - Section D Biological Crystallography. 59 (2), 396-399 (2003).
  38. Darmanin, C., et al. Protein crystal screening and characterization for serial femtosecond nanocrystallography. Scientific Reports. 6, 25345 (2016).
  39. Gati, C., et al. Atomic structure of granulin determined from native nanocrystalline granulovirus using an X-ray free-electron laser. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (9), 2247-2252 (2017).
  40. Cheng, R. K. Y. Towards an optimal sample delivery method for serial crystallography at XFEL. Crystals. 10 (3), 215 (2020).
  41. Schmidt, M. Mix and Inject: Reaction Initiation by Diffusion for Time-Resolved Macromolecular Crystallography. Advances in Condensed Matter Physics. 2013, 1-10 (2013).
  42. Oberthuer, D., et al. Double-flow focused liquid injector for efficient serial femtosecond crystallography. Scientific Reports. 7 (1), 44628 (2017).
  43. McPherson, A., Gavira, J. A. Introduction to protein crystallization. Acta crystallographica. Section F, Structural biology communications. 70, Pt 1 2-20 (2014).
  44. Yaoi, M., et al. Effect of stirring method on protein crystallization. Japanese Journal of Applied Physics, Part 2: Letters. 43 (10), 1318 (2004).
  45. Castro, F., Ferreira, A., Teixeira, J. J., Rocha, F. Influence of Mixing Intensity on Lysozyme Crystallization in a Meso Oscillatory Flow Reactor. Crystal Growth & Design. 18 (10), 5940-5946 (2018).
  46. Moews, P. C., Bunn, C. W. An X-ray crystallographic study of the rennin-like enzyme of Endothia parasitica. Journal of Molecular Biology. 54 (2), 395-397 (1970).
  47. Newman, J., et al. Towards rationalization of crystallization screening for small- to medium-sized academic laboratories: the PACT/JCSG+ strategy. Acta crystallographica. Section D, Biological. 61, Pt 10 1426-1431 (2005).
  48. Ebrahim, A., et al. Resolving polymorphs and radiation-driven effects in microcrystals using fixed-target serial synchrotron crystallography. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 75, Pt 2 151-159 (2019).
  49. Davy, B., et al. Reducing sample consumption for serial crystallography using acoustic drop ejection. Journal of Synchrotron Radiation. 26 (5), (2019).

Tags

Denne måneden i JoVE utgave 168 seriell krystallografi batchkrystallisering mikrokrystallisering XFEL dampdiffusjon endothiapepsin
Optimalisering av veksten av endothiapepsinkrystaller for serielle krystallografieksperimenter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Beale, J. H., Marsh, M. E.… More

Beale, J. H., Marsh, M. E. Optimizing the Growth of Endothiapepsin Crystals for Serial Crystallography Experiments. J. Vis. Exp. (168), e61896, doi:10.3791/61896 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter