Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Optimering af væksten af endothiapepsinkrystaller til serielle krystallografieksperimenter

Published: February 4, 2021 doi: 10.3791/61896
Automatic Translation
1, 1
1Swiss Light Source, Paul Scherrer Institut

Summary

Formålet med denne artikel er at give seeren en solid forståelse af, hvordan man omdanner deres lille volumen, dampdiffusionsprotokol til dyrkning af store, enkeltproteinkrystaller til en storvolumenbatchmikrokrystallisationsmetode til seriel krystallografi.

Abstract

Her præsenteres en protokol for at lette dannelsen af store mængder (> 100 μL) mikrokrystallinske opslæmninger, der er egnede til serielle krystallografieksperimenter ved både synkrotroner og XFEL'er. Metoden er baseret på en forståelse af proteinkrystalfasediagrammet, og hvordan denne viden kan udnyttes. Metoden er opdelt i tre faser: (1) optimering af krystalmorfologi, (2) overgang til batch og (3) skalering. Trin 1 indebærer at finde godt diffrakterende, enkelte krystaller, forhåbentlig men ikke nødvendigvis, der præsenterer i en terninglignende morfologi. I trin 2 optimeres trin 1-tilstanden efter krystalvæksttid. Denne strategi kan omdanne krystaller dyrket ved dampdiffusion til batch. Når krystalvækst kan forekomme inden for ca. 24 timer, kan et morfogram af protein- og bundfældningsblandingen plottes og anvendes som grundlag for en skaleringsstrategi (trin 3). Når krystaller kan dyrkes i batch, kan skalering forsøges, og krystalstørrelsen og koncentrationen optimeres, når volumenet øges. Endothiapepsin er blevet anvendt som demonstrationsprotein til denne protokol. Nogle af de præsenterede beslutninger er specifikke for endothiapepsin. Det er dog håbet, at den måde, de er blevet anvendt på, vil inspirere til en måde at tænke på denne procedure, som andre kan tilpasse til deres egne projekter.

Introduction

Rumtemperatur (RT) makromolekylær krystallografi er populær igen inden for strukturbiologi samfund. Udviklingen af røntgenfri elektronlaser (XFEL) lyskilder har ansporet udviklingen af RT-prøveleveringsmetoder 1,2,3,4, og disse metoder er nu blevet anvendt på synkrotroner 5,6,7,8. RT-metoder åbner ikke kun muligheden for pumpesondeeksperimentelle strageties 9,10,11,12, men der er også stigende beviser for, at de fremmer alternative konformationstilstande inden for proteiner 13,14,15,16,17.

Hovedårsagen til, at kryo-metoder fik trækkraft over RT-tilgange i slutningen af 1990'erne, var imidlertid opbremsningen af strålingsskader ved krystaltemperaturerunder nul 18. Kryo-metoder19 begyndte at muliggøre indsamling af et komplet datasæt fra en enkelt proteinkrystal. Moderne RT-metoder ved XFELs og synkrotroner løste problemet med enkeltkrystalstrålingsskader ved udvikling af hurtige (> 100 Hz) krystalleveringsstrategier 1,2,3,4. Disse metoder giver mulighed for indsamling af et komplet datasæt fra tusindvis af individuelt eksponerede krystaller. Disse RT-leveringsmetoder kræver derfor produktion af store mængder opløsninger indeholdende homogene mikrokrystaller (> 100 μL < 50 μm krystaller). Men da kryometoder har tendens til kun at kræve enkeltkrystaller, er metoder til at skabe sådanne mikrokrystallinske opslæmninger i øjeblikket ikke allestedsnærværende på tværs af proteinkrystallografilaboratorier.

Der er eksempler i litteraturen på, hvordan man gør dele af mikrokrystallisationsoptimeringsproceduren for serielle krystallografiprøver. Her skal der skelnes mellem membran og opløselige proteiner. Protokoller til optimering af væksten af mikromembranproteinkrystaller dyrket i monoolein (eller et andet lipid) til lipidisk kubisk fase (LCP) er blevet godt beskrevet20,21,22. Imidlertid mangler der generelt metoder til mikrokrystallisation af opløselige proteiner, herunder membranproteiner dyrket under ikke-LCP-betingelser. Tidligere undersøgelser har fokuseret på specifikke dele af processen, såsom mikrokrystalscreening 23,24, forbedring af kimdannelse24 og skalering ved hjælp af fri grænsefladediffusion 25, men ikke en komplet metode.

Imidlertid blev der for nylig beskreveten metode 26 , der forsøger at tilbyde en komplet protokol. Ligesom mange aspekter af proteinkrystallografi er det ikke nyt. Mange af de foreslåede ideer blev allerede beskrevet af Rayment (2002)27. Metoden har til formål at vise krystallografer, hvordan man udfører konverteringen fra en enkelt krystal dyrket ved hjælp af dampdiffusion til en batchmetode til dyrkning af tusindvis af mikrokrystaller. Metoden fokuserer på dampdiffusion som et fælles udgangspunkt, da 95% af alle Protein Data Bank (PDB) aflejringer kommer fra krystaller dyrket i dampdiffusionsplader26. Dampdiffusion er imidlertid ikke den ideelle metode til mikrokrystallisation26, så der beskrives en metode til at konvertere dampdiffusion til batchkrystallisation. Når krystaller kan dyrkes i batch, bliver skaleringsruter til større mængder mere praktiske. I betragtning af proteinkrystalliseringens luner vil forfatterne understrege, at denne metode ikke er fejlsikker. Protokollen skal dog i det mindste give et indblik i et proteins 'krystalliseringsrum'.

Denne metode er afhængig af proteinkrystalliseringsfasediagrammet, og hvordan en forståelse af dette diagram kan fungere som vejledning under mikrokrystallisationsoptimering. Et proteinfasediagram er almindeligvis afbildet som et x/y-plot med udfældnings- og proteinkoncentrationer på henholdsvis x- og y-akserne (figur 1A). Fra punktet rent vand (nederste venstre hjørne - figur 1A) øges koncentrationen af både protein og bundfald, indtil opløselighedslinjen er nået. Opløselighedslinjen markerer overmætningspunktet (lilla linje - figur 1A). Når et protein er overmættet, bliver opløsningen termodynamisk ustabil og begynder at adskille sig i to faser: 'proteinrig' og en stabil mættet opløsning. Denne adskillelse kan forekomme hvor som helst uden for opløselighedslinjen, og dens kinetik afhænger af proteinets egenskaber og opløsningens komponenter.

Når protein- og bundfaldkoncentrationerne er for store, nedbrydes proteinet ustabilt ud af opløsningen og resulterer i amorft bundfald (lyserødt område - figur 1A). Imidlertid kan ordnet faseadskillelse forekomme i kimdannelsesområdet [se Garcia-Ruiz (2003) 28 for detaljeret beskrivelse], og krystalnukleanter har tilbøjelighed til at danne (grøn region - figur 1A). Nukleation og vækst fjerner protein fra opløsningen og flytter dråben ind i det metastabile område, hvor væksten kan fortsætte, indtil opløselighedslinjen er nået [se McPherson og Kuznetsov (2014) 29 for detaljeret diskussion]. Diagrammet er for langt de fleste krystalliseringsbetingelser en grov oversimplificering30. Uanset dette er diagrammet dog stadig af stor nytte for mikrokrystallografer, da kortlægningen af diagrammet gør det muligt at bestemme opløselighedslinjen og kinetikken for kimdannelse.

Med hensyn til at skabe mikrokrystaller er de to faktorer under krystallisering, der skal optimeres, antallet af krystaller (Xn) og deres gennemsnitlige, længste dimension (Xs). X n vil være proportional med antallet af kimdannelseshændelser (n ) (Eq. 1).

Equation 1     Eq. 1

X s er proportional med koncentrationen af frit protein over opløselighedslinjen (Ps) divideret med Xn (Eq. 2).

Equation 2     Eq. 2

I en perfekt situation ville enhver kimdannelsesbegivenhed give en mulig krystal, og hver eneste af disse krystaller ville have lige adgang til det tilgængelige protein i opløsning. Figur 2 er en grafisk repræsentation fra et ideelt scenario af forholdet mellem Xn og Xs. I praksis er den vigtigste kontrol, en krystallograf har over Xn og Xs , ved at påvirke mængden af kimdannelse eller ved tilsætning af frøkrystaller. Mikrokrystallografen skal bedømme, hvordan man øger Xn , således at der både kan skabes en passende krystalkoncentration og krystalstørrelse.

De fleste krystalliseringsteknikker kræver en "overgangsperiode" (figur 1B). For eksempel i et dampdiffusionseksperiment, ved blanding af protein- og bundfældningsopløsningerne, vil koncentrationerne af hver ændre sig, når dråben udligner sig med brøndopløsningen. Man håber, at disse ændringer gradvist vil overføre faldet til kimdannelseszonen, hvor tilbøjeligheden til krystallisation vil stige. Når krystaller begynder at nukleere og vokse, vil mængden af protein i opløsning begynde at falde, hvilket reducerer sandsynligheden for yderligere kimdannelse. Den ultimative mængde kimdannelse vil være protein- og tilstandsspecifik og også afhængig af dybden af penetration af i nukleationszonen. I betragtning af den begrænsede kimdannelseszonepenetration af metoder, der kræver et overgangstrin, vil kimdannelsesniveauet i sidste ende være begrænset til kimdannelseshastigheden ved metastabil-nukleationsregionsgrænsen.

På grund af vigtigheden af at kunne forbedre kimdannelsesniveauet for en mikrokrystallograf er det vigtigt at flytte til en batchkrystallisationsmetode. Batch kan drage større fordel af hele nukleationsområdet (figur 1C). I batchmetoder er ideen at blande proteinet og bundfaldet sammen, således at der skabes en overmættet opløsning uden behov for ændringer i komponentkoncentrationer. Nukleation bør være mulig umiddelbart efter blanding. Batchmetoder tillader derfor, at hele kimdannelseszonen teoretisk nås. Enhver stigning i kimdannelseskinetik ud over metastabil-nukleationsgrænsen kan derefter udnyttes.

Hvis det basale niveau af krystalkimdannelse ikke er nok til at generere et stort Xn, kan mikrosåningsmetoder anvendes. Ved mikrosåning brydes forvoksede krystaller op for at skabe en opslæmning af krystallinske fragmenter, der kan fungere som et stillads for frisk krystalvækst31,32. Mikrosåning har været meget udbredt i seriel krystallografisk prøveforberedelse som en måde at øge Xn uden behov for at øge krystalkimdannelsen (figur 1C).

Overgangen fra dampdiffusion til batch kan visualiseres på et fasediagram som at flytte det eksperimentelle udgangspunkt fra enten de ikke-overmættede eller metastabile regioner til kimdannelseszonen. Dette kan gøres ved at øge protein- og/eller udfældningskoncentrationerne og/eller forholdet mellem de to inden for faldet (figur 1D) og observere, hvilke betingelser der giver krystaller, der viser sig hurtigt (< 24 timer)26. Fuldstændig dampdiffusionsdråbeligevægt kan tage dage eller uger33. Derfor, ved at lede efter betingelser, der viser hurtigt fremkomne krystaller, kan batchbetingelser findes uden at skulle flytte til alternative krystalliseringsscreeningsformater såsom mikrobatch34,35,36,37.

Når kimdannelseszonen er fundet, er der fundet en batchtilstand, og der kan oprettes et morfogram - her et groft fasediagram. Morfogrammet er af stor nytte, når man overvejer, om man skal bruge en podet batch eller lige batchprotokol. Ved at plotte Xn som funktion af protein- og bundfældningskoncentrationen kan der foretages en vurdering af kimdannelseskinetikken26. Hvis X n forbliver lav over hele kimdannelsesområdet, kan det være nødvendigt med frøbatch for at gøre Xn stor nok til at begrænse krystalvækst. Denne vurdering er det første skridt i processen med at skalere til større mængder (> 100 μL).

Denne metode blev designet således, at den kunne udføres i de fleste krystallisationslaboratorier ved hjælp af standard dampdiffusionskrystallisationsudstyr. Der er også udført mange undersøgelser, som beskriver teknikker til at lette mange dele af denne proces, hvis udstyret er tilgængeligt. Disse omfatter, men er ikke begrænset til, dynamisk lysspredning (DLS) 25,27, ikke-lineær billeddannelse 20,24,25, pulverdiffraktion 20,24,27 og elektronmikroskopi 26 [se Cheng et al. (2020) 40 for en god gennemgang].

Formålet med dette arbejde er at give en visuel demonstration af metoden til overgang fra lille volumen (< 500 nL) dampdiffusionskrystallisation til stor volumen (> 100 μL) batchkrystallisering. Endothiapepsin fra Cryphonectria parasitica er blevet brugt som et eksempelsystem til demonstration af denne oversættelse. Den type eksperiment og prøveleveringsmetode, som mikrokrystallerne er nødvendige for, vil påvirke det ideelleX-s output26. For blandingsforsøg, der kræver en millisekundtidsopløsning41 eller gasdynamiske virtuelle dyser42, kan en endelig Xs på < 5 μm være ønskelig. I dette tilfælde var målet at producere proteinkrystaller, der diffrakterer til ca. 1,5 Å, til et fotonaktiveret pumpesondeeksperiment og ved hjælp af en leveringsmetode med fast mål.

For at give en illustration af prøvekravene til et sådant serielt krystallografieksperiment ved anvendelse af endothiapepsin viser tabel 1 de eksperimentelle parametre for et hypotetisk eksperiment. Eksempeloplysningerne var baseret på den protokol, der er beskrevet nedenfor. I betragtning af nogle konservative skøn over hitrater og dataindsamlingskrav er 50 mg det samlede prøveforbrugsestimat for hele eksperimentet.

Figur 3 viser et rutediagram over den komplette optimeringsproces fra indledende dampdiffusionskrystallisation i lille volumen til storskalabatch. For de fleste serielle krystallografiprojekter begynder denne protokol på trin 2: 'overgang til batch', da målproteinet allerede vil være krystalliseret. Trin 1 er dog medtaget for fuldstændighed og for at minde læserne om dens betydning. At finde en tilstand, der giver anledning til en godt diffrakterende, enkelt, stor krystal, er det bedste udgangspunkt for mikrokrystaloptimering. I trin 2 kan denne tilstand derefter optimeres fra dampdiffusion til batch, og et morfogram af nukleations- og metastabile regioner kan plottes. Når dette er gjort, kan batchbetingelsen skaleres til større mængder i trin 3. Ved afslutningen af rutediagrammet vil en krystallograf have skabt en gentagelig, stor volumen (> 100 μL), mikrokrystallisation, batchprotokol for endothiapepsin. Denne metode kan derefter anvendes på deres særlige protein af interesse.

Protocol

BEMÆRK: Alle 96-brønds siddedråbekrystalliseringseksperimenter blev opsat ved hjælp af enten 2- eller 3-dråbeplader. En væskehåndteringsrobot og et krystalliseringskamera / hotel blev brugt til at lette forberedelsen og overvågningen af alle 96-brønds skærme. Alle reagenskoncentrationer til krystallisationsforsøg angives ved deres startkoncentrationer før blanding.

1. Optimering af krystalmorfologi

BEMÆRK: Trin 1.1.1. og 1.1.6. Beskriv hvordan endothiapepsin krystallisationsbetingelser blev fundet, og hvordan disse betingelser blev optimeret til at finde en enkelt tilstand, der gav enkelte, godt diffrakterende krystaller.

  1. Sparsom-matrix optimering
    1. Forbered frisk endothiapepsinopløsning.
      BEMÆRK: Endothiapepsin, når det anskaffes som Superan 600, skal bufferoverføres fra sin opbevaringsopløsning og koncentreres.
      1. Der fremstilles 3 liter 0,1 M Naacetat-pH 4,6 ved 4 °C.
      2. Skær 20 cm dialyseslangen og vask kortvarigt i bufferen. Den ene ende af slangen forsegles ved hjælp af en klemme, 50 ml endothiapepsinopløsning anbringes i slangen, og derefter forsegles den anden ende.
      3. Opløsningen skal dialyseres i mindst 4 timer (eller natten over) ved 4 °C i 1 liter Naacetatbuffer. På grund af komponenterne i opbevaringsbufferen vil opløsningen i dialyseposen nu være ca. 100 ml.
      4. Dialyseposen indeholdende endothiapepsin overføres til en frisk liter på 4 °C, 0,1 M Naacetat pH 4,6. Dette trin gentages endnu en gang, således at den oprindelige buffer er blevet fortyndet 2000x mod Naacetatet.
      5. Endothiapepsin vil nu være på ca. 10 mg / ml. Der koncentreres til 100 mg/ml ved hjælp af en 10 kDa centrifugalkoncentrator og en centrifuge.
      6. Endothiapepsinopløsningen flashafkøles i flydende nitrogen i 50 μL alikvoter og opbevares ved -80 °C.
    2. Forbered en PACT Premier 96-brønds sparsommatrixskærm.
      1. Brug en væskehåndteringsrobot til at dispensere 100 nL 70 mg/ml endothiapepsin og 100 nL brøndopløsning i en enkelt underbrønd pr. brønd. Bland proteinet og brøndopløsningen 3 gange efter tilsætning af krystallisationsbufferen.
      2. Pladen forsegles og henstår i 28 dage ved 20 °C, idet der tages billeder hver dag i den første uge og derefter hver uge i 4 uger.
    3. Sparsom-matrix analyse
      1. Identificer hits, der producerer enkelte endothiapepsinkrystaller. Fra PACT-skærmen voksede tilstande, der indeholdtMgCl2 , som singletons snarere end nåleklynger.
    4. Sparsom-matrix optimering
      1. Fra MgCl2 , der indeholder tilstande identificeret i trin 1.1.3.1, oprettes en 96-brønds skærm, der tilfældigt kombinerer og varierer de forskellige brøndkomponenter.
      2. Brug en væskehåndteringsrobot til at dispensere 100 nL 70 mg/ml endothiapepsin og 100 nL brøndopløsning i en enkelt underbrønd pr. brønd. Bland proteinet og brøndopløsningen 3 gange efter tilsætning af krystallisationsbufferen.
      3. Pladen forsegles og henstår i 28 dage ved 20 °C, idet der tages billeder hver dag i den første uge og derefter hver uge i 4 uger.
    5. Optimering analyse
      1. Ved hjælp af passende regnearkssoftware rangordnes krystalliseringsbetingelserne, der giver anledning til krystaller baseret på krystalkvalitet og nedbørsniveau, henholdsvis ingen krystaller (0) til ideel (5) og lav (0) til høj (5). Med hensyn til krystalkvalitet er de brede kriterier enkeltkrystaller med en kasselignende morfologi.
      2. Udfør en Pearsons korrelationsanalyse mellem indholdet af krystalliseringstilstanden og krystalmængden og nedbørsniveauet.
      3. Plot disse data som et varmekort. Se efter komponenter og betingelser, der var korreleret med de foretrukne resultater.
    6. Diffraktionsanalyse.
      1. Bekræft, at krystallerne dyrket fra de identificerede betingelser i trin 1.1.5 er egnede til seriel krystallografi ved at udføre et røntgendiffraktionseksperiment.
      2. Læg en prøve af endothiapepsinkrystallerne fra hver af de identificerede betingelser på understøtninger, der muliggør dataindsamling ved enten 100 eller 293 K, og udfør et røntgendiffraktionseksperiment. Hvis du arbejder under kryo, skal du bruge 25% ethylenglycol som kryobeskyttelsesmiddel.
      3. Behandl disse data via en passende softwarepakke. Endothiapepsinkrystaller bør diffraktere til over 1,5 Å. Kontroller for venskabsbysamarbejde, da tvillingkrystaller kan komplicere seriel krystallografisk databehandling betydeligt.
      4. Hvis krystaller er singletoner og diffrakterer til 1,5 Å, fortsæt til trin 2. Hvis ikke, skal du gå tilbage til trin 1.1.2 og prøve flere sparsomme matrixskærme for at identificere lovende forhold. Efter analyserne i trin 1.1.5. og 1.1.6., en krystallisationstilstand på 25% (w/v) PEG 6.000, 0,1 M Tris-HCl pH 7,0 og 0,15 MMgCl2 burde have været fundet som det omtrentlige ideal.

2. Overgang til batch

  1. Morphogram eksperiment
    1. Opret en mikrokrystalfrøbestand.
      BEMÆRK: Det er bedste praksis, når man laver frøstammer, at fremstille frøene af krystaller, der er specielt dyrket til opgaven. Dette hjælper i høj grad med reproducerbarhed. Andre ideer, der præsenteres i trin 2.1.1.1 til 2.1.1.11, er altid at bruge krystallerne dyrket fra et standardantal brønde - her 5 - og alikvote lagrene, når de er lavet for at negere fryse-optøningscyklusser.
      1. Der fremstilles en krystallisationsplade med 96 brønde med huller, der indeholder krystallisationsbufferen: 25% (w/v) PEG 6.000, 0,1 M Tris-HCl pH 7,0 og 0,15 M MgCl2.
      2. Ved hjælp af en væskehåndteringsrobot dispenseres 200 nL optøet 70 mg/ml endothiapepsin og 200 nL brøndopløsning i en enkelt underbrønd pr. brønd. Bland proteinet og brøndopløsningen 3 gange efter tilsætning af krystallisationsbufferen.
      3. Forsegl pladen og lad den stå i 24 timer.
      4. Fyld et 1,5 ml centrifugerør med 250 μL krystallisationsbuffer og 10-15 1 mm glasperler. Lad centrifugeglasset ligge på is for at afkøle i 5-10 min.
      5. Vælg 5 brønde med krystaller, åbn brøndene med en skalpel, og knus krystallerne i brøndene ved hjælp af en pipettespids.
      6. Der suges 1 μL buffer ud af det isede centrifugerør og anvendes til homogenisering af den knuste krystalopslæmning. Når den er homogen, aspireres hele gyllen og opsamles i det afkølede centrifugerør.
      7. Gentag trin 2.1.2.6 for hver af de 5 underhuller.
      8. Centrifugerøret indeholdende bufferen, poolede opslæmninger og perler ved 1000 o/min i 30 s.
      9. Sæt centrifugerøret tilbage til is i 30 sekunder.
      10. Gentag trin 2.1.2.8 og 2.1.2.9 to gange mere.
      11. Frøstammen er nu klar og kan omdannes til 10 μL partier og opbevares ved -20 °C.
    2. Udfør morfogrameksperiment.
      1. Forbered en gitterskærm med 2 dråber og 96 brønde. Koncentrationen af PEG 6.000 varieres fra 5 til 40% (w/v) langs pladekolonnerne, idet bufferen og saltet holdes på henholdsvis 0,1 M Tris-HCl pH 7,0 og 0,15 MMgCl2.
      2. Der fremstilles en sekventiel fortynding af endothiapepsin i 0,1 M Naacetat-pH 4,6 fra 100 til 12,5 mg/ml over 8 trin. En anden koncentration af endothiapepsin vil blive anvendt til hver række af pladen.
      3. Ved hjælp af en væskehåndteringsrobot dispenseres 150 nL endothiapepsin i både underhul 1 og 2. I underbrønd 1 dispenseres 150 nL af brøndopløsningen. I underbrønd 2 multiaspireres 50 nL optøet frøbestand og 100 nL brøndopløsning, og begge dele hældes derefter i proteinopløsningen. Opløsningerne blandes 3 gange efter tilsætning af krystallisationsbufferen.
      4. Pladen forsegles og lades stå ved 20 °C og tager billeder hver 0., 3., 6., 12., 18., 24. time, derefter hver dag i den første uge og hver uge i de næste fire. Hvis automatisk billeddannelse ikke er mulig, skal du ikke bekymre dig om timebilleddannelsen på dag 1.
  2. Morphogram analyse
    1. Når du ser på billederne taget efter 24 timer, skal du estimere antallet af krystaller, der er til stede i hver brønd, og registrere disse estimater i arket "morfogramgenerator". Disse skøn behøver ikke at være præcise. Individuelt at tælle tusindvis af mikrokrystaller, hvis de er til stede, er ikke praktisk eller nødvendigt. Prøv først og fremmest at sikre, at estimaterne er konsistente over hele pladen.
      BEMÆRK: 24 timers reglen var baseret på observationerne i Beale et al . (2019)26. Dampdiffusionskrystallisationsbetingelser kan tage dage eller uger at ekvilibrere. Krystaller, der vises hurtigt, er mere tilbøjelige til at være vokset via en batchproces snarere end ved gradvis ligevægt af dråbekomponenterne. 24 timers kriteriet er derfor noget vilkårligt, og en nøjagtig afskæringstid mellem et batch- og dampdiffusionseksperiment vil afhænge af den specifikke blanding af tilstanden [se Beale et al. (2019) 26 for yderligere oplysninger].
    2. Indtast startkoncentrationerne af endothiapepsin og PEG 6.000 i de angivne felter.
    3. Arbejdsarket plotter automatisk resultaterne i det traditionelle fasediagramformat med bundfældnings- og proteinkoncentration på henholdsvis x- og y-akserne. Brøndforhold, der kun giver anledning til krystaller i deres frøede dråber, angiver diagrammets metastabile område (gennemsigtig blå), mens betingelser, der har krystaller i både de frøede og ikke-frøede dråber, angiver kimdannelseszonen (fast grøn).
      BEMÆRK: Ideelt set bør størstedelen af kimdannelseszonen være til stede på diagrammet (dvs. der er nogle klare brønde i bunden af diagrammet, og noget bundfald skal være synligt ved høje protein- og bundfaldskoncentrationer). Hvis dette ikke er tilfældet, skal du måske gentage eksperimentet, men øge protein- og/eller udfældningskoncentrationen (hvis muligt).
    4. Hvis krystal er dukket op på mindre end 24 timer, fortsættes til trin 2.3.1. Hvis ikke, skal du fortsætte til trin 2.4 og fortsætte med at optimere mod batch.
  3. Krystal analyse
    1. Som sagt i slutningen af trin 1, før du går videre til næste trin, skal du sikre dig, at disse krystaller har den ønskede morfologi og diffraktionskvalitet. Med hensyn til morfologi, er krystallerne observerbart usammenflettede og danner som singletons snarere end nålekuglelignende eller viftelignende strukturer? Med hensyn til diffraktion skal du indsamle diffraktionsdata fra krystallerne, hvis det er muligt. Hvis disse krystaller ikke diffrakterer, er det usandsynligt, at krystallerne dyrket i et større volumen vil diffraktere.
    2. Indlæs en prøve af endothiapepsinkrystallerne fra morfogrameksperimentet på understøtninger, der muliggør dataindsamling ved enten 100 eller 293 K, og udfør et røntgendiffraktionseksperiment. Hvis du arbejder under kryo, skal du bruge 25% ethylenglycol som kryobeskyttelsesmiddel.
    3. Behandl disse data via en passende softwarepakke. Endothiapepsinkrystaller bør diffraktere til over 1,5 Å. På tværs af prøven af krystaller skal du observere cellestørrelsen, det samlede antal observationer og mosaikiteten; Disse målinger vil give en indikation af homogeniteten af de diffrakterende krystaller.
    4. Hvis krystalmorfologien og diffraktionskvaliteten er tilstrækkelig, skal du fortsætte til trin 3.
  4. Optimer krystalvæksttiden.
    BEMÆRK: Morfogramanalysen (trin 2.2) vil have givet en indikation af krystallisationsudgangspunktet (dvs. det område af fasediagrammet, hvor dråben er placeret, når bundfældnings- og proteinopløsningerne blev blandet). Er faldet i det metastabile område eller under opløselighedslinjen? Batchkrystallisation begynder i nukleationszonen (figur 1C). Målet med dette trin er at flytte dette udgangspunkt fra enten under opløselighedslinjen eller det metastabile område ind i nukleationszonen (figur 1D). Hvis frø-dråber fra trin 2.2. har givet krystaller hurtigt, er dette en indikation af, at dråbeblandingen allerede er i det metastabile område, hvis ikke, så er det sandsynligt, at dråben ikke er overmættet.
    1. Optimering af krystalvæksttid.
      1. Brug samme skærm som i trin 2.1.3 til at forberede et 96-brønds dampdiffusionskrystallisationseksperiment i en 3-dråbeplade.
      2. Forøg startproteinkoncentrationen af endothiapepsin på y-aksen (dvs. koncentrer proteinet yderligere, måske 120 mg / ml for endothiapepsin).
      3. Der udføres en seriel fortynding som i trin 2.1.3.2, således at hver række på pladen indeholder en sekventielt lavere proteinkoncentration.
      4. Brug forskellige dråbeforhold i hver af de tre dråber på pladen: 1: 1, 1: 2 og 2: 1, protein: bundfald.
      5. Se eller billede pladen den første dag kl. 0, 3, 6, 12, 18, 24 timer og derefter hver dag i den første uge og hver uge i de næste fire. Hvis automatisk billeddannelse ikke er mulig, skal du ikke bekymre dig om timebilleddannelsen på dag 1.
      6. Identificer dråber, der producerer de hurtigst fremkomne krystaller, og gør disse til udgangspunktet for gentagne optimeringer, indtil krystalvækst sker inden for 24 timer.
      7. Når en hurtigt forekommende krystaltilstand er blevet identificeret, skal du vende tilbage til trin 2.1 for at plotte morfogrammet som en optakt til at begynde skalering.

3. Skalering

  1. Rang skalering ruter. På dette stadium er det ikke nødvendigt at beslutte sig for en enkelt skaleringsrute, kun for at identificere og rangere mulighederne, så de kan udforskes igen. Da volumenet af batchblandingen øges under skaleringsproceduren, vil der forekomme ændringer i kimdannelseshastigheden og rækkevidden af krystalstørrelser. Disse kan dog overvindes ved omhyggelig justering af komponentkoncentrationer, da det skalerede volumen øges.
    BEMÆRK: Trin 3.1.1 og 3.1.2 beskriver, hvordan man ud fra morfogrammet kan se, om en batch- eller seeded-batch-protokol er mere hensigtsmæssig.
    1. Lige batch-protokol
      1. Er Xn i kimdannelseszonen proportional med protein- og/eller udfældningskoncentrationen? Dvs. stiger X n som funktion af enten bundfældnings- og/eller proteinkoncentration? -Ja? Gå til trin 3.1.1.2. Nej? Gå til trin 3.1.2. 
      2. Find betingelser, der giver krystaller af den krævede størrelse, og gå til trin 3.2.
    2. Protokol for seedet batch
      1. Er Xn fladt over nukleationszonen? Dvs. Xn øges ikke som funktion af hverken bundfældnings- og/eller proteinkoncentration.
      2. Find frøede forhold, der giver krystaller af den krævede størrelse, og gå til trin 3.2. Hvis alle krystaller er for store - gå til trin 3.1.2.3.
      3. Morfogramforsøget gentages (trin 2.1), men denne gang øges koncentrationen af den frøbestand, der anvendes i de såede brønde. Frøbestanden kan øges ved at bruge flere krystaller i sin skabelse. I stedet for 5 brønde i trin 2.1.1.5 skal du f.eks. bruge 10 huller.
      4. Se eller billede pladen over de første 0, 3, 6, 12, 18, 24 timer.
      5. Xn skulle være steget, ogX'erne faldt i de seedede dråber. Gentag denne cyklus, hvis der er behov for mindre krystaller, og følg derefter en podet batchprotokol.
  2. Gradvis skalering
    1. Skalering i 96-brøndplader. Fra endothiapepsinmorfogrammet blev en lige batchmetode ved anvendelse af krystalliseringsbetingelsen 0,1 M Tris-HCl pH 7,0, 0,15 MMgCl2 og 30% (w / v) PEG 6.000 oprindeligt valgt til skalering. 100 mg/ml endothiapepsin blandet med krystallisationsbufferen i forholdet 1:1.
      1. Forbered 2-3 brønde i en 2-brønds 96-brønds siddedråbeplade med 100 μL 0,1 M Tris-HCl pH 7,0, 0,15 M MgCl2 og 30% (w/v) PEG 6.000.
      2. Brug frisk optøet 100 mg/ml endothiapepsinopløsning, uddel 0,5 μL protein og 0,5 μL fældningsmiddel pr. hul, forsegl og opbevar ved 20 °C.
      3. Se eller billede pladen over de første 0, 3, 6, 12, 18, 24 timer. Bemærk eventuelle ændringer i området X,s og X, n.
      4. Hvis der er sket ændringer, gentages trin 3.2.1.1 til 3.2.1.2, men koncentrationen af protein, bundfald og/eller frø øges eller mindskes for at genoprette eventuelle ændringer i området Xs og Xn.
      5. Når området Xs og Xn er acceptable, fortsættes til trin 3.2.2.
    2. Skalering i 24-brønds hængende dråbeplader
      1. Forbered en enkelt brønd med en 24-brønds hængende dråbeplade ved at smøre brøndens kanter med vakuumfedt.
      2. Forbered 0,5 ml 0,1 M Tris-HCl pH 7,0, 0,15 MMgCl2 og 30% (w/v) PEG 6.000, og fyld det smurte hul.
      3. Ved hjælp af frisk optøet endothiapepsinopløsning pipetteres 1 μL protein på overfladen af et glasdæksel. Pipette 1 μL krystallisationsbuffer på proteindråben og blandes ved hjælp af pipetten.
      4. Se eller billede pladen over de første 0, 3, 6, 12, 24 timer. Bemærk eventuelle ændringer i området X,s og X, n.
      5. Hvis der er sket ændringer, gentages trin 3.2.2.1 til 3.2.2.4, men koncentrationen af protein, bundfald og/eller frø øges eller mindskes for at genoprette eventuelle ændringer i området Xs og Xn.
      6. Når/hvis intervallet Xs og Xn kan accepteres, fortsættes til trin 3.2.2.7.
      7. Trin 3.2.2.1 til 3.2.2.5 gentages, idet eksperimentets samlede volumen gradvis øges til 10 μl.
      8. Efter et volumen på 10 μl eller derover fortsættes centrifugeglassene i trin 3.2.3.
    3. Skalering i centrifugerør
      BEMÆRK: Forfiningen af endothiapepsinbatchtilstanden skete hovedsageligt ved 200 μL volumener (se Resultater, skalering). Processen begyndte med en krystallisationstilstand på 0,1 M Tris-HCl pH 7,0, 0,15 MMgCl2 og 30% (w/v) PEG 6.000. PEG-koncentrationen ændrede sig dog i sidste ende til 40% (w/v). Frø var også nødvendige for at kontrollere Xn, og for at forhindre krystaller i at vokse for store, måtte krystalvækst slukkes. Trin 3.2.3.1 til 3.2.3.7 beskriver processen med tilstandsoptimering. Trin 3.2.4. Beskriv den endelige batchprotokol.
      1. Forbered 1 ml krystallisationsbuffer: 0,1 M Tris-HCl pH 7,0, 0,15 MMgCl2 og 30% (w/v) PEG 6.000.
      2. Ved hjælp af frisk optøet 100 mg / ml endothiapepsin tilsættes 25 μL protein til et 1,5 ml centrifugerør.
      3. Bland krystallisationsbufferen grundigt med proteinopløsningen i forholdet 1:1 med en pipettespids. Røret anbringes i en revolver/rotator med høj omrøring ved 20 °C.
      4. Tag regelmæssige (5, 10, 30, 60 min, 2, 5, 10, 24 timer) 2,5 μL alikvoter og se i et hæmocytometer. Optag Xn og Xs rækkevidde.
      5. Hvis der er sket ændringer, gentages trin 3.2.3.1. til 3.2.3.4. men øg eller formindsk protein-, bundfældnings- og/eller frøkoncentrationen for at genoprette eventuelle ændringer i området Xs og Xn
      6. Når Xs- og Xn-intervallet er acceptabelt, fortsættes til trin 3.2.3.7.
      7. Trin 3.2.2.1 til 3.2.2.5 gentages, idet eksperimentets samlede volumen gradvist øges til 200 μL eller derover efter behov.
    4. Endelig seedet-batch-protokol
      1. Forbered frøbestand.
        1. Forbered 2 ml krystallisationsbuffer: 0,1 M Tris-HCl pH 7,0, 0,15 MMgCl2 og 40% (w / v) PEG 6.000.
        2. Brug nyoptøet 100 mg/ml endothiapepsin til at tilsætte 100 μL protein til et 1,5 ml centrifugerør.
        3. Bland krystallisationsbufferen grundigt med proteinopløsningen i forholdet 1:1 med en pipettespids. Anbring røret i en revolver/rotator med høj omrøring ved 20 °C i 24 timer for at lade 50 μm krystaller vokse.
        4. Tilsæt 10-15 1 mm glasperler til 50 μm krystalopslæmningen.
        5. Vortex centrifugerøret indeholdende gylle og perler ved 1000 o / min i 30 s.
        6. Sæt centrifugerøret tilbage til is i 30 sekunder.
        7. Gentag trin 3.2.4.1.5 og 3.2.4.1.6 10 gange mere.
        8. Dette er nu 200 μL af en 1x frøbestand. Frøstammen fortyndes 10x ved tilsætning af 1,8 ml krystallisationsbuffer. 10x frøstammen sorteres i partier på 50 μL og opbevares ved -20 °C.
      2. Seeded-batch protokol.
        1. Forbered krystallisationsbuffer: 0,1 M Tris-HCl pH 7,0, 0,15 MMgCl2 og 40% (w/v) PEG 6.000.
        2. I et centrifugeglas blandes 100 μL krystallisationsbuffer med 50 μL frisk optøet 10x frøstamme.
        3. Brug nyoptøet 100 mg/ml endothiapepsin til at tilsætte 150 μL protein til et 1,5 ml centrifugerør.
        4. Krystallisationsbuffer/frøblandingen blandes grundigt med endothiapepsinopløsningen med en pipettespids, og røret anbringes i en revolver/rotator under høj omrøring ved 20 °C.
        5. Overvåg krystalliseringen ved at tage regelmæssige 2,5 μL alikvoter og se krystallerne i et hæmocytometer. Optag Xn og Xs rækkevidde.
        6. Efter ca. 80 min, når krystallerne har nået en Xs på 15 μm, slukkes reaktionen ved tilsætning af 150 μL 0,05 M Naacetat pH 4,6, 0,05 M Tris-HCl pH 7,0, 0,075 MMgCl2 og 20% (w/v) PEG 6.000 (en opløsning sammensat af endothiapepsinbuffer og krystallisationsbuffer, blandet 1:1).
        7. Opbevar krystallerne ved 20 °C.
      3. Har protokollen produceret et acceptabelt krystalstørrelsesområde og antal for det påtænkte eksperiment? Ja - UDFØRT - Nej - vend tilbage til trin 3.1. og prøv en alternativ skaleringsindstilling. For eksempel kan et andet protein: bundfældningsforhold være muligt eller tilføje frø, hvis dette ikke blev gjort tidligere. Når disse alle er opbrugt, kan det være nødvendigt at finde en ny tilstand på trin 1.

Representative Results

Optimering af krystalmorfologi
Trin 1, optimering af krystalmorfologi, er inkluderet for at minde læseren om dens betydning. Det kan være muligt at skabe perfekte mikrokrystaller fra nålekugler med dårlig diffraktion; Forfatterne vil dog foreslå, at det er bedre at optimere de to separat. Find først betingelser, der giver anledning til godt diffrakterende, enkelt krystal via dampdiffusion, og konverter derefter disse betingelser til batch i stedet for at forsøge at kombinere de to trin sammen. Det er ikke nødvendigt at opdage stærkt nukleerende betingelser på dette stadium; Morfologi og diffraktionskvalitet er de vigtigste mål.

Før mikrokrystallisationen af endothiapepsin påbegyndes, blev der udført en analyse af deponerede strukturkrystallisationsbetingelser fra PDB. Krystalliseringsbetingelser og omtrentlige protokoller kunne opnås for 47 af de 48 aflejringer af enthothiapepsin. Disse var stort set alle baseret på den første krystallisering af endothiapepsin udført af Moews og Bunn (1970)46. I betragtning af lighederne mellem disse forhold og deres 'klassiske' oprindelse blev der udført en 96-brønds, dampdiffusion, sparsommatrixskærm for at udforske en bredere vifte af krystalliseringsbetingelser. Endothiapepsin blev koncentreret til 70 mg/ml og en PACT sparsom-matrix skærm47 blev udført i en 96-brønds siddedråbeplade ved 20 °C blanding af 100 nL protein med 100 nL brøndopløsning. Hver tilstand fra dette eksperiment efter 36 timer gav anledning til krystaller. En analyse af krystalmorfologien viste imidlertid, at nogle betingelser kan vise sig bedre for optimering af mikrokrystallisation.

Figur 4A viser et fald fra PACT-skærmen, der stort set var repræsentativt for dem, der blev observeret i størstedelen af pladen. Ved første øjekast kan det være fristende at tro, at disse krystaller kan være værd at optimere yderligere til mikrokrystallisering. Krystallerne er store, og der ser ud til at være betydelig kimdannelse. Den overordnede krystalmorfologi er imidlertid ikke ideel. For det første er krystallerne ikke observerbare singletoner, da det ser ud til, at flere krystaller vokser fra enkeltnukleationspunkter. For det andet er krystalstørrelsen meget asymmetrisk med vækst, der hovedsageligt forekommer ned ad en enkelt akse. Sådanne krystaller er teoretisk mere tilbøjelige til fortrinsvis at justere, når de leveres til røntgenstrålen. Begge karakteristika giver problemer under indsamling og behandling af serielle krystallografiske data.

Figur 4B viser imidlertid endothiapepsinkrystaller dyrket i nærvær afMgCl2. Denne morfologi var konsistent på tværs af alle tilstande, der indeholdtMgCl2 og foreslog derfor, at deres morfologi skyldtes MgCl2. MgCl2-betingelserne producerede enkelte, mere kasselignende krystaller, der repræsenterede et bedre mål for de ultimative serielle eksperimenter.

Der var fire betingelser inden for PACT-skærmen, der indeholdt MgCl2. For bedre at forstå indflydelsen af alle de forskellige komponenter i disse tilstande på endothiapepsinkrystallisation blev der udført en tilfældig optimering. Der blev oprettet en skærm, der indeholdt en tilfældig kombination af buffere og bundfældningsmidler ved en række koncentrationer og pH-værdier. MgCl2-koncentrationen blev også varieret, og derefter blev de resulterende dråber vilkårligt klassificeret fra 0-5 (0 er ingen krystaller eller udfældning) med hensyn til deres visuelle krystalkvalitet og nedbørsniveau.

Figur 5A viser et varmekort over resultaterne fra en Pearsons korrelationsanalyse mellem nedbørsniveauet og krystalkvaliteten og skærmvariablerne (eksempler på dråberne fra dette eksperiment er vist i figur 5B, C og D). Resultaterne indikerede, at opløsningens pH var stærkt korreleret med udfældningsniveauet, med alkaliske buffere, der resulterede i mere nedbør. MgCl2-koncentrationen var let korreleret med nedbørsniveauet, ligesom pH-værdien og udfældningskoncentrationen til krystalkvalitet.

Baseret på disse resultater blev beslutningen truffet om at tage krystallerne dyrket i 0,1 M Tris-HCI pH 7,0, 0,15 MMgCl2, 20% (w / v) PEG 6.000 til næste trin i protokollen - Overgang til batch. Morfologien af krystaller var acceptabel, og en analyse af røntgendiffraktions- og datakvalitetsmålingerne fra disse krystaller antydede, at der ikke var nogen signifikant forskel mellem krystallerne dyrket ind og ud af tilstedeværelsen af Mg2+ (figur 9).

Overgang til batch
For mange serielle krystallografi-mikrokrystalliseringsoptimeringer vil trin 2 være udgangspunktet. Proteinet af interesse vil allerede være krystalliseret til kryokrystallografi, og krystalliseringsprotokollen skal nu transformeres for at skabe mikrokrystalopslæmninger. Denne protokol har kun brugt 96-brønds dampdiffusionsplader til at udføre transformationen til batch, da dampdiffusion er krystalliseringsmetoden, der anvendes af 95% af PDB-poster26. Protokollen har undgået at flytte ind i mikrobatch34,35,37, da denne overgang stadig kan medføre en lignende optimering. Dette betyder ikke, at denne protokol kun kan udføres i dampdiffusionsplader. Alle de præsenterede trin ville også fungere i mikrobatch, hvis dette var den oprindelige krystalliseringsmetode.

For at vurdere krystallisationen af endothiapepsin i den valgte tilstand blev der oprettet et morfogram - eller et groft fasediagram. Formålet med morfogrameksperimentet er tredelt. For det første er en analyse af morfogrammet af stor nytte, når man vurderer skaleringsruter i trin 3 - Skalering. For det andet fungerer morfogrammet som et optimeringsværktøj, der hjælper med at opdage dampdiffusionsbetingelser, der giver anledning til krystaller via batch [dvs . hurtigt fremkomne krystaller (< 24 timer)]. For det tredje, hvis krystaller ikke har vist sig hurtigt, kan en analyse af de frøede dråber give krystallografen en ide om den omtrentlige placering af den aktuelle tilstand på fasediagrammet. For eksempel, hvis de frøede betingelser giver krystaller, men de ikke-seedede ikke gør det, vil disse betingelser sandsynligvis være i det metastabile område.

Morfogramforsøget med endothiapepsin blev udført baseret på 0,1 M Tris-HCl pH 7,0, 0,15 MMgCl2, 20% (w/v) PEG 6.000 tilstand. Protein- og PEG-koncentrationerne varierede fra henholdsvis 100 til 12,5 mg/ml og 5 til 40 % (w/v). Dråberne blev analyseret og resultaterne plottet ved hjælp af det medfølgende regneark (figur 6A).

Det var også allerede klart fra optimeringskrystalmorfologistadiet , at endothiapepsinkrystalvækst i denne tilstand og ved disse proteinkoncentrationer ville resultere i krystaller dyrket på under 24 timer. Dette indikerede, at krystallisering skete via en batch snarere end en dampdiffusionsdrevet proces. Krystallen dyrket under disse forhold var derfor egnet til skalering til større mængder.

Hvis krystaller ikke havde været synlige i de ikke-seedede dråber efter 24 timer, ville det have været sandsynligt, at krystallisering stadig var afhængig af en overgang (figur 1B) og derfor ikke batch. I dette tilfælde er resultaterne fra morfogrameksperimentet stadig af interesse. De giver en indikation af det sandsynlige udgangspunkt for krystallisering på fasediagrammet og dermed hvordan den efterfølgende optimering skal forløbe. Se på de frøede dråber. Frøene giver mulighed for krystalvækst i det metastabile område uanset kimdannelse. For eksempel, hvis krystaller forekommer inden for 24 timer i de frøede dråber, men ikke de ikke-seedede dråber, indikerer dette, at en del af det metastabile område kan observeres. Hvis der ikke observeres krystaller i hverken de frøede eller ikke-seedede dråber, forbliver alle brønde undermættede.

Skalering
Når man ser på morfogrammet (figur 6A), kunne der gøres en række observationer. Mængden af kimdannelse syntes at være påvirket af både protein- og bundfældningskoncentrationerne. Der var også en meget klar afgrænsning af dråber, der fører til proteinudfældning, hvor dråber enten indeholder: intet, krystaller eller bundfald (figur 6B). Tilsætningen af frø (figur 6D) steg også kraftigt Xn sammenlignet med dråberne uden frø (figur 6C). Ved at tage alle disse resultater sammen blev det besluttet at forsøge at skalere både en batch- og seeded-batch-protokol ved 30% (w / v) PEG 6.000 og 100 mg / ml endothiapepsin.

Den indledende testskalering blev udført i 24-brøndhængende dråbeplader. Dråbevolumenerne blev gradvist øget, så eventuelle ændringer i krystalliseringsadfærd kunne observeres (figur 7). Som det kan ses, er der i både de ufrøede og frøede dråber sket krystalvækst. Alle de ikke-seedede dråber voksede en række krystalstørrelser, men overvejende store krystaller (100-200 μm - længste dimension). De frøede dråber producerede imidlertid mindre krystaller (5 - 50 μm - længste dimension). Disse indledende tests antydede, at frø ville være forpligtet til at reducere Xs, men også at denne betingelse skulle være egnet til større mængder.

Når volumenet blev øget i 200 μL, blev krystalliseringsvolumenet kontinuerligt omrørt under krystalvækst. Hovedårsagen til denne omrøring var at sikre, at krystallisationsopløsningen forbliver homogen, og at voksende krystaller ikke sætter sig på bunden eller siderne af rørene. Aflejring af krystaller kan føre til en heterogen krystalpopulation med både meget store og små krystaller. Omrøring af krystallisationsopløsningen kan også fremme kimdannelse44,45.

Desværre producerede den ikke-seedede 30% (w / v) PEG 6.000 ingen krystaller, så PEG-koncentrationen blev øget til 35% (w / v). Denne stigning forbedrede krystalliseringen markant med et endeligt Xn- og Xs-område på henholdsvis 3,6 ± 1,2 x 106 krystaller·ml-1 og 42 ± 4,1 μm (figur 8A og B - sort). Selvom det var en betydelig forbedring og en acceptabel krystalkoncentration, var de endelige krystaller for store til det planlagte eksperiment, så yderligere optimeringer blev foretaget. For at reducere størrelsen af de endelige krystaller blev to veje undersøgt (figur 1E): faldende proteinkoncentration for at forsøge at begrænse den endelige krystalvækst (figur 8A og B - hot pink) og øge PEG-koncentrationen for at forsøge at øge kimdannelsen (figur 8A og B - grøn).

Reduktionen af proteinkoncentrationen reducerede desværre også Xn dramatisk, hvilket i sidste ende producerede endnu større krystaller. Forøgelse af PEG-koncentrationen til 40% gav et endeligt Xn- og Xs-intervalpå henholdsvis 3,1 ± 0,7 x 106 krystaller·ml-1 og 39 ± 2,3 μm. Disse var ikke signifikant forskellige fra de 35%, men da den endelige krystalstørrelse blev reduceret, blev denne tilstand fortsat med de yderligere optimeringer.

For at øge Xn blev frø tilsat. Dette øgede dramatisk Xn (1,1 ± 1,8 x 108 krystaller · ml-1) og førte til et mindre Xs (4,2 ± 4,0 μm) (figur 8A og B - stiplet lilla). Disse krystaller, selvom de var meget velegnede til nogle serielle krystallografiforsøg, blev anset for at være for små, så koncentrationen af de tilsatte frø blev ændret.

Denne indstilling af den tilsatte frøbestand viste sig imidlertid vanskelig at gentage pålideligt; Derfor blev slukning forsøgt. Efter tilsætning af en frøbestand blev krystalstørrelsen overvåget, og når en passende krystalstørrelse var opnået (ca. 10 - 20 μm), blev batchkrystalliseringen slukket (figur 8C og D). Quenching blev foreslået med hensyn til mikrokrystallisation i Kupitz et al. (2014)25. Selvom det måske ikke er en ideel metode, da proteinopløsning i sidste ende vil gå til spilde26, var teknikken meget nyttig i denne situation, da krystalvækst var vanskelig at kontrollere. Ideen bag slukning er hurtigt at returnere krystallisationsblandingen til et punkt lige over opløselighedslinjen (figur 1F). Når opløsningen er vendt tilbage til opløselighedslinjen, er opløsningen vendt tilbage til en stabil mættet opløsning, og der vil ikke forekomme yderligere krystalvækst.

Forsøg på at slukke en krystalliseringsreaktion er ikke uden risiko. Hvis der tilsættes for stor en slukningsopløsning, kan proteinet i opløsningen fortyndes så meget, at opløselighedslinjen passeres. I dette tilfælde bliver opløsningen undermættet, og krystallerne begynder at opløses. For at forhindre dette er det muligt at estimere mængden af krævet slukningsopløsning baseret på morfogramresultaterne. På tidspunktet for slukning skal du tage koncentrationen af proteinopløsningen. Ved at sammenligne proteinkoncentrationen ved opløselighedslinjen og proteinkoncentrationen i opløsning kan der foretages et skøn over den krævede fortynding.

Den slukkede version af 40% (w/v) PEG 6.000, 10 x fortyndet frøeksperiment gav en endelig krystalkoncentration og størrelsesinterval på henholdsvis 2,6 ± 3,1 x 106 krystaller·ml-1 og 15 ± 3,9 μm.

Gennem hele processen blev testrøntgendataindsamlinger af endothiapepsinkrystallerne indsamlet ved den schweiziske lyskilde PXII-strålelinje ved hjælp af et 10 x 30 μm fokus, en energi på 12,4 keV svækket med 80% og under kryo-betingelser. Dataene blev behandlet ved hjælp af drejeknapper, og figur 9 viser en sammenligning af CC1/2. Der blev ikke observeret nogen dramatisk ændring i CC1/2 i løbet af optimeringen.

Figure 1
Figur 1: En oversigt over overgangs- og batchkrystallisering og skaleringsmetoder kortlagt på et fasediagram. A. Zonerne og grænserne for det arketypiske proteinkrystallisationsfasediagram. Bundfalds- og proteinkoncentrationerne afbildes på henholdsvis x- og y-akserne med punktet rent vand ved oprindelsen. Den lilla linje angiver proteinovermætningsgrænsen, og metastabile, kimdannelses- og nedbørszoner er vist i henholdsvis blå, grøn og lyserød. B. Et eksempel på kernezonens penetrationsgrænser for en krystallisationsmetode i 'overgangsfasen', såsom dampdiffusion. I dette teoretiske eksperiment begynder faldfældnings- og proteinkoncentrationerne lige under opløselighedslinjen - endnu ikke overmættet. Mens faldet ekvilibrerer, øges faldkomponentkoncentrationerne, således at faldet bliver overmættet og fortsætter med at bevæge sig - eller overgå - til nukleationszonen. Ved krystalnukleation begynder proteinkoncentrationen i opløsning at falde. Koncentrationen fortsætter med at falde, når krystaller vokser, indtil de endelig stopper ved opløselighedslinjen. Den blå stiplede linje markerer en teoretisk grænse for overgangen til kimdannelseszonen. Så snart kimdannelsen begynder, vil proteinkoncentrationen falde, hvilket forhindrer yderligere penetration. C. Eksempel på batch- og seeded-batchkrystallisationsbaner. I batch skal blandingen af proteinet og bundfaldet skabe en overmættet opløsning inden for kimdannelseszonen, således at krystalvækst kan forekomme. I frøet batch er det ikke strengt nødvendigt at være i kimdannelseszonen på grund af tilsætning af mikrofrø, så steder i det metastabile område kan også udforskes. D. En hypotetisk optimering af krystallisationseksperimentet vist i B fra dampdiffusion til batch. Det oprindelige dampdiffusionsudgangspunkt er via den resulterende optimeringsvektor overgået til den nye startposition; inde i kimdannelseszonen. Den resulterende vektor er produktet af to optimeringer: en stigning i både protein- og bundfældningskoncentrationer. E. Eksempler på optimeringer ved skalering af batchbetingelser for at skræddersy de endelige X,n og Xs. F. Slukning af krystallisationseksperimentet ved tilsætning af krystallisationsbuffer. Det er vigtigt, at slukningen ikke tager proteinkoncentrationen ud af det metastabile område og derfor under punktet for proteinovermætning. Ellers begynder krystaller at opløses tilbage i opløsning. B. og C . er blevet tilpasset fra Beale et al. (2019)26 med tilladelse fra forfatterne. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Stigende Xn og faldende Xs. Det idealiserede forhold mellem antallet af krystaller produceret fra et krystalliseringseksperiment og deres gennemsnitlige længste dimension. For at skabe denne graf blev krystallisationen af et hypotetisk 10 kDa-modelprotein anvendt. Proteinet krystalliserede i en koncentration på 10 mg/ml og gav P2 1 2 1 21 krystaller med dimensionerne 49x50x51 Å. Hver kimdannelsesbegivenhed blev antaget at give en krystal. Krystalvækst blev antaget at være homogen fra alle ansigter. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Et rutediagram, der viser trinene til optimering af en krystal dyrket i et lille volumen (<500 nL), dampdiffusionseksperiment til et stort volumen (> 100 μL) batcheksperiment. Krystaloptimering er opdelt i tre faser: (1) Optimering af krystalmorfologi. (2) Overgang til batch. (3) Skalering. I trin 1 er det vigtigt at identificere egnede krystaller til mikrokrystallisation. Nogle proteiner er kun til stede i en enkelt krystalmorfologi uanset krystallisationstilstanden. Det er dog værd at kigge efter forhold, der giver anledning til enkelte, terninglignende krystaller eller så tæt på disse som menneskeligt muligt. Enkelt, terninglignende krystaller, hypotetisk og anekdotisk, vil generelt give anledning til bedre resultater fra serielle krystallografieksperimenter. Når en krystalmorfologi er valgt og diffraktionen bekræftet, er det derefter nødvendigt at flytte krystallisationseksperimentet fra dampdiffusion til batch (trin 2). Her skal krystaller optimeres af deres kimdannelsestid. Målet er at finde forhold, der giver hurtigt forekommende krystaller (> 24 timer), da disse betingelser sandsynligvis rammer kernezonen med det samme og derfor er batch. Når en tilstand i kimdannelseszonen er fundet, kan der oprettes et morfogram. Morfogrammet giver mulighed for, at størstedelen af kimdannelseszonen kortlægges og potentielle skaleringsruter identificeret for trin 3. Volumenet af en identificeret batchtilstand kan derefter enten gradvist eller hurtigt skaleres i størrelse for at give et endeligt volumen på >100 μL. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: En analyse af endothiapepsinkrystallisationsbetingelser fra en PACT-sparsommatrixskærm. A . og B. er fotos efter 24 timer af henholdsvis hul A4 og C10 fra PACT-skærmen . Krystalliseringsbufferkomponenterne er fremhævet på figuren. SPG-bufferen er ravsyre, natriumdihydrogenphosphat og glycin blandet i et molært forhold på 2: 7: 7. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: En analyse af endothiapepsinkrystallisationsoptimering fra PACTMgCl2-betingelserne . A. Et varmekort over resultaterne fra en Pearsons korrelationsanalyse mellem buffer pH,MgCl2 koncentration og bundfældningskoncentration og nedbørsniveau og krystalkvalitet. Udfældningsniveauet og krystalkvaliteten blev begge vurderet vilkårligt på en skala fra 0-5 (hvor 0 ikke var krystaller eller nedbør) efter 24 timer f.Kr. og D . viser eksempler på krystallisering og udfældning i tre forskellige dråber. Krystalliseringstilstanden og vurderinger af nedbørsniveauet og krystalkvaliteten vises også. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 6
Figur 6: Et endothiapepsinmorfogram, når det krystalliseres i 0,1 M Tris-HCl pH 7,0, 0,15 MMgCl2 og PEG 6.000. A. Et morfogram oprettet ud fra regnearket "fasediagramgenerator". Det relative antal krystaller i hver dråbe betegnes med størrelsen af cirklerne, og resultaterne fra drop 1 (protein og bundfald) og drop 2 (protein, bundfald og frø) fremhæves i henholdsvis grøn og blå. Værdierne af protein- og bundfaldskoncentrationerne på henholdsvis x- og y-aksen angiver forblandede værdier for hver snarere end endelige volumener. Baseret på resultaterne er der tegnet sorte linjer og en lilla linje for at vise grænserne for henholdsvis kimdannelseszonen og metastabil zone. B. C. og D. vise nogle eksempler på resultater fra eksperimentet. De røde og blå prikker markeret på A. angiver placeringen af B. og C. og D., henholdsvis. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 7
Figur 7: Indledende skaleringsforsøg med endothiapepsin i 24-godt hængende dråbeplader. De samme protein- og bundfaldskoncentrationer blev anvendt til alle spor: 100 mg/ml endothiapepsin i henholdsvis 0,1 M Naacetat pH 4,6 og 0,1 M Tris-HCl pH 7,0, 0,15 MMgCl2 og 30% (w/v) PEG 6.000. Alle de viste billeder blev taget efter 24 timer, og de endelige dråbevolumener er mærket på hvert billede. Det venstre panel (A, D og G) er en 1: 1 blanding af protein og bundfald, det midterste panel (B, E og H) er en 1: 2: 3 blanding af frø, bundfald og protein, og det højre panel (C, F og I) er forstørrede billeder af midterpanelet. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 8
Figur 8: Analyse af endothiapepsinmikrokrystallisationen i 200-300 μL volumener. A. og C. viser, hvordan Xn ændrede sig i løbet af eksperimenttiden. B. og D. viser, hvordan Xs (længste dimension) ændrede sig over tid. Resultaterne af eksperimenterne er blevet adskilt for klarhedens skyld. Den røde stiplede linje på C. og D. viser det punkt, hvor slukningen blev udført. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 9
Figur 9: CC1/2-resultater og billeder af krystaller opnået på hvert trin i mikrokrystallisationsprocessen til vurdering af diffraktionskvalitet. A. CC1/2 plottet mod opløsning fra data indsamlet fra dyrkede krystaller: med og uden Mg - en del af trin 1-optimeringen, i et 200 nL volumen, et 10 μL volumen og det endelige 300 μL volumen. B.C. og D. viser krystallerne fra henholdsvis 200 nL, 10 μL og 300 μL volumen. Klik her for at se en større version af denne figur.

Oplysninger om protein
Protein Endothiapepsin
Molekylvægt (kDa) 33.8
Rumgruppe P12 11
a, b, c (Å) 45.2, 73.3, 52.7
α, β, ɣ (°) 90.0, 109.2, 90.0
Parametre med faste mål
Indlæst volumen pr. chip (μL) 150
Blændeåbninger pr. chip 25,600
Påkrævet krystalkoncentration (krystaller/ml) 500,000
Eksempel på oplysninger
Proteinmasse anvendt til fremstilling af 200 μL prøve (mg) 10
Krystal længste dimension (μm) 15
Krystalkoncentration (krystaller/ml) 2,500,000
Eksperimentelle variabler
Antal krævede tidspunkter 5
Antal billeder, der kræves pr. tidspunkt 50,000
Hitrate (integrerede mønstre/billeder indsamlet) 0.3
Krav om faste mål pr. tidspunkt (rundet op) 7
Krav til prøver
Påkrævet prøvevolumen pr. tidspunkt (μL) 1,050
Samlet prøvevolumen, der kræves til forsøg (ml) 5.25
Samlet masse af protein, der kræves (mg) 52.5

Tabel 1: Et eksempel på prøvekravene til et hypotetisk optisk pumpesondeeksperiment udført med faste mål. Proteinet, der blev anvendt i dette teoretiske eksperiment, var endothiapepsin. De faste målparametre var baseret på eksperimenter rapporteret i Ebrahim et al. (2019) 48 og Davy et al. (2019) 49. Prøveoplysningerne kom fra protokollen rapporteret i denne videoartikel, og de eksperimentelle variabler var konservative estimater baseret på levet erfaring. Følgende stikprøvebehov blev efterfølgende beregnet på baggrund af de tidligere antagelser.

Discussion

Den præsenterede metode viser, hvordan man optimerer krystalliseringen af endothiapepsin fra store krystaller (≥ 100 μm længste dimension), dyrket i sparsomme matrix 96-brøndskærme, til mikrokrystaller, dyrket i centrifugerør (300 μL volumen) via batch. Ideen bag protokollen er, at de skridt, der er taget for at optimere endothiapepsin, også kan bruges til andre proteiner. I sidste ende besvarer problemet med at skabe store mængder (>100 μL) mikrokrystaller (10-20 μm) til serielle krystallografieksperimenter ved XFEL'er og synkrotroner.

Protokollen opdeler opgaven med mikrokrystallisation i store mængder i tre trin: (1) Optimering af krystalmorfologi, (2) Overgang til batch og (3) Skalering. I trin 1 skal rækkevidden af krystalformer, som et protein kan skabe, undersøges i dampdiffusionsplader. Betingelser, der giver anledning til enkelte, kasselignende krystaller, der diffrakterer til den krævede opløsning, bør være målet. I trin 2 kan udvalgte betingelser derefter omdannes fra dampdiffusion til batch. Her er optimeringskriteriet krystalvæksttid og at finde forhold, der giver anledning til proteinkrystaller inden for 24 timer. Et morfogram kan også plottes, hvilket giver eksperimentatoren en ide om placeringen af opløselighedslinjen og nukleationszonegrænserne. Dette morfogram er af stor nytte i trin 3, skalering. Morfogrammet vil give en indikation af, om kimdannelse alene kan øge Xn og drive Xs ned. Efterhånden som eksperimentets volumen øges, kanXn og Xs løbende vurderes som nøglekriterierne for skaleringssucces.

I tilfælde af endothiapepsin opdagede trin 1, hvad der potentielt var en tidligere ukendt krystalmorfologi for endothiapepsin. Denne morfologi havde den samme rumgruppe som de tidligere rapporterede, men vigtigere for seriel krystallografi, en mere kasselignende form. Enkeltkrystaller syntes også at vokse fra enkeltnukleationspunkter, i modsætning til ventilatorerne skabt af andre forhold (figur 4). For den valgte tilstand var trin 2 allerede delvist tilfreds, da krystalvækst fandt sted i < 24 timer. Morfogrammet indikerede, at både en ren eller seed-batch-protokol kan være vellykket ved skalering i trin 3. Indledende skalering i lige batch skabte en tilstand, der producerede krystaller med et X,n og Xs område på henholdsvis 3,6 ± 1,2 x 106 krystaller · ml-1 og 42 ± 4,1 μm. Disse krystaller, selvom de var acceptable for nogle serielle krystallografieksperimenter, blev anset for at være for store. Så yderligere optimeringer blev udført. Den endelige protokol producerede krystaller med en koncentration og størrelsesområde på henholdsvis 3,1 x 106 krystaller · ml-1 og 15 ± 3,9 μm. Dette var mere end ideelt til de planlagte eksperimenter.

Metoden fokuserer på transformation af 'opløselige' proteinkrystaller dyrket i dampdiffusionsplader til batch. Årsagen til dette fokus er, at langt størstedelen af opløselige proteinkrystaller dyrkes via dampdiffusion26. Imidlertid kunne de præsenterede koncepter også anvendes på opløselige proteinkrystaller dyrket ved hjælp af andre metoder, såsom mikrobatch. Begreberne kan også anvendes på membranproteinkrystaller dyrket i LCP; da dette også er en batchkrystallisationsproces.

Et centralt aspekt af protokollen er processen med at transformere betingelserne for krystaller dyrket i dampdiffusionsplader, så de kan dyrkes i batch. Til denne transformation anvender metoden det kriterium, der er foreslået af Beale et al. (2019)26. Krystaller dyrket via en batchproces, selv i dampdiffusionsplader, dannes hurtigt (< 24 timer). Dette kriterium er en tilnærmelse baseret på hastigheden af dampdiffusionsfaldsligevægt og gælder mest for PEG-baserede bundfældningsbetingelser. Imidlertid vil krystallisationsbetingelser indeholde en lang række forbindelser, som vil påvirke ligevægtstiden. Ligevægten af saltbaserede krystallisationsbetingelser, f.eks. stærkt koncentreret ammoniumchlorid, kan ske på 1-2 dage. Derfor er 24 timer-kriteriet muligvis ikke sandt for saltbaserede forhold. Saltbaserede forhold kan også have mere komplekse fasediagrammer26,30, der muligvis ikke er i overensstemmelse med arketypen præsenteret i denne protokol. Det kan være nødvendigt at reducere tidskriteriet for saltbaserede forhold til 12 eller 6 timer, hvis det viser sig umuligt at skalere til større mængder.

En anden begrænsning af denne metode er dens tilsyneladende kompleksitet. Protokollen, der blev fulgt for at optimere mikrokrystallisationen af endothiapepsin, ændrede faktisk den oprindelige tilstand fra den sparsomme matrixskærm relativt lidt. Det første hit, der blev observeret på PACT-skærmen, var 0,1 HEPES pH 7,0, 0,2 MMgCl2 og 20% (w/v) PEG 6.000. Den endelige skalerede krystallisationsbuffer var 0,1 Tris-HCl pH 7,0, 0,15 MMgCl2 og 40% (w/v) PEG 6.000. Det er også meget muligt, at ændringen i buffer fra HEPES til Tris-HCI ogMgCl2-koncentration bidrog lidt til processens succes. At lade stigningen i PEG 6.000-koncentrationen være den eneste optimering, og en, der kunne have været opnået ganske enkelt.

Denne vurdering er imidlertid også for forenklet. Det diskonterer ikke kun de problemer, der opstår under skalering (dvs. brugen af frø og slukning), men også det faktum, at bare fordi dette protein viste sig ligetil, er der ingen garanti for, at det næste også vil vise sig at være. De trin, der anbefales i protokollen, blev udtænkt, fordi optimering af skalering af proteinkrystalliseringsvolumener kan være meget proteindyrt. I løbet af de syv endothiapepsinskaleringsforsøg, der vises, blev 100 mg protein forbrugt. Nogle af disse skridt blev ganske vist udført for at vise deres konsekvenser i lyset af denne protokol. Alligevel kan 100 mg af et protein plus potentielt yderligere 50 mg for protein, der indtages under et eksperiment (tabel 1), være en betydelig investering i enten tid eller penge.

Heldigvis er det ikke klart, at denne masse af krævet prøve er allestedsnærværende på tværs af alle proteiner. Endothiapepsin var meget opløseligt og krævede derfor en stor proteinkoncentration for at nå overmætning. I andre (i øjeblikket under optimering) kan overmætning nås ved 10 eller endda 5 mg / ml. Sådanne variabler er proteinspecifikke og skal omfavnes, når de vises.

Andre begrænsninger ved metoden inkluderer dens afhængighed af komplekst udstyr såsom væskehåndteringsrobotter til skærm- og pladeoprettelse og billeddannere til automatisk billedplader, når det er nødvendigt. Alternative rutiner er blevet tilbudt for at begrænse behovet for nogle af disse stykker udstyr, men protokollen vil være mere tidskrævende at følge uden dem. Protokollen foreslår også at teste diffraktionen af optimerede krystaller. For krystallografer uden regelmæssig adgang til en synkrotron kan disse tests vise sig udfordrende. Kontrol på hvert trin er muligvis ikke nødvendig, men disse tests anbefales kraftigt, når et hit er blevet identificeret, og før og efter skalering. Ikke-diffrakterende krystaller ved en XFEL er desværre ikke en ualmindelig forekomst. I betragtning af dette er det bedre at fejle på forsigtighedssiden med hensyn til antagelser om krystaldiffraktion.

I sidste ende vil denne protokol og resultater, der præsenteres her, tilbyde en guide, ideer og et eksempel til dem, der kæmper med at producere prøver til serielle krystallografieksperimenter. Forhåbentlig, efterhånden som seriel krystallografi videreudvikles, vil prøvekravene til teknikken blive reduceret, således at behovet for protokoller som dette vil blive reduceret. Men selv i dette tilfælde vil de strategier, der præsenteres her, stadig være nyttige for dem, der ønsker at udforske krystalliseringsrummet for deres protein.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter at oplyse.

Acknowledgments

Dette projekt har modtaget støtte fra EU's Horizon 2020 forsknings- og innovationsprogram under Marie Skłodowska-Curie-tilskudsaftale nr. 701647. Mange tak for hjælp og støtte fra beamline-forskere ved Swiss Light Source beamline X10SA-PXII.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Swissci 96-well 2-Drop plates Molecular Dimensions MD11-002 96-well 2-drop crystallisation plate
Swissci 96-well 3-Drop plates Molecular Dimensions MD11-003 96-well 3-drop crystallisation plate
mosquito LCP liquid handling robot sptlabtech mosquito LCP Crystallisation robot
ClearVue Sheets Molecular Dimensions MD6-015 96-well crystallization plate seals
Safe-Tube 1.5 mL Eppendorf 30120086 1.5 mL centrifuge tubes
Scaple Swan and Morton No. 3 scalple and No. 3 handle Scalple for cutting open plate seals
MS 3 Vortex IKA 3319000 Vortex for mixing solution and making seed stocks
24-well XRL Plate Molecular Dimensions MD3-11 24-well hanging-drop plates
Tube revolver/rotator Thermo Fischer Scientific 88881001 Tube revolver for mixing solution during scaling
Eppendorf Research plus pipettes Eppendorf Range of manual pipettes, 0.5-10, 1-20, 10-100, 100-1000 µL
Eppendorf pipette tips Eppendorf Range of tip sizes for manual pipettes
Suparen 600 Prochem AG Suparen 600 Endothiapepsin solution
Sodium Acetate Sigma-Aldrich 241245-1KG Sodium Acetate
Tris Merck 8382T014 Tris
Magnesium Chloride Sigma-Aldrich M2670-1kg Magnesium Chloride
PEG 6,000 Sigma-Aldrich 81255-1kg PEG 6,000
Ethelyene glycol Sigma-Aldrich 324558-1L Ethelyene glycol for cyro-protecting the crystals
PACT Premier HT screen Molecular Dimensions MD1-36 PACT Premier 96-well crystal screen
DOW CORNING high vacuum grease Molecular Dimensions MD6-02 Grease for sealing 24-well plates
Hirschmann 22 x 22 mm glaser cover slides Hirschmann 8000104 Cover slides for sealing 24-well sitting drop plates
Crystal pins PSI Manufactured inhouse Thin-film supports for micro-crystals.
1-1.3 mm SiLibeads Type S Faust 6239547 Glass beads for making mico-seed stocks
Macbook Pro Apple Macbook Pro Computer for performing data analysis
CCP4 software suite CCP4 Diffraction pattern data processing software
Excel Microsoft Microsoft Office Plotting tool for phase diagram
Hausser Scientific Bright-Line counting chamber Thermo Fischer Scientific 02-671-51B Tool to calculate crystal concentration
PACT Premier Molecular Dimensions MD1-29-ECO Sparse-matrix crystallization screen
Rock Imager Formulatrix Rock Imager Temperature controlled crystal plate storage and imager
Rock MakerWeb Formulatrix Rock MakerWeb Crystal plate creation and image storage stoftware
Formulator Formulatrix Formulator 96-well crystal screen creation liquid handling robot
Leica MZ16 Microscope Leica Leica MZ16 Light microscope
LAS V4.6 Leica LAS V4.6 Software for Leica microscopes
Spectra/Por 3.5 kDa dialysis tubing Spectrumlabs Spectra/Por 3 Dialysis Membrane 3.5 kDa dialysis membrane
Dialysis tubing closures Spectrumlabs Spectra/Por 3 Duniversal Closures Clips to seal the dialysis tubing ends
Amicon 10 kDa centrifugal concentrator Merck-Millipore Amicon Ultra-15 10 kDa centrifugal concentrator 10 kDa centrifugal filter
5810 R swing bucket centrifuge Eppendorf 5810 R Centrifuge Swing bucket centrifuge

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. DePonte, D. P., et al. Gas dynamic virtual nozzle for generation of microscopic droplet streams. Journal of Physics D: Applied Physics. 41 (19), 195505 (2008).
  2. Hunter, M. S., et al. Fixed-target protein serial microcrystallography with an x-ray free electron laser. Scientific Reports. 4 (1), 6026 (2014).
  3. Weierstall, U., et al. Lipidic cubic phase injector facilitates membrane protein serial femtosecond crystallography. Nature Communications. 5 (1), 1-6 (2014).
  4. Roessler, C. G. G., et al. Acoustic Injectors for Drop-On-Demand Serial Femtosecond Crystallography. Structure. 24 (4), 631-640 (2016).
  5. Sherrell, D. A., et al. A modular and compact portable mini-endstation for high-precision, high-speed fixed target serial crystallography at FEL and synchrotron sources. Journal of Synchrotron Radiation. 22 (6), 1372-1378 (2015).
  6. Roedig, P., et al. A micro-patterned silicon chip as sample holder for macromolecular crystallography experiments with minimal background scattering. Scientific Reports. 5 (1), 1-11 (2015).
  7. Botha, S., et al. Room-temperature serial crystallography at synchrotron X-ray sources using slowly flowing free-standing high-viscosity microstreams. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 71 (2), 387-397 (2015).
  8. Weinert, T., et al. Serial millisecond crystallography for routine room-temperature structure determination at synchrotrons. Nature Communications. 8 (1), 542 (2017).
  9. Tenboer, J., et al. Time-resolved serial crystallography captures high-resolution intermediates of photoactive yellow protein. Science. 346 (6214), 1242-1246 (2014).
  10. Nango, E., et al. A three-dimensionalmovie of structural changes in bacteriorhodopsin. Science. 354 (6319), 1552-1557 (2016).
  11. Suga, M., et al. Light-induced structural changes and the site of O=O bond formation in PSII caught by XFEL. Nature. 543 (7643), 131-135 (2017).
  12. Mehrabi, P., et al. Liquid application method for time-resolved analyses by serial synchrotron crystallography. Nature Methods. 16 (10), 979-982 (2019).
  13. Halle, B. Biomolecular cryocrystallography: structural changes during flash-cooling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (14), 4793-4798 (2004).
  14. Fraser, J. S., et al. Hidden alternative structures of proline isomerase essential for catalysis. Nature. 462 (7273), 669-673 (2009).
  15. Fenwick, R. B., van den Bedem, H., Fraser, J. S., Wright, P. E. Integrated description of protein dynamics from room-temperature X-ray crystallography and NMR. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (4), 445-454 (2014).
  16. Keedy, D. A., et al. Mapping the conformational landscape of a dynamic enzyme by multitemperature and XFEL crystallography. Elife. 4, (2015).
  17. Thomaston, J. L., et al. XFEL structures of the influenza M2 proton channel: Room temperature water networks and insights into proton conduction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (51), 13357-13362 (2017).
  18. Haas, D. J., Rossmann, M. G. Crystallographic studies on lactate dehydrogenase at -75 °C. Acta Crystallographica Section B Structural Crystallography and Crystal Chemistry. 26 (7), 998-1004 (1970).
  19. Hope, H. Cryocrystallography of biological macromolecules: a generally applicable method. Acta Crystallographica Section B Structural Science. 44 (1), 22-26 (1988).
  20. Wu, W., et al. Batch crystallization of rhodopsin for structural dynamics using an X-ray free-electron laser. Acta Crystallographica Section:F Structural Biology Communications. 71 (7), 856-860 (2015).
  21. Ishchenko, A., Cherezov, V., Liu, W. Preparation and delivery of protein microcrystals in lipidic cubic phase for serial femtosecond crystallography. Journal of Visualized Experiments. (115), e54463 (2016).
  22. Andersson, R., et al. Well-based crystallization of lipidic cubic phase microcrystals for serial X-ray crystallography experiments. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 75 (10), 937-946 (2019).
  23. Luft, J. R., et al. The detection and subsequent volume optimization of biological nanocrystals. Structural Dynamics. 2 (4), 041710 (2015).
  24. Lee, D. B., et al. Supersaturation-controlled microcrystallization and visualization analysis for serial femtosecond crystallography. Scientific Reports. 8 (1), 1-10 (2018).
  25. Kupitz, C., et al. Microcrystallization techniques for serial femtosecond crystallography using photosystem II from Thermosynechococcus elongatus as a model system. Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 369 (1647), 20130316 (2014).
  26. Beale, J. H., et al. Successful sample preparation for serial crystallography experiments. Journal of Applied Crystallography. 52, Pt 6 1385-1396 (2019).
  27. Rayment, I. Small-scale batch crystallization of proteins revisited: An underutilized way to grow large protein crystals. Structure. 10 (2), 147-151 (2002).
  28. García-Ruiz, J. M. Nucleation of protein crystals. Journal of Structural Biology. 142 (1), 22-31 (2003).
  29. McPherson, A., Kuznetsov, Y. G. Mechanisms, kinetics, impurities and defects: Consequences in macromolecular crystallization. Acta Crystallographica Section F:Structural Biology Communications. 70 (4), 384-403 (2014).
  30. Rupp, B. Origin and use of crystallization phase diagrams. Acta crystallographica. Section F, Structural biology communications. 71, Pt 3 247-260 (2015).
  31. Luft, J. R., DeTitta, G. T. A method to produce microseed stock for use in the crystallization of biological macromolecules. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 55 (5), 988-993 (1999).
  32. Ireton, G. C., Stoddard, B. L. Microseed matrix screening to improve crystals of yeast cytosine deaminase. Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 60 (3), 601-605 (2004).
  33. Forsythe, E. L., Maxwell, D. L., Pusey, M. Vapor diffusion, nucleation rates and the reservoir to crystallization volume ratio. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 58 (10), 1601-1605 (2002).
  34. Chayen, N. E., Shaw Stewart, P. D., Maeder, D. L., Blow, D. M. IUCr An automated system for micro-batch protein crystallization and screening. Journal of Applied Crystallography. 23 (4), 297-302 (1990).
  35. Chayen, N. E., Shaw Stewart, P. D., Blow, D. M. Microbatch crystallization under oil - a new technique allowing many small-volume crystallization trials. Journal of Crystal Growth. 122 (1-4), 176-180 (1992).
  36. Chayen, N. E. Comparative studies of protein crystallization by vapour-diffusion and microbatch techniques. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 54 (1), 8-15 (1998).
  37. D'Arcy, A., Mac Sweeney, A., Stihle, M., Haber, A. The advantages of using a modified microbatch method for rapid screening of protein crystallization conditions. Acta Crystallographica - Section D Biological Crystallography. 59 (2), 396-399 (2003).
  38. Darmanin, C., et al. Protein crystal screening and characterization for serial femtosecond nanocrystallography. Scientific Reports. 6, 25345 (2016).
  39. Gati, C., et al. Atomic structure of granulin determined from native nanocrystalline granulovirus using an X-ray free-electron laser. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (9), 2247-2252 (2017).
  40. Cheng, R. K. Y. Towards an optimal sample delivery method for serial crystallography at XFEL. Crystals. 10 (3), 215 (2020).
  41. Schmidt, M. Mix and Inject: Reaction Initiation by Diffusion for Time-Resolved Macromolecular Crystallography. Advances in Condensed Matter Physics. 2013, 1-10 (2013).
  42. Oberthuer, D., et al. Double-flow focused liquid injector for efficient serial femtosecond crystallography. Scientific Reports. 7 (1), 44628 (2017).
  43. McPherson, A., Gavira, J. A. Introduction to protein crystallization. Acta crystallographica. Section F, Structural biology communications. 70, Pt 1 2-20 (2014).
  44. Yaoi, M., et al. Effect of stirring method on protein crystallization. Japanese Journal of Applied Physics, Part 2: Letters. 43 (10), 1318 (2004).
  45. Castro, F., Ferreira, A., Teixeira, J. J., Rocha, F. Influence of Mixing Intensity on Lysozyme Crystallization in a Meso Oscillatory Flow Reactor. Crystal Growth & Design. 18 (10), 5940-5946 (2018).
  46. Moews, P. C., Bunn, C. W. An X-ray crystallographic study of the rennin-like enzyme of Endothia parasitica. Journal of Molecular Biology. 54 (2), 395-397 (1970).
  47. Newman, J., et al. Towards rationalization of crystallization screening for small- to medium-sized academic laboratories: the PACT/JCSG+ strategy. Acta crystallographica. Section D, Biological. 61, Pt 10 1426-1431 (2005).
  48. Ebrahim, A., et al. Resolving polymorphs and radiation-driven effects in microcrystals using fixed-target serial synchrotron crystallography. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 75, Pt 2 151-159 (2019).
  49. Davy, B., et al. Reducing sample consumption for serial crystallography using acoustic drop ejection. Journal of Synchrotron Radiation. 26 (5), (2019).

Tags

Denne måned i JoVE udgave 168 Seriel krystallografi batchkrystallisation mikrokrystallisation XFEL dampdiffusion endothiapepsin
Optimering af væksten af endothiapepsinkrystaller til serielle krystallografieksperimenter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Beale, J. H., Marsh, M. E.… More

Beale, J. H., Marsh, M. E. Optimizing the Growth of Endothiapepsin Crystals for Serial Crystallography Experiments. J. Vis. Exp. (168), e61896, doi:10.3791/61896 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter