Summary
En metod för bestämning av pollineringskrav i japanska hybrider av plommontyp beskrivs, som kombinerar fält- och laboratoriebestämningar och observationer av pollenrör under fluorescensmikroskopi med identifiering av S-genotyper genom PCR och övervakning av blomning för val av pollinizers.
Abstract
De japanska plommonsorter som vanligen odlas är interspecifika hybrider som härrör från korsningar mellan den ursprungliga Prunus salicina med andra Prunus-arter. De flesta hybrider uppvisar gametophytic självkompatibilitet, som styrs av en enda och mycket polymorf S-locus som innehåller flera alleler. De flesta odlade hybrider är självkompatibla och behöver pollen från en kompatibel donator för att befrukta sina blommor. Att fastställa pollineringskrav i japansk plommon blir allt viktigare på grund av det stora antalet nya sorter med okända pollineringskrav. I detta arbete beskrivs en metod för bestämning av pollineringskrav i japanska plommonhybrider. Självkompatibiliteten bestäms av handbestämningar både på fältet och i laboratoriet, följt av övervakning av förlängningen av pollenröret med fluorescensmikroskopi och övervakning av fruktmognad på fältet. Val av pollinizer sorter bedöms genom att kombinera identifiering av S-genotyper genom PCR analys med övervakning av blomningstid i fältet. Att känna till pollineringskraven för sorter underlättar valet av sorter för utformning av nya fruktträdgårdar och gör det möjligt att tidigt upptäcka produktivitetsproblem relaterade till pollineringsbrist i etablerade fruktträdgårdar.
Introduction
Japansk plommon (Prunus salicina Lindl.) är infödd till Kina1. På 1800-talet introducerades denna gröda från Japan till USA, där den korsades med andra nordamerikanska diploida plommon2. Under 1900-talet spreds några av dessa hybrider till tempererade regioner runt om i världen. Numera hänvisar termen "japansk plommon" till ett brett utbud av interspecifika hybrider som härrör från kors mellan den ursprungliga P. salicina med upp till 15 andra diploida Prunus spp.3,4,5.
Japansk plommon, liksom andra arter av Rosaceae-familjen, uppvisar Gametophytic Self-Incompatibility (GSI), som kontrolleras av en enda och mycket polymorf S-locussom innehåller flera alleler6. S-locusinnehåller två gener som kodar en ribonukleas (S-RNase) uttryckt i pistillen och ett F-boxprotein (SFB) uttryckt i pollenkornet7. I självinkompatibilitetsreaktionen, när S-allelen uttryckt i pollenkornet (haploid) är densamma som en av de två uttryckta i pistillen (diploid), arresteras pollenrörets tillväxt över stilen på grund av nedbrytningen av pollenrörets RNA genom verkan av S-RNase8. Eftersom denna process förhindrar befruktning av den kvinnliga gametofyten i äggstocken, främjar GSI outcrossing mellan sorter.
Även om vissa japanska plommonsorter är självkompatibla, är de flesta sorter som för närvarande odlas självkompatibla och behöver pollen från interkompatibla givare för att befrukta sina blommor3. I stenfruktarter av släktet Prunus som mandel9, aprikos10,11,12 och söt körsbär13kan pollineringskrav för sorter fastställas genom olika tillvägagångssätt. Självkompatibilitet kan bestämmas genom självbestämning av blommor i fält och efterföljande övervakning av fruktuppsättning, eller genom semi-in vivo självbestämningar vid kontrollerade förhållanden i ett laboratorium och observation av pollenrör under mikroskopet14,15,16,17,18 . Inkompatibilitetsförhållanden mellan sorter kan bestämmas genom korsbestämningar i fältet eller laboratoriet med pollen från den potentiella pollinizer-sorten, och genom identifiering av S-alleler av varje sort genom PCR-analys14,15,16,19,20,21,22 . Hos arter som söt körsbär eller mandel kan självkompatibiliteten också bedömas genom identifiering av särskilda S-alleler i samband med självkompatibilitet, som S4' i söt körsbär13 eller Sf i mandel23.
Flera plommonuppfödningsprogram från de viktigaste producerande länderna släpper ut ett antal nya sorter2,14, många av dem med okända pollineringskrav. I detta arbete beskrivs en metod för bestämning av pollineringskrav i japanska plommonhybrider. Självkompatibiliteten bestäms av självbestämningar inom både fältet och laboratoriet, följt av observationer av pollenrör under fluorescensmikroskopin. Val av pollinizer sorter kombinerar identifieringen av S-genotyper genom PCR-analys med övervakning av blomningstid i fältet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Handbestämning på fältet
-
Pollenextraktion
- För att få pollen, samla blomknoppar i steg D24, enligt steg 57 på BBCH-skalan25,26.
OBS: Fler blomknoppar är nödvändiga i japansk plommon än i andra Prunus-arter eftersom deras anthers producerar mindre pollen. - Ta bort anthersna med ett plastnät (2 mm x 2 mm porstorlek) och placera dem på papper i rumstemperatur i 24 timmar tills det finns en avstjäning.
- Sikta pollenkornen genom ett fint nät (0,26 mm x 0,26 mm porstorlek) och spara dem i ett 10 ml glasrör med ett lock vid 4 °C fram till användning.
- För att få pollen, samla blomknoppar i steg D24, enligt steg 57 på BBCH-skalan25,26.
-
Pollinering av emaskulerade blommor
- När mellan 10 och 20% av blommorna är öppna väljer du och märker flera grenar. Ta bort öppna blommor och unga knoppar och lämna endast blomknoppar i steg D24, enligt steg 57 på BBCH-skalan25,26.
- Ta bort kronblad, foderblad och ståndare på mellan 800 och 1 000 blomknoppar per behandling med antingen naglar eller pincett.
- Hand pollinera pistillerna med hjälp av en fin pensel 24 h efter utmärgling. Vissa grenar som innehåller hälften av pistillerna med pollen av samma sort, och den andra hälften med kompatibel pollen från andra sorter som kontroll. Var försiktig så att du inte förorenar fingertoppen eller penseln med pollenkorn från andra sorter.
- Registrera veckovisa antal blommor och utveckla frukter för att karakterisera fruktfallsmönster och kvantifiera den slutliga frukten som sätts i varje pollineringsbehandling.
-
Kompletterande pollinering på fältet
- Några dagar innan de första blommorna öppnas, omslut utvalda träd i en 0,8 mm maskbur för att undvika ankomsten av pollinerande insekter.
- När 10–20 % blommor är öppna väljer du ut och märker flera grenar per pollineringsbehandling, vilket ger 1 000–1 500 blommor per behandling.
- Nästa dag, när blommor är öppna, pollinerar varje blomma med hjälp av en pensel med motsvarande pollen (pollen från samma sort för självbestämning och från andra kompatibla sorter som korsbestämningskontroll).
- Pollinera varannan dag tills alla blommor öppnas.
- Registrera veckovisa antal blommor och utveckla frukter från antes till skörd för att karakterisera fruktfallsmönster och kvantifiera slutlig frukt som sätts i varje pollineringsbehandling.
2. Handbestämning i laboratoriet
- Samla 50-100 blommor i steg D24, enligt steg 57 på BBCH-skalan25,26.
- I laboratoriet utmärgla 30 blommor per behandling (själv- och korsbestämning).
OBS: Utmärgling bör fortsätta försiktigt för att undvika skador på pistillerna. - Gör ett nytt snitt på basen av varje blomma pedicel under vattnet innan du placerar den på en bit våt florist skum (en bit skum för varje pollineringsbehandling).
- Handbestämma varje pistill 24 h senare med en fin pensel med pollen som samlats in tidigare (se avsnitt 1.1). Pollinera en uppsättning pistiller med pollen från samma sort, och den andra uppsättningen med pollen från en kompatibel sort som kontroll.
- Lämna de pollinerade pistillerna 72 h efter pollinering vid rumstemperatur. Blomskummet ska vara kontinuerligt vått med vatten.
- Fixera pistillerna i en fixativ lösning av etanol/ättiksyra (3:1) i minst 24 timmar vid 4 °C. Ersätt fixativet med 75% etanol. Proverna kan bevaras i denna lösning vid 4 °C tills de används27.
OBS: Se till att proverna är helt nedsänkta i lösningen.
3. Mikroskopiska observationer
-
Utvärdering av in vitro pollen spiring
- För att utarbeta pollensprutningsmedium, lös upp 25 g sackaros på 250 ml destillerat vatten och tillsätt sedan 0,075 g kalciumnitrat [Ca(NR3)2] och 0,075 g borsyra (H3BO3).
- Tillsätt 2 g agar till lösningen och blanda tills den är helt upplöst28.
- För att sterilisera mediet, autoklav den vid 120 °C i 20 min. Kyl mediet och fördela 3 ml per steril Petri-skål (55 mm x 12 mm) i en steril laminär flödeshuv innan den stelnar. Efter medelhög stelning, bevara Petri-disken insvept i aluminiumfolie vid 4 °C tills de används.
- Sprid pollen från varje sort som tidigare använts som pollendonator i de kontrollerade pollineringarna i två Petri-rätter och inkubera dem vid 25 °C i 24 timmar.
OBS: De inokulerade odlingsmedierna kan observeras med mikroskopi omedelbart efter eller lagras vid -20 °C fram till användning. För detta ändamål bör Petri-disken bytas från frysen till kylskåpet 24 h före mikroskopiobservationer. - För att observera pollenkornen, förbered 1% (v/v) aniline blå lösning som fläckar callose. Förbered först en 0,1 N kaliumfosfattribasisk (K3PO4)lösning genom att lösa upp 7,97 g K3PO4 i 1 000 ml destillerat vatten. För att utveckla 1% (v/v) aniline blå lösning, lös 1 ml aniline blå i 100 ml 0,1 N K3PO4.
- Tillsätt 2–3 droppar anolinblå lösning på varje Petri-diskplatta och observera efter 5 minuter under ett UV-epifluorescensmikroskop med exciterfiltret BP340-390 och barriärfiltret LP425. Räkna livskraftiga och icke-livskraftiga pollenkorn i tre fält per tallrik, varje fält som innehåller 100-200 pollenkorn, i två Petri-rätter för varje sort.
-
Tillväxt av pollenrör
- Skölj de fasta pistillerna med destillerat vatten tre gånger (1 h vardera, 3 h totalt) och överför till 5% (w/v) natriumsulfit (Na2SO3) vid 4 °C för 24 h. För att förbereda denna lösning, lös upp 5 g natriumsulfit i 100 ml destillerat vatten.
- Autoklav pistillerna vid 120 °C i 8 min i 5% (w/v) natriumsulft för att mjuka upp vävnaderna.
- Squash mjukade pistiller i en droppe av 1% (v /v) aniline blå lösning under ett täckglas på en bild för att färga callose.
- Observera pollenrörstillväxt längs stilen under ett mikroskop med UV-epifluorescens med hjälp av exciterfiltret BP340-390 och barriärfiltret LP425.
4. Fastställande av oförenlighetsförhållanden
- DNA-extraktion från blad
- För att extrahera DNA, samla 3-4 unga blad av varje sort i fältet, helst på våren.
OBS: DNA kan också extraheras från mogna blad, men DNA från unga blad har mindre fenolföreningar. - Isolera DNA med hjälp av ett kommersiellt kit och följ det medföljande protokollpaketet (se Tabell över material).
- Kvantifiera DNA-koncentrationen och utvärdera kvaliteten på DNA för varje prov vid 260 nm i en UV-Vis mikrovolumspektrofotometer. Justera DNA-koncentrationen till 10 ng/μL.
- För att extrahera DNA, samla 3-4 unga blad av varje sort i fältet, helst på våren.
- PCR-villkor för fragmentförstärkning
- Etikett 0,2 mL PCR-rör och lock.
- Förbered PCR-reagenserna enligt tabell 1 och låt dem tina på is.
- Ställ in en volym mastermix av varje par primers i ett 1,5 ml mikrorör enligt antalet reaktioner plus 10% överskott, med tanke på en volym på 16 μL per reaktion. Tillsätt reagenserna enligt beställningen i tabell 1 och blanda noggrant.
- Alikvot 16 μL masterblandning i varje 0,2 ml PCR-rör som innehåller 4 μL DNA-mall eller 4 μL steriliserat destillerat vatten som negativ kontroll (C-). Använd DNA från sorter med känd genotyp som positiva kontroller. Blanda försiktigt, stäng reaktionsrören med locken och centrifugera vid 2 000 x g i 30 s för att samla hela volymen längst ner i reaktionsröret.
- Placera reaktionsrören i termocykeln och sätt upp PCR-programmet med följande temperaturprofil: ett första steg på 3 min vid 94 °C, 35 cykler på 1 min vid 94 °C, 1 min vid 56 °C och 3 min vid 72 °C och ett sista steg på 7 min vid 72 °C20.
- Elektrofores och uppskattning av fragmentstorlek
- För att förbereda en 1,7% (w/v) agarose mini gel, lös upp 0,68 g agaros och 40 ml 1x TBE-buffert i en 100 ml Erlenmeyerkolv. Smält lösningen genom att värma i en mikrovågsugn vid 600 W med 30 s mellanrum för att undvika kokning.
- Låt lösningen stanna kvar på bänken för att svalna och tillsätt sedan 3,5 μL nukleinsyrafärgningslösning.
- Placera gelbrickan i gjutstället och sätt den valda kammen i gelformen. Var noga med att ha tillräckligt med brunnar för varje PCR-produkt och DNA-stege.
- Häll agaroslösningen i gelformen och låt den svalna tills polymerisation. Ta bort kammen på den polymeriserade gelén. Placera gelén i det horisontella elektroforessystemet som innehåller tillräckligt med 1x TBE-buffert för att täcka gelens yta.
- Ladda den första och sista brunnen med 2 μL av DNA:s molekylviktsstege (1 kb DNA Ladder). Lasta 3 μL av varje produkt av PCR i de andra brunnarna. Stäng kammaren, slå på strömmen och kör gelén vid 100 V i 30 min.
- Observera gelén under UV-ljus med hjälp av ett geldokumentationssystem. Använd DNA-stegen för molekylvikt för att bestämma storleken på det förstärkta fragmentet och jämföra det med de positiva kontrollerna för att identifiera motsvarande alleler.
5. Övervakning av blomdatum
- Övervaka fenologin hos olika träd i varje sort vid blomning under olika år. Fastställ blomningsperiodens längd från den första (ca 5%) till de sista öppna blommorna (ca 95%). Full blomning anses när minst 50% av blommorna är i steg F24, enligt steg 65 på BBCH-skalan25,26.
- För att jämföra blomningsdatumen för interkompatibla sorter och bestämma de som sammanfaller vid blomningstid varje år, utarbeta en kalender med blomningstider med data från flera år.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Varje japansk plommonblomsknopp innehåller en blomställning med 1-3 blommor. Liksom i andra stenfruktarter består varje blomma av fyra virvlar: carpel, ståndare, kronblad och foderblad, som smälts och bildar en kopp vid blommans botten. Blomstrukturer är mindre än andra stenfrukter, med en kort och bräcklig pistill omgiven av ståndarna som innehåller en liten mängd pollenkorn. Vid full blomning visas blommorna i varje blomställning separerade på korta stjälkar, som visar de vita kronbladen som bildar en ballong omgiven av de gröna foderbladen (steg D, 57 BBCH) (figur 1A) dagarna före antesen. Blomman är helt öppen vid anthesis, som visar anthers och pistill (steg F, 65 BBCH) (Figur 2A). Liksom andra tempererade Prunus spp., blommar knopparna först, och bladknopparna gror flera dagar senare. Detta gör att blommande träd ser spektakulära ut och visar ett stort antal blommor men inga löv.
Handbestämningar i japansk plommon krävde insamling av blommor i ballongstadiet före antesen (figur 1A), där pistillen och ståndarna är nästan mogna, men anthersna är fortfarande oupplysta. Detta steg förhindrar ankomsten av insekter som bär extern pollen eftersom kronbladen fortfarande är stängda. Även om antalet blommor är mycket högre än hos andra Prunusarter, kan de flesta av dem (85%-95%) inte sätta frukt. Som ett resultat är det obligatoriskt att använda ett stort antal blommor för pollineringsexperiment. De ohämmade anthersna kunde lätt separeras från blomman i laboratoriet och förlängas på ett papper (figur 1B), där anthersna dehisced efter 24 h vid rumstemperatur, visar pollenkornen (figur 1C). Därefter siktades pollenkornen lätt genom ett fint nät (figur 1D) och kunde användas omedelbart eller lagras fram till användning, både för fält (figur 2A-D) och/eller laboratoriebestämningar(figur 2E,F).
Övervakningen av fruktdroppe av handbestämda blommor efter utmärgling(figur 2A,B) eller kompletterande pollinering av icke-emaskulerade blommor(figur 2C,D) visade tydliga skillnader mellan behandlingarna. De flesta blommor sjönk 2-3 veckor efter pollinering i båda behandlingarna. Alla självbestämda blommor tappade. 4 % av de självbestämplade blommorna från den kompletterande pollineringsbehandlingen fanns dock kvar i trädet fram till skörden, vilket tyder på att denna sort (Rubirosa) beter sig som självkompatibel (figur 3). Beteendet hos korsbestämda blommor som används som kontroll varierade också mellan behandlingarna. Korsbestämda blommor med kompletterande pollinering sjönk fram till 3 veckor efter pollinering, vilket resulterade i 7% av fruktuppsättningen. Men alla emaskulerade korsbestämda blommor sjönk sammanföll med droppen av alla självbestämda blommor.
För hand pollinering i laboratoriet placerades pistillerna i våt floristskum efter ett färskt snitt på basen av varje blomma pedicel under vattnet (figur 2E) och pollinerades 24 h senare med hjälp av en fin borste (figur 2F). I självbestämda blommor visade självkompatibla sorter minst ett pollenrör som nådde basen av stilen i de flesta av de undersökta pistillerna, medan pollenrörstillväxten i självkompatibla sorter arresterades i övre stil (tabell 2).
In vitro pollen spiring skilde sig avsevärt mellan sorter(tabell 3). God pollen livskraft beaktades när mer än 20% av pollenkornen visade ett pollenrör längre än dess längd efter 24 timmar i odlingsmediet (figur 4A). Men när de flesta pollenkorn inte grodde (figur 4B), ansågs sorten vara manlig steril och inte lämplig som pollinator.
Liksom i andra Prunusbestår pistillen av tre strukturer: stigma, stil och äggstock. Äggstocken har två ägglossar, och minst en av dem ska befruktas för fruiting. Under pollinering överförs pollenkorn till stigmatiseringen, där spiring inträffade inom 24 timmar (figur 4C). Varje groddande pollenkorn producerade ett pollenrör, som växte genom pistillstrukturerna. I självkompatibla sorter där pollenkornen har en S-allel som sammanfaller med en av de två S-allelerna i pistillen slutade pollenröret att växa i den övre tredjedelen av stilen (figur 4D), vilket förhindrar ankomsten till äggstocken och den efterföljande befruktningen. Men när S-allelen av pollenkornet är annorlunda med pistillens, kan pollenröret växa genom stilen (figur 4E), nå äggstocken (figur 4F) och befrukta en äggstock.
PCR-analys(tabell 1) utfördes med hjälp av primers från bevarade regioner i S-RNase av söt körsbär och japansk plommon(figur 5). Den använda primeruppsättningen, PruC2-PCER och PruT2-PCER (Se Tabell över material), får bestämma storleken på båda S-allelerna i varje sort. De förstärkta fragmenten kördes i agarose gel av elektrofores, och sju olika S-alleler (Sa, Sb, Sc, Se, Sf, Sh, Sk) identifierades i de analyserade sorterna. Fragmentstorlekarna varierade mellan 393 och 1 580 bp med Hjälp av PruC2-PCER(figur 5) och mellan 820 och 1 993 bp med PruT2-PCER. Sex S-genotyper identifierades (SaSb, SbSc, SbSf, ScSh, SeSh, SfSk).
Fenologin för varje sort tillät att beräkna blomningsperiodens längd under en total period av fyra år, med tanke på full blomning när de flesta blommor var i steg F, steg 65 BBCH. Blomning i fruktträdgårdsförhållanden (figur 6) gjorde det möjligt att jämföra blomningstider mellan sorter och år, och bestämning av vilka sorter som sammanfaller vid blomningstiden varje år(figur 7).
Figur 1: Pollenextraktion i japansk plommon. A) Blomknoppar i ballongsteg D, enligt Baggiolini24,steg 57 på BBCH-skalan. b)Avlägsnande av ohämmade anthers från blomman. C)Avhisced anthers som visar pollenkornen. ( D)Sikt av pollenkorn från anthers med hjälp av ett fint nät. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 2: Handbestämningsexperiment för att bestämma självkompatibilitet i japansk plommon. Fältbestämningar: (A) Blommande i japansk plommon, med blommor vid antesen och i ballongstadiet. (B) Blommor i ballongstadium D, enligt Baggiolini24,steg 57 av BBCH-skalan efter utmärgling. c)Träd i bur för att undvika att insekter kommer. ( D)Kompletterande handbestämning av icke-emaskulerade blommor. Laboratoriebestämningar: (E) Skär på basen av pedicel under vattnet och emasculated blommor placerade på blött skum. F)Handbestämning av pistillerna med en fin pensel. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 3: Fruktdroppe i japansk plommon som påverkas av olika pollineringsbehandlingar. Själv- och korsbestämning i emaskulerade och icke-emaskulerade blommor. Procentandel blommor och utveckling av frukter från det ursprungliga antalet återstående blommor i trädet under de 4 veckorna efter pollinering i "Rubirosa". Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 4: Pollenspiring och pollenrörstillväxt i självbestämda blommor i japansk plommon. a)In vitro-pollenspiring. b)Icke-grodda pollenkorn (pilar) in vitro. c)Pollenkornsspiring på stigmaytan. (D) Pollenrör arresterat i den övre tredjedelen av stilen. (E) Pollenrör växer längs stilen. (F) Pollenrör vid foten av stilen. Skalstänger, 200 μm. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Bild 5: PCR-förstärkning med primerset PruC2-PCER av nio japanska plommonsorter. Identifiering av sju S-alleler (Sa, Sb, Sc, Se, Sf, Sh, Sk) och sex S-genotyper (SaSb, SbSc, SbSf, ScSh, SeSh, SfSk). Inkompatibilitetsgruppen (I.G.3),"Fortune" (F), "TC Sun" (TS), "Laroda" (LR), "Queen Rosa (QR), "Red Beaut" (RB), "Golden Globe" (GG), "Kelsey" (K), Negativ kontroll (destillerat vatten) (C-), "Zanzi Sun" (ZS), "Laetitia" (LT). 1 kb: Storleksstandard. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 6: Övervakning av fenologi av japansk plommon. Två japanska plommonsorter med blommor i olika fenologiska steg. Steg C24, steg 55 av BBCH-skalan (vänster) och steg F24, steg 65 av BBCH-skalan (höger). Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 7: Blomningstid i fyra japanska plommonsorter under 4 år. Period från den första till den sista öppna blommorna. Gula celler indikerar de dagar av full blomning där de flesta blommor var öppna. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
| Reagenser | Volym per en reaktion (μL) | |
| H2O | 11.50 | |
| 10X Buffert med 20 mM MgCl2 | 2.80 | |
| dNTP mix , 10 mM vardera | 0.80 | |
| Primer framåt | 0.40 | |
| PruC2 (5'-CTATGGCCAAGTAATTCAAACC-3')40 eller | ||
| PruT2 (5'- TSTTSTTGSTTTTGCTTTCTT-3')40 | ||
| Primer omvänd | 0.40 | |
| PCER (5'-TGTTTTTCCATTCGCCTTCCC-3')41 | ||
| DNA-mall | 4.00 | |
| Taq DNA-polymeras, 500 U | 0.09 | |
| Slutlig volym | 20.0 | |
Tabell 1: Reaktionsvillkor som används i detta protokoll.
| Sorter (S- genotyp) | Antal undersökta pistiller | Grodda pollenkorn på stigma (%) | Pistiller med pollenrör vid basen av stil (%) | Pollenrör vid stilens botten (medelvärde) | Reaktion på själv-/korskompatibilitet |
| TC Sun (SbSc) × Larry Ann (SbSh) | 22 | 92.3 | 27 | 1.2 | + |
| TC Sun (SbSc) × Blackamber (SbSc) | 10 | 74.8 | 0 | 0.0 | - |
| TC Sun(SbSc)självbestämning | 44 | 78.3 | 7 | 1.0 | + |
| Gyllene plommon (SbSc) × Svart Stjärna (SeSf) | 11 | 64.7 | 36 | 1.5 | + |
| Gyllene plommon (SbSc) × TC-sol (SbSc) | 11 | 98.4 | 0 | 0.0 | - |
| Gyllene plommon (ShSk) självbestämning | 38 | 85.2 | 0 | 0.0 | - |
Tabell 2: Pollenspiring och pollenrör tillväxt genom stilen för två japanska plommonsorter efter själv- och korsbestämningar. Antal handpollinerade pistiller som undersökts, procentandel grodda pollenkorn på stigma, procentandel pistiller med pollenrör vid basen av stilen, genomsnittligt antal pollenrör vid basen av stilen, Själv- eller korskompatibla (-) och själv- eller korskompatibla (+).
| Sorten | Spiring (%) | SD* |
| Earlemoon | 50 | 3.3 |
| Earliqueen | 30 | 4.2 |
| Eldorado | 10 | 1.3 |
| Broder | 52 | 2.0 |
| Gyllene Japan | 17 | 3.8 |
| Gyllene Plumza | 18 | 3.3 |
| Laroda | 46 | 3.6 |
| Larry Ann | 20 | 5.8 |
| Methley | 2 | 0.8 |
| Owen T | 16 | 0.3 |
| Primetime | 20 | 3.3 |
| Drottning Rosa | 42 | 3.9 |
| Kunglig diamant | 19 | 2.2 |
| Santa Rosa | 36 | 2.0 |
| TC-sol | 49 | 3.1 |
| *SD = Standardavvikelse | ||
Tabell 3: Andel in vitro-pollenspiring av 15 japanska plommonsorter. Medelvärde ± SD på sex replikat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den metod som beskrivs häri för pollineringskrav för japanska plommonsorter kräver att man fastställer varje sorts självkompatibilitet genom kontrollerade pollineringar på fältet eller i laboratoriet och efterföljande observation av pollenrörstillväxt med fluorescensmikroskopi. Inkompatibilitetsrelationerna upprättas genom karakteriseringen av S-allelerna genom molekylär genotypning. Slutligen utförs valet av pollinizers av övervakningsfenologin för att upptäcka de sorter som sammanfaller vid blomning varje år.
Fastställandet av pollineringskrav i nya japanska plommonsorter blir allt viktigare på grund av det stora antalet nya sorter med okända pollineringskrav och att de flesta av dem är självkompatibla3. Det tillvägagångssätt som beskrivs häri, som kombinerar fenologisk övervakning, kontrollerade pollinering, fluorescensmikroskopi och molekylär genotypning, har visat sig vara användbart för att bestämma pollineringskraven för sorter14.
Japanska plommonhybrider visar ett antal särdrag som hindrar användningen av en enda metod för att bestämma pollineringskrav som används i andra Prunus-arter. Först är blommorna mindre och bräckligare3. Pollenutvinning och hantering liknar den för andra Prunus spp.12, även om det är nödvändigt att samla ett högre antal blommor eftersom anthersna har mindre mängd pollenkorn3. I vissa sorter som Rubirosa kan blomutmärgling inte användas eftersom denna teknik orsakar ägglossning degeneration22 och den efterföljande droppen av blomman21, vilket kan resultera i falsk diagnos av självkompatibilitet. För avelsändamål kan blom utmärgling i känsliga sorter som används som kvinnlig förälder leda till brist på avkommor3.
Antalet blommor är mycket högre än i andra arter av fruktträd, men andelen fruktuppsättning är mycket låg3. Detta gör det nödvändigt att använda ett högre antal blommor för både fält- och laboratoriebestämningar21,22. Laboratoriebestämningar och efterföljande mikroskopiska observationer av pollenrörstillväxt gör det möjligt att bedöma självkompatibiliteten mer exakt än genom att övervaka handpollinerade blommor i fältet fram till skörden, eftersom denna teknik undviker miljöpåverkan och möjliggör analys av ett större antal sorter än i fältexperiment. Blomhantering är dock mer besvärlig än i andra Prunus-arter som aprikos12, eftersom det är nödvändigt att skära pedicelen under vattnet innan pistilarna placeras i skummet. Dessutom måste ett högre antal pistiller analyseras under mikroskopet än hos andra arter, eftersom pollenrören i de kompatibla pollen-pistillförhållandena mellan japanska plommonhybrider når äggstocken i en minskad andel blommor3. Dessutom är pollenrör svårare att upptäcka under mikroskopet, och antalet rör som når basen av stilen är lägre15,18,20,28,29,30,31,32,33,34 . I de sorter vars blommor är särskilt ömtåliga och degenereras under laboratorieförhållanden innan pollenrören når stilens botten, bör kompatibiliteten med självkompatibilitet utvärderas genom fältpollineringar.
Utvärderingen av pollens livskraft gör det möjligt att veta om det pollen som används i handpollineringarna är tillräckligt och därmed kassera eventuella falska diagnoser av självkompatibilitet i dessa fall av låg eller noll spiringsprocent. Användningen av denna teknik har rapporterat betydande skillnader i pollenspiring mellan japanska plommonsorter21,22,35. Dessutom är detta tillvägagångssätt också användbart för att upptäcka manlig sterilitet22,36,37, vilket är av stor betydelse för att kassera mansterila sorter som pollendonatorer i kommersiella fruktträdgårdar och i kors för avelsändamål.
Även om inkompatibilitetsrelationerna mellan sorter kan bestämmas med samma tillvägagångssätt som används för självkompatibilitetsbedömning av laboratoriebestämningar, har den tekniken vissa nackdelar för detta ändamål. Pollinering kan endast utföras under blomningssäsongen, och samlingar eller fruktträdgårdar med vuxna träd placerade nära laboratoriet behövs för insamling av blommor, vars livslängd är mycket kort3,38. Dessutom är antalet relationer som analyseras varje år lågt, eftersom varje par sorter kräver en viss korsbestämning. Som ett alternativ kräver identifieringen av S-allelerna med PCR inte blommor, eftersom DNA kan extraheras från någon växtvävnad; Därför är den period under vilken proverna kan samlas in längre. Dessutom, till skillnad från blommor som måste användas omedelbart, kan bladen eller andra växtvävnader lagras, så analysen är inte begränsad till några dagar på våren, men kan göras under hela år39. Identifieringen av de två S-allelerna för varje sort genom förstärkning av den andra S-RNase-intronen med hjälp av primeruppsättningen PruC2-PCER och PruT2-PCER40,41 och den efterföljande analysen av storleken på de förstärkta fragmenten agarose gel elektrofores20,21 gör det möjligt att tilldela sorterna till deras motsvarande inkompatibilitetsgrupp (I.G.3. ). Varje I.G. inkluderar de självkompatibla sorterna med samma två S-alleler, som därför är oförenliga. Sorter från olika grupper, som bär minst en annan S-allel, är kompatibla.
Denna teknik har en begränsning av att den inte tillåter bestämning av självkompatibiliteten för japanska plommonsorter som den förekommer hos andra Prunusarter, där självkompatibilitet har associerats med en viss S-allel, såsom Sf i mandel42 och S4' i söt körsbär43. Vissa S-alleler var ursprungligen associerade med självkompatibilitet i japansk plommon, till exempel Sb20,44, Se19,20,44, Sg45och St46. Senare verk har dock rapporterat självkompatibla sorter som bär dessa S-alleler14,20,21,22,47. Därför krävs ytterligare arbete av S-allel sekvensering i japansk plommon för att klargöra om olika alleler av samma storlek eller mutationer felaktigt har identifierats som alleler Sb, Se, Sgeller St3. Under tiden bör bedömningen av självkompatibilitet i japansk plommon analyseras genom fält- eller laboratoriebestämningar och efterföljande övervakning av fruktfall i fältet eller beteendet hos pollenrör under mikroskopet.
Identifieringen av S-alleler genom PCR-analys har visat sig vara tillräcklig för att fastställa oförenlighetsförhållanden mellan sorterna3. För att välja lämpliga pollinizers är det dock nödvändigt att kombinera denna information med uppgifterna om blomningstiderna för varje sort i varje område i flera år, eftersom missmatchningen under blomningsperioden, även om den bara inträffar under vissa år, kan orsaka brist på fruktuppsättning med betydande minskning av skörden14.
Många av de skillnader som observerats i blombiologi och agronomiskt beteende mellan sorter kan vara relaterade till deras ursprung, eftersom alla sorter som för närvarande odlas är hybrider som härrör från korsningar mellan den ursprungliga arten P. salicina med andra arter av samma släkt men med olika egenskaper5,48. Detta kan vara den främsta anledningen till att det är nödvändigt att kombinera olika tekniker för att bestämma pollineringskrav, till skillnad från andra fruktarter. Att känna till pollineringskraven för varje sort underlättar ett lämpligt urval av sorter för utformning av nya fruktträdgårdar och gör det möjligt att upptäcka och lösa produktionsproblem relaterade till bristen på pollinering i etablerade fruktträdgårdar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Denna forskning finansierades av Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria (RFP2015-00015-00 och RTA2017-00003-00); Gobierno de Aragón– Europeiska socialfonden, Europeiska unionen (Grupo Consolidado A12-17R) och Junta de Extremadura –Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER), Plan Regional de Investigación (IB16181), Grupo de Investigación (AGA001, GR18196). B.I. Guerrero stöddes av ett stipendium från Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología från México (CONACYT, 471839).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic Acid Glacial | Panreac | 131008.1611 | |
| Agar | iNtRON Biotechnology | 25999 | |
| Aniline blue | Difco | 8504-88 | |
| Boric Acid (H3BO4) | Panreac | 131015.1210 | |
| Calcium Nitrate 4-hydrate (Ca(NO3)2·4H2O) | Panreac | 131231.1211 | |
| Coverglass | Deltalab | D102460 | 24 mm x 60 mm |
| Digital Camera | Imaging Developmet Systems | UI-1490SE | |
| Digital Camera Software Suite | Imaging Developmet Systems | 4.93.0. | |
| DNA Oligos | ThermoFisher Scientific | ||
| dNTP Mix, 10 mM each | ThermoSischer Scientific | R0193 | |
| DreamTaq Green DNA polymerase | ThermoFisher Scientific | EP0713 | |
| Ethanol 96° | VWR-Chemicals | 83804.360 | |
| 1Kb DNA Ladder (U.S. Patent No. 4.403.036) (500pb-12Kb) | Invitrogen | 15615-016 | Size: 250µg; Conc: 1.0 µg/µl |
| Gel Documentation System | Bio-Rad | 1708195 | |
| Hand Counter | Tamaco | TM-4 | |
| Image Lab Software | Bio-Rad | Image Analyse System for Gel Documentation System | |
| MetaPhor Agarose | Lonza | 50180 | |
| Microcentrifuge 5415 R | Eppendorf | Z605212 | |
| Microscope with UV epiflurescence | Leica | DM2500 | Exciter filter BP340-390, Barrier filter LP425 |
| Microslides | Deltalab | D100004 | 26 mm x 76 mm |
| Mini Electrophoresis System | Fisherbrand | 14955170 | |
| Minicentrifuge | ThermoFisher Scientific | 15334204 | |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND1000 | |
| Petri Dishes | Deltalab | 200201 | 55 mm x 14 mm |
| Potassium Phosphate Tribasic (K3PO4·1.5H2O) | Panreac | 141513 | |
| Primer forward 'Pru C2' | ThermoFisher Scientific | ||
| Primer forward Pru T2' | ThermoFisher Scientific | ||
| Primer reverse 'PCER' | ThermoFisher Scientific | ||
| RedSafe Nucleic Acid Staining Solution | iNtRON Biotechnology | 21141 | |
| Saccharose | Panreac | 131621.1211 | |
| Sodium sulphite anhydrous (Na2SO3) | Panreac | 131717.1211 | |
| Speedtools plant DNA extraction Kit | Biotools | 21272 | |
| TBE Buffer (10X) | Panreac | A0972,5000PE | |
| Thermal Cycler T100 | Bio-Rad | 1861096 | |
| Thermomixer comfort | Eppendorf | T1317 | |
| Vertical Autoclave Presoclave II | JP Selecta | 4001725 | |
| Vortex | Fisherbrand | 11746744 |
References
- Hendrick, U. P. The Plums of New York. , J. B. Lyon Co., State Printers. (1911).
- Okie, W. R., Hancock, J. F. Plums. Temperate Fruit Crop Breeding. Hancock, J. F. , Springer. Dordrecht. 337-357 (2008).
- Guerra, M. E., Rodrigo, J. Japanese plum pollination: a review. Scientia Horticulturae. 197, 674-686 (2015).
- Okie, W. R.
- Okie, W. R., Weinberger, J. H. Fruit Breeding, vol. 1. Tree and tropical fruits. Janick, J., Moore, J. , John Wiley and Sons Inc. New York. 559-608 (1996).
- Mccubbin, A. G., Kao, T. Molecular recognition and response in pollen and pistil interactions. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 16, 333-364 (2000).
- Hegedűs, A., Halász, J. Recent findings of the tree fruit self-incompatibility studies. International Journal of Horticultural Science. 13 (2), 7-15 (2007).
- de Nettancourt, D. Incompatibility and Incongruity in Wild and Cultivated Plants. , Springer-Verlag. Berlín. (2001).
- Tao, R., et al. Identification of stylar RNases associated with gametophytic self-incompatibility in almond (Prunus dulcis). Plant and Cell Physiology. 38 (3), 304-311 (1997).
- Halász, J., Pedryc, A., Ercisli, S., Yilmaz, K., Hegedűs, A. S-genotyping supports the genetic relationships between Turkish and Hungarian apricot germplasm. Journal of the American Society for Horticultural Science. 135 (5), 410-417 (2010).
- Lora, J., Hormaza, J. I., Herrero, M., Rodrigo, J. Self-incompatibility and S-allele identification in new apricot cultivars. Acta Horticulturae. (1231), 171-176 (2019).
- Herrera, S., Lora, J., Hormaza, J. I., Rodrigo, J. Determination of self- and inter-(in)compatibility relationships in apricot combining hand-pollination, microscopy and genetic analyses. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (160), (2020).
- Cachi, A. M., Wunsch, A. Characterization of self-compatibility in sweet cherry varieties by crossing experiments and molecular genetic analysis. Tree Genetics & Genomes. 10, 1205-1212 (2014).
- Guerra, M. E., Guerrero, B. I., Casadomet, C., Rodrigo, J. Self-compatibility, S-RNase allele identification, and selection of pollinizers in new Japanese plum-type cultivars. Scientia Horticulturae. 261, 109022 (2020).
- Herrera, S., Lora, J., Hormaza, J. I., Herrero, M., Rodrigo, J. Optimizing production in the new generation of apricot cultivars: self-incompatibility, S-RNase allele identification, and incompatibility group assignment. Frontiers in Plant Science. 9, 1-12 (2018).
- Herrera, S., Rodrigo, J., Hormaza, J. I., Lora, J. Identification of self-incompatibility alleles by specific PCR analysis and S-RNase sequencing in apricot. International Journal of Molecular Sciences. 19 (11), 3612 (2018).
- Sociasi Company, R., Kodad, O., Fernández i Martí, J. M., Alonso, J. M. Mutations conferring self-compatibility in Prunus species: from deletions and insertions to epigenetic alterations. Scientia Horticulturae. 192, 125-131 (2015).
- Rodrigo, J., Herrero, M. Evaluation of pollination as the cause of erratic fruit set in apricot 'Moniqui. Journal of Horticultural Science and Biotechnology. 71 (5), 801-805 (1996).
- Beppu, K., et al. Se-haplotype confers self-compatibility in Japanese plum (Prunus salicina Lindl). Journal of Horticultural Science and Biotechnology. 80 (6), 760-764 (2005).
- Guerra, M. E., Rodrigo, J., López-Corrales, M., Wünsch, A. S-RNase genotyping and incompatibility group assignment by PCR and pollination experiments in Japanese plum. Plant Breeding. 128 (3), 304-311 (2009).
- Guerra, M. E., Wunsch, A., López-Corrales, M., Rodrigo, J. Flower emasculation as the cause for lack of fruit set in Japanese plum crosses. Journal of the American Society for Horticultural Science. 135 (6), 556-562 (2010).
- Guerra, M. E., Wünsch, A., López-Corrales, M., Rodrigo, J. Lack of fruit set caused by ovule degeneration in Japanese plum. Journal of the American Society for Horticultural Science. 136 (6), 375-381 (2011).
- Fernández i Martí, A., Gradziel, T. M., Socias i Company, R. Methylation of the Sf locus in almond is associated with S-RNase loss of function. Plant Molecular Biology. 86, 681-689 (2014).
- Baggiolini, M. Les stades repérés des arbres fruitiers à noyau. Revue romande d'Agriculture et d'Arboriculture. 8, 3-4 (1952).
- Meier, U. Growth stages of mono-and dicotyledonous plants: BBCH Monograph. Federal Biological Research Centre for Agriculture and Forestry. , (2001).
- Fadón, E., Herrero, M., Rodrigo, J. Flower development in sweet cherry framed in the BBCH scale. Scientia Horticulturae. 192, 141-147 (2015).
- Fadon, E., Rodrigo, J. Combining histochemical staining and image analysis to quantify starch in the ovary primordia of sweet cherry during winter dormancy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (145), (2019).
- Hormaza, J. I., Pinney, K., Polito, V. S. Correlation in the tolerance to ozone between sporophytes and male gametophytes of several fruit and nut tree species (Rosaceae). Sexual Plant Reproduction. 9, 44-48 (1996).
- Burgos, L., et al. The self-compatibility trait of the main apricot cultivars and new selections from breeding programmes. Journal of Horticultural Science and Biotechnology. 72 (1), 147-154 (1997).
- Dicenta, F., Ortega, E., Cánovas, J. A., Egea, J. Self-pollination vs. cross-pollination in almond: pollen tube growth, fruit set and fruit characteristics. Plant Breeding. 121, 163-167 (2002).
- Alonso, J. M., Socias i Company, R. Differential pollen tube growth in inbred self-compatible almond genotypes. Euphytica. 144, 207-213 (2005).
- Hedhly, A., Hormaza, J. I., Herrero, M. The effect of temperature on pollen germination, pollen tube growth, and stigmatic receptivity in peach. Plant Biology. 7, 476-483 (2005).
- Hedhly, A., Hormaza, J. I., Herrero, M. Warm temperatures at bloom reduce fruit set in sweet cherry. Journal of Applied Botany. 81, 158-164 (2007).
- Milatović, D., Nikolić, D. Analysis of self-(in)compatibility in apricot cultivars using fluorescence microscopy. Journal of Horticultural Science and Biotechnology. 82, 170-174 (2007).
- Jia, H. J., He, F. J., Xiong, C. Z., Zhu, F. R., Okamoto, G. Influences of cross pollination on pollen tube growth and fruit set in Zuili plums (Prunus salicina). Journal of Integrative Plant Biology. 50, 203-209 (2008).
- Herrero, M., Salvador, J. La polinización del ciruelo Red Beaut. Información Técnica Econónomica Agraria. 41, 3-7 (1980).
- Ramming, D. W. Plum. Register of new fruit and nut varieties: Brooks and Olmo, List 37. HortScience. 30 (6), 1142-1144 (1995).
- Hartmann, W., Neümuller, M. Plum breeding. Breeding plantation tree crops: Temperate species. , Springer. New York, NY. 161-231 (2009).
- Guerra, M. E., López-Corrales, M., Wünsch, A. Improved S-genotyping and new incompatibility groups in Japanese plum. Euphytica. 186 (2), 445-452 (2012).
- Tao, R., et al. Molecular typing of S-alleles through identification, characterization and cDNA cloning for S-RNases in sweet cherry. Journal of the American Society for Horticultural Science. 124 (3), 224-233 (1999).
- Yamane, H., Tao, R., Sugiura, A., Hauck, N. R., Lezzoni, A. F. Identification and characterization of S-RNases in tetraploid sour cherry (Prunus cerasus). Journal of the American Society for Horticultural Science. 126, 661-667 (2001).
- López, M., Jose, F., Vargas, F. J., Battle, I. Self-(in)compatibility almond genotypes: a review. Euphytica. 150, 1-16 (2006).
- Bošković, R., Tobutt, K. R. Correlation of stylar ribonuclease zymograms with incompatibility alleles in sweet cherry. Euphytica. 90, 245-250 (1996).
- Beppu, K., Syogase, K., Yamane, H., Tao, R., Kataoka, I. Inheritance of self-compatibility conferred by the Se-haplotype of Japanese plum and development of Se-RNase gene-specific PCR primers. Journal of Horticultural Science and Biotechnology. 85, 215-218 (2010).
- Beppu, K., Kumai, M., Yamane, H., Tao, R., Kataoka, I. Molecular and genetic analyses of the S-haplotype of the self-compatible Japanese plum (Prunus salicina Lindl.) "Methley". Journal of Horticultural Science and Biotechnology. 87 (5), 493-498 (2012).
- Beppu, K., Konishi, K., Kataoka, I. S-haplotypes and self-compatibility of the Japanese plum cultivar 'Karari'. Acta Horticulturae. 929, 261-266 (2012).
- Sapir, G., Stern, R. A., Shafir, S., Goldway, M. S-RNase based S-genotyping of Japanese plum (Prunus salicina Lindl.) and its implication on the assortment of cultivar-couples in the orchard. Scientia Horticulturae. 118, 8-13 (2008).
- Karp, D.
