Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Maksimal isometrisk tetanisk kraftmåling av Tibialis fremre muskel i rotten

Published: June 26, 2021 doi: 10.3791/61926
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1, 1, 1, 1
1Department of Orthopedic Surgery, Mayo Clinic, 2Radboud University Medical Center, Radboud Institute for Health Sciences, Department of Plastic Surgery, Nijmegen, The Netherlands

Summary

Evaluering av motorisk utvinning er fortsatt målestokkens resultatmål i eksperimentelle perifere nervestudier. Den isometriske tetaniske kraftmålingen av tibialis fremre muskel i rotten er et uvurderlig verktøy for å vurdere funksjonelle resultater etter rekonstruksjon av isjiasnervefeil. Metodene og nyansene er beskrevet i denne artikkelen.

Abstract

Traumatiske nerveskader resulterer i betydelig funksjonelt tap og segmentære nervefeil krever ofte bruk av autologe interposisjonsnervetransplantasjoner. På grunn av deres begrensede tilgjengelighet og tilhørende donorsidemorbiditet, fokuserer mange studier innen nerveregenerering på alternative teknikker for å bygge bro over et segmentært nervegap. For å undersøke resultatene av kirurgiske eller farmakologiske eksperimentelle behandlingsalternativer, brukes rottes isjiasnervemodellen ofte som bioassay. Det finnes en rekke utfallsmålinger som brukes i rottemodeller for å bestemme omfanget av nerveregenerering. Den maksimale utgangskraften til målmuskelen er fortsatt det mest relevante resultatet for klinisk oversettelse av eksperimentelle terapier. Isometrisk kraftmåling av tetanisk muskelkontraksjon har tidligere blitt beskrevet som en reproduserbar og gyldig teknikk for evaluering av motorisk utvinning etter nerveskade eller reparasjon i både rotte- og kaninmodeller. I denne videoen vil vi gi en trinnvis instruksjon av denne uvurderlige prosedyren for vurdering av funksjonell gjenoppretting av tibialis fremre muskel i en rotte isjias nerve defekt modell ved hjelp av optimaliserte parametere. Vi vil beskrive de nødvendige pre-kirurgiske preparater i tillegg til kirurgisk tilnærming og disseksjon av den vanlige peroneal nerve og tibialis fremre muskel sene. Den isometriske tetaniske kraftmålingsteknikken vil bli detaljert. Å bestemme optimal muskellengde og stimuluspulsfrekvens forklares og måling av maksimal stivkrampe muskelkontraksjon er demonstrert.

Introduction

Tap av motorisk funksjon etter traumatisk perifer nerveskade har en betydelig innvirkning på livskvaliteten og sosioøkonomisk status hos pasienter1,2,3. Prognosen for denne pasientpopulasjonen forblir dårlig på grunn av minimale forbedringer i kirurgiske teknikker gjennom årene4. Direkte ende-til-ende spenningsfri epineural reparasjon danner gullstandarden kirurgisk rekonstruksjon. Men i tilfeller med utvidede nervehull interposisjon av en autolog nervegraft har vist seg å være overlegen5,6. Den tilknyttede donorstedet sykelighet og begrenset tilgjengelighet av autologe nervetransplantasjoner har pålagt behovet for alternative teknikker7,8.

Eksperimentelle dyremodeller har blitt brukt til å belyse mekanismen for perifer nerveregenerering og for å evaluere resultatene av en rekke rekonstruktive og farmakologiske behandlingsalternativer8,9. Rotte isjias nervemodellen er den mest brukte dyremodellen10. Deres lille størrelse gjør dem enkle å håndtere og huse. På grunn av deres superlative nevroregenerative potensial, kan den reduserte tiden mellom intervensjon og evaluering av resultater resultere i relativt lavere kostnader11,12. Andre fordeler ved bruken inkluderer morfologiske likheter med menneskelige nervefibre og det høye antallet komparative / historiske studier13. Selv om sistnevnte bør nærmer seg forsiktig, som et bredt utvalg av forskjellige utfallstiltak mellom studier gjør det vanskelig å sammenligne resultater14,15,16,17,18.

Utfallstiltak for å vurdere nerveregenerering spenner fra elektrofysiologi til histomorfometri, men disse metodene innebærer en korrelasjon, men måler ikke nødvendigvis direkte retur av motorisk funksjon14,15. Det kan hende at regenererende nervefibre ikke gir riktige tilkoblinger som kan føre til overestimering av antall funksjonelle tilkoblinger14,15,19,20. Den beste og klinisk mest relevante målingen for å demonstrere riktig reinnervasjon av endeorganer forblir vurdering av muskelfunksjon21,22,23. Det er imidlertid utfordrende å lage motorfunksjonsvurderingsverktøy for dyremodeller. Medinaceli et al. beskrev først gåbaneanalysen, som siden har vært den mest brukte metoden for å evaluere funksjonell utvinning i eksperimentelle perifere nervestudier21,24,25,26,27,28. Gåbaneanalysen kvantifiserer isjiasfunksjonsindeksen (SFI) basert på målinger av potetrykk fra vandrende rotter21,29. Store begrensninger i gåbaneanalysen, som tåkontrakturer, automutilation, smøring av trykket og dårlig korrelasjon med andre tiltak for reinnervasjon, har nødvendiggjort bruken av andre parametere for kvantifisering av funksjonell utvinning30,31.

I tidligere studier i Lewis rotter32 og New Zealand kaniner33, validerte vi den isometriske tetaniske kraften (ITF) måling for tibialis fremre (TA) muskel og demonstrerte effektiviteten i evalueringen av muskelgjenoppretting etter forskjellige typer nervereparasjon34,35,36,37,38,39. TA-muskelen er godt egnet på grunn av sin relativt store størrelse, innervasjon av den peroneale grenen av isjiasnerven og godt belyste biokjemiske egenskaper40,41,42,43. Når muskellengde (preload force) og elektriske parametere er optimalisert, gir ITF en side-til-side-variasjon på henholdsvis 4,4% og 7,5% hos rotter32 og kaniner33.

Denne artikkelen gir en detaljert protokoll for ITF-målingen i rottes isjiasnervemodellen, inkludert en grundig beskrivelse av nødvendig pre-kirurgisk planlegging, kirurgisk tilnærming og disseksjon av den vanlige peroneale nerven og den distale TA-muskelsenen. Ved hjelp av forhåndsbestemte verdier for stimulusintensiteten og varigheten vil den optimale muskellengden og stimuluspulsfrekvensen bli definert. Med disse fire parameterne kan ITF-en deretter måles konsekvent og nøyaktig.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyreprosedyrer ble utført med godkjenning fra Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC A334818).

1. Kalibrering av krafttransduseren

  1. Kontroller at datamaskinen er riktig koblet til DEN multifunksjonelle DAQ-enheten (USB-6009 Multifunctional I/O), som igjen skal kobles til krafttransduseren.
    MERK: Andre rottestammer og arter kan kreve en annen lastcellekrafttransduser, da høyere krefter forventes 44.
  2. Fest en tilpasset klemme laget fra en modifisert kirurgisk hemostat til krafttransduseren som er montert på en vakuumbase justerbar spakarm.
    MERK: Den skreddersydde klemmen består av en kirurgisk hemostat modifisert med en strammeskrue som gjør det mulig å justere spenningen (Figur 1).
  3. Plasser den skreddersydde akrylglasstestplattformen, som inneholder to treblokker for fiksering av rottebenet, på bordet.
    MERK: Andre materialer som uretan kan også brukes i stedet for tre så lenge K-ledningene er i stand til å trenge inn og fiksere.
  4. Fest klemmen, krafttransduseren og den justerbare spakarmkombinasjonen vertikalt til testplattformen ved hjelp av vakuumbasen.
  5. Fest en krok eller sløyfe til klemmen for kalibreringsvektene.
  6. Slå på datamaskinen og åpne programvaren (f.eks.
  7. Når programvaren er åpnet, starter du det skreddersydde virtuelle instrumentet (VI) for ITF-måling (Figur 2).
    MERK: Figur 2 inneholder LabVIEW-koden i en VI-kodebit. Denne VI-kodebiten kan dras til blokkdiagrammet i LabVIEW. Den blir automatisk omgjort til en grafisk kode. For dette eksperimentet ble samplingsfrekvensen satt til 2000 Hz med 25 prøver å lese for hver iterasjon.
  8. Kjør VI ved å trykke på den hvite pilen i venstre øvre hjørne og velg Ny kalibrering. Et nytt vindu åpnes.
  9. Start kalibreringsprosessen med null vekt (bare klemmen med en festet krok eller sløyfe) og trykk på OK.
  10. Legg deretter til 10, 20, 30 og 50 gram vekt og trykk OK mellom hver vektmåling.
  11. Når alle de fem målingene er samlet inn, klikker du på Prosess.
  12. Godta bare verdiene hvis diagrammet i VI viser en positiv lineær kurve (Figur 3).
  13. Omplasser klemmen, krafttransduseren og den justerbare spakarmkombinasjonen horisontalt på testplattformen. Dette vil være stillingen som brukes til å måle ITF.
  14. Klikk på Null, og vinduet lukkes automatisk.

2. Dyrepersoner

  1. Bruk mannlige Lewis rotter som veier mellom 300-500 g.
    MERK: For sammenligning av nerveregenerering er det viktig å bruke samme rottestamme i både kontroll- og eksperimentelle grupper, siden vekt og forekomst av autotomi er belastningsavhengig og kan påvirke resultatene av ITF10,32,45,46,47.

3. Kirurgisk forberedelse

  1. Forbered alle nødvendige kirurgiske instrumenter før operasjonen (Tabell over materialer).
  2. Vei dyrene for å bestemme den nødvendige mengden anestesi.
  3. Induser anestesi ved å plassere rotten i et kammer gasset med 3% isofluran i oksygen.
  4. Bedøv rotten dypt ved hjelp av en cocktail av ti deler ketamin (100 mg/ml) og endelt xylazin (100 mg/ml) i en dose på 1 ml/kg kroppsvekt via en intraperitoneal injeksjon. Overvåk dybden av anestesi basert på responsen på en tåklemme og ved å observere luftveiene.
  5. Omtrent 30 minutter etter den første dosen av ketamin/xylazincocktail, administrer en supplerende dose på 0,3-0,6 ml/kg kroppsvekt på bare ketamin (100 mg/ml) intraperitonealt for å opprettholde tilstrekkelig anestesi gjennom hele prosedyren, som er definert som en lav respiratorisk hastighet og en fraværende respons på en tåklemme.
    FORSIKTIG: Det er viktig å omhyggelig administrere den nødvendige anestesi da en overdose ikke kan motvirkes.
  6. Barber forsiktig bakbenene på rotten ved hjelp av elektriske clippers.
  7. Plasser rotten i utsatt posisjon på en varmepute for å opprettholde kroppstemperaturen ved 37 °C. Eventuelt kan kroppstemperaturen overvåkes ved hjelp av et rektalt termometer.
  8. Injiser 5 ml 0,9% natriumklorid (NaCl) subkutant i løs hud over rottens hals for å bevare en tilstrekkelig hydreringsstatus gjennom hele prosedyren.
  9. På grunn av ikke-overlevelsesmessig karakter av denne prosedyren, krever ikke det kirurgiske feltet og instrumentene å være sterile. Kirurgen bør bruke personlig verneutstyr (PVU) og kirurgiske lupes anbefales for riktig visualisering av anatomiske strukturer.

4. Kirurgisk tilnærming til den vanlige peroneale nerven

  1. Plasser rotten i enten høyre eller venstre sideposisjon, avhengig av hvilken side som skal måles først.
  2. Lag et 2-3 cm snitt i huden på det bakre låret parallelt med lårbenet som starter ved større trochanter ved hjelp av et kirurgisk nr.
  3. Identifiser flyet mellom biceps femoris muskelen og gluteus maximus og vastus lateralis muskler og utføre en stump disseksjon ved hjelp av tenotomy saks for å skille disse musklene og eksponere den underliggende isjiasnerven.
  4. Finn trifurkasjonen av isjiasnerven og plasser en retraktor for å få bedre tilgang. De tre grenene av isjiasnerven inkluderer den vanlige peroneale nerven, tibialisnerven og den surale nerven.
  5. Isoler den vanlige peroneale nervegrenen (vanligvis den mest ventrale grenen) av isjiasnerven ved hjelp av en buet mikrokirurgisk tang.
    MERK: I tilfelle usikkerhet stimulerer du forsiktig den isolerte nerven med en kirurgisk nervestimulator og observerer motorresponsen. Stimulering av den vanlige peroneale nerven resulterer i dorsiflexion av poten.

5. Disseksjon av distal tibialis fremre muskel sene

  1. For å eksponere TA-muskelen og dens innsetting, oppse huden på det anterolaterale aspektet av underbenet, starter ved kneleddet og synker ned til middelmådig side av bakpoten.
  2. Disseker den distale TA muskel senen fra det omkringliggende vevet ved hjelp av en skalpell med et kirurgisk blad nr.
  3. Ved hjelp av mygg tang, direkte dissekere TA muskel sene mot innsetting og kutte senen så distal som mulig. La den proksimale TA-muskelen være uforstyrret, og bevarer den nevrovaskulære pedicle.
    MERK: Fukt TA-muskelen regelmessig (ca. hvert 5. minutt) med oppvarmede 0,9 % NaCl (37 °C) for å forhindre kjøling og uttørking.

6. Isometrisk tetanisk kraftmåling

  1. Koble de bipolare elektrodekablene og jordkabelen i henhold til fargen til en bipolar stimulatorenhet.
  2. Fest den andre enden av de bipolare elektrodekablene til en subminiatylektrode.
    MERK: Referanseelektroden (rød, anode) skal plasseres distal og den aktive elektroden (svart, katode) proksimal.
  3. Overfør dyret sammen med varmeputen til testplattformen.
  4. Fest rottens bakre lem til treblokken ved hjelp av to 1 mm Kirschner-ledninger gjennom ankelen og den laterale kondylen til den distale lårbenet som unngår det bakre aspektet av kneet.
    FORSIKTIG: Unngå vaskulær skade på popliteal arterien og venen som er plassert dorsally til lårbenet condyle.
  5. Fest en holder med en tilpasset klemme til testplattformen ved hjelp av vakuumbasen.
  6. Fest den distale TA muskelsenen til klemmen festet til krafttransduseren.
    MERK: Klemmen og krafttransduseren skal plasseres parallelt med ta-muskelen.
  7. Plasser retraktoren på rottens bakre lår for å få tilgang til den vanlige peroneale nerven.
    MERK: Isjiasnerven og dens grener bør holdes fuktige med oppvarmet 0,9% NaCl (37 °C) for å forhindre kjøling og uttørking.
  8. Sett inn bakkekabelen i de omkringliggende musklene (f.eks. den enorme lateralismuskelen).
    MERK: Grass SD9-stimulatoren krever en jordkabel for å redusere elektriske gjenstander. Nyere stimulatorer krever kanskje ikke en ekstra jordkabel.
  9. Hekt den vanlige peroneale nerven til subminiatylektroden og fest posisjonen ved hjelp av holderen på plattformen (figur 4).
    MERK: Pass på at bare den vanlige peroneale nerven er koblet til subminiatylektroden.
  10. Optimalisering av muskellengden
    1. Slå på den bipolare stimulatorenheten og juster innstillingene som følger: firkantet monofasisk puls, forsinkelse 2 ms, stimuluspulsvarighet 0,4 ms, stimulusintensitet 2 V.
      MERK: Forsinkelsen bestemmer tiden mellom synkroniseringspulsen og leveringen av forkanten av pulsen.
    2. Velg Parametertest, og slå på Utløsersamling i VI.
    3. Øk muskellengden (forhåndslasting) ved å justere spakarmen som er festet til krafttransduseren.
    4. Start ved 10 g preload og bruk trinn på 10 g til maksimal aktiv muskelkraft er bestemt.
    5. For hver forhåndsinnlasting, bruk to enkle rykninger rett etter hverandre ved hjelp av knappen på den bipolare stimulatorenheten. Utgangen vil være synlig på skjermen, og rotten skal vise dorsiflexion av poten.
      MERK: Før du stimulerer nerven, må du alltid fjerne overflødig 0,9 % NaCl rundt nerven ved hjelp av bomullsspissede applikatorer for å sikre at signalet ikke utføres til det omkringliggende vevet.
    6. Hvis du vil stoppe målingen, trykker du på Trigger collection igjen i VI.
    7. Hvis programmet automatisk oppdager de to topputgangskreftene, klikker du på Godta. Hvis programmet ikke velger disse utgangskreftene automatisk, trykker du på Avslå og velger toppene manuelt. De to høyeste produksjonskreftene vil i gjennomsnitt være en gjennomsnittlig toppeffektstyrke (figur 5).
    8. Beregn den aktive muskelkraften ved å trekke preloaden fra gjennomsnittlig toppeffektkraft.
    9. Skriv ned den aktive kraften for hver forhåndsinnlasting for å visualisere trenden og gjenkjenne den maksimale aktive kraften (figur 6). Et regneark kan også brukes.
  11. Måling av isometrisk tetanisk kraft
    1. Etter å ha bestemt den ideelle muskellengden, la muskelen hvile ved null preload i 5 minutter før du starter de stive muskelsammentrekningene.
    2. Bytt i mellomtiden fra parametertest til frekvenstest på VI og juster stimulusintensiteten til 10 V på den bipolare stimulatorenheten.
    3. Hold henholdsvis forsinkelses- og stimuluspulsvarigheten på henholdsvis 2 ms og 0,4 ms.
    4. Mål den isometriske tetaniske muskelkraften ved hjelp av økende stimulansfrekvenser som starter på 30 Hz med trinn på 30 Hz til maksimalt kraftplatå observeres.
    5. Klikk på Trigger samling og satt til den forhåndsbestemte optimale muskellengden.
    6. Trykk på Gjenta-knappen på den bipolare stimulatorenheten for å indusere en stivkrampestimulering i maksimalt 5 sekunder eller til en krafttopp er tydelig observert.
      MERK: Før du stimulerer nerven, må du alltid fjerne overflødig 0,9 % NaCl rundt nerven ved hjelp av bomullsspissede applikatorer for å sikre at signalet ikke utføres til det omkringliggende vevet.
    7. Hvis du vil samle inn dataene, trykker du på Utløs innsamling på nytt og dokumenterer den maksimale utdataene. Hvis programmet ikke automatisk oppdager den høyeste maksimale utgangskraften, trykker du på Avslå og velger toppen manuelt.
    8. La muskelen hvile igjen ved null preload i 5 minutter før du starter neste stivkrampe muskelsammentrekninger.
      MERK: Fukt TA-muskelen regelmessig (ca. hvert 5. minutt) med oppvarmede 0,9 % NaCl (37 °C) for å forhindre kjøling og uttørking.
    9. Fortsett å øke stimulansfrekvensen til det maksimale kraftplatået er nådd. Kraftplatået vil bli definert som maksimal isometrisk tetanisk kraft.
      MERK: Etter dette trinnet fjerner du K-ledningene, stifter eller suturerer huden og gjentar hele prosedyren til det kontralaterale bakre lemmet, fra trinn 4.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Fem parametere brukes til å måle ITF-målingen. Disse inkluderer muskelspenning (preload force), stimulusintensitet (spenning), stimuluspulsfrekvens, stimulusvarighet på 0,4 ms og en forsinkelse på 2 ms. Før du måler ITF, må den optimale muskelspenningen bestemmes ved hjelp av to enkelt rykninger muskelsammentrekninger med en intensitet på 2 V under parametertesten. Disse stimuliene forårsaker dorsiflexion av poten og produserer et utgangssignal på grafen i VI (figur 5). Disse enkle rykningskurvene har ideelt sett en rask vertikal oppsving som representerer sammentrekningsperioden direkte etterfulgt av en langsommere vertikal reduksjonsperiode som viser avslapningsperioden. Programmet vil i gjennomsnitt ha disse to toppeffektkreftene, men den aktive kraften må beregnes manuelt ved å trekke preload-kraften fra gjennomsnittlig utgangskraft. I eksemplet i figur 5resulterer en forhåndsinnlasting på 10 g i to toppeffektkrefter på 411,09 g (4,03 N) og 379,78 g (3,73 N), som i gjennomsnitt er en gjennomsnittlig toppeffektstyrke på 395,43 g (3,88 N). Når de aktive kreftene til hver forhåndsinnlasting er plottet inn i en graf, kan maksimal aktiv kraft identifiseres. Disse aktive kreftene produserer vanligvis en klokkeformet kurve, og den maksimale aktive kraften for Lewis-rotter som veier 300-500 g, bør være rundt 30-40 g (0,29-0,39 N) (figur 6).

For de tetanske stimuleringene under frekvenstesten økes stimulusintensiteten til en supra-maksimal spenning (10 V) for å sikre maksimal aktivering av alle TA muskelmotorenheter ved hjelp av økende frekvenser. Den optimale tetaniske kurven øker og minker kraftig og har en sakte avtagende platåfase med minimale svingninger. Figur 7 viser et eksempel på en stivkrampe kurve med en stimulusfrekvens på 30 Hz med en isometrisk tetanisk kraft på 803,25 g (7,88 N). Det høyeste kraftplatået er definert som maksimal ITF.

Figure 1
Figur 1: Bilde av tilpasset klemme laget av en kirurgisk hemostat og modifisert med en strammeskrue som gjør det mulig å justere spenningen.

Figure 2
Figur 2: Grafisk kode for virtuelt instrument for isometrisk tetanisk kraftmåling på LabVIEW. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Kalibrering av krafttransduseren. Vellykket kalibrering av krafttransduseren med fem vekter (0, 10, 20, 30 og 50 g) bør resultere i en positiv lineær kurve. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Skjematisk oversikt over eksperimentelt oppsett for isometrisk tetanisk kraftmåling. (Opphavsrettsbeskyttet og brukt med tillatelse fra Mayo Foundation for Medical Education and Research; alle rettigheter forbeholdt. Gjengitt fra: Shin, R. H. et al. Isometrisk tetanisk kraftmålingsmetode for tibialis fremre i rotten. Mikrokirurgi. 28 (6), 452-457 (2008)). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Representative enkle rykningskurver for optimalisering av muskellengde. For hver forhåndsinnlastingsmåling påføres to enkle rykninger. Disse enkle rykningskurvene har en rask vertikal oppsving (sammentrekningsperiode) etterfulgt av en vertikal nedgang (avslapningsperiode). De to toppproduksjonskreftene vil i gjennomsnitt være en gjennomsnittlig toppproduksjonsstyrke. I dette eksemplet med en Lewis-rotte resulterer en forhåndsbelastning på 10 g i to toppeffektkrefter på 411,09 g (4,03 N) og 379,78 g (3,73 N), som i gjennomsnitt er en gjennomsnittlig toppeffektstyrke på 395,43 g (3,88 N). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Optimal muskellengde (forhåndslasting). Den aktive muskelkraften kan beregnes ved å trekke preloaden fra gjennomsnittlig toppeffektkraft. Den aktive muskelkraften for hver preload bør dokumenteres til en dråpe i aktiv muskelkraft er synlig. Forhåndsbelastningen som gir den høyeste aktive muskelkraften, vil bli brukt til å måle den isometriske tetaniske kraften. Den optimale forlastingen for Lewis-rotter som veier 300-500 g, bør være rundt 30-40 g (0,29-0,39 N) (N =10). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 7
Figur 7: Representativ isometrisk stivkrampekurve. Den optimale tetaniske kurven øker kraftig, og har deretter en sakte avtagende platåfase etterfulgt av en kraftig nedgang. Det høyeste kraftplatået er definert som maksimal ITF. Dette eksemplet viser den stive kurven med en stimulusfrekvens på 30 Hz med en isometrisk tetanisk kraft på 803,25 g (7,88 N). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokollen beskriver en tidligere validert metode for å oppnå nøyaktige maksimale ITF-målinger av TA-muskelen i rottemodellen32. Gjenvinning av maksimal styrke etter eksperimentelle nerverekonstruksjonsbehandlinger er av primær interesse for den kliniske innstillingen, da det beviser at nerven ikke bare regenererte, men også gjorde arbeidsforbindelser med målmuskelen. ITF kan brukes i en liten nervegapmodell, for eksempel rottes isjiasnervemodellen32, og med noen få modifikasjoner på protokollen kan den også brukes i en større nervegapkaninmodell33.

Det er flere kritiske trinn som bør vurderes for å sikre konsistente og pålitelige maksimale isometriske muskelkraftmålinger. Viktigheten av å nøye velge type anestesi for å forhindre skjelettmuskulatur bivirkninger har tidligere blitt beskrevet32,33. Bruken av isofluran har vist en tidsavhengig reduksjon i muskelkraft, noe som kan forklares med sin evne til å indusere sarkoplasmatisk retikulum stimulert frigjøring av kalsium33,48. Effekten av ketamin/xylazin på muskelkraften har vist seg å være minimal basert på vår erfaring og tidligere studie32. Sikker festing av den distale TA muskel senen til krafttransduseren er også av stor betydning for nøyaktige målinger. Glidning eller riving av senen bør forhindres eller korrigeres direkte. Derfor ble en skreddersydd klemme opprettet fra en kirurgisk hemostat og modifisert med en strammeskrue. Andre forskningsgrupper har beskrevet en teknikk for tørking av senen i ca 30 minutter for å mekanisk styrke grensesnittet mellom senen og en klemme49. For å opprettholde utholdenheten i muskelen er det viktig å unngå uttørking av TA-muskelen og senen med varm 0,9% NaCl og implementere en 5-minutters hvileperiode mellom hver stivkratisk stimulering. Hvileperioden er basert på aktiviteten til phosphagen-systemet, også kjent som den umiddelbare energikilden, som er viktig for eksplosive muskelsammentrekninger. Den består av adenosin triphosfat (ATP) og kreatinfosfataktivitet og gir energi til mindre enn 10 sekunder med maksimal aktivitet. Det tar omtrent 3-5 minutter å fylle opp 100% av phosphagens50.

Vi gjenkjenner begrensningene til metoden som er beskrevet i denne videoen. Prosedyrens ikke-overlevelsesnatur tillater ikke serielle målinger over tid. I tillegg er det en detaljert og tidkrevende testprotokoll. I løpet av 1 til 2 timers testtid gjennomgår nerve og muskler et betydelig antall stimuleringer som kan føre til muskeltretthet med potensiell reduksjon i ITF. Dette har imidlertid vist seg å være mindre fremtredende i rottemodellen sammenlignet med kaninen33.

Avslutningsvis er ITF-målingen beskrevet i denne videoen et uvurderlig verktøy i eksperimentelle perifere nervestudier for å kvantifisere motorisk utvinning. Når det presenteres andre utfallsmål som elektrofysiologi og histomorfometri, kan en global vurdering av nervefunksjon gis.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Forskning rapportert i denne publikasjonen ble støttet av National Institute of Neurological Disorders and Stroke of the National Institutes of Health under Award Number RO1 NS 102360. Innholdet er utelukkende forfatternes ansvar og representerer ikke nødvendigvis de offisielle synspunktene til National Institutes of Health.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.9% Sodium Chloride Baxter Healthcare Corporation, Deerfield, IL, USA G130203
1 mm Kirshner wires Pfizer Howmedica, Rutherford, NJ N/A
Adson Tissue Forceps ASSI, Westbury, NY, USA MTK-6801226
Bipolar electrode cables Grass Instrument, Quincy, MA N/A
Bipolar stimulator device Grass SD9, Grass Instrument, Quincy, MA N/A
Cotton-tip Applicators Cardinal Health, Waukegan, IL, USA C15055-006
Curved Mosquito forceps ASSI, Westbury, NY, USA MTK-1201112
Force Transducer MDB-2.5 Transducer Techniques, Temecula, CA N/A
Gauze Sponges 4x4 Covidien, Mansfield, MA, USA 2733
Ground cable Grass Instrument, Quincy, MA N/A
Isoflurane chamber N/A N/A Custom-made
Ketamine Ketalar, Par Pharmaceutical, Chestnut, NJ 42023-115-10
LabView Software National Instruments, Austin, TX
Loop N/A N/A Custom-made
Microsurgical curved forceps ASSI, Westbury, NY, USA JFA-5B
Microsurgical scissors ASSI, Westbury, NY, USA SAS-15R-8-18
Microsurgical straight forceps ASSI, Westbury, NY, USA JF-3
Retractor ASSI, Westbury, NY, USA AG-124426
Scalpel Blade No. 15 Bard-Parker, Aspen Surgical, Caledonia, MI, USA 371115
Slim Body Skin Stapler Covidien, Mansfield, MA, USA 8886803512
Subminiature electrode Harvard Apparatus, Holliston, MA N/A
Surgical Nerve Stimulator Checkpoint Surgical LCC, Cleveland, OH, USA 9094
Terrell Isoflurane Piramal Critical Care Inc., Bethlehem, PA, USA H961J19A
Testing platform N/A N/A Custom-made
Tetontomy Scissors ASSI, Westbury, NY, USA ASIM-187
Traceable Big-Digit Timer/Stopwatch Fisher Scientific, Waltham, MA, USA S407992
USB-6009 multifunctional I/O data acquisition (DAQ) device National Instruments, Austin, TX 779026-01
Vacuum Base Holder Noga Engineering & Technology Ltd., Shlomi, Isreal N/A Attached clamp is custom-made
Weight (10 g) Denver Instruments, Denver, CO, USA 820010.4
Weight (20 g) Denver Instruments, Denver, CO, USA 820020.4
Weight (50 g) Denver Instruments, Denver, CO, USA 820050.4
Xylazine Xylamed, Bimeda MTC Animal Health, Cambridge, Canada 1XYL002

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Taylor, C. A., Braza, D., Rice, J. B., Dillingham, T. The incidence of peripheral nerve injury in extremity trauma. American Journal of Physical Medicine & Rehabilitation. 87 (5), 381-385 (2008).
  2. Huckhagel, T., Nuchtern, J., Regelsberger, J., Lefering, R., TraumaRegister, D. G. U. Nerve injury in severe trauma with upper extremity involvement: evaluation of 49,382 patients from the TraumaRegister DGU(R) between 2002 and 2015. Scandinavian Journal of Trauma, Resuscitation and Emergency Medicine. 26 (1), 76 (2018).
  3. Tapp, M., Wenzinger, E., Tarabishy, S., Ricci, J., Herrera, F. A. The Epidemiology of Upper Extremity Nerve Injuries and Associated Cost in the US Emergency Departments. Annals of Plastic Surgery. 83 (6), 676-680 (2019).
  4. Grinsell, D., Keating, C. P. Peripheral nerve reconstruction after injury: a review of clinical and experimental therapies. BioMed Research International. 2014, 698256 (2014).
  5. Terzis, J., Faibisoff, B., Williams, B. The nerve gap: suture under tension vs. graft. Plastic and Reconstructive Surgery. 56 (2), 166-170 (1975).
  6. Millesi, H. Forty-two years of peripheral nerve surgery. Microsurgery. 14 (4), 228-233 (1993).
  7. Wood, M. D., Kemp, S. W., Weber, C., Borschel, G. H., Gordon, T. Outcome measures of peripheral nerve regeneration. Annals of Anatomy-Anatomischer Anzeiger. 193 (4), 321-333 (2011).
  8. Alvites, R., et al. Peripheral nerve injury and axonotmesis: State of the art and recent advances. Cogent Medicine. 5 (1), 1466404 (2018).
  9. Diogo, C. C., et al. The use of sheep as a model for studying peripheral nerve regeneration following nerve injury: review of the literature. Journal of Neurology Research. 39 (10), 926-939 (2017).
  10. Irintchev, A. Potentials and limitations of peripheral nerve injury models in rodents with particular reference to the femoral nerve. Annals of Anatomy. 193 (4), 276-285 (2011).
  11. Brenner, M. J., et al. Role of timing in assessment of nerve regeneration. Microsurgery. 28 (4), 265-272 (2008).
  12. Vleggeert-Lankamp, C. L. The role of evaluation methods in the assessment of peripheral nerve regeneration through synthetic conduits: a systematic review. Laboratory investigation. Journal of Neurosurgery. 107 (6), 1168-1189 (2007).
  13. Deumens, R., Marinangeli, C., Bozkurt, A., Brook, G. A. Assessing motor outcome and functional recovery following nerve injury. Methods in Molecular Biology. 1162, 179-188 (2014).
  14. Dellon, A. L., Mackinnon, S. E. Selection of the appropriate parameter to measure neural regeneration. Annals of Plastic Surgery. 23 (3), 197-202 (1989).
  15. Munro, C. A., Szalai, J. P., Mackinnon, S. E., Midha, R. Lack of association between outcome measures of nerve regeneration. Muscle Nerve. 21 (8), 1095-1097 (1998).
  16. Varejao, A. S., Melo-Pinto, P., Meek, M. F., Filipe, V. M., Bulas-Cruz, J. Methods for the experimental functional assessment of rat sciatic nerve regeneration. Journal of Neurology Research. 26 (2), 186-194 (2004).
  17. Hadlock, T. A., Koka, R., Vacanti, J. P., Cheney, M. L. A comparison of assessments of functional recovery in the rat. Journal of the Peripheral Nervous System. 4 (3-4), 258-264 (1999).
  18. Kanaya, F., Firrell, J. C., Breidenbach, W. C. Sciatic function index, nerve conduction tests, muscle contraction, and axon morphometry as indicators of regeneration. Plastic and Reconstructive Surgery. 98 (7), 1264-1271 (1996).
  19. Nichols, C. M., et al. Choosing the correct functional assay: a comprehensive assessment of functional tests in the rat. Behavioural Brain Research. 163 (2), 143-158 (2005).
  20. Terzis, J. K., Smith, K. J. Repair of severed peripheral nerves: comparison of the "de Medinaceli" and standard microsuture methods. Experimental Neurology. 96 (3), 672-680 (1987).
  21. de Medinaceli, L., Freed, W. J., Wyatt, R. J. An index of the functional condition of rat sciatic nerve based on measurements made from walking tracks. Experimental Neurology. 77 (3), 634-643 (1982).
  22. Doi, K., Hattori, Y., Tan, S. H., Dhawan, V. Basic science behind functioning free muscle transplantation. Clinics in Plastic Surgery. 29 (4), (2002).
  23. Vathana, T., et al. An Anatomic study of the spinal accessory nerve: Extended harvest permits direct nerve transfer to distal plexus targets. Clinical Anatomy. 20 (8), 899-904 (2007).
  24. Chaiyasate, K., Schaffner, A., Jackson, I. T., Mittal, V. Comparing FK-506 with basic fibroblast growth factor (b-FGF) on the repair of a peripheral nerve defect using an autogenous vein bridge model. Journal of Investigative Surgery. 22 (6), 401-405 (2009).
  25. Lee, B. K., Kim, C. J., Shin, M. S., Cho, Y. S. Diosgenin improves functional recovery from sciatic crushed nerve injury in rats. Journal of Exercise Rehabilitation. 14 (4), 566-572 (2018).
  26. Lubiatowski, P., Unsal, F. M., Nair, D., Ozer, K., Siemionow, M. The epineural sleeve technique for nerve graft reconstruction enhances nerve recovery. Microsurgery. 28 (3), 160-167 (2008).
  27. Luis, A. L., et al. Use of PLGA 90:10 scaffolds enriched with in vitro-differentiated neural cells for repairing rat sciatic nerve defects. Tissue Engineering, Part A. 14 (6), 979-993 (2008).
  28. Shabeeb, D., et al. Histopathological and Functional Evaluation of Radiation-Induced Sciatic Nerve Damage: Melatonin as Radioprotector. Medicina. 55 (8), Kaunas. (2019).
  29. Bain, J. R., Mackinnon, S. E., Hunter, D. A. Functional evaluation of complete sciatic, peroneal, and posterior tibial nerve lesions in the rat. Plastic and Reconstructive Surgery. 83 (1), 129-138 (1989).
  30. Monte-Raso, V. V., Barbieri, C. H., Mazzer, N., Yamasita, A. C., Barbieri, G. Is the Sciatic Functional Index always reliable and reproducible. Journal of Neuroscience Methods. 170 (2), 255-261 (2008).
  31. Lee, J. Y., et al. Functional evaluation in the rat sciatic nerve defect model: a comparison of the sciatic functional index, ankle angles, and isometric tetanic force. Plastic and Reconstructive Surgery. 132 (5), 1173-1180 (2013).
  32. Shin, R. H., et al. Isometric tetanic force measurement method of the tibialis anterior in the rat. Microsurgery. 28 (6), 452-457 (2008).
  33. Giusti, G., et al. Description and validation of isometric tetanic muscle force test in rabbits. Microsurgery. 32 (1), 35-42 (2012).
  34. Bulstra, L. F., et al. Functional Outcome after Reconstruction of a Long Nerve Gap in Rabbits Using Optimized Decellularized Nerve Allografts. Plastic and Reconstructive Surgery. 145 (6), 1442-1450 (2020).
  35. Giusti, G., et al. The influence of vascularization of transplanted processed allograft nerve on return of motor function in rats. Microsurgery. 36 (2), 134-143 (2016).
  36. Giusti, G., et al. The influence of nerve conduits diameter in motor nerve recovery after segmental nerve repair. Microsurgery. 34 (8), 646-652 (2014).
  37. Hundepool, C. A., et al. Comparable functional motor outcomes after repair of peripheral nerve injury with an elastase-processed allograft in a rat sciatic nerve model. Microsurgery. 38 (7), 772-779 (2018).
  38. Lee, J. Y., et al. The effect of collagen nerve conduits filled with collagen-glycosaminoglycan matrix on peripheral motor nerve regeneration in a rat model. Journal of Bone and Joint Surgery. 94 (22), 2084-2091 (2012).
  39. Shin, R. H., Friedrich, P. F., Crum, B. A., Bishop, A. T., Shin, A. Y. Treatment of a segmental nerve defect in the rat with use of bioabsorbable synthetic nerve conduits: a comparison of commercially available conduits. Journal of Bone and Joint Surgery. 91 (9), 2194-2204 (2009).
  40. Coombes, J. S., et al. Effects of vitamin E deficiency on fatigue and muscle contractile properties. Eur J Appl Physiol. 87 (3), 272-277 (2002).
  41. Kauvar, D. S., Baer, D. G., Dubick, M. A., Walters, T. J. Effect of fluid resuscitation on acute skeletal muscle ischemia-reperfusion injury after hemorrhagic shock in rats. Journal of the American College of Surgeons. 202 (6), 888-896 (2006).
  42. Murlasits, Z., et al. Resistance training increases heat shock protein levels in skeletal muscle of young and old rats. Experimental Gerontology. 41 (4), 398-406 (2006).
  43. Zhou, Z., Cornelius, C. P., Eichner, M., Bornemann, A. Reinnervation-induced alterations in rat skeletal muscle. Neurobiology of Disease. 23 (3), 595-602 (2006).
  44. Schmoll, M., et al. In-situ measurements of tensile forces in the tibialis anterior tendon of the rat in concentric, isometric, and resisted co-contractions. Physiological Reports. 5 (8), (2017).
  45. Heinzel, J. C., Hercher, D., Redl, H. The course of recovery of locomotor function over a 10-week observation period in a rat model of femoral nerve resection and autograft repair. Brain and Behavior. 10 (4), 01580 (2020).
  46. Kingery, W. S., Vallin, J. A. The development of chronic mechanical hyperalgesia, autotomy and collateral sprouting following sciatic nerve section in rat. Pain. 38 (3), 321-332 (1989).
  47. Weber, R. A., Proctor, W. H., Warner, M. R., Verheyden, C. N. Autotomy and the sciatic functional index. Microsurgery. 14 (5), 323-327 (1993).
  48. Kunst, G., Graf, B. M., Schreiner, R., Martin, E., Fink, R. H. Differential effects of sevoflurane, isoflurane, and halothane on Ca2+ release from the sarcoplasmic reticulum of skeletal muscle. Anesthesiology. 91 (1), 179-186 (1999).
  49. Schmoll, M., et al. A novel miniature in-line load-cell to measure in-situ tensile forces in the tibialis anterior tendon of rats. PLoS One. 12 (9), 0185209 (2017).
  50. Paul, R. J. Cell Physiology Source Book (Fourth Edition). Sperelakis, N. , Academic Press. 801-821 (2012).

Tags

Nevrovitenskap Utgave 172 Nerveskade nerveregenerering isjiasnerven funksjonell gjenoppretting motorisk funksjon tetanisk muskelkraft rottemodell
Maksimal isometrisk tetanisk kraftmåling av Tibialis fremre muskel i rotten
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bedar, M., Saffari, T. M.,… More

Bedar, M., Saffari, T. M., Friedrich, P. F., Giusti, G., Bishop, A. T., Shin, A. Y. Maximum Isometric Tetanic Force Measurement of the Tibialis Anterior Muscle in the Rat. J. Vis. Exp. (172), e61926, doi:10.3791/61926 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter