Summary
La valutazione del recupero motorio rimane la misura di risultato di riferimento negli studi sperimentali sui nervi periferici. La misurazione della forza tetanica isometrica del muscolo tibiale anteriore nel ratto è uno strumento inestimabile per valutare gli esiti funzionali dopo la ricostruzione dei difetti nervosi sciatici. I metodi e le sfumature sono dettagliati in questo articolo.
Abstract
Le lesioni nervose traumatiche si traducono in una sostanziale perdita funzionale e difetti nervosi segmentali spesso richiedono l'uso di innesti nervosi di interposizione autologa. A causa della loro limitata disponibilità e della morbilità laterale associata del donatore, molti studi nel campo della rigenerazione nervosa si concentrano su tecniche alternative per colmare un gap nervoso segmentale. Al fine di indagare i risultati delle opzioni di trattamento sperimentale chirurgico o farmacologico, il modello di nervo sciatico del ratto è spesso usato come saggio biologico. Esistono una varietà di misurazioni dei risultati utilizzate nei modelli di ratto per determinare l'estensione della rigenerazione nervosa. La forza massima di uscita del muscolo bersaglio rimane il risultato più rilevante per la traduzione clinica di terapie sperimentali. La misurazione isometrica della forza della contrazione muscolare tetanica è stata precedentemente descritta come una tecnica riproducibile e valida per valutare il recupero motorio dopo la lesione nervosa o la riparazione sia nei modelli di ratto che di coniglio. In questo video, forniremo un'istruzione passo-passo di questa procedura inestimabile per la valutazione del recupero funzionale del muscolo anteriore tibiale in un modello di difetto del nervo sciatico del ratto utilizzando parametri ottimizzati. Descriveremo i necessari preparati pre-chirurgici oltre all'approccio chirurgico e alla dissezione del comune nervo peroneale e del tendine muscolare anteriore tibialis. La tecnica di misurazione della forza tetanica isometrica sarà dettagliata. Viene spiegato determinare la lunghezza muscolare ottimale e la frequenza dell'impulso di stimolo e misurare la massima contrazione muscolare tetanica.
Introduction
La perdita della funzione motoria a seguito di lesioni traumatiche del nervo periferico ha un impatto significativo sulla qualità della vita e sullo statosocioeconomico dei pazienti 1,2,3. La prognosi di questa popolazione di pazienti rimane scarsa a causa di miglioramenti minimi nelle tecniche chirurgiche nel corso degli anni4. La riparazione epineurale diretta end-to-end senza tensione forma la ricostruzione chirurgica gold standard. Tuttavia, nei casi con intervalli nervosi estesi l'interposizione di un innesto nervoso autologo si è dimostratasuperiore a 5,6. La morbilità del sito donatore associato e la limitata disponibilità di innesti nervosi autologi hanno imposto la necessità di tecniche alternative7,8.
Modelli animali sperimentali sono stati utilizzati per chiarire il meccanismo di rigenerazione dei nervi periferici e per valutare i risultati di una varietà di opzioni di trattamento ricostruttivo efarmacologico 8,9. Il modello di nervo sciatico del ratto è il modello animale10 più frequentemente utilizzato. Le loro piccole dimensioni li rendono facili da maneggiare e ospitare. A causa del loro potenziale neuroregenerativo superlativo, il tempo ridotto tra l'intervento e la valutazione dei risultati può comportare costirelativamente inferiori 11,12. Altri vantaggi del suo uso includono somiglianze morfologiche con le fibre nervose umane e l'alto numero di studi comparativi / storici13. Sebbene questi ultimi debbano essere avvicinati con cautela, poiché un'ampia varietà di diverse misure di risultato tra gli studi rende difficile confrontarei risultati 14,15,16,17,18.
Le misure di risultato per valutare la rigenerazione nervosa vanno dall'elettrofisiologia all'istomorfometria, ma questi metodi implicano una correlazione ma non misurano necessariamente direttamente ilritorno della funzione motoria 14,15. Le fibre nervose rigeneranti potrebbero non creare connessioni appropriate che possono causare una sopravvalutazione del numero di connessioni funzionali14,15,19,20. La misurazione migliore e clinicamente più rilevante per dimostrare la corretta reinnervazione degli organi finali rimane la valutazione della funzionemuscolare 21,22,23. La creazione di strumenti di valutazione delle funzioni motorie per i modelli animali è, tuttavia, impegnativa. ha descritto per la prima volta l'analisi della pista da passeggio, che da allora è stato il metodo più frequentemente utilizzato per valutare il recupero funzionale negli studi sperimentali sui nervi periferici21,24,25, 26,27,28. L'analisi della pista da passeggio quantifica l'indice funzionale sciatico (SFI) sulla base delle misurazioni delle impronte delle zampe dei ratti checamminano 21,29. Le principali limitazioni dell'analisi dei sentieri, come le contratture, l'automutilazione, lo sbavatura della stampa e la scarsa correlazione con altre misure di reinnervazione, hanno reso necessario l'uso di altri parametri per la quantificazione delrecupero funzionale 30,31.
In precedenti studi su ratti Lewis32 e conigli neozelandesi33, abbiamo convalidato la misurazione della forza tetanica isometrica (ITF) per il muscolo tibiale anteriore (TA) e dimostrato la sua efficacia nella valutazione del recupero muscolare dopo diversi tipi diriparazione nervosa 34,35,36,37,38,39. Il muscolo TA è adatto a causa delle sue dimensioni relativamente grandi, innervazione da parte del ramo peroneale del nervo sciatico e proprietà biochimiche ben chiarite40,41,42,43. Quando la lunghezza muscolare (forza di precarico) e i parametri elettrici sono ottimizzati, l'ITF fornisce una variabilità side-to-side del 4,4% e del 7,5% rispettivamentenei ratti 32 e nei conigli 33.
Questo articolo fornisce un protocollo dettagliato della misurazione ITF nel modello del nervo sciatico del ratto, inclusa una descrizione approfondita della necessaria pianificazione pre-chirurgica, approccio chirurgico e dissezione del comune nervo peroneale e del tendine muscolare TA distale. Utilizzando valori predeterminati per l'intensità e la durata dello stimolo, verrà definita la lunghezza muscolare ottimale e la frequenza dell'impulso di stimolo. Con questi quattro parametri, l'ITF può essere successivamente misurato in modo coerente e accurato.
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Protocol
Tutte le procedure sugli animali sono state eseguite con l'approvazione del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC A334818).
1. Taratura del trasduttore di forza
- Assicurarsi che il computer sia correttamente collegato al dispositivo daq (Multifunctional I/O Data Acquisition) USB-6009, che a sua volta deve essere collegato al trasduttore di forza.
NOTA: Altri ceppi e specie di ratti possono richiedere un trasduttore di forza delle cellule di carico diverso, poiché si prevede un'elevata forza 44. - Attaccare un morsetto personalizzato modellato da un emostato chirurgico modificato al trasduttore di forza montato su un braccio a leva regolabile in base al vuoto.
NOTA: Il morsetto su misura è costituito da un emostato chirurgico modificato con una vite di serraggio che consente la regolazione della tensione (Figura 1). - Posizionare sul tavolo la piattaforma di prova in vetro acrilico su misura, che contiene due blocchi di legno per il fissazione dell'arto posteriore del ratto.
NOTA: Altri materiali come l'uretano possono essere utilizzati anche al posto del legno purché i fili K siano in grado di penetrare e fissarsi. - Collegare verticalmente il morsetto, il trasduttore di forza e la combinazione regolabile del braccio della leva alla piattaforma di prova utilizzando la sua base sottovuoto.
- Fissare un gancio o un anello al morsetto per i pesi di calibrazione.
- Accendere il computer e aprire il software (ad esempio, LabVIEW).
- Una volta aperto il software, avviare lo strumento virtuale su misura (VI) per la misurazione ITF (Figura 2).
NOTA: la figura 2 contiene il codice LabVIEW in un frammento VI. Questo frammento VI può essere trascinato nel diagramma a blocchi in LabVIEW. Verrà automaticamente trasformato in un codice grafico. Per questo esperimento la frequenza di campionamento è stata impostata a 2000 Hz con 25 campioni da leggere per ogni iterazione. - Eseguire il VI premendo la freccia bianca nell'angolo superiore sinistro e selezionare Nuova calibrazione. Si aprirà una nuova finestra.
- Avviare il processo di calibrazione con peso zero (solo il morsetto con gancio o loop collegato) e premere OK.
- Consecutivamente, aggiungere 10, 20, 30 e 50 grammi di peso e premere OK tra ogni misurazione del peso.
- Una volta raccolte tutte e cinque le misurazioni, fare clic su Processo.
- Accettate i valori solo se il grafico sul VI visualizza una curva lineare positiva (Figura 3).
- Riposizionare il morsetto, il trasduttore di forza e la combinazione del braccio della leva regolabile orizzontalmente sulla piattaforma di prova. Questa sarà la posizione utilizzata per misurare l'ITF.
- Clicca su Zero e la finestra si chiuderà automaticamente.
2. Soggetti animali
- Utilizzare ratti Maschi Lewis del peso compreso tra 300 e 500 g.
NOTA: Per il confronto della rigenerazione nervosa, è imperativo utilizzare lo stesso ceppo di ratto sia nei gruppi di controllo che in quello sperimentale, poiché il peso e l'incidenza dell'autotomia dipendono dallo sforzo e possono influenzare enormemente i risultati dell'ITF10,32,45,46,47.
3. Preparazione chirurgica
- Preparare tutti gli strumenti chirurgici necessari prima dell'intervento chirurgico(Tabella dei materiali).
- Pesare gli animali per determinare la quantità richiesta di anestesia.
- Indurre l'anestesia mettendo il ratto in una camera gassata con il 3% di isoflurane nell'ossigeno.
- Anestetizzare profondamente il ratto utilizzando un cocktail di chetamina in dieci parti (100 mg/mL) e xiazina monotonale (100 mg/mL) ad un dosaggio di 1 mL/kg di peso corporeo mediante iniezione intraperitoneale. Monitorare la profondità dell'anestesia in base alla risposta a un dito del piedi e osservando la frequenza respiratoria.
- Circa 30 minuti dopo il dosaggio iniziale del cocktail chetamina/xiazina, somministrare una dose supplementare di 0,3-0,6 mL/kg di peso corporeo solo di chetamina (100 mg/mL) intraperitoneale per mantenere un'anestesia adeguata durante l'intera procedura, definita come una bassa frequenza respiratoria e una risposta assente a un dito del piedino.
ATTENZIONE: È importante somministrare meticolosamente l'anestesia richiesta in quanto un sovradosaggio non può essere contrastato. - Radere con cura gli arti posteriori del topo usando tosaerba elettriche.
- Posizionare il ratto in posizione prona su un riscaldante per mantenere la temperatura corporea a 37 °C. Opzionalmente, la temperatura corporea può essere monitorata utilizzando un termometro rettale.
- Iniettare 5 mL di cloruro di sodio allo 0,9% (NaCl) per via sottocutanea nella pelle sciolta sul collo del ratto per preservare un adeguato stato di idratazione durante tutta la procedura.
- A causa della natura non di sopravvivenza di questa procedura, il campo chirurgico e gli strumenti non richiedono di essere sterili. Il chirurgo dovrebbe utilizzare dispositivi di protezione individuale (DPI) e le loupes chirurgiche sono consigliate per una corretta visualizzazione delle strutture anatomiche.
4. Approccio chirurgico al comune nervo peroneale
- Posizionare il ratto nella posizione reclinata laterale destra o sinistra a seconda del lato che verrà misurato per primo.
- Creare un'incisione di 2-3 cm nella pelle della coscia posterolaterale parallela al femore a partire dal trochanter maggiore utilizzando una lama chirurgica n. 15.
- Identificare il piano tra il muscolo bicipite femoris e i muscoli gluteo massimo e vastus lateralis ed eseguire una dissezione smussata usando forbici tenotomiche per separare questi muscoli ed esporre il nervo sciatico sottostante.
- Individuare la triforcazione del nervo sciatico e posizionare un riavvolgitore per acquisire un migliore accesso. I tre rami del nervo sciatico includono il comune nervo peroneale, il nervo tibiale e il nervo surale.
- Isolare il comune ramo nervoso peroneale (di solito il ramo più ventrale) del nervo sciatico usando una forcep microchirurgica curva.
NOTA: In caso di incertezza, stimolare delicatamente il nervo isolato con uno stimolatore nervoso chirurgico e osservare la risposta motoria. La stimolazione del comune nervo peroneale provoca la dorsiflessione della zampa.
5. Dissezione del tendine muscolare anteriore della tibiale distale
- Per esporre il muscolo TA e il suo inserimento, incidere la pelle all'aspetto anterolaterale della parte inferiore della gamba, iniziando dall'articolazione del ginocchio e scendendo sul lato mediodorsale della zampa posteriore.
- Sezionare il tendine muscolare TA distale dal tessuto circostante usando un bisturi con una lama chirurgica n. 15.
- Usando una forza di zanzara, sezionare senza mezzi termini il tendine muscolare TA verso l'inserimento e tagliare il tendine il più distale possibile. Lasciare indisturbato il muscolo TA prossimale, preservando il pedicolo neurovascolare.
NOTA: Regolarmente (circa ogni 5 minuti), idratare il muscolo TA con NaCl riscaldato dello 0,9% (37 °C) per prevenire il raffreddamento e l'essiccazione.
6. Misurazione della forza tetanica isometrica
- Collegare i cavi dell'elettrodo bipolare e il cavo di terra in base al loro colore a un dispositivo di stimolatore bipolare.
- Collegare l'altra estremità dei cavi degli elettrodi bipolari a un elettrodo di sottominiatura.
NOTA: L'elettrodo di riferimento (rosso, anodo) deve essere posizionato distale e l'elettrodo attivo (nero, catodo) prossimale. - Trasferire l'animale insieme alla pastiglia di riscaldamento alla piattaforma di prova.
- Fissare l'arto posteriore del topo al blocco di legno usando due fili Kirschner da 1 mm attraverso la caviglia e il condilo laterale del femore distale evitando l'aspetto posteriore del ginocchio.
ATTENZIONE: Evitare danni vascolari all'arteria e alla vena poplitea che si trovano dorsalmente al condilo del femore. - Collegare un supporto con un morsetto personalizzato alla piattaforma di prova utilizzando la sua base sottovuoto.
- Fissare il tendine muscolare TA distale al morsetto attaccato al trasduttore di forza.
NOTA: Il morsetto e il trasduttore di forza devono essere posizionati parallelamente al decorso del muscolo TA. - Posizionare il riavvolgitore alla coscia posterolaterale del ratto per accedere al comune nervo peroneale.
NOTA: Il nervo sciatico e i suoi rami devono essere mantenuti umidi con NaCl riscaldato dello 0,9% (37 °C) per prevenire il raffreddamento e l'essiccazione. - Inserire il cavo di terra nei muscoli circostanti (ad esempio, il muscolo vastus lateralis).
NOTA: Lo stimolatore Grass SD9 richiede un cavo di terra per ridurre gli artefatti elettrici. Gli stimolatori più nuovi potrebbero non richiedere un cavo di terra aggiuntivo. - Agganciare il comune nervo peroneico all'elettrodo della sottominiatura e fissarne la posizione utilizzando il supporto sulla piattaforma (Figura 4).
NOTA: Assicurarsi che solo il nervo peroneale comune sia agganciato all'elettrodo della sottominiatura. - Ottimizzazione della lunghezza muscolare
- Accendere il dispositivo stimolatore bipolare e regolare le impostazioni come segue: impulso monofasico quadrato, ritardo 2 ms, durata dell'impulso di stimolo 0,4 ms, intensità di stimolo 2 V.
NOTA: Il ritardo determina il tempo tra l'impulso di sincronizzazione e l'erogazione del bordo anteriore dell'impulso. - Selezionare Test parametro e attivare la raccolta Trigger nel VI.
- Aumentare la lunghezza muscolare (precaricare) regolando il braccio della leva attaccato al trasduttore di forza.
- Iniziare da 10 g di precaricamento e utilizzare incrementi di 10 g fino a quando non viene determinata la forza muscolare attiva massima.
- Per ogni precaricamento, applicare due singole contrazioni direttamente l'una dopo l'altra utilizzando il pulsante sul dispositivo di stimolatore bipolare. L'uscita sarà visibile sullo schermo e il topo dovrebbe mostrare la dorsiflessione della zampa.
NOTA: Prima di stimolare il nervo, rimuovere sempre qualsiasi NaCl in eccesso dello 0,9% che circonda il nervo utilizzando applicatori con punta di cotone per garantire che il segnale non sia condotto al tessuto circostante. - Per interrompere la misurazione, premi nuovamente la raccolta trigger nel VI.
- Se il programma rileva automaticamente le due forze di output di picco, fare clic su Accetta. Nel caso in cui il programma non selezioni automaticamente queste forze di output, premere Rifiuta e selezionare manualmente i picchi. Le due forze di uscita di picco saranno medie ad una forza media di uscita di picco (Figura 5).
- Calcola la forza muscolare attiva sottraendo il precarico dalla forza media di uscita del picco.
- Annotare la forza attiva per ogni precarico per visualizzare la tendenza e riconoscere la forza attiva massima (Figura 6). È inoltre possibile utilizzare un foglio di calcolo.
- Accendere il dispositivo stimolatore bipolare e regolare le impostazioni come segue: impulso monofasico quadrato, ritardo 2 ms, durata dell'impulso di stimolo 0,4 ms, intensità di stimolo 2 V.
- Misurazione della forza tetanica isometrica
- Dopo aver determinato la lunghezza muscolare ideale, lasciare riposare il muscolo a zero precaricarsi per 5 minuti prima di iniziare le contrazioni muscolari tetaniche.
- Nel frattempo, passare dal test di parametro al test di frequenza sul VI e regolare l'intensità dello stimolo a 10 V sul dispositivo di stimolatore bipolare.
- Mantenere il ritardo e la durata dell'impulso di stimolo rispettivamente a 2 ms e 0,4 ms.
- Misurare la forza muscolare tetanica isometrica usando frequenze di stimolo crescenti a partire da 30 Hz con incrementi di 30 Hz fino a quando non si osserva l'altopiano massimo della forza.
- Fare clic sulla raccolta trigger e impostare sulla lunghezza muscolare ottimale predeterminata.
- Premere il tasto Ripeti sul dispositivo stimolatore bipolare per indurre una stimolazione tetanica per un massimo di 5 secondi o fino a quando non viene chiaramente osservato un picco di forza.
NOTA: Prima di stimolare il nervo, rimuovere sempre qualsiasi NaCl in eccesso dello 0,9% che circonda il nervo utilizzando applicatori con punta di cotone per garantire che il segnale non sia condotto al tessuto circostante. - Per raccogliere i dati, premere nuovamente la raccolta Trigger e documentare la forza di output massima. Nel caso in cui il programma non rilevi automaticamente la forza massima di uscita di picco, premere Rifiuta e selezionare manualmente il picco.
- Lasciare riposare di nuovo il muscolo a zero precaricamento per 5 minuti prima di iniziare le prossime contrazioni muscolari tetaniche.
NOTA: Regolarmente (circa ogni 5 minuti), idratare il muscolo TA con NaCl riscaldato dello 0,9% (37 °C) per prevenire il raffreddamento e l'essiccazione. - Continuare ad aumentare la frequenza di stimolo fino al raggiungere l'altopiano massimo della forza. L'altopiano di forza sarà definito come la forza tetanica isometrica massima.
NOTA: Dopo questo passaggio, rimuovere i fili K, graffettare o suturare la pelle e ripetere l'intera procedura all'arto posteriore contralto, a partire dal passaggio 4.
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Representative Results
Cinque parametri vengono utilizzati per misurare la misurazione ITF. Questi includono tensione muscolare (forza di precarico), intensità di stimolo (tensione), frequenza dell'impulso di stimolo, durata dello stimolo di 0,4 ms e un ritardo di 2 ms. Prima di misurare l'ITF, la tensione muscolare ottimale deve essere determinata utilizzando due contrazioni muscolari a contrazione singola ad un'intensità di 2 V durante il test dei parametri. Questi stimoli causano la dorsiflessione della zampa e producono un segnale di uscita sul grafico nel VI (Figura 5). Queste curve a contrazione singola hanno idealmente una rapida ripresa verticale che rappresenta il periodo di contrazione direttamente seguito da un periodo di diminuzione verticale più lento che dimostra il periodo di rilassamento. Il programma erà in media queste due forze di uscita di picco, ma la forza attiva deve essere calcolata manualmente sottraendo la forza di precaricamento dalla forza media di uscita. Nell'esempio della figura 5, un precarico di 10 g si traduce in due forze di uscita di picco di 411,09 g (4,03 N) e 379,78 g (3,73 N), che è mediamente una forza di uscita di picco media di 395,43 g (3,88 N). Quando le forze attive di ogni precarico sono tracciate in un grafico, è possibile identificare la forza attiva massima. Queste forze attive di solito producono una curva a campana e la forza attiva massima per i ratti Lewis del peso di 300-500 g dovrebbe essere di circa 30-40 g (0,29-0,39 N)(figura 6).
Per le stimolazioni tetaniche durante il test di frequenza, l'intensità dello stimolo viene aumentata a una tensione sovra-massima (10 V) per garantire la massima attivazione di tutte le unità motorie muscolari TA utilizzando frequenze crescenti. La curva tetanica ottimale aumenta e diminuisce bruscamente e ha una fase di plateau in lenta diminuzione con oscillazioni minime. La figura 7 descrive un esempio di curva tetanica ad una frequenza di stimolo di 30 Hz con una forza tetanica isometrica di 803,25 g (7,88 N). L'altopiano di forza più alto è definito come il massimo ITF.
Figura 1: Immagine di morsetto personalizzato modellato da un emostato chirurgico e modificato con una vite di serraggio che consente la regolazione della tensione. Fare clic qui per visualizzare una versione più ampia di questa figura.
Figura 2: Codice grafico per strumento virtuale per la misurazione isometrica della forza tetanica su LabVIEW. Fare clic qui per visualizzare una versione più ampia di questa figura.
Figura 3: Taratura del trasduttore di forza. Una calibrazione riuscita del trasduttore di forza con cinque pesi (0, 10, 20, 30 e 50 g) dovrebbe comportare una curva lineare positiva. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Panoramica schematica dell'impostazione sperimentale per la misurazione isometrica della forza tetanica. (Protetto da copyright e utilizzato con il permesso della Mayo Foundation for Medical Education and Research; tutti i diritti riservati. Ristampato da: Shin, R. H. et al. Metodo di misurazione della forza tetanica isometrica del tibialis anteriore nel ratto. Microchirurgia. 28 (6), 452-457 (2008)). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Curve rappresentative a contrazione singola per l'ottimizzazione della lunghezza muscolare. Per ogni misurazione di precaricamento vengono applicate due singole contrazioni. Queste singole curve di contrazione hanno una rapida ripresa verticale (periodo di contrazione) seguita da una diminuzione verticale (periodo di rilassamento). Le due forze di uscita di picco saranno mediate in una forza di uscita di picco media. In questo esempio con un ratto di Lewis, un precarico di 10 g si traduce in due forze di uscita di picco di 411,09 g (4,03 N) e 379,78 g (3,73 N), che è mediamente ad una forza di uscita di picco media di 395,43 g (3,88 N). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Lunghezza muscolare ottimale (precaricamento). La forza muscolare attiva può essere calcolata sottraendo il precarico dalla forza media di uscita del picco. La forza muscolare attiva per ogni precarico deve essere documentata fino a quando non è visibile un calo della forza muscolare attiva. Il precarico che produce la forza muscolare attiva più alta sarà usato per misurare la forza tetanica isometrica. Il precarico ottimale per i ratti Lewis del peso di 300-500 g dovrebbe essere di circa 30-40 g (0,29-0,39 N) (N=10). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: Curva rappresentativa della forza tetanica isometrica. La curva tetanica ottimale aumenta bruscamente, quindi ha una fase di plateau in lenta diminuzione seguita da una forte diminuzione. L'altopiano di forza più alto è definito come il massimo ITF. Questo esempio descrive la curva tetanica ad una frequenza di stimolo di 30 Hz con una forza tetanica isometrica di 803,25 g (7,88 N). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Questo protocollo descrive un metodo precedentemente convalidato per acquisire misurazioni ITF massime accurate del muscolo TA nel modello di ratto32. Il recupero della massima forza dopo trattamenti sperimentali di ricostruzione nervosa è di primario interesse nell'ambiente clinico in quanto dimostra che il nervo non solo si è rigenerato, ma ha anche fatto connessioni di lavoro con il muscolo bersaglio. L'ITF può essere utilizzato in un piccolo modello di nerve gap, come il ratto sciatico nerve model32, e con alcune modifiche al protocollo, può anche essere utilizzato in un coniglio gap nervoso più grande modello33.
Ci sono diversi passaggi critici che dovrebbero essere considerati per garantire misurazioni della forza muscolare isometrica massima coerenti e affidabili. L'importanza di selezionare attentamente il tipo di anestesia per prevenire gli effetti collaterali del muscolo scheletrico è stata precedentementedescritta 32,33. L'uso di isoflurane ha dimostrato una diminuzione dipendente dal tempo della forza muscolare, che può essere spiegata dalla sua capacità di indurre il reticolo sarcoplasmatico stimolatorilascio di calcio 33,48. L'effetto della chetamina / xiazina sulla forza muscolare si è dimostrato minimo in base alla nostra esperienza e allo studio precedente32. Anche l'attacco sicuro del tendine muscolare TA distale al trasduttore di forza è di grande importanza per misurazioni accurate. Lo slittamento o lo strappo del tendine devono essere prevenuti o corretti direttamente. Pertanto, un morsetto su misura è stato creato da un emostato chirurgico e modificato con una vite di serraggio. Altri gruppi di ricerca hanno descritto una tecnica di essiccazione del tendine per circa 30 minuti per rafforzare meccanicamente l'interfaccia tra il tendine e un morsetto49. Al fine di mantenere la resistenza del muscolo è fondamentale evitare l'essiccazione del muscolo TA e del tendine con nacl caldo 0,9% e implementare un periodo di riposo di 5 minuti tra ogni stimolazione tetanica. Il periodo di riposo si basa sull'attività del sistema fosfageno, noto anche come fonte di energia immediata, che è importante per le contrazioni muscolari esplosive. Consiste di adenosina trifosfato (ATP) e attività fosfato di creatina e fornisce energia per meno di 10 secondi di attività massima. Ci vogliono circa 3-5 minuti per ricostituire il 100% dei fosfageni50.
Riconosciamo i limiti del metodo descritto in questo video. La natura di non sopravvivenza della procedura non consente misurazioni seriali nel tempo. Inoltre, è un protocollo di test dettagliato e dispendioso in termini di tempo. Durante il tempo di test da 1 a 2 ore, il nervo e il muscolo subiscono un numero significativo di stimolazioni che possono causare affaticamento muscolare con potenziale diminuzione dell'ITF. Questo, tuttavia, si è dimostrato meno prominente nel modello di ratto rispetto al coniglio33.
In conclusione, la misurazione ITF descritta in questo video è uno strumento inestimabile negli studi sperimentali sui nervi periferici per quantificare il recupero del motore. Quando viene presentato con altre misure di risultato come l'elettrofisiologia e l'istomorfometria, può essere fornita una valutazione globale della funzione nervosa.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
La ricerca riportata in questa pubblicazione è stata supportata dal National Institute of Neurological Disorders and Stroke del National Institutes of Health con il premio Numero RO1 NS 102360. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente le opinioni ufficiali degli Istituti Nazionali di Sanità.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% Sodium Chloride | Baxter Healthcare Corporation, Deerfield, IL, USA | G130203 | |
| 1 mm Kirshner wires | Pfizer Howmedica, Rutherford, NJ | N/A | |
| Adson Tissue Forceps | ASSI, Westbury, NY, USA | MTK-6801226 | |
| Bipolar electrode cables | Grass Instrument, Quincy, MA | N/A | |
| Bipolar stimulator device | Grass SD9, Grass Instrument, Quincy, MA | N/A | |
| Cotton-tip Applicators | Cardinal Health, Waukegan, IL, USA | C15055-006 | |
| Curved Mosquito forceps | ASSI, Westbury, NY, USA | MTK-1201112 | |
| Force Transducer MDB-2.5 | Transducer Techniques, Temecula, CA | N/A | |
| Gauze Sponges 4x4 | Covidien, Mansfield, MA, USA | 2733 | |
| Ground cable | Grass Instrument, Quincy, MA | N/A | |
| Isoflurane chamber | N/A | N/A | Custom-made |
| Ketamine | Ketalar, Par Pharmaceutical, Chestnut, NJ | 42023-115-10 | |
| LabView Software | National Instruments, Austin, TX | ||
| Loop | N/A | N/A | Custom-made |
| Microsurgical curved forceps | ASSI, Westbury, NY, USA | JFA-5B | |
| Microsurgical scissors | ASSI, Westbury, NY, USA | SAS-15R-8-18 | |
| Microsurgical straight forceps | ASSI, Westbury, NY, USA | JF-3 | |
| Retractor | ASSI, Westbury, NY, USA | AG-124426 | |
| Scalpel Blade No. 15 | Bard-Parker, Aspen Surgical, Caledonia, MI, USA | 371115 | |
| Slim Body Skin Stapler | Covidien, Mansfield, MA, USA | 8886803512 | |
| Subminiature electrode | Harvard Apparatus, Holliston, MA | N/A | |
| Surgical Nerve Stimulator | Checkpoint Surgical LCC, Cleveland, OH, USA | 9094 | |
| Terrell Isoflurane | Piramal Critical Care Inc., Bethlehem, PA, USA | H961J19A | |
| Testing platform | N/A | N/A | Custom-made |
| Tetontomy Scissors | ASSI, Westbury, NY, USA | ASIM-187 | |
| Traceable Big-Digit Timer/Stopwatch | Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | S407992 | |
| USB-6009 multifunctional I/O data acquisition (DAQ) device | National Instruments, Austin, TX | 779026-01 | |
| Vacuum Base Holder | Noga Engineering & Technology Ltd., Shlomi, Isreal | N/A | Attached clamp is custom-made |
| Weight (10 g) | Denver Instruments, Denver, CO, USA | 820010.4 | |
| Weight (20 g) | Denver Instruments, Denver, CO, USA | 820020.4 | |
| Weight (50 g) | Denver Instruments, Denver, CO, USA | 820050.4 | |
| Xylazine | Xylamed, Bimeda MTC Animal Health, Cambridge, Canada | 1XYL002 |
References
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