Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

कर्वेलेट ट्रांसफॉर्म-आधारित उपकरणों के साथ फिब्रिल्लर कोलेजन संगठन की मात्रा निर्धारित करना

Published: November 11, 2020 doi: 10.3791/61931
Automatic Translation
1, 1,2,3
1Laboratory for Optical and Computational Instrumentation, Center for Quantitative Cell Imaging, University of Wisconsin-Madison, 2Departments of Medical Physics and Biomedical Engineering, University of Wisconsin-Madison, 3Morgridge Institute for Research, Madison, Wisconsin, 4test, test

Summary

यहां, हम सामान्य और रोगग्रस्त ऊतकों दोनों के बाह्त मैट्रिक्स में फाइब्रिलर कोलेजन संगठन की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक कर्वेलेट ट्रांसफॉर्म-आधारित, ओपन-सोर्स मैटलैब सॉफ्टवेयर टूल का उपयोग करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। इस उपकरण को कोलेजन फाइबर या लाइन जैसी संरचनाओं के अन्य प्रकार के साथ छवियों पर लागू किया जा सकता है।

Abstract

फिब्रिलर कोलेजन प्रमुख बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) घटक हैं, और उनके टोपोलॉजी परिवर्तन स्तन, अंडाशय, गुर्दे और अग्नाशय के कैंसर सहित बीमारियों की एक विस्तृत श्रृंखला की प्रगति के साथ जुड़े होने के लिए दिखाए गए हैं। स्वतंत्र रूप से उपलब्ध फाइबर क्वांटिफिकेशन सॉफ्टवेयर टूल मुख्य रूप से फाइबर संरेखण या अभिविन्यास की गणना पर केंद्रित होते हैं, और वे मैन्युअल चरणों की आवश्यकता, शोर पृष्ठभूमि में फाइबर एज का पता लगाने में अशुद्धि, या स्थानीयकृत सुविधा लक्षण वर्णन की कमी जैसी सीमाओं के अधीन होते हैं। इस प्रोटोकॉल में वर्णित कोलेजन फाइबर क्वांटिटेशन टूल को वक्रलेट ट्रांसफॉर्म (सीटी) द्वारा सक्षम इष्टतम मल्टीस्केल छवि प्रतिनिधित्व का उपयोग करके चिह्नित किया गया है। यह एल्गोरिथम दृष्टिकोण फाइब्रिलर कोलेजन छवियों से शोर को हटाने और फाइबर किनारों की वृद्धि के लिए अन्य उपकरणों से प्राप्त अप्रत्यक्ष पिक्सेल-वार या खिड़की-वार जानकारी का उपयोग करने के बजाय, फाइबर किनारों को सीधे फाइबर से स्थान और अभिविन्यास जानकारी प्रदान करने की अनुमति देता है। इस सीटी-आधारित ढांचे में दो अलग-अलग, लेकिन लिंक्ड, "सीटी-फायर" और "CurveAlign" नाम के पैकेज शामिल हैं जो एक वैश्विक, ब्याज के क्षेत्र (आरओआई), या व्यक्तिगत फाइबर आधार पर फाइबर संगठन की मात्रा निर्धारित कर सकते हैं। यह मात्राकरण ढांचा दस वर्षों से अधिक समय से विकसित किया गया है और अब एक व्यापक और उपयोगकर्ता संचालित कोलेजन क्वांटिफिकेशन प्लेटफॉर्म के रूप में विकसित हुआ है। इस प्लेटफ़ॉर्म का उपयोग करके, कोई भी व्यक्ति फाइबर गुणों जैसे लंबाई, कोण, चौड़ाई और सीधापन, साथ ही घनत्व और संरेखण जैसे थोक माप सहित लगभग तीस फाइबर सुविधाओं को माप सकता है। इसके अतिरिक्त, उपयोगकर्ता मैन्युअल रूप से या स्वचालित रूप से खंडित सीमाओं के सापेक्ष फाइबर कोण को माप सकता है। यह प्लेटफ़ॉर्म आरओआई विश्लेषण, स्वचालित सीमा निर्माण और पोस्ट-प्रोसेसिंग के लिए कई अतिरिक्त मॉड्यूल भी प्रदान करता है। इस प्लेटफ़ॉर्म का उपयोग करने के लिए प्रोग्रामिंग या छवि प्रसंस्करण के पूर्व अनुभव की आवश्यकता नहीं होती है, और यह सैकड़ों या हजारों छवियों सहित बड़े डेटासेट को संभाल सकता है, जिससे जैविक या जैव चिकित्सा अनुप्रयोगों के लिए कोलेजन फाइबर संगठन का कुशल मात्राकरण सक्षम हो सकता है।

Introduction

फिब्रिलर कोलेजन प्रमुख, संरचनात्मक ईसीएम घटक हैं। उनका संगठन ऊतक के प्रभाव को बदलता है और ऑस्टियोजेनेसिस इम्परफेक्टा1, हृदय रोग2और घाव भरने से लेकर विभिन्न प्रकार के कैंसरों में होने वाली कई बीमारियों की प्रगति से जुड़ा होता है, जिसमें स्तन 4 ,5,6,अंडाशय7,8,गुर्दे9और अग्नाशय के कैंसरशामिलहैं । कई स्थापित इमेजिंग तौर-तरीकों का उपयोग फिब्रिलर कोलेजन जैसे दूसरे हार्मोनिक जनरेशन माइक्रोस्कोपी11,चमकीले क्षेत्र या फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी या ध्रुवीकृत प्रकाश माइक्रोस्कोपी12,तरल क्रिस्टल आधारित ध्रुवीकरण माइक्रोस्कोपी (एलसी-पोलस्कोप)13और इलेक्ट्रोन माइक्रोस्कोपी14के साथ संयोजन के रूप में दाग या रंगों की कल्पना करने के लिए किया जा सकता है। चूंकि फिब्रिलर कोलेजन संगठन का महत्व स्पष्ट हो गया है, और इन तरीकों का उपयोग बढ़ गया है, बेहतर कोलेजन फाइबर विश्लेषण दृष्टिकोण की आवश्यकता भी बढ़ी है।

फिब्रिलर कोलेजन के स्वचालित माप के लिए कम्प्यूटेशनल विधियों को विकसित करने के लिए कई प्रयास किए गए हैं। स्वतंत्र रूप से उपलब्ध सॉफ्टवेयर टूल मुख्य रूप से फाइबर अलाइनमेंट या ओरिएंटेशन की गणना पर ध्यान केंद्रित करते हैं या तो पहले व्युत्पन्न या संरचना टेन्सर को पिक्सेल15,16,या इमेज टाइल्स17के लिए फोरियर ट्रांसफॉर्म-आधारित स्पेक्ट्रम विश्लेषण के लिए अपनाते हैं। ये सभी उपकरण मैन्युअल चरणों की आवश्यकता, शोर पृष्ठभूमि में फाइबर एज का पता लगाने में अशुद्धि, या स्थानीयकृत सुविधा लक्षण वर्णन की कमी जैसी सीमाओं के अधीन हैं।

अन्य स्वतंत्र रूप से उपलब्ध ओपन-सोर्स फ्री सॉफ्टवेयर टूल्स की तुलना में, इस प्रोटोकॉल में वर्णित तरीकों सीटी-एक इष्टतम, मल्टीस्केल, दिशात्मक छवि प्रतिनिधित्व विधि का उपयोग करते हैं- फाइब्रिलर कोलेजन छवियों से शोर को हटाने और फाइबर किनारों को बढ़ाने या ट्रैक करने के लिए। स्थान और अभिविन्यास के बारे में जानकारी सीधे फाइबर संगठन के मैट्रिक्स का अनुमान लगाने के लिए अप्रत्यक्ष पिक्सेल-वार या खिड़की के लिहाज से जानकारी का उपयोग करके फाइबर से प्रदान की जा सकती है। यह सीटी-आधारित ढांचा18,19,20,21 एक वैश्विक, आरओआई, या फाइबर आधार पर फाइबर संगठन की मात्रा निर्धारित कर सकता है, मुख्य रूप से दो अलग-अलग के माध्यम से, लेकिन लिंक्ड, "सीटी-फायर"18, 21और "CurveAlign"19,21 नाम के पैकेज। जहां तक सॉफ्टवेयर के कार्यान्वयन का संबंध है, सीटी-फायर में, कई पैमानों पर सीटी गुणांक का उपयोग एक छवि के पुनर्निर्माण के लिए किया जा सकता है जो किनारों को बढ़ाता है और शोर को कम करता है। फिर, एक व्यक्तिगत फाइबर निष्कर्षण एल्गोरिथ्म सीटी-खंगाला छवि के लिए लागू किया जाता है उनके प्रतिनिधि केंद्र अंक खोजने के लिए फाइबर ट्रैक करने के लिए, केंद्र अंक से फाइबर शाखाओं का विस्तार, और फाइबर शाखाओं को जोड़ने के लिए एक फाइबर नेटवर्क बनाने के लिए । CurveAlign में, उपयोगकर्ता-निर्दिष्ट पैमाने पर सीटी गुणांक का उपयोग स्थानीय फाइबर अभिविन्यास को ट्रैक करने के लिए किया जा सकता है, जहां वक्रलेट्स के अभिविन्यास और स्थानों को निकाला जाता है और संबंधित स्थानों पर फाइबर अभिविन्यास का अनुमान लगाने के लिए समूहीकृत किया जाता है। इस परिणामस्वरूप मात्राकरण ढांचा दस से अधिक वर्षों के लिए विकसित किया गया है और कार्यक्षमता, उपयोगकर्ता इंटरफेस और मॉड्यूलरिटी जैसे कई पहलुओं में बहुत विकसित हुआ है। उदाहरण के लिए, यह उपकरण स्थानीय फाइबर अभिविन्यास की कल्पना कर सकता है और उपयोगकर्ता को तीस फाइबर सुविधाओं को मापने की अनुमति देता है जिसमें लंबाई, कोण, चौड़ाई और सीधापन जैसे व्यक्तिगत फाइबर गुण, साथ ही घनत्व और संरेखण जैसे थोक माप शामिल हैं। इसके अतिरिक्त, उपयोगकर्ता मैन्युअल रूप से या स्वचालित रूप से खंडित सीमाओं के सापेक्ष फाइबर कोण को माप सकता है, जो, उदाहरण के लिए, स्तन कैंसर22 और अग्नाशय के कैंसर अध्ययन10में छवि-आधारित बायोमार्कर विकास में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। यह प्लेटफ़ॉर्म आरओआई विश्लेषण, स्वचालित सीमा निर्माण और पोस्ट-प्रोसेसिंग के लिए लोगों सहित कई फीचर मॉड्यूल प्रदान करता है। आरओआई मॉड्यूल का उपयोग आरओआई के विभिन्न आकारों को एनोटेट करने और संबंधित आरओआई विश्लेषण का संचालन करने के लिए किया जा सकता है। एक आवेदन उदाहरण के रूप में, स्वचालित सीमा निर्माण मॉड्यूल का उपयोग दूसरी हार्मोनिक पीढ़ी (एसएचजी) छवियों के साथ हेमटॉक्सीलिन और ईओसिन (एच एंड ई) उज्ज्वल क्षेत्र छवियों को पंजीकृत करने और पंजीकृत एच एंड ई छवियों से ट्यूमर सीमाओं के छवि मुखौटा उत्पन्न करने के लिए किया जा सकता है। पोस्ट-प्रोसेसिंग मॉड्यूल संभावित सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए व्यक्तिगत छवियों से आउटपुट डेटा फ़ाइलों के प्रसंस्करण और एकीकरण को सुविधाजनक बनाने में मदद कर सकता है।

इस क्वांटिफिकेशन प्लेटफॉर्म को प्रोग्रामिंग या इमेज प्रोसेसिंग के पूर्व अनुभव की आवश्यकता नहीं होती है और सैकड़ों या हजारों छवियों सहित बड़े डेटासेट को संभाल सकता है, जिससे जैविक या जैव चिकित्सा अनुप्रयोगों के लिए कोलेजन संगठन का कुशल मात्राकरण सक्षम होता है। यह व्यापक रूप से दुनिया भर में कई शोधकर्ताओं द्वारा विभिन्न अनुसंधान क्षेत्रों में इस्तेमाल किया गया है, खुद सहित. सीटी-फायर और कर्वअलाइन18, 19,20, 21पर चार मुख्य प्रकाशन हैं, जिनमें से पहले तीन को 272 बार उद्धृत किया गया है (Google विद्वान के अनुसार 2020-05-04 तक)। इस प्लेटफ़ॉर्म (सीटी-फायर या CurveAlign) का हवाला देने वाले प्रकाशनों की समीक्षा इंगित करती है कि लगभग 110 जर्नल पेपर हैं जिन्होंने सीधे इसे अपने विश्लेषण के लिए उपयोग किया, जिसमें लगभग 35 प्रकाशन हमारे समूह के साथ सहयोगात्मक थे, और अन्य (~ 75) अन्य समूहों द्वारा लिखे गए थे। उदाहरण के लिए, इस मंच का उपयोग निम्नलिखित अध्ययनों के लिए किया गया था: स्तन कैंसर22,23,24,अग्नाशय का कैंसर10,25,गुर्दे का कैंसर9,26,घाव उपचार3,27,28,29,30,ओवेरियन कैंसर8,31,7,गर्भाशयोस्फेषिक स्नायु32,हाइपोफोस्फेमिकडेंटिन डेंटिन 33, बेसल सेल कार्सिनोमा34, हाइपोक्सिक सारकोमा35, उपास्थि ऊतक36, हृदय रोग37, न्यूरॉन्स38, ग्लियोब्लास्टोमा39, लिम्फेटिक संकुचन40, रेशेदार कैस्फोल्ड41, गैस्ट्रिक कैंसर42, माइक्रोटुबुल43, और मूत्राशय44. चित्रा 1 एसएचजी छवि से स्तन कैंसर19 के ट्यूमर से जुड़े कोलेजन हस्ताक्षर खोजने के लिए CurveAlign के कैंसर इमेजिंग आवेदन को दर्शाता है । चित्रा 2 इस मंच के एक विशिष्ट योजनाबद्ध कार्यप्रवाह का वर्णन करता है। यद्यपि इन उपकरणों की तकनीकी रूप से18,19,21की समीक्षा की गई है, और CurveAlign के साथ संरेखण विश्लेषण के लिए एक नियमित प्रोटोकॉल20 भी उपलब्ध है, एक दृश्य प्रोटोकॉल जो सभी आवश्यक सुविधाओं को दर्शाता है उपयोगी हो सकता है। एक दृश्य प्रोटोकॉल, जैसा कि यहां प्रस्तुत किया गया है, इस प्लेटफ़ॉर्म का उपयोग करने की सीखने की प्रक्रिया को सुविधाजनक बनाएगा और साथ ही उपयोगकर्ताओं के पास होने वाली चिंताओं और प्रश्नों को अधिक कुशलता से संबोधित करेगा।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

नोट: यह प्रोटोकॉल कोलेजन क्वांटिफिकेशन के लिए सीटी-फायर और CurveAlign के उपयोग का वर्णन करता है। इन दोनों उपकरणों के पूरक है, लेकिन अलग, मुख्य लक्ष्यों और कुछ हद तक एक साथ जुड़े हुए हैं । उन्नत पोस्ट-प्रोसेसिंग और आरओआई विश्लेषण को छोड़कर अधिकांश संचालन करने के लिए सीडब्ल्यूएएलिज इंटरफ़ेस से सीटी-फायर शुरू किया जा सकता है। सीटी-फायर के पूरे ऑपरेशन के लिए इसे अलग से शुरू किया जाना चाहिए।

1. छवि संग्रह और छवि की आवश्यकता

नोट: उपकरण किसी भी इमेज फ़ाइल को मैटलैब द्वारा पठनीय लाइन जैसी संरचनाओं के साथ संसाधित कर सकता है, भले ही इसे इकट्ठा करने के लिए उपयोग किए जाने वाले इमेजिंग मोडलि का कोई भी तरीका हो।

  1. छवि प्रकार के रूप में 8-बिट ग्रेस्केल का उपयोग करें क्योंकि डिफ़ॉल्ट रनिंग पैरामीटर इस प्रारूप पर आधारित हैं।
    नोट: एसएचजी इमेजिंग एक व्यापक रूप से उपयोग किया जाने वाला लेबल-मुक्त और उच्च-रिज़ॉल्यूशन फिब्रिलार कोलेजन इमेजिंग विधि है। एक स्तन कैंसर अध्ययन19 से एसएचजी छवियों प्रदर्शन के उद्देश्य के लिए यहां इस्तेमाल किया जाएगा ।

2. सॉफ्टवेयर स्थापना और सिस्टम की आवश्यकता

नोट: स्टैंडअलोन और स्रोत-कोड दोनों संस्करण स्वतंत्र रूप से उपलब्ध हैं। स्रोत कोड संस्करण के लिए सिग्नल प्रोसेसिंग, इमेज प्रोसेसिंग, स्टैटिस्टिक्स एनालिसिस और पैरलल कंप्यूटिंग के टूलबॉक्स सहित एक पूर्ण मैटलैब इंस्टॉलेशन की आवश्यकता होती है। स्रोत-कोड संस्करण चलाने के लिए, तीसरे पक्ष के स्रोतों से कुछ सहित सभी आवश्यक फ़ोल्डर को मैटलैब पथ में जोड़ा जाना चाहिए। अधिकांश उपयोगकर्ताओं के लिए स्टैंडअलोन एप्लिकेशन (एपीपी) का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है, जिसके लिए निर्दिष्ट संस्करण के स्वतंत्र रूप से उपलब्ध मैटलैब कंपाइलर रनटाइम (एमसीआर) की स्थापना की आवश्यकता होती है। ऐप को स्थापित करने और लॉन्च करने की प्रक्रिया नीचे वर्णित है।

  1. सीटी-फायर संस्करण 3.0 (CTF3.0) और CurveAlign संस्करण 5.0 (CA5.0) ऐप पैकेज क्रमशः https://eliceirilab.org/software/ctfire/ और https://eliceirilab.org/software/curvealign/ से डाउनलोड करें।
    नोट: प्रत्येक पैकेज में स्टैंडअलोन ऐप, मैनुअल और परीक्षण छवियां शामिल हैं।
  2. MATLAB MCR 2018bस्थापित करने के लिए उपरोक्त वेबसाइटों से विस्तृत आवश्यकताओं और स्थापना निर्देशों का पालन करें।
  3. ऐप लॉन्च करें।
    1. विंडोज 64-बिट सिस्टम के लिए, इसे लॉन्च करने के लिए ऐप आइकन पर डबल क्लिक करें।
    2. मैक सिस्टम के लिए, इसे लॉन्च करने के लिए निम्नलिखित चरणों का पालन करें: ऐप (सीटीआरएल-क्लिक) पर सही क्लिक करें | | पैकेज सामग्री दिखाएं सामग्री | मैकओएस | applauncher (सही क्लिक करें और खुला चुनें)।
      नोट: अन्य विवरण 2.1 में सूचीबद्ध सॉफ्टवेयर वेबसाइटों में देखा जा सकता है।

3. सीटी-फायर के साथ व्यक्तिगत फाइबर निष्कर्षण

नोट: सीटी-फायर छवि को मूल्यकृत करने, फाइबर किनारों को बढ़ाने के लिए सीटी का उपयोग करता है, और फिर व्यक्तिगत फाइबर को ट्रैक करने के लिए फाइबर निष्कर्षण एल्गोरिदम का उपयोग करता है। लंबाई, कोण, चौड़ाई, और सीधापन व्यक्तिगत फाइबर के लिए गणना कर रहे हैं।

  1. एकल छवि या कई छवियों पर सीटी-फायर
    1. 2.3 में वर्णित ऐप लॉन्च करें।
    2. मुख्य ग्राफिकल यूजर इंटरफेस (जीयूआई, चित्रा 3 ए)में ओपन फाइल (एस) बटन पर क्लिक करें, और फिर प्रॉम्प्ट विंडो से एक या अधिक छवियों/या छवि ढेर का चयन करें । संवाद में कई छवियों का चयन करने के लिए ऑपरेटिंग सिस्टम के लिए उपयुक्त तकनीक का उपयोग करें (उदाहरण के लिए, विंडोज में, कई फ़ाइलों का चयन करते समय सीटीआरएल पकड़ें)।
      नोट: यदि दो या अधिक छवि फ़ाइलों का चयन किया जाता है, तो सभी छवियों को विश्लेषण के लिए समान रनिंग पैरामीटर का उपयोग करना चाहिए। सुनिश्चित करें कि सभी छवियों को एक ही या समान परिस्थितियों में प्राप्त कर रहे हैं।
    3. कई छवियों के विश्लेषण के लिए शीर्ष दाएं कोने पर समानांतर चेकबॉक्स की जांच करके समानांतर कंप्यूटिंग विकल्पों का चयन करें।
    4. छवि स्टैक के लिए, स्लाइस स्लाइडर को फ़ाइल लिस्टबॉक्स के नीचे ले जाएं ताकि विश्लेषण किए जाने वाले स्लाइस का चयन किया जा सके।
    5. चल रहे गुणों को सेट करें। कुछ छवियों के प्रारंभिक विश्लेषण के लिए डिफ़ॉल्ट मापदंडों का उपयोग करें। डिफ़ॉल्ट मापदंडों का उपयोग कर रहे हैं, तो चरण 3.1.6 पर छोड़ दें। अलग-अलग पैरामीटर सेट करने के लिए पैरामीटर्स पैनल में अपडेट बटन पर क्लिक करें। मापदंडों को ठीक से ट्यून करने के लिए मैनुअल का पालन करें।
      नोट: सबसे अधिक बार समायोजित मापदंडों पृष्ठभूमि सीमा(thresh_im2)और नाभिक खोज त्रिज्या(s_xlinkbox)शामिल हैं । यदि पृष्ठभूमि शोर का स्तर अधिक है, तो thresh_im2 एक बड़े मूल्य पर सेट करें; s_xlinkbox फाइबर के औसत त्रिज्या के साथ जुड़ा हुआ है, पतली फाइबर का पता लगाने के लिए एक छोटे मूल्य निर्धारित करते हैं।
    6. रन बटन पर क्लिक करें।
      नोट: प्रगति की जानकारी सूचना खिड़की और कमांड विंडो दोनों में प्रदर्शित की जाएगी। विश्लेषण पूरा होने के बाद, आउटपुट टेबल(चित्रा 3 बी)प्रदर्शित किया जाएगा।
    7. लंबाई, चौड़ाई, कोण और सीधापन सहित छवि के फाइबर उपायों(चित्रा 3C और चित्रा 3F)के हिस्टोग्राम को देखने के लिए आउटपुट टेबल में किसी भी आइटम पर क्लिक करें।
      नोट: मूल छवि पर मढ़ा फाइबर के साथ फाइबर छवियों को भी प्रदर्शित किया जाएगा(चित्रा 3E)।
    8. मढ़ा छवि ".tiff" फ़ाइल, ".csv" फ़ाइल, और ".mat" फ़ाइल सहित आउटपुट फ़ाइलों के लिए छवि फ़ोल्डर के तहत ctFIREout नाम के उपफोल्डर की जांच करें ।
  2. सीटी-फायर क्षेत्र ब्याज (आरओआई) विश्लेषण
    1. आरओआई प्रबंधक का उपयोग करके आरओआई एनोटेशन
      1. एक या एक से अधिक छवियों को लोड करने के लिए मुख्य जीयूआई(चित्रा 3A)में ओपन फाइल (एस) बटन पर क्लिक करें।
      2. फ़ाइल सूची में एनोटेट होने के लिए छवि का चयन करें।
      3. आरओआई विकल्प पैनल के ड्रॉपडाउन मेनू में आरओआई प्रबंधक का चयन करें।
      4. आरओआई मैनेजर मॉड्यूल(चित्रा 3A)लॉन्च करने के लिए रन बटन पर क्लिक करें ।
      5. आरओआई मैनेजर जीयूआई(चित्रा 4 ए)में आरओआई को आकर्षित करने के लिए ड्रा आरओआई मेनू (डी)के नीचे ड्रॉपडाउन मेनू पर क्लिक करें, एक-एक करके।
        नोट: आरओआई आकार आयत, फ्रीहैंड, एलिप्स, बहुभुज या निर्दिष्ट आयत हो सकता है। आरओआई एनोटेशन को आकर्षित करने, बचाने और छोड़ने के लिए ऑन-स्क्रीन निर्देशों का पालन करें।
      6. आरओआई को आकर्षित करने के लिए विधि का चयन करने के बाद, मूल छवि पर दिखाई देने वाले पीले आयत को वांछित स्थिति में खींचें, और फिर सेव आरओआई (एस) बटन पर क्लिक करें या इस आरओआई सूची में इस आरओआई को जोड़ने के लिए कुंजी दबाएं। इस आरओआई का नाम अपने आप हो जाएगा।
      7. पिछले आरओआई को एक नई स्थिति में खींचकर एक नया आरओआई ड्रा करें, और इसे 3.2.1.6 में उल्लिखित के रूप में सहेजें, या एक नया आरओआई आकर्षित करने के लिए चरण 3.2.1.5-3.2.1.6 दोहराएं।
      8. प्रेस एक्स या नई आरओआई का चयन करें? आरओआई एनोटेशन छोड़ने के लिए आरओआई आकार ड्रॉपडाउन मेनू में।
      9. सूची में सभी परिभाषित आरओआई और मूल छवि पर उनके नाम दिखाने के लिए चेकबॉक्स सभी और लेबल दिखाएं।
      10. आरओआई सूची में आरओआई का चयन करें, जिसमें आरओआई का नाम बदलना, आरओआई को हटाना, आरओआई टेक्स्ट को सेवकरना, टेक्स्ट से लोड आरओआई, सेव आरओआई मास्क, लोड आरओआई से मास्कऔर कंबाइन आरओआईशामिल हैं ।
      11. मूल छवि फ़ोल्डर के तहत ROI_management नाम के एक उपफोल्ड में ".चटाई" फ़ाइल के रूप में सहेजे गए आरओआई प्रबंधक की आउटपुट फ़ाइल की जांच करें।
      12. खोली गई फ़ाइल सूची में एक और छवि को एनोटेट करने के लिए, चरण 3.2.1.2-3.2.1.11 दोहराएं।
      13. एनोटेशन होने के बाद, आरओआई मैनेजर जीयूआई को बंद करें, और मुख्य जीयूआई में रीसेट बटन पर क्लिक करके मुख्य जीयूआई को रीसेट करें।
    2. आरओआई प्रबंधक में एक ही छवि के लिए आरओआई विश्लेषण
      1. यदि पूर्ण छवि सीटी-फायर विश्लेषण किया जाता है और परिणाम डिफ़ॉल्ट निर्देशिका में सहेजे जाते हैं, तो आरओआई सूची में एक या एक से अधिक आरओआई पर क्लिक करें, फिर पोस्ट-आरओआई विश्लेषण मॉड्यूल लॉन्च करने के लिए ctFIRE ROI विश्लेषक बटन पर क्लिक करें।
        नोट: परिणाम स्वचालित रूप से एक उपफोल्डर में सहेजा जाएगा \ \ [छवि फ़ोल्डर] \ CTF_ROI \ व्यक्तिगत \ ROI_post_analysis \
      2. पॉप-अप विंडो में, चयनित आरओआई(चित्रा 4B)के भीतर फाइबर प्रदर्शित करने के लिए चेक फाइबर बटन पर क्लिक करें।
      3. प्रत्येक आरओआई(चित्रा 4C)के हिस्टोग्राम प्रदर्शित करने के लिए प्लॉट स्टैटिस्टिक्स पर क्लिक करें। इसी उत्पादन के आंकड़े प्रदर्शित किए जाएंगे।
      4. यदि पूर्ण छवि सीटी-फायर विश्लेषण नहीं किया गया है, तो आरओआई सूची में एक या एक से अधिक आरओआई पर क्लिक करें, और चयनित आरओआई पर सीधे सीटी-फायर विश्लेषण लागू करने के लिए आरओआई बटन पर लागू सीटी फायर पर क्लिक करें।
      5. विश्लेषण चलाने के लिए त्वरित विंडो में निर्देशों का पालन करें।
        नोट: सीटी-फायर चलाने के मापदंड मुख्य जीयूआई के माध्यम से पारित किए जाते हैं, और उपयोगकर्ता आवश्यकतानुसार चरण 3.1.5 में वर्णित रनिंग मापदंडों को अपडेट कर सकता है। विश्लेषण पूरा होने के बाद, फाइबर उपायों के सारांश आंकड़े आउटपुट टेबल में प्रदर्शित किए जाएंगे। परिणाम स्वचालित रूप से एक उपफोल्डर में सहेजा जाएगा \ \ [छवि फ़ोल्डर]\ CTF_ROI \ व्यक्तिगत \ ROI_analysis\
    3. आरओआई एनालाइजर का उपयोग करके कई छवियों के लिए आरओआई विश्लेषण
      1. छवियों का विश्लेषण करने के लिए आरओआई को एनोटेट करने के लिए 3.2.1 में चरणों का पालन करें।
      2. ओपन फाइल (एस) बटन पर क्लिक करके एक या एक से अधिक छवियां खोलें।
      3. आरओआई पोस्ट विश्लेषण चलाने के लिए जब पूर्ण छवि विश्लेषण परिणाम उपलब्ध हों, तो रन ऑप्शन पैनल में ड्रॉपडाउन मेनू पर क्लिक करें और विकल्प सीटीएफ पोस्ट-आरओआई एनालाइजरका चयन करें।
      4. सभी भरी हुई छवियों के लिए आरओआई विश्लेषण चलाने के लिए रन बटन पर क्लिक करें।
      5. जीयूआई के नीचे और कमांड विंडो में संदेश विंडो में प्रदर्शित प्रगति जानकारी की जांच करें।
      6. विश्लेषण पूरा होने के बाद, आउटपुट टेबल में प्रदर्शित प्रत्येक आरओआई के सारांश आंकड़ों की जांच करें।
        नोट: विस्तृत आउटपुट फाइलें स्वचालित रूप से एक उपफोल्डर में सहेजी जाती हैं \ \ CTF_ROI \ बैच \ ROI_post_analysis\
      7. जब पूर्ण छवि विश्लेषण परिणाम उपलब्ध नहीं होते हैं, तो प्रत्यक्ष विश्लेषण चलाने के लिए, चरण 3.2.3.1-3.2.3.6 का पालन करें, सिवाय इसके कि चरण 3.2.3.3 में, विकल्प सीटीएफ आरओआई का विश्लेषणआर का चयन करें; चरण 3.2.3.4 में, रन बटन पर क्लिक करने से पहले, चरण 3.1.5 में वर्णित रनिंग पैरामीटर को अपडेट करें। रन बटन पर क्लिक करने के बाद, एक त्वरित संवाद खिड़की में, किसी भी आकार के आयताकार रॉय और आरओआई मास्क केबीच चुनें।
        नोट: यदि सभी एनोटेटेड आरओआई आयताकार हैं, तो उपयोगकर्ता "आयताकार आरओआई" चुन सकता है। चरण 3.2.3.6 में, आरओआई विश्लेषण परिणाम \\[छवि फ़ोल्डर]पर स्थित एक उपफोल्डर में सहेजे जाते हैं \ CTF_ROI \ बैच \ ROI_analysis \
  3. सीटी-फायर के साथ पोस्ट-प्रोसेसिंग
    नोट: 3.1 में वर्णित नियमित सीटी-फायर विश्लेषण के बाद, उपयोगकर्ता आगे पोस्ट-प्रोसेसिंग कर सकता है। समय लेने वाले फाइबर निष्कर्षण को फिर से चलाने के बिना, 3.3.1 में वर्णित नियमित रूप से पोस्ट-प्रोसेसिंग, कुछ बुनियादी आउटपुट फिगर गुणों को अपडेट कर सकता है, जबकि 3.3.2 में वर्णित उन्नत पोस्ट-प्रोसेसिंग व्यक्तिगत फाइबर और उनके गुणों की कल्पना कर सकता है, सभी चार फाइबर गुणों के बीच जटिल थ्रेसिंग कर सकता है, चयनित फाइबर के सारांश आंकड़े उत्पन्न करता है, और अनुकूलित रंग मानचित्र का उपयोग करके चयनित फाइबर की कल्पना कर सकता है।
    1. सीटी-फायर के साथ नियमित रूप से पोस्ट-प्रोसेसिंग
      1. सीटी-फायर ऐप लॉन्च करें, या सीटी-फायर मुख्य जीयूआई(चित्रा 3A)को शुरू करने के लिए अन्य अभियानों के बाद रीसेट बटन पर क्लिक करें।
      2. मुख्य जीयूआई के शीर्ष पर .mat चेकबॉक्स की जांच करें।
      3. सीटीएफआईआरईउट सबफोल्डर में सीटी-फायर आउटपुट (मैट फाइल) का चयन करने के लिए ओपन फाइल (एस) बटन पर क्लिक करें।
        नोट: यदि कई फ़ाइलों का चयन किया जाता है, तो बैच चेकबॉक्स स्वचालित रूप से चेक किया जाएगा। संबंधित छवियों की फ़ाइल का नाम बॉक्स सूची में प्रदर्शित किया जाएगा।
      4. आउटपुट फिगर कंट्रोल पैनल में विकल्पों को अपडेट करें।
      5. आउटपुटविकल्पों में डिफ़ॉल्ट विकल्प रखें, जो यह सुनिश्चित करेगा कि सभी आउटपुट फ़ाइलों को 3.3.1.4 में निर्धारित मापदंडों के नए सेट के अनुसार अपडेट किया जाएगा।
      6. पोस्ट-प्रोसेसिंग बटन पर क्लिक करें। मुख्य जीयूआई के नीचे के साथ-साथ कमांड विंडो में संदेश विंडो में प्रगति की जानकारी देखें।
      7. विश्लेषण पूरा होने के बाद, लंबाई, चौड़ाई, कोण और सीधापन सहित छवि के फाइबर उपायों के हिस्टोग्राम को देखने के लिए आउटपुट टेबल में किसी भी आइटम पर क्लिक करें।
        नोट: नई आउटपुट फाइलें ctFIREout सबफोल्डर में पुराने लोगों को ओवरराइट करेंगी।
    2. सीटी-फायर की उन्नत पोस्ट-प्रोसेसिंग
      1. सीटी-फायर ऐप लॉन्च करें, या सीटी-फायर मुख्य जीयूआई(चित्रा 3A)को शुरू करने के लिए अन्य अभियानों के बाद रीसेट बटन पर क्लिक करें।
      2. मुख्य जीयूआई(चित्रा 3 ए)के शीर्ष पर OUT.adv चेकबॉक्स की जांच करें।
      3. 'एनालिसिस मॉड्यूल'(चित्रा 5A)नाम के एडवांस्ड पोस्ट-प्रोसेसिंग जीयूआई लॉन्च करने के लिए पोस्ट-प्रोसेसिंग बटन पर क्लिक करें।
      4. इमेज चुनने के लिए सिलेक्ट फाइल बटन पर क्लिक करें।
      5. टैब फिगर ओरिजनल फाइबरमें लेबल के आधार पर फाइबर नंबर दर्ज करने के लिए विजुअलाइज फाइबर बटन पर क्लिक करें ।
        नोट: चयनित फाइबर के माप एक आउटपुट टेबल(चित्रा 5B)में प्रदर्शित किए जाएंगे, और इसी फाइबर को मापा-फाइबर (चित्रा 5C)नाम के टैब फिगर में दिखाए गए मूल छवि पर मढ़ा जाएगा।
      6. थ्रेसिंग ऑपरेशन में जाने के लिए कन्फर्म/अपडेट बटन पर क्लिक करें ।
      7. थ्रेसहोल्ड सेटिंग को सक्षम करने के लिए थ्रेसहोल्ड बॉक्स की जांच करें.
      8. ड्रॉपडाउन मेनू से चार थ्रेसिंग विकल्पों में से एक चुनें।
      9. एक या एक से अधिक फाइबर गुणों के लिए थ्रेसहोल्ड पैनल में वांछित थ्रेसहोल्ड दर्ज करें।
      10. उपरोक्त थ्रेसहोल्डिंग शर्तों को लागू करने के लिए थ्रेसहोल्ड नाउ बटन पर क्लिक करें।
      11. इसके नाम के साथ शीघ्र आंकड़ा की जांच करें, जो चयनित फाइबर को मूल छवियों पर मढ़ा हुआ है, जैसा कि चित्र 5Eमें दिखाया गया है।
      12. वांछनीय थ्रेसहोल्ड सेट करने के लिए 3.3.2.9-3.3.2.11 चरण दोहराएं।
      13. चयनित फाइबर जानकारी को बचाने के लिए सेव फाइबर बटन पर क्लिक करें।
        नोट: इसी चयनित फाइबर के बाद-थ्रेसिंगनाम टैब आंकड़ा में प्रदर्शित किया जाएगा ।
      14. जेनरेट आँकड़े बटन पर क्लिक करें, और फिर सारांश आंकड़े उत्पन्न करने के लिए पॉप-अप विंडो में ओके बटन पर क्लिक करें।
        नोट: एक आउटपुट टेबल(चित्रा 5D)चयनित फाइबर का मतलब मूल्य दिखाएगा। चयनित फाइबर के अन्य आंकड़े एक एक्सेल फ़ाइल में सहेजे जाएंगे जिसका स्थान इस जीयूआई के नीचे स्थिति खिड़की में प्रदर्शित किया जाता है।
      15. आउटपुट फाइल में चयनित व्यक्तिगत फाइबर जानकारी को शामिल करने के लिए, ओके बटन पर क्लिक करने से पहले कच्चे डेटा बॉक्स के लिए जेनरेट शीट की जांच करें।
      16. चरण 3.3.2.4 में कई छवियों से परिणामों को संयोजित करने के लिए, बैच मोड बॉक्स या स्टैक मोड की जांच करें और विश्लेषण करने के लिए कई छवियों या स्टैक (ओं) का चयन करें; चरण 3.3.2.5-3.3.2.6 छोड़ें। चरण 3.3.2.8-3.3.2.9 में, थ्रेसहोल्ड की स्थिति निर्धारित करें, लेकिन जैसे ही बटन अब सीमा तय करते हैं और फाइबर को सहेजते हैं, चरण 3.3.2.10-3.3.2.13 को छोड़ दें; और अंत में, चयनित फाइबर के सारांश आंकड़े और व्यक्तिगत फाइबर गुण उत्पन्न करने के लिए चरण 3.3.2.14 में निर्देशों का पालन करें।

4. वक्रअलाइन के साथ फाइबर विश्लेषण

नोट: CurveAlign शुरू में स्वचालित रूप से उपयोगकर्ता परिभाषित सीमाओं के संबंध में फाइबर के कोणों को मापने के लिए विकसित किया गया था । CurveAlign के वर्तमान संस्करण का उपयोग सीटी-फायर द्वारा निकाली गई व्यक्तिगत फाइबर जानकारी को लोड करके या सीधे वक्रलेट्स के स्थानीय अभिविन्यास का उपयोग करके सापेक्ष कोण माप के अलावा घनत्व और संरेखण-आधारित सुविधाओं के थोक मूल्यांकन के लिए किया जा सकता है। CurveAlign मुख्य रूप से घनत्व और संरेखण के साथ-साथ व्यक्तिगत फाइबर गुणों सहित वैश्विक या स्थानीय सुविधाओं से संबंधित तीस सुविधाओं की गणना करता है जब सीटी-फायर को फाइबर ट्रैकिंग विधि के रूप में अपनाया जाता है।

  1. वक्रलेट्स के साथ फाइबर विश्लेषण
    1. 2.3 में वर्णित ऐप लॉन्च करें।
    2. यदि अन्य संचालन किए गए हैं तो ऐप को अपनी प्रारंभिक स्थिति में रीसेट करने के लिए रीसेट बटन पर क्लिक करें।
    3. मुख्य जीयूआई(चित्रा 6A)में, यह सुनिश्चित करने के लिए फाइबर विश्लेषण विधि विकल्प की जांच करें कि सीटी का चयन (डिफ़ॉल्ट विकल्प) है।
      नोट: इस मोड में, सीटी छवि पर किया जाता है, और प्रत्येक वक्रलेट का अभिविन्यास संबंधित स्थान पर फाइबर की दिशा का प्रतिनिधित्व करता है।
    4. बाउंड्री विधि ड्रॉपडाउन मेनू पर क्लिक करें, और निम्नलिखित ड्रॉपडाउन मेनू विकल्पों में से सीमा प्रसंस्करण मोड का चयन करें: कोई सीमा, सीएसवी बाउंड्री और झगड़ा सीमा नहीं।
      नोट: यदि कोई सीमा की जरूरत है, इस कदम को छोड़ दें । सीमा के संबंध में फाइबर कोणों की गणना करने के लिए 4.3 का उल्लेख करें।
    5. मुख्य जीयूआई(चित्रा 6A)में गेट इमेज (एस) बटन पर क्लिक करें, और फिर त्वरित विंडो से एक या अधिक छवियों/या छवि ढेर का चयन करें । संवाद में कई छवियों का चयन करने के लिए अपने ऑपरेटिंग सिस्टम के लिए उपयुक्त तकनीक का उपयोग करें (उदाहरण के लिए, विंडोज में, कई फ़ाइलों का चयन करते समय सीटीआरएल पकड़ें)।
      नोट: यदि दो या अधिक छवि फ़ाइलों का चयन किया जाता है, तो सभी छवियों को विश्लेषण के लिए समान रनिंग पैरामीटर का उपयोग करना चाहिए। सुनिश्चित करें कि सभी छवियों को एक ही या समान परिस्थितियों में प्राप्त कर रहे हैं।
    6. छवि स्टैक के लिए, स्लाइस स्लाइडर को फ़ाइल लिस्टबॉक्स के नीचे ले जाएं ताकि विश्लेषण किए जाने वाले स्लाइस का चयन किया जा सके।
    7. रखने के लिए coefs के अंशदर्ज करें । यह मूल्य सीटी के सबसे बड़े गुणांक का अंश है जिसका उपयोग फाइबर विश्लेषण में किया जाएगा।
      नोट: यदि छवि में फाइबर तीव्रता या इसके विपरीत एक बड़ा अंतर है, तो फाइबर विश्लेषण के लिए भी विपरीत के साथ ब्याज के क्षेत्रों को एनोटेट करें क्योंकि यह मोड केवल एक छवि में प्रतिभाशाली फाइबर का पता लगाता है। इसके अलावा, छवि का आकार जितना बड़ा होता है, इस अंश के लिए एक छोटा मूल्य निर्धारित करें।
    8. आउटपुट विकल्पों में सभी पैरामीटर और अन्य को डिफ़ॉल्ट के रूप में उन्नत विकल्प में रखें; भविष्य के अन्य कार्यों में आउटपुट फाइलों की आवश्यकता हो सकती है।
    9. मुख्य जीयूआई(चित्रा 6A)के नीचे रन बटन पर क्लिक करें ।
      नोट: प्रगति की जानकारी नीचे हरे रंग में हाइलाइट किए गए संदेश विंडो में प्रदर्शित की जाएगी। प्रक्रिया पूरी होने के बाद, प्रत्येक छवि के लिए कुछ सारांश आंकड़े आउटपुट टेबल(चित्रा 6 बी)में प्रदर्शित किए जाएंगे, और सभी आउटपुट फाइलें मूल छवि (एस) की निर्देशिका में CA_Out नाम के उप-फ़ोल्डर में स्वचालित रूप से सहेजी जाएंगी।
    10. फाइबर कोण के हिस्टोग्राम(चित्रा 6E)या कम्पास प्लॉट(चित्रा 6F)को देखने के लिए आउटपुट टेबल(चित्रा 6B)में किसी भी आइटम पर क्लिक करें।
      नोट: संरेखण या कोण की ओवरले इमेज(चित्रा 6C)और हीटमैप(चित्रा 6डी)भी प्रदर्शित की जाएगी।
    11. अन्य संचालन चलाने के लिए रीसेट बटन पर क्लिक करें, या ऐप छोड़ने के लिए मुख्य जीयूआई बंद करें।
  2. सीटी-फायर के साथ व्यक्तिगत फाइबर विश्लेषण
    नोट: प्रक्रिया धारा 4.1 में वर्णित एक के समान है सिवाय इसके कि चरण 4.1.3 में, सीटी-फायर से संबंधित फाइबर विश्लेषण मोडका चयन करें, और चरण 4.1.7 को छोड़ दें क्योंकि यह लागू नहीं है और सीटी-फायर मोड में अक्षम है। विशेष रूप से, चरण 4.1.3 में, निम्नलिखित तीन सीटी-फायर-आधारित व्यक्तिगत फाइबर विश्लेषण विधियों में से एक का चयन करें:
    1. फाइबर का प्रतिनिधित्व करने के लिए फाइबर सेंटर पॉइंट और फाइबर एंगल का उपयोग करने के लिए सीटी-फायर फाइबर का चयन करें।
      नोट: यह विकल्प फाइबर की लंबाई के साथ फाइबर अभिविन्यास में परिवर्तन पर विचार नहीं करता है।
    2. फाइबर का प्रतिनिधित्व करने के लिए फाइबर और इसी फाइबर कोण के दो अंत बिंदुओं का उपयोग करने के लिए सीटी-फायर एंडपॉइंट्स का चयन करें।
      नोट: 4.2.1 की तुलना में, यह विकल्प एक (फाइबर का केंद्र बिंदु) के बजाय फाइबर का प्रतिनिधित्व करने के लिए दो पदों का उपयोग करता है।
    3. फाइबर का प्रतिनिधित्व करने के लिए फाइबर के खंडों का उपयोग करने के लिए सीटी-फायर सेगमेंट का चयन करें।
      नोट: प्रत्येक सेगमेंट में समान लंबाई (सीटी-फायर में डिफ़ॉल्ट रूप से 5 पिक्सल तक सेट) के साथ-साथ इसका अभिविन्यास और स्थान होता है, जो फाइबर की पूरी लंबाई के साथ अभिविन्यास में परिवर्तन को दर्शाता है। यह विकल्प सबसे अधिक समय लेने वाला होगा, लेकिन एक सुडौल फाइबर के स्थानीय अभिविन्यास में परिवर्तन को ट्रैक करने के लिए तीन सीटी-फायर-आधारित फाइबर विश्लेषण विधियों के बीच सबसे अच्छा विकल्प होगा।
  3. सीमा के साथ सापेक्ष संरेखण विश्लेषण
    नोट: धारा 4.2 और 4.3 में वर्णित सीमा शर्तों के बिना नियमित विश्लेषण की तुलना में, सीमा शर्तों के साथ सापेक्ष संरेखण विश्लेषण निम्नलिखित की आवश्यकता है:
    1. चरण 4.1.3 में, झगड़ा सीमा स्थिति का चयन करें।
      नोट: उपयोगकर्ता को प्रत्येक छवि या प्रत्येक स्टैक के लिए एक संबंधित सीमा फ़ाइल की आवश्यकता होगी। सीएसवी (कॉमा-अलग-वैल्यूज फॉर्मेट आधारित, एक्स-वाई निर्देशांक) सीमा फ़ाइल या झगड़ा सीमा फ़ाइल को मैन्युअल रूप से एनोटेट करने के लिए ऑन-स्क्रीन निर्देशों का पालन करें। वक्रअलाइन में बनाई गई सीमा फ़ाइलें स्वचालित रूप से फ़ाइल निर्देशिका और मैनुअल में वर्णित नाम करण सम्मेलनों के अनुसार सहेजी जाएंगी। यदि एच एंड ई ब्राइट-फील्ड और एसएचजी छवियों की एक जोड़ी प्रदान की जाती है, तो सीमा फ़ाइल उत्पन्न करने के लिए धारा 4.4 में वर्णित स्वचालित सीमा निर्माण मॉड्यूल का उपयोग करें।
    2. प्राथमिक मापदंडों पैनल में, केवल इस दूरी सीमा के भीतर फाइबर का मूल्यांकन करने के लिए निकटतम सीमा से दूरी दर्ज करें।
    3. आउटपुट ऑप्शंस पैनल में, सीमा एसोसिएशन बॉक्स Bdry Assoc की जांच करें जो एक फाइबर, फाइबर सेगमेंट या वक्रलेट से जुड़ी सीमा पर बिंदु की कल्पना करने के लिए है।
  4. स्वचालित सीमा निर्माण
    1. 2.3 में वर्णित ऐप लॉन्च करें।
    2. यदि अन्य ऑपरेशन पहले ही किए जा चुके हैं तो ऐप को अपनी प्रारंभिक स्थिति में रीसेट करने के लिए रीसेट बटन पर क्लिक करें।
    3. ऑटोमैटिक बाउंड्री क्रिएशन मॉड्यूल लॉन्च करने के लिए बीडी क्रिएशन बटन पर क्लिक करें।
    4. एच एंड ई ब्राइट-फील्ड और एसएचजी छवियों की एक जोड़ी के आधार पर एक या एक से अधिक छवियों के लिए सीमा फ़ाइल बनाने के लिए ऑन-स्क्रीन निर्देशों/सुरागों का पालन करें।
    5. मॉड्यूल विंडो को बंद करें, या इस मॉड्यूल को छोड़ने के लिए मुख्य जीयूआई(चित्रा 6A)में रीसेट बटन पर क्लिक करें।
  5. ब्याज विश्लेषण का वक्रअलाइन क्षेत्र
    1. आरओआई प्रबंधक का उपयोग करके आरओआई एनोटेशन
      1. एक या एक से अधिक छवियों को लोड करने के लिए मुख्य जीयूआई(चित्रा 6A)में गेट इमेज (ओं) बटन पर क्लिक करें।
      2. फ़ाइल सूची में एनोटेट होने के लिए छवि का चयन करें।
      3. आरओआई मैनेजर मॉड्यूल(चित्रा 7A)लॉन्च करने के लिए आरओआई मैनेजर पर क्लिक करें ।
      4. धारा 3.2.1 में चरण 3.2.1.5-3.2.1.13 का पालन करें।
    2. आरओआई प्रबंधक में एक ही छवि के लिए आरओआई विश्लेषण
      1. यदि पूर्ण छवि CurveAlign विश्लेषण आयोजित किया गया है, और परिणाम डिफ़ॉल्ट निर्देशिका में सहेजे जाते हैं, आरओआई सूची में एक या एक से अधिक आरओआई पर क्लिक करें, और फिर पोस्ट-आरओआई विश्लेषण चलाने के लिए सीए आरओआई एनालाइजर बटन पर क्लिक करें।
        नोट: विश्लेषण पूरा होने के बाद, सारांश आंकड़े एक आउटपुट टेबल(चित्रा 7C)के साथ-साथ एक हिस्टोग्राम फिगर(चित्रा 7D)में प्रदर्शित किए जाएंगे जो कोण वितरण दिखाता है।
      2. किसी दिए गए आरओआई(चित्रा 7B)के साथ-साथ फाइबर कोणों के हिस्टोग्राम में फाइबर की कल्पना करने के लिए आउटपुट टेबल में किसी भी आइटम पर क्लिक करें।
      3. \\\[छवि फ़ोल्डर]पर स्थित एक उपफोल्डर में सहेजी गई आउटपुट फाइलों की जांच करें \ CA_ROI \ व्यक्तिगत \ ROI_post_analysis \
      4. यदि पूर्ण छवि वाले सीए विश्लेषण नहीं किए गए हैं, तो आरओआई सूची में एक या एक से अधिक आरओआई पर क्लिक करें, और चयनित आरओआई पर सीधे सीए विश्लेषण लागू करने के लिए आरओआई बटन पर लागू सीए पर क्लिक करें। विश्लेषण चलाने के लिए त्वरित विंडो में निर्देशों का पालन करें।
        नोट: सीए विश्लेषण चलाने के मापदंड मुख्य जीयूआई के माध्यम से पारित किए जाते हैं; आवश्यकतानुसार चरण 4.1.7 में वर्णित रनिंग पैरामीटर को अपडेट करें। विश्लेषण पूरा होने के बाद, फाइबर उपायों के सारांश आंकड़ों के परिणाम आउटपुट टेबल में प्रदर्शित किए जाएंगे। परिणाम स्वचालित रूप से एक उपफोल्डर में सहेजा जाएगा \ \ [छवि फ़ोल्डर] \ CA_ROI \ व्यक्तिगत \ ROI_analysis\
    3. आरओआई एनालाइजर का उपयोग करके कई छवियों के लिए आरओआई विश्लेषण
      1. छवियों का विश्लेषण करने के लिए आरओआई को एनोटेट करने के लिए 4.5.1 में चरणों का पालन करें।
      2. गेट इमेज (एस) बटन पर क्लिक करके एक या एक से अधिक छवियां खोलें।
      3. आरओआई पोस्ट विश्लेषण चलाने के लिए जब पूर्ण छवि विश्लेषण परिणाम उपलब्ध हों, तो आरओआई विश्लेषण बटन पर क्लिक करें और आरओआई पोस्ट-प्रोसेसिंगविकल्प का चयन करें।
      4. जीयूआई के नीचे और कमांड विंडो में संदेश विंडो में प्रदर्शित प्रगति जानकारी की जांच करें।
      5. विश्लेषण पूरा होने के बाद, आउटपुट टेबल में प्रदर्शित प्रत्येक आरओआई के सारांश आंकड़ों की जांच करें।
        नोट: विस्तृत आउटपुट फाइलें स्वचालित रूप से एक उपफोल्डर में सहेजी जाती हैं \ \ CA_ROI \ बैच \ ROI_post_analysis\
      6. सीटी मोड के साथ एक सीधा विश्लेषण चलाने के लिए जब पूर्ण छवि विश्लेषण परिणाम उपलब्ध नहीं हैं, कदम 4.5.3.1-4.5.3.5 का पालन करें, निम्नलिखित परिवर्तनों के अलावा: किसी भी आकार के आरओआई के साथ मुखौटा पर फसली आयताकार आरओआई या सीए पर विकल्प सीए का चयन करके चरण 4.5.3.3 को संशोधित करें। यदि सभी एनोटेटेड आरओआई आयताकार आकार के हैं, तो आयताकार आरओआई विकल्प चुनें। चरण 4.5.3.2 के बाद, 4.1.7 में वर्णित रनिंग पैरामीटर को अपडेट करें।
        नोट: आरओआई विश्लेषण परिणामों को \ पर स्थित एक उपफोल्डर में सहेजा जाएगा \ \ CA_ROI \ बैच \ ROI_analysis \
  6. कर्वेअलाइन की पोस्ट-प्रोसेसिंग
    1. धारा 2.3 में वर्णित ऐप लॉन्च करें।
    2. यदि अन्य कार्य पहले ही किए जा चुके हैं तो ऐप को अपनी प्रारंभिक स्थिति में रीसेट करने के लिए रीसेट बटन पर क्लिक करें।
    3. पोस्ट-प्रोसेसिंग मॉड्यूल लॉन्च करने के लिए पोस्ट-प्रोसेसिंग बटन पर क्लिक करें।
    4. विभिन्न छवियों से आउटपुट सुविधाओं या मूल्यों को संयोजित करने के लिए ऑन-स्क्रीन निर्देशों/सुरागों का पालन करें।
    5. मॉड्यूल विंडो को बंद करें, या इस मॉड्यूल को छोड़ने के लिए मुख्य जीयूआई(चित्रा 6A)में रीसेट बटन पर क्लिक करें।

5. अनुमानित रनिंग टाइम

  1. मध्यम फाइबर घनत्व के साथ 1024 पिक्सल x 1024 पिक्सल के आकार के साथ एक छवि प्रसंस्करण के लिए अनुमानित रनिंग टाइम प्रतीक्षा करें। वास्तविक कम्प्यूटेशनल समय आम तौर पर फ़ाइल के आकार, विश्लेषण मोड, तैनात की जाने वाली सुविधाओं, केंद्रीय प्रसंस्करण इकाई (सीपीयू) प्रकार और उपलब्ध यादृच्छिक-पहुंच स्मृति (या रैम) की मात्रा सहित कई कारकों पर निर्भर करता है। सीटी-फायर व्यक्तिगत फाइबर निष्कर्षण मिनट के एक जोड़े को लगते हैं । बिना बाउंड्री के कर्वअलाइन सीटी-मोड में कुछ सेकंड लगते हैं। वक्रअलाइन सीटी-फायर फाइबर या फाइबर सीमा के बिना मोड समाप्त होता है सेकंड के दसियों लेता है । सीमा के बिना CurveAlign सीटी-फायर फाइबर मोड सैकड़ों सेकंड लेता है। सीमा के साथ CurveAlign विश्लेषण सीमाओं की जटिलता के आधार पर, कई मिनट के लिए सेकंड के दसियों लेता है ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

इन तरीकों को सफलतापूर्वक कई अध्ययनों में लागू किया गया है। कुछ विशिष्ट अनुप्रयोगों में शामिल हैं: 1) Conklin एट अल.22 ने ट्यूमर से जुड़े कोलेजन हस्ताक्षरों की गणना करने के लिए CurveAlign का उपयोग किया, और पाया कि कोलेजन फाइबर सीटू (डीसीआईएस) घावों में डक्टल कार्सिनोमा में डक्ट परिधि के लिए अधिक बार गठबंधन किए गए थे; 2) ड्रिफ्का एट अल10 ने वक्रअलाइन में सीटी-फायर मोड का उपयोग अग्नाशय डक्टल एडेनोकार्सिनोमा और सामान्य/क्रोनिक अग्नाशयशोथ ऊतकों के लिए स्ट्रोमल कोलेजन संरेखण की मात्रा निर्धारित करने के लिए किया, और पाया कि सामान्य/पुराने ऊतकों की तुलना में कैंसर ऊतकों में वृद्धि हुई संरेखण था; 3) अलमिन एट अल.7 ने ओवेरियन स्ट्रोमल कोलेजन की एसएचजी छवियों से एफ-ऐक्टिन फाइबर और समग्र कोलेजन संरेखण के कोणीय वितरण की मात्रा निर्धारित करने के लिए CurveAlign का उपयोग किया, और दिखाया कि मैट्रिक्स आकृति विज्ञान सेल गतिशीलता और एफ-ऐक्टिन संरेखण को चलाने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है; 4) LeBert एट अल3 एक ज़ेब्राफ़िश घाव की मरंमत मॉडल के एसएचजी छवियों के लिए सीटी-आग लागू किया और तीव्र घायल होने के बाद कोलेजन फाइबर की मोटाई में वृद्धि पाया; 5) डिवाइन एटअल. 45 ने व्यक्तिगत फाइबर गुणों और समग्र संरेखण को मापने के लिए विभिन्न पशु मॉडलों से मुखर गुना कोलेजन की एसएचजी छवियों के लिए CurveAlign में सीटी-फायर मोड का उपयोग किया, और दिखाया कि पोर्सिन और कैनाइन मुखर गुना कोलेजन में उच्च संरेखण और सीधापन था; 6) कीखोसरवी एट अल13 ने एलसी-पोलस्कोप के साथ इमेज किए गए हिस्टोपैथोलॉजी नमूनों में कोलेजन अलाइनमेंट की मात्रा निर्धारित करने के लिए CurveAlign का उपयोग किया, और दिखाया कि एलसी-पोलस्कोप और एसएचजी कुछ प्रकार के ऊतकों के लिए संरेखण और अभिविन्यास माप के मामले में तुलनीय हैं।

Figure 1
चित्रा 1: एक मानव स्तन कैंसर ऊतक माइक्रोएरी (टीएमए) के एसएचजी छवियों से ट्यूमर से जुड़े कोलेजन हस्ताक्षर खोजने के लिए CurveAlign का उपयोग करना । (A)एसएचजी इमेज (पीला) के साथ टीएमए कोर की ओवरले इमेज इसी एच एंड ई ब्राइट फील्ड इमेज पर मढ़ा जाता है । (ख)(ए)के हित का क्षेत्र । (ग)की ब्राइट फील्ड इमेज(बी)। (घ)एसएचजी इमेज ऑफ(बी)। (च)ब्राइट फील्ड इमेज(सी)से जुड़ा मास्क । (ई)CurveAlign आउटपुट ओवरले छवि ट्यूमर सीमाओं (पीले) से(एफ),प्रतिनिधि फाइबर स्थानों, और अभिविन्यास (हरी लाइनों) दिखा; नीली रेखाओं का उपयोग फाइबर को उनकी निकटतम सीमाओं के साथ संबद्ध करने के लिए किया जाता है। (बी)और(ई)में हरे तीर ट्यूमर सीमा के समानांतर फाइबर दिखाते हैं, जबकि वहां लाल तीर सीमा के लंबवत फाइबर दिखाते हैं। स्केल बार(ए)200 माइक्रोन के बराबर है। (बी)में छवियां-(एफ) एक ही पैमाने में प्रदर्शित कर रहे हैं, और प्रतिनिधि पैमाने बार में(डी)५० μm के बराबर होती है । संक्षिप्त रूप: एसएचजी = दूसरी हार्मोनिक पीढ़ी; एच एंड ई = हेमटॉक्सीलिन और ियोसिन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: एक फाइब्रिलर कोलेजन छवि के मात्राकरण का योजनाबद्ध कार्यप्रवाह। (A)एसएचजी इमेज का विश्लेषण सीटी-फायर और/या कर्वअलाइन द्वारा किया जाएगा । (ख)सीटी-फायर द्वारा ओवरले इमेज आउटपुट । (ग)मास्क बाउंड्री ऑफ(ए)एक वैकल्पिक कर्वअलिज इनपुट है । (घ)वक्रअलाइन द्वारा इमेज आउटपुट को ओवरले करें। (बी)में रंग लाइनें निकाले गए फाइबर का प्रतिनिधित्व करती हैं। (घ)में, हरी रेखाएं उन फाइबर के स्थानों और झुकाव को इंगित करती हैं जो सीमाओं (पीली रेखाओं) के बाहर हैं और उनकी निकटतम सीमाओं से निर्दिष्ट दूरी के भीतर हैं, लाल रेखाएं अन्य फाइबर हैं, और नीली रेखाओं का उपयोग फाइबर को उनकी निकटतम सीमाओं के साथ संबद्ध करने के लिए किया जाता है। (A)-(D)में छवियां एक ही पैमाने में प्रदर्शित कर रहे हैं, और प्रतिनिधि पैमाने बार में(A)२०० μm के बराबर होती है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: सीटी-फायर नियमित विश्लेषण। (A)मुख्य जीयूआई । (ख)सारांश आंकड़े दिखाते हुए आउटपुट टेबल । (ग)और(एफ)क्रमशः कोण और चौड़ाई के हिस्टोग्राम दिखाते हैं । (ई)आउटपुट इमेज जिसमें निकाले गए फाइबर (कलर लाइन्स) को मूल एसएचजी इमेज(डी)पर मढ़ा हुआ दिखाया गया है । संक्षिप्त रूप: जीयूआई = सीटी = वक्रलेट ट्रांसफॉर्म; ग्राफिकल यूजर इंटरफेस; एसएचजी = दूसरी हार्मोनिक पीढ़ी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: सीटी-फायर आरओआई प्रबंधन मॉड्यूल। (A)मॉड्यूल जीयूआई। (ख)आरओआई के बाद चार आरओआई का विश्लेषण, जिसमें प्रत्येक आरओआई के भीतर फाइबर दिखाते हुए विभिन्न आकार दिए जाते हैं । (ग)विभिन्न फाइबर गुणों के आरओआई हिस्टोग्राम। संक्षिप्त रूप: सीटी = वक्रलेट ट्रांसफॉर्म; जीयूआई = ग्राफिकल यूजर इंटरफेस; आरओआई = ब्याज का क्षेत्र। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: सीटी-फायर उन्नत पोस्ट-प्रोसेसिंग मॉड्यूल। (A)मॉड्यूल जीयूआई। (ख)चयनित तीन फाइबर के माप। (ग)चयनित तीन फाइबर का दृश्य(बी)में । (घ)लंबाई सीमा (>60 पिक्सल) लागू करने के बाद सारांश आंकड़े । (ई)लंबाई आधारित रंग बार के साथ(डी)में चयनित फाइबर का दृश्य। संक्षिप्त रूप: सीटी = वक्रलेट ट्रांसफॉर्म; जीयूआई = ग्राफिकल यूजर इंटरफेस। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्र 6: CurveAlign नियमित विश्लेषण। (A)मुख्य जीयूआई । (ख)सारांश आंकड़े दिखाते हुए आउटपुट टेबल । (ग)आउटपुट इमेज मूल एसएचजी छवि पर मढ़ा प्रतिनिधि फाइबर (हरी रेखाओं) और सीमाओं (पीली रेखाओं) के स्थानों और अभिविन्यास को दिखाता है, नीली रेखाओं का उपयोग फाइबर को उनकी निकटतम सीमाओं के साथ संबद्ध करने के लिए किया जाता है, लाल रेखाएं सीमा के अंदर या बाहर की सीमा के अंदर फाइबर के स्थानों और झुकाव को दिखाती हैं (&उपयोगकर्ता निर्दिष्ट दूरी, उदाहरण के लिए, 250 पिक्सेल यहां)। (घ)कोणों का हीटमैप: लाल (> 60 डिग्री), पीला (45-60] डिग्री, हरा (10, 45] डिग्री। (ई)-(एफ) क्रमशः हिस्टोग्राम और कंपास प्लॉट का उपयोग करके कोण वितरण दिखाते हैं। संक्षिप्त रूप: जीयूआई = ग्राफिकल यूजर इंटरफेस; एसएचजी = दूसरी हार्मोनिक पीढ़ी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 7
चित्रा 7: CurveAlign रॉय प्रबंधन मॉड्यूल। (A)मॉड्यूल जीयूआई। (ख)मूल छवि पर मढ़ा चार एनोटेटेड आयताकार ROIs । (ग)आरओआई पोस्ट-एनालिसिस आउटपुट टेबल । (घ)प्रत्येक आरओआई का एंगल हिस्टोग्राम। संक्षिप्त रूप: आरओआई = ब्याज का क्षेत्र; जीयूआई = ग्राफिकल यूजर इंटरफेस। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

यह प्रोटोकॉल फाइब्रिलर कोलेजन क्वांटिफिकेशन के लिए सीटी-फायर और कर्वएलिजन के उपयोग का वर्णन करता है और सीटी-फायर या वक्रअलाइन द्वारा विश्लेषण के लिए उपयुक्त कोलेजन फाइबर या अन्य लाइन-जैसे लंबी संरचनाओं के साथ किसी भी छवि पर लागू किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, इलास्टिन या लोचदार फाइबर को इस मंच पर इसी तरह से संसाधित किया जा सकता है। हमने गणना के दौरान उत्पादित सिंथेटिक फाइबर21पर दोनों उपकरणों का परीक्षण किया है । एप्लिकेशन के आधार पर, उपयोगकर्ताओं को विश्लेषण मोड चुनना चाहिए जो उनके डेटा के लिए सबसे उपयुक्त है। सीटी फाइबर विश्लेषण मोड सीधे फाइबर स्थान और अभिविन्यास का प्रतिनिधित्व करने के लिए सीटी में curvelets का उपयोग कर सकते हैं, और यह स्थानीय फाइबर संरचना में परिवर्तन के प्रति संवेदनशील है । सीटी मोड का उपयोग जटिल परिस्थितियों में फाइबर और उनके अभिविन्यास का पता लगाने के लिए किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, जहां शोर का स्तर अधिक है, फाइबर सुडौल है, या फाइबर मोटाई में भिन्नता अधिक है। हालांकि, के रूप में सीटी मोड केवल एक छवि के प्रतिभाशाली भागों उठाता है, यह कम तीव्रता के साथ कुछ फाइबर याद आती है जब वहां छवि तीव्रता में एक बड़ा बदलाव है ।

इसके अलावा, सीटी मोड व्यक्तिगत फाइबर के बारे में जानकारी प्रदान नहीं करता है। सीटी-मोड के विपरीत, सीटी-फायर मोड व्यक्तिगत फाइबर गुणों की गणना करता है और उन सभी फाइबर का विश्लेषण कर सकता है जिनकी तीव्रता एक निर्दिष्ट सीमा से ऊपर है। सीटी-फायर मोड से जुड़ी चुनौतियों में शामिल हैं: 1) एक बरकरार फाइबर निष्कर्षण की सटीकता को कम या समझौता किया जा सकता है जब फाइबर या फाइबर मोटाई के साथ तीव्रता में बड़ी भिन्नता होती है; और 2) वर्तमान मानक विश्लेषण गणना की मांग के रूप में प्रोटोकॉल में उल्लेख किया है । इन तरीकों के फायदों और सीमाओं के बारे में अधिक जानकारी हमारे पिछले प्रकाशनों में देखी जा सकती है20,21.

जहां तक फाइबर ट्रैकिंग की सटीकता का संबंध है, उपयोगकर्ता मुख्य रूप से ओवरलैपिंग छवि की जांच करने के लिए दृश्य निरीक्षण पर भरोसा कर सकता है जहां निकाले गए फाइबर या प्रतिनिधि झुकाव मूल छवि पर मढ़ा जाता है। इसके अलावा, सीटी-फायर के लिए, उपयोगकर्ता चयनित व्यक्तिगत फाइबर के गुणों की पहचान करने के लिए उन्नत पोस्ट-प्रोसेसिंग मॉड्यूल का उपयोग कर सकता है, और फिजी46जैसे अन्य छवि विश्लेषण उपकरणों का उपयोग करके माप से उनकी तुलना कर सकता है। CurveAlign के लिए, उपयोगकर्ता ओरिएंटेशन या संरेखण परिणामों की तुलना ओरिएंटेशनजे16 और साइटोस्पेक्ट्रे17जैसे अन्य उपकरणों द्वारा गणना किए गए परिणामों से कर सकता है।

प्लेटफ़ॉर्म द्वारा आउटपुट के लिए उपलब्ध सुविधाओं में, संरेखण से संबंधित सुविधाओं का सबसे अधिक उपयोग किया जाता है और सबसे विश्वसनीय और मजबूत हैं। व्यक्तिगत फाइबर सुविधाओं का उपयोग करने के लिए, उपयोगकर्ता को प्रतिनिधि फाइबर सुविधाओं के निष्कर्षण की पुष्टि करने की आवश्यकता है। ध्यान दें, एक बरकरार फाइबर को कुछ परिस्थितियों में कई छोटे खंडों में विभाजित किया जा सकता है, जिसे उपयोगकर्ता को फाइबर विश्लेषण मोड का चयन करते समय या आगे सांख्यिकीय विश्लेषण करते समय ध्यान में रखना चाहिए। यहां तक कि जब फाइबर की लंबाई सीधे एक तुलनीय संपत्ति के रूप में इस्तेमाल नहीं किया जा सकता है, अभिविन्यास या उनकी लंबाई के खिलाफ भारित फाइबर खंडों की चौड़ाई अभी भी उपयोगी जानकारी का संकेत हो सकता है । जहां तक एसएचजी इमेजिंग का संबंध है, उद्देश्य लेंस का संख्यात्मक एपर्चर (एनए) फाइबर की चौड़ाई और लंबाई का पता लगाने को काफी प्रभावित कर सकता है, लेकिन इसका अभिविन्यास और संरेखण माप पर कम प्रभाव पड़ता है। एसएचजी इमेजिंग में हमारे अनुभव में, हमें आमतौर पर एक मजबूत फाइबर मोटाई माप प्राप्त करने के लिए एनए ≥ 1.0 के साथ 40x आवर्धन या उच्च के साथ ऑब्जेक्टिव लेंस का उपयोग करने की आवश्यकता होती है।

"संरेखण" की व्याख्या तीन अलग-अलग तरीकों से की जा सकती है: 1) "कोण" नामक सकारात्मक क्षैतिज दिशा के संबंध में संरेखण, 0 से 180 डिग्री तक, जहां 0 के करीब कोणों में 180 डिग्री के करीब कोणों के समान अभिविन्यास होता है; 2) "सापेक्ष कोण" नामक सीमा के संबंध में संरेखण, 0 से 90 डिग्री तक, 0 डिग्री सीमा के समानांतर फाइबर का संकेत देता है और 90 लंबवत फाइबर का संकेत देता है; और 3) एक दूसरे के संबंध में फाइबर का संरेखण "संरेखण गुणांक", 0 से 1 तक, 1 पूरी तरह से गठबंधन फाइबर और अधिक बेतरतीब ढंग से वितरित फाइबर का प्रतिनिधित्व करने वाले छोटे मूल्यों का संकेत देता है।

इस मंच में गणना की गई फाइबर सुविधाओं के अलावा, बनावट विश्लेषण47, 48,49 के आधार पर कुछ मैट्रिक्स को ईसीएम पैटर्न की मात्रा निर्धारित करने का भी प्रस्ताव किया गया था। उन बनावट से संबंधित सुविधाओं कुछ अनुप्रयोगों में ECM के एक वैकल्पिक या अतिरिक्त वर्णनकर्ता प्रदान कर सकते हैं । इस प्रकार के मैट्रिक्स के विकास के लिए चुनौतियां संभावित जैविक प्रासंगिकता, स्थानीय लक्षण वर्णन और व्यक्तिगत फाइबर का पता लगाने की सटीकता के अंतर-संचालन में झूठ बोलती हैं।

चल रहे मापदंडों को अनुकूलित करने और समस्या निवारण करने के लिए, उपयोगकर्ता मैनुअल, प्रासंगिकप्रकाशनों 20,21 के साथ-साथ वक्रलेट्स भंडार के गिटहब विकी पृष्ठों पर एफएक्यू साइडबार का उल्लेख कर सकता है: https://github.com/uw-loci/curvelets/wiki। कुछ बटनों के लिए, जब उपयोगकर्ता माउस आइकन को एक बटन से ऊपर ले जाता है तो वर्तमान या अगले ऑपरेशन के लिए उपयोगकर्ता को मार्गदर्शन करने के लिए एक फ़ंक्शन संकेत दिखाई दे सकता है। समस्या निवारण करने के लिए जीयूआई या कमांड विंडो पर जानकारी का पालन करें।

एक बड़े डेटासेट को संसाधित करने के लिए, उपयोगकर्ता को समानांतर कंप्यूटिंग विकल्पों का उपयोग करने के लिए प्रोत्साहित किया जाता है, जो उपकरण को एक साथ कई छवियों को संसाधित करने में सक्षम बनाता है। यदि उपयोग किया जा रहा है तो एक विकल्प कई सीपीयू कोर का उपयोग कर रहा है। वैकल्पिक रूप से, दोनों एपीपी का एक हेडलेस संस्करण प्रदान किया जाता है और विस्कॉन्सिन-मैडिसन विश्वविद्यालय में कोंडोर-आधारित50 सेंटर फॉर हाई थ्रूपुट कंप्यूटिंग (CHTC) में आयोजित सर्वर के माध्यम से संकलन नोड में सफलतापूर्वक संकलित किया गया है। बड़े पैमाने पर फाइबर क्वांटिफिकेशन के लिए सीएचटीसी कार्यप्रवाह विकसित किया गया है, परीक्षण किया गया है, और हजारों छवियों से मिलकर वास्तविक छवि सेट पर सफलतापूर्वक उपयोग किया गया है। उपयोगकर्ता अमेज़ॅन, Google और माइक्रोसॉफ्ट द्वारा प्रदान की जाने वाली वाणिज्यिक सेवाओं सहित अन्य क्लाउड कंप्यूटिंग सिस्टम पर मात्राकरण चलाने के लिए सीटी-फायर और CurveAlign दोनों के हेडलेस मैटलैब कार्यों को अनुकूलित कर सकता है।

चल रहे और भविष्य के विकास के निर्देशों में शामिल हैं: 1) उच्च गुणवत्ता वाले सिंथेटिक कोलेजन फाइबर छवियों को निकालने या उत्पन्न करने और फाइबर ट्रेसिंग एल्गोरिदम की मजबूती और सटीकता में सुधार करने के लिए गहरे सीखने वाले तंत्रिका नेटवर्क का समावेश; 2) सर्वश्रेष्ठ सॉफ्टवेयर इंजीनियरिंग प्रथाओं का पालन करते हुए कोड और प्रलेखन का अनुकूलन करते हुए सभी मॉड्यूल को एक व्यापक मंच में एकीकरण; 3) क्लाउड कंप्यूटिंग प्लेटफॉर्म पर सभी मुख्य सुविधाओं की तैनाती; 4) CHTC सेवा का उपयोग कर फाइबर विश्लेषण के कार्यप्रवाह की वृद्धि; और 5) सिंथेटिक फाइबर जनरेटर की कार्यक्षमता में सुधार।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम पिछले कुछ वर्षों में सीटी-फायर और CurveAlign के लिए कई योगदानकर्ताओं और उपयोगकर्ताओं को धन्यवाद देते हैं, जिनमें डॉ रोब नोलक, डॉ कैरोलिन पेहलके, डॉ जेरेमी ब्रेडफेल्ट, गुनीत मेहता, एंड्रयू लीच, डॉ अदिब कीखोसरवी, डॉ मैट कॉनक्लिन, डॉ जायने गिलहरी, डॉ पाओलो प्रोवेन्जानो, डॉ ब्रेंडा ओगले, डॉ पेट्रीसिया कीली, डॉ जोसेफ Szulczewski, डॉ सुजान पोनिक और अतिरिक्त तकनीकी योगदान शामिल हैं । इस काम को सेमीकंडक्टर रिसर्च कॉरपोरेशन, मोरग्रिज इंस्टीट्यूट फॉर रिसर्च, और एनआईएच ग्रांट R01CA199996, R01CA181385 और U54CA210190 से केडब्ल्यूई तक फंडिंग से सपोर्ट मिला ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CT-FIRE Univerity of Wisconsin-Madison N/A open source software available from https://eliceirilab.org/software/ctfire/
CurveAlign University of Wisconsin-Madison N/A open source software available from https://eliceirilab.org/software/curvealign/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nadiarnykh, O., et al. Second harmonic generation imaging microscopy studies of osteogenesis imperfecta. Journal of Biomedical Optics. 12 (5), 051805 (2007).
  2. Kouris, N. A., et al. A nondenatured, noncrosslinked collagen matrix to deliver stem cells to the heart. Regenerative Medicine. 6 (5), 569-582 (2011).
  3. LeBert, D. C., et al. Matrix metalloproteinase 9 modulates collagen matrices and wound repair. Development. 142 (12), 2136-2146 (2015).
  4. Provenzano, P. P., et al. Collagen reorganization at the tumor-stromal interface facilitates local invasion. BMC Medicine. 4 (1), 38 (2006).
  5. Provenzano, P. P., et al. Collagen density promotes mammary tumor initiation and progression. BMC Medicine. 6 (1), 1 (2008).
  6. Conklin, M. W., et al. Aligned collagen is a prognostic signature for survival in human breast carcinoma. The American Journal of Pathology. 178 (3), 1221-1232 (2011).
  7. Alkmin, S., et al. Migration dynamics of ovarian epithelial cells on micro-fabricated image-based models of normal and malignant stroma. Acta Biomaterialia. 100, 92-104 (2019).
  8. Campbell, K. R., Campagnola, P. J. Assessing local stromal alterations in human ovarian cancer subtypes via second harmonic generation microscopy and analysis. Journal of Biomedical Optics. 22 (11), 116008 (2017).
  9. Best, S. L., et al. Collagen organization of renal cell carcinoma differs between low and high grade tumors. BMC Cancer. 19 (1), 490 (2019).
  10. Drifka, C. R., et al. Periductal stromal collagen topology of pancreatic ductal adenocarcinoma differs from that of normal and chronic pancreatitis. Modern Pathology. 28 (11), 1470-1480 (2015).
  11. Campagnola, P. J., et al. Three-dimensional high-resolution second-harmonic generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues. Biophysical Journal. 82 (1), 493-508 (2002).
  12. Arun Gopinathan, P., et al. Study of collagen birefringence in different grades of oral squamous cell carcinoma using picrosirius red and polarized light microscopy. Scientifica. 2015, 1-7 (2015).
  13. Keikhosravi, A., et al. Quantification of collagen organization in histopathology samples using liquid crystal based polarization microscopy. Biomedical Optics Express. 8 (9), 4243-4256 (2017).
  14. Quan, B. D., Sone, E. D. Cryo-TEM analysis of collagen fibrillar structure. Methods in Enzymology. 532, 189-205 (2013).
  15. Boudaoud, A., et al. FibrilTool, an ImageJ plug-in to quantify fibrillar structures in raw microscopy images. Nature Protocols. 9 (2), 457-463 (2014).
  16. Rezakhaniha, R., et al. Experimental investigation of collagen waviness and orientation in the arterial adventitia using confocal laser scanning microscopy. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 11 (3-4), 461-473 (2012).
  17. Kartasalo, K., et al. CytoSpectre: a tool for spectral analysis of oriented structures on cellular and subcellular levels. BMC Bioinformatics. 16 (1), 1 (2015).
  18. Bredfeldt, J. S., et al. Computational segmentation of collagen fibers from second-harmonic generation images of breast cancer. Journal of Biomedical Optics. 19 (1), 016007 (2014).
  19. Bredfeldt, J. S., et al. Automated quantification of aligned collagen for human breast carcinoma prognosis. Journal of Pathology Informatics. 5 (1), 28 (2014).
  20. Liu, Y., Keikhosravi, A., Mehta, G. S., Drifka, C. R., Eliceiri, K. W. Methods for quantifying fibrillar collagen alignment. Methods in Molecular Biology. 1627, 429-451 (2017).
  21. Liu, Y., et al. Fibrillar collagen quantification with curvelet transform based computational methods. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 198 (2020).
  22. Conklin, M. W., et al. Collagen alignment as a predictor of recurrence after ductal carcinoma in situ. Cancer Epidemiology and Prevention Biomarkers. 27 (2), 138-145 (2018).
  23. Jallow, F., et al. Dynamic interactions between the extracellular matrix and estrogen activity in progression of ER+ breast cancer. Oncogene. 38 (43), 6913-6925 (2019).
  24. Smirnova, T., et al. Serpin E2 promotes breast cancer metastasis by remodeling the tumor matrix and polarizing tumor associated macrophages. Oncotarget. 7 (50), 82289 (2016).
  25. Fanous, M., Keikhosravi, A., Kajdacsy-Balla, A., Eliceiri, K. W., Popescu, G. Quantitative phase imaging of stromal prognostic markers in pancreatic ductal adenocarcinoma. Biomedical Optics Express. 11 (3), 1354-1364 (2020).
  26. Jiménez-Torres, J. A., Virumbrales-Muñoz, M., Sung, K. E., Lee, M. H., Abel, E. J., Beebe, D. J. Patient-specific organotypic blood vessels as an in vitro model for anti-angiogenic drug response testing in renal cell carcinoma. EBioMedicine. 42, 408-419 (2019).
  27. Govindaraju, P., Todd, L., Shetye, S., Monslow, J., Puré, E. CD44-dependent inflammation, fibrogenesis, and collagenolysis regulates extracellular matrix remodeling and tensile strength during cutaneous wound healing. Matrix Biology. 75, 314-330 (2019).
  28. Henn, D., et al. Cryopreserved human skin allografts promote angiogenesis and dermal regeneration in a murine model. International Wound Journal. 17 (4), 925-936 (2020).
  29. Rico-Jimenez, J., et al. Non-invasive monitoring of pharmacodynamics during the skin wound healing process using multimodal optical microscopy. BMJ Open Diabetes Research and Care. 8 (1), 000974 (2020).
  30. Israel, J. S., et al. Quantification of collagen organization after nerve repair. Plastic and Reconstructive Surgery Global Open. 5 (12), (2017).
  31. Rentchler, E. C., Gant, K. L., Drapkin, R., Patankar, M., Campagnola, P. J. Imaging collagen alterations in STICs and high grade ovarian cancers in the fallopian tubes by second harmonic generation microscopy. Cancers. 11 (11), 1805 (2019).
  32. Hu, C., et al. Imaging collagen properties in the uterosacral ligaments of women with pelvic organ prolapse using spatial light interference microscopy (SLIM). Frontiers in Physics. 7, 72 (2019).
  33. Guirado, E., et al. Disrupted protein expression and altered proteolytic events in hypophosphatemic dentin can be rescued by dentin matrix protein 1. Frontiers in Physiology. 11, 82 (2020).
  34. Kiss, N., et al. Quantitative analysis on ex vivo nonlinear microscopy images of basal cell carcinoma samples in comparison to healthy skin. Pathology & Oncology Research. 25 (3), 1015-1021 (2019).
  35. Lewis, D. M., et al. Collagen fiber architecture regulates hypoxic sarcoma cell migration. ACS Biomaterials Science & Engineering. 4 (2), 400-409 (2018).
  36. Moura, C. C., Bourdakos, K. N., Tare, R. S., Oreffo, R. O., Mahajan, S. Live-imaging of Bioengineered Cartilage Tissue using Multimodal Non-linear Molecular Imaging. Scientific Reports. 9 (1), 1-9 (2019).
  37. Murtada, S. I., et al. Paradoxical aortic stiffening and subsequent cardiac dysfunction in Hutchinson-Gilford progeria syndrome. Journal of The Royal Society Interface. 17 (166), 0066 (2020).
  38. Nichol, R. H., Catlett, T. S., Onesto, M. M., Hollender, D., Gómez, T. M. Environmental elasticity regulates cell-type specific RHOA signaling and neuritogenesis of human neurons. Stem Cell Reports. 13 (6), 1006-1021 (2019).
  39. Pointer, K. B., et al. Association of collagen architecture with glioblastoma patient survival. Journal of Neurosurgery. 126 (6), 1812-1821 (2016).
  40. Razavi, M. S., Leonard-Duke, J., Hardie, B., Dixon, J. B., Gleason, R. L. Axial stretch regulates rat tail collecting lymphatic vessel contractions. Scientific Reports. 10 (1), 1-11 (2020).
  41. Xue, Y., et al. Valve leaflet-inspired elastomeric scaffolds with tunable and anisotropic mechanical properties. Polymers for Advanced Technologies. 31 (1), 94-106 (2020).
  42. Zhou, Z. H., et al. Reorganized collagen in the tumor microenvironment of gastric cancer and its association with prognosis. Journal of Cancer. 8 (8), 1466 (2017).
  43. Zinn, A., et al. The small GTPase RhoG regulates microtubule-mediated focal adhesion disassembly. Scientific Reports. 9 (1), 1-15 (2019).
  44. Zwaans, B. M., et al. Radiation cystitis modeling: A comparative study of bladder fibrosis radio-sensitivity in C57BL/6, C3H, and BALB/c mice. Physiological Reports. 8 (4), (2020).
  45. Devine, E. E., Liu, Y., Keikhosravi, A., Eliceiri, K. W., Jiang, J. J. Quantitative second harmonic generation imaging of leporine, canine, and porcine vocal fold collagen. The Laryngoscope. 129 (11), 2549-2556 (2019).
  46. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  47. Zeitoune, A. A., et al. Epithelial ovarian cancer diagnosis of second-harmonic generation images: A semiautomatic collagen fibers quantification protocol. Cancer Informatics. 16, (2017).
  48. Wershof, E., et al. Matrix feedback enables diverse higher-order patterning of the extracellular matrix. PLoS Computational Biology. 15 (10), 1007251 (2019).
  49. Mostaço-Guidolin, L. B., et al. Fractal dimension and directional analysis of elastic and collagen fiber arrangement in unsectioned arterial tissues affected by atherosclerosis and aging. Journal of Applied Physiology. 126 (3), 638-646 (2019).
  50. Thain, D., Tannenbaum, T., Livny, M. Distributed computing in practice: the Condor experience. Concurrency and Computation: Practice and Experience. 17 (2-4), 323-356 (2005).

Tags

बायोइंजीनियरिंग अंक 165 ट्यूमर माइक्रोएनवायरमेंट एक्सपेरिमेंट मैट्रिक्स कैंसर कोलेजन फाइबर संगठन फाइब्रिल्लर कोलेजन क्वांटिफिकेशन कर्वेलेट ट्रांसफॉर्म दूसरी हार्मोनिक जेनरेशन माइक्रोस्कोपी इमेज एनालिसिस सॉफ्टवेयर
कर्वेलेट ट्रांसफॉर्म-आधारित उपकरणों के साथ फिब्रिल्लर कोलेजन संगठन की मात्रा निर्धारित करना
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Liu, Y., Eliceiri, K. W. Quantifying … More

Liu, Y., Eliceiri, K. W. Quantifying Fibrillar Collagen Organization with Curvelet Transform-Based Tools. J. Vis. Exp. (165), e61931, doi:10.3791/61931 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter