Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Kvantificering af Fibrillar Kollagen organisation med Curvelet Transform-baserede værktøjer

Published: November 11, 2020 doi: 10.3791/61931
Automatic Translation
1, 1,2,3
1Laboratory for Optical and Computational Instrumentation, Center for Quantitative Cell Imaging, University of Wisconsin-Madison, 2Departments of Medical Physics and Biomedical Engineering, University of Wisconsin-Madison, 3Morgridge Institute for Research, Madison, Wisconsin, 4test, test

Summary

Her præsenterer vi en protokol til at bruge en curvelet transform-baseret, open source MATLAB software værktøj til kvantificering fibrillar kollagen organisation i den ekstracellulære matrix af både normale og syge væv. Dette værktøj kan anvendes på billeder med kollagenfibre eller andre typer linjelignende strukturer.

Abstract

Fibrillar kollagen er fremtrædende ekstracellulære matrix (ECM) komponenter, og deres topologi ændringer har vist sig at være forbundet med udviklingen af en bred vifte af sygdomme, herunder bryst-, æggestokkene, nyre-, og bugspytkirtelkræft. Frit tilgængelige fiberkvantificeringssoftwareværktøjer er hovedsageligt fokuseret på beregningen af fiberjustering eller orientering, og de er underlagt begrænsninger som krav om manuelle trin, unøjagtighed i påvisning af fiberkanten i støjende baggrund eller mangel på lokaliseret funktionskarakterisering. Det kollagenfiberkvantantitationsværktøj, der er beskrevet i denne protokol, er kendetegnet ved at bruge en optimal billedrepræsentation i flere målestok, der aktiveres af kurvetransformation (CT). Denne algoritmiske tilgang giver mulighed for fjernelse af støj fra fibrillar kollagen billeder og forbedring af fiber kanter til at give placering og orientering oplysninger direkte fra en fiber, snarere end at bruge den indirekte pixel-kloge eller vindue-kloge oplysninger fra andre værktøjer. Denne CT-baserede ramme indeholder to separate, men linkede pakker med navnet "CT-FIRE" og "CurveAlign", der kan kvantificere fiberorganisation på globalt, interesseområde (ROI) eller individuel fiberbasis. Denne kvantificeringsramme er udviklet i mere end ti år og har nu udviklet sig til en omfattende og brugerdrevet kollagenkvantificeringsplatform. Ved hjælp af denne platform kan man måle op til omkring tredive fiberfunktioner, herunder individuelle fiberegenskaber som længde, vinkel, bredde og ligehed samt bulkmålinger som tæthed og justering. Derudover kan brugeren måle fibervinkel i forhold til manuelt eller automatisk segmenterede grænser. Denne platform giver også flere ekstra moduler, herunder dem til ROI-analyse, automatisk grænseoprettelse og efterbehandling. Brug af denne platform kræver ikke forudgående erfaring med programmering eller billedbehandling, og det kan håndtere store datasæt, herunder hundreder eller tusinder af billeder, hvilket muliggør effektiv kvantificering af kollagenfiberorganisation til biologiske eller biomedicinske applikationer.

Introduction

Fibrillar kollagen er fremtrædende, strukturelle ECM komponenter. Deres organisation ændringer indvirkning væv funktion og er sandsynligvis forbundet med udviklingen af mange sygdomme lige fra osteogenese imperfecta1, hjerte dysfunktion2, og sårheling3 til forskellige typer afkræft,herunder bryst4,5,6, æggestokkene7,8, nyre9, og kræft i bugspytkirtlen10. Mange etablerede billedbehandlingsmetoder kan bruges til at visualisere fibrillar kollagen såsom anden harmoniske generation mikroskopi11, pletter eller farvestoffer i forbindelse med lyse felt eller fluorescens mikroskopi eller polariseret lys mikroskopi12, flydende krystal-baseret polarisering mikroskopi (LC-PolScope)13, og elektron mikroskopi14. Efterhånden som betydningen af fibrillar kollagen organisation er blevet klarere, og brugen af disse metoder er steget, behovet for forbedret kollagen fiber analyse tilgange er også vokset.

Der har været mange bestræbelser på at udvikle beregningsmetoder til automatiseret måling af fibrillar kollagen. Frit tilgængelige softwareværktøjer er hovedsageligt fokuseret på beregning af fiberjustering eller -retning ved at anvende enten første afledte eller struktur tensor for pixel15,16eller Fourier transform-baseret spektrumanalyse for billedfliser17. Alle disse værktøjer er underlagt begrænsninger såsom kravet om manuelle trin, unøjagtighed i påvisning af fiberkanten i støjende baggrund eller mangel på lokaliseret funktionskarakterisering.

Sammenlignet med andre frit tilgængelige open source-fri softwareværktøjer bruger de metoder, der er beskrevet i denne protokol, CT - en optimal, multiskala, retningsbestemt billedrepræsentationsmetode - til at fjerne støj fra fibrillar kollagenbilleder og forbedre eller spore fiberkanter. Oplysninger om placering og orientering kan leveres direkte fra en fiber i stedet for ved at bruge de indirekte pixel-kloge eller vindue-kloge oplysninger til at udlede målinger af fiber organisation. Denne CT-baserede ramme18,19,20,21 kan kvantificere fiber organisation på globalt, ROI, eller fiber grundlag, primært via to separate, men forbundet, pakker med navnet "CT-FIRE"18,21 og "CurveAlign"19,21. Hvad angår implementeringen af softwaren, kan CT-FIRE-koefficienter på flere skalaer i CT-FIRE bruges til at rekonstruere et billede, der forbedrer kanterne og reducerer støj. Derefter anvendes en individuel fiberudvindingsalgoritme på det CT-rekonstruerede billede for at spore fibre til at finde deres repræsentative centerpunkter, udvide fibergrene fra midtpunkterne og forbinde fibergrene for at danne et fibernetværk. I CurveAlign kan CT-koefficienter på en brugerdefineret skala bruges til at spore lokal fiberretning, hvor kurvernes retning og placering udtrækkes og grupperes for at estimere fiberretningen på de tilsvarende steder. Denne resulterende kvantificeringsramme er blevet udviklet i mere end ti år og har udviklet sig meget på mange områder såsom funktionalitet, brugergrænseflade og modularitet. For eksempel kan dette værktøj visualisere lokal fiberorientering og giver brugeren mulighed for at måle op til tredive fiberfunktioner, herunder individuelle fiberegenskaber som længde, vinkel, bredde og ligehed samt bulkmålinger som tæthed og justering. Derudover kan brugeren måle fibervinkel i forhold til manuelt eller automatisk segmenterede grænser, som for eksempel spiller en vigtig rolle i billedbaseret biomarkørudvikling i brystkræft22 og kræft i bugspytkirtlen10. Denne platform indeholder flere funktionsmoduler, herunder moduler til ROI-analyse, automatisk grænseoprettelse og efterbehandling. ROI-modulet kan bruges til at kommentere forskellige former for INVESTERINGSAFKAST og udføre tilsvarende ROI-analyse. Som et programeksempel kan det automatiske grænseoprettelsesmodul bruges til at registrere hematoxylin og eosin (H&E) lyse feltbilleder med anden harmoniske generation (SHG) billeder og generere billedmasken af tumorgrænser fra de registrerede H&E-billeder. Efterbehandlingsmodulet kan hjælpe med at lette behandlingen og integrationen af outputdatafiler fra individuelle billeder til mulig statistisk analyse.

Denne kvantificeringsplatform kræver ikke forudgående erfaring med programmering eller billedbehandling og kan håndtere store datasæt, herunder hundreder eller tusinder af billeder, hvilket muliggør effektiv kvantificering af kollagenorganisation til biologiske eller biomedicinske applikationer. Det har været meget udbredt i forskellige forskningsområder af mange forskere over hele verden, herunder os selv. Der er fire hovedpublikationer om CT-FIRE og CurveAlign18,19,20,21, hvoraf de første tre er blevet citeret 272 gange (fra 2020-05-04 ifølge Google Scholar). En gennemgang af de publikationer, der citerede denne platform (CT-FIRE eller CurveAlign) viser, at der er omkring 110 tidsskriftspapirer, der direkte brugte det til deres analyse, hvor ca. 35 publikationer samarbejdede med vores gruppe, og de andre (~ 75) blev skrevet af andre grupper. F.eks. denne platform blev brugt til følgende undersøgelser: brystkræft22,23,24, kræft i bugspytkirtlen10,25, nyrekræft9,26, sårheling3,27,28,29,30, kræft i æggestokkene8,31,7, livmoderbånd32, hypophosfatmisk dentin33, basalcellekarcinom34, hypoxisk sarkom35, bruskvæv36, hjertedysfunktion37, neuroner38, glioblastoma39, lymfesammentrækninger40, fibrøse cacffolds41, mavekræft42, mikrotubule43og blærefibrose44. Figur 1 viser kræft imaging anvendelse af CurveAlign at finde tumor-associerede kollagen underskrifter af brystkræft19 fra SHG billedet. Figur 2 beskriver en typisk skematisk arbejdsproces for denne platform. Selvom disse værktøjer er blevet gennemgået tekniskset 18,19,21, og en almindelig protokol20 til justeringsanalyse med CurveAlign også er tilgængelig, kan en visuel protokol, der demonstrerer alle de væsentlige funktioner, være nyttig. En visualiseret protokol, som præsenteret her, vil lette læringsprocessen ved at bruge denne platform samt mere effektivt adressere bekymringer og spørgsmål, som brugerne måtte have.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

BEMÆRK: Denne protokol beskriver brugen af CT-FIRE og CurveAlign til kollagen kvantificering. Disse to værktøjer har komplementære, men forskellige hovedmål og er til en vis grad knyttet sammen. CT-FIRE kan lanceres fra CurveAlign-grænsefladen for at udføre de fleste operationer undtagen avanceret efterbehandling og ROI-analyse. For at CT-FIRE kan fungere fuldt ud, bør den lanceres separat.

1. Krav til billedsamling og billedsamling

BEMÆRK: Værktøjet kan behandle enhver billedfil med linjelignende strukturer, der kan læses af MATLAB, uanset hvilken billedmodalitet der bruges til at indsamle den.

  1. Brug 8-bit gråtoneskala, da billedtypen som standardkørselsparametre er baseret på dette format.
    BEMÆRK: SHG imaging er en udbredt etiket-fri og høj opløsning fibrillar kollagen billedbehandling metode. SHG billeder fra en brystkræft undersøgelse19 vil blive brugt her med henblik på demonstration.

2. Krav til softwareinstallation og -system

BEMÆRK: Både enkeltstående versioner og versionskoder er frit tilgængelige. Versionsstyringen kræver en komplet MATLAB-installation, herunder værktøjskasser til signalbehandling, billedbehandling, statistikanalyse og parallel databehandling. Hvis du vil køre versionskilden, skal alle de nødvendige mapper, herunder nogle fra tredjepartskilderne, føjes til MATLAB-stien. Brug af det enkeltstående program (APP) anbefales til de fleste brugere, hvilket kræver en installation af en frit tilgængelig MATLAB Compiler Runtime (MCR) af den angivne version. Proceduren for installation og lancering af APP er beskrevet nedenfor.

  1. Hent CT-FIRE version 3.0 (CTF3.0) og CurveAlign Version 5.0 (CA5.0) APP-pakker fra henholdsvis https://eliceirilab.org/software/ctfire/ og https://eliceirilab.org/software/curvealign/.
    BEMÆRK: Hver pakke indeholder de enkeltstående APP-, manuelle og testbilleder.
  2. Følg de detaljerede krav og installationsvejledninger fra ovenstående websteder for at installere MATLAB MCR 2018b.
  3. Start APP'en.
    1. For et Windows 64-bit system skal du dobbeltklikke på APP-ikonet for at starte det.
    2. I forbindelse med et Mac-system skal du følge følgende trin for at starte det: Højreklik på APP-| Vis pakkeindhold | Indhold | MacOS-| applauncher (højreklik, og vælg åbn).
      BEMÆRK: Andre detaljer kan ses på de softwarewebsteder, der er anført i 2.1.

3. Individuel fiberudtrækning med CT-FIRE

BEMÆRK: CT-FIRE bruger CT til at denoise billedet, forbedre fiberkanterne og bruger derefter en fiberudtrækningsalgoritme til at spore individuelle fibre. Længde, vinkel, bredde og glathed beregnes for individuelle fibre.

  1. CT-FIRE på enkelt billede eller flere billeder
    1. Start APP som beskrevet i 2.3.
    2. Klik på knappen Åbn filer i den grafiske hovedgrænseflade (GUI, Figur 3A), og vælg derefter et eller flere billeder/eller billedstakke i promptvinduet. Brug den teknik, der passer til operativsystemet, til at markere flere billeder i dialogboksen (f.eks. i Windows skal du holde CTRL nede, mens du markerer flere filer).
      BEMÆRK: Hvis der er valgt to eller flere billedfiler, skal alle billederne bruge de samme kørende parametre til analysen. Sørg for, at alle billederne er erhvervet under de samme eller lignende forhold.
    3. Vælg indstillinger for parallel databehandling ved at markere afkrydsningsfeltet Parallel i øverste højre hjørne for at få flere billedanalyser.
    4. I billedstakken skal du flytte udsnitsskyderen under fillisten for at vælge det udsnit, der skal analyseres.
    5. Angiv kørende egenskaber. Brug standardparametre til en indledende analyse af nogle billeder. Hvis du bruger standardparametre, skal du gå til trin 3.1.6. Hvis du vil angive forskellige parametre, skal du klikke på knappen Opdater i panelet Parametre. Følg vejledningen for at justere parametrene korrekt.
      BEMÆRK: De hyppigst justerede parametre omfatter baggrundstærsklen (thresh_im2) og nukleationssøgningsradius (s_xlinkbox). Hvis baggrundsstøjniveauet er højt, skal du indstille thresh_im2 til en større værdi. s_xlinkbox er forbundet med fibrenes gennemsnitlige radius, skal du indstille en mindre værdi for at detektere tynde fibre.
    6. Klik på knappen Kør.
      BEMÆRK: Statusoplysningerne vises i både oplysningsvinduet og kommandovinduet. Når analysen er færdig, vises outputtabellen (Figur 3B).
    7. Klik på et element i output tabellen for at se histogram af fiber mål (Figur 3C og Figur 3F) af billedet, herunder længde, bredde, vinkel og straightness.
      BEMÆRK: Fiberbillederne med fibre overlejret på det originale billede vises også (Figur 3E).
    8. Kontroller undermappen med navnet ctFIREout under billedmappen for outputfilerne, herunder den overlejrede billedfil ".tiff", ".csv" og filen ".mat".
  2. Analyse af CT-FIRE-interesseregion (ROI)
    1. ROI-anmærkning ved hjælp af ROI Manager
      1. Klik på knappen Åbn fil(er) i hoved-GUI (Figur 3A) for at indlæse et eller flere billeder.
      2. Vælg det billede, der skal kommenteres på fillisten.
      3. Vælg ROI Manager i rullemenuen i panelet Roi Options.
      4. Klik på knappen KØR for at starte ROI Manager-modulet ( Figur3A).
      5. I GUI'en for ROI manager (Figur 4A) skal du klikke på rullemenuen under Tegn ROI-menu(d)for at tegne ROI'erne en efter en.
        BEMÆRK: ROI-figuren kan være rektangel, frihånd, ellipse, polygon eller specificeret rektangel. Følg vejledningen på skærmen for at tegne, gemme og afslutte ROI-anmærkninger.
      6. Når du har valgt metoden til at tegne investeringsafkastet, skal du trække det gule rektangel, der vises på det oprindelige billede, til den ønskede placering og derefter klikke på knappen Gem investeringsafkast eller trykke på tasterne for at føje dette investeringsafkast til roi-listen. Dette investeringsafkast navngives automatisk.
      7. Tegn et nyt investeringsafkast ved at trække det forrige investeringsafkast til en ny placering, og gem det som nævnt i 3.2.1.6, eller gentag trin 3.2.1.5-3.2.1.6 for at tegne et nyt investeringsafkast.
      8. Tryk på x, eller vælg Nyt investeringsafkast i rullemenuen ROI-figur for at afslutte ROI-anmærkningen.
      9. Markér afkrydsningsfelterne Vis alle og Etiketter for at få vist alle de definerede ROI'er på listen og deres navne på det oprindelige billede.
      10. Vælg investeringsafkastet på roi-listen for at udføre grundlæggende ROI-handlinger, herunder Omdøb ROI, Slet ROI , Gem ROI-tekst, Indlæs investeringsafkast fra tekst, Gem ROI-maske, Indlæs investeringsafkast fra maskeog Kombiner ROI ' er.
      11. Kontroller outputfilen for den ROI Manager, der er gemt som ".mat"-fil, i en undermappe med navnet ROI_management under den oprindelige billedmappe.
      12. Hvis du vil anmærke et andet billede på listen over åbne filer, skal du gentage trin 3.2.1.2-3.2.1.11.
      13. Når anmærkningen er udført, skal du lukke GUI'en for ROI Manager og nulstille hoved-GUI'en ved at klikke på knappen Nulstil i hoved-GUI'en.
    2. ROI-analyse for et enkelt billede i ROI Manager
      1. Hvis der udføres CT-FIRE-analyse med fuldt billede, og resultaterne gemmes i standardmappen, skal du klikke på en eller flere ROI'er på ROI-listen og derefter klikke på knappen ctFIRE ROI Analyzer for at starte analysemodulet Efter ROI.
        BEMÆRK: Resultaterne gemmes automatisk i en undermappe, der er placeret i \\[billedmappe]\ CTF_ROI\Individuel\ROI_post_analysis\.
      2. I pop op-vinduet skal du klikke på knappen Kontroller fibre for at få vist fibre i de valgte ROI'er (Figur 4B).
      3. Klik på Plot Statistik for at vise histogrammer af hver ROI (Figur 4C). De tilsvarende outputtal vises.
      4. Hvis der ikke er udført fuld billedanalyse af CT-FIRE, skal du klikke på en eller flere ROI'er på ROI-listen og klikke på knappen Anvend ctFIRE på ROI for direkte at anvende CT-FIRE-analyse på de valgte ROI'er.
      5. Følg instruktionerne i promptvinduet for at køre analysen.
        BEMÆRK: Parametrene til kørsel af CT-FIRE sendes gennem hoved-GUI'en, og brugeren kan opdatere de kørende parametre som beskrevet i trin 3.1.5 efter behov. Når analysen er færdig, vises oversigtsstatistikken over fibermålpunkter i outputtabellen. Resultaterne gemmes automatisk i en undermappe, der er placeret i \\[billedmappe]\ CTF_ROI\Individuel\ROI_analysis\.
    3. ROI-analyse for flere billeder ved hjælp af ROI Analyzer
      1. Følg trinnene i 3.2.1 for at kommentere ROI'er for de billeder, der skal analyseres.
      2. Åbn et eller flere billeder ved at klikke på knappen Åbn fil(er).
      3. Hvis du vil køre roi-indlægsanalyse, når de fulde billedanalyseresultater er tilgængelige, skal du klikke på rullemenuen i panelet Indstillinger for kørsel og vælge indstillingen CTF-analyse efter ROI.
      4. Klik på knappen KØR for at køre ROI-analyse for alle de indlæste billeder.
      5. Kontroller de statusoplysninger, der vises i meddelelsesvinduet nederst i gui'en og i kommandovinduet.
      6. Når analysen er fuldført, skal du kontrollere oversigtsstatistikken for hvert investeringsafkast, der vises i en outputtabel.
        BEMÆRK: De detaljerede outputfiler gemmes automatisk i en undermappe, der er placeret på \\ [billedmappe]\CTF_ROI\Batch\ROI_post_analysis\.
      7. Hvis du vil køre en direkte analyse, når de fulde billedanalyseresultater ikke er tilgængelige, skal du følge trin 3.2.3.1-3.2.3.6, bortset fra at du i trin 3.2.3.3 skal vælge indstillingen CTF ROI analyzer; I trin 3.2.3.4 skal du opdatere de kørende parametre som beskrevet i trin 3.1.5, før du klikker på knappen KØR. Når du har klikket på knappen KØR, skal du vælge mellem rektangulær ROI- og ROI-maske for enhver figuri et dialogboksvindue med prompt .
        BEMÆRK: Hvis alle de kommenterede ROI'er er rektangulære, kan brugeren vælge "Rektangulær ROI". I trin 3.2.3.6 gemmes resultaterne af investeringsafkastet i en undermappe, der er placeret i \\[billedmappe]\CTF_ROI\Batch\ROI_analysis\.
  3. Efterbehandling med CT-FIRE
    BEMÆRK: Efter den almindelige CT-FIRE-analyse, der er beskrevet i 3.1, kan brugeren udføre yderligere efterbehandling. Uden at køre den tidskrævende fiberudvinding igen kan regelmæssig efterbehandling, der er beskrevet i 3.3.1, opdatere nogle grundlæggende outputfiguregenskaber, mens den avancerede efterbehandling, der er beskrevet i 3.3.2, kan visualisere individuelle fibre og deres egenskaber, udføre kompleks tærskelværdi blandt alle de fire fiberegenskaber, generere sammenfattende statistikker over de valgte fibre og visualisere de valgte fibre ved hjælp af et tilpasset farvekort.
    1. Regelmæssig efterbehandling med CT-FIRE
      1. Start CT-FIRE-appen, eller klik på knappen Nulstil efter andre handlinger for at initialisere CT-FIRE-hoved-GUI(Figur 3A).
      2. Marker afkrydsningsfeltet .mat øverst i hoved-GUI'en.
      3. Klik på knappen Åbn fil(er) for at vælge .mat-filen til CT-FIRE-output i ctFIREout-undermappen.
        BEMÆRK: Hvis flere filer er markeret, markeres afkrydsningsfeltet Batch automatisk. Filnavnet på de tilsvarende billeder vises på listen over bokse.
      4. Opdater indstillingerne i kontrolpanelet Outputfigur.
      5. Bevar standardindstillingerne i Outputindstillinger, som sikrer, at alle outputfiler opdateres i overensstemmelse med det nye sæt parametre, der er angivet i 3.3.1.4.
      6. Klik på knappen Efterbehandling. Kontroller statusoplysningerne i meddelelsesvinduet nederst i hoved-GUI'en og i kommandovinduet.
      7. Når analysen er færdig, skal du klikke på et element i outputtabellen for at se histogrammet af fibermål af billedet, herunder længde, bredde, vinkel og ligehed.
        BEMÆRK: Nye outputfiler overskriver de gamle i ctFIREout-undermappen.
    2. Avanceret efterbehandling af CT-FIRE
      1. Start CT-FIRE-appen, eller klik på knappen Nulstil efter andre handlinger for at initialisere CT-FIRE-hoved-GUI(Figur 3A).
      2. Se afkrydsningsfeltet OUT.adv øverst i hoved-GUI'en (Figur 3A).
      3. Klik på knappen Efterbehandling for at starte den avancerede efterbehandlings-GUI med navnet "Analysemodul" (Figur 5A).
      4. Klik på knappen Vælg fil for at vælge et billede.
      5. Klik på knappen Visualiser fibre for at indtaste fibernummer baseret på etiketterne i tabulatorfiguren Original-fiber.
        BEMÆRK: Målingerne af de valgte fibre vises i en outputtabel (Figur 5B), og de tilsvarende fibre overlejres på det oprindelige billede, der vises i tabulatorfiguren Med navnet Målte fibre ( Figur5C).
      6. Klik på knappen Bekræft/opdater for at gå til tærskelhandlingen.
      7. Markér grænseboksen for at aktivere tærskelindstillingerne.
      8. Vælg en af de fire indstillinger for tærskelværdier i rullemenuen.
      9. Angiv de ønskede tærskler i panelet Tærskler for en eller flere fiberegenskaber.
      10. Klik på knappen Tærskel nu for at anvende ovenstående tærskelbetingelser.
      11. Kontroller promptfiguren med navnet, der slutter med visualisering af målinger, for at se de valgte fibre overlejret på de originale billeder med de tilpassede farvekort som vist i Figur 5E.
      12. Gentag trin 3.3.2.9-3.3.2.11 for at angive de ønskede tærskler.
      13. Klik på knappen Gem fibre for at gemme de valgte fiberoplysninger.
        BEMÆRK: Tilsvarende valgte fibre vises i tabulatorfiguren med navnet Eftertærskning.
      14. Klik på knappen Generer statistik, og klik derefter på knappen OK i pop op-vinduet for at generere oversigtsstatistik.
        BEMÆRK: En outputtabel (Figur 5D) viser middelværdien af de valgte fibre. Andre statistikker over de valgte fibre gemmes i en Excel-fil, hvis placering vises i statusvinduet nederst i denne GUI.
      15. Hvis du vil medtage de valgte individuelle fiberoplysninger i outputfilen, skal du markere afkrydsningsfeltet Generer ark for rå data, før du klikker på knappen OK.
      16. Hvis du vil kombinere resultater fra flere billeder, skal du markere afkrydsningsfeltet Batchtilstand eller Staktilstand i trin 3.3.2.4 og vælge de flere billeder eller stakke, der skal analyseres. springe trin 3.3.2.5-3.3.2.6 over. I trin 3.3.2.8-3.3.2.9 skal du angive tærskelbetingelser, men når knapperne er deaktiveret nu, og Gem fibre er deaktiveret, skal du springe trin 3.3.2.10-3.3.2.13 over. og endelig skal du følge instruktionerne i trin 3.3.2.14 for at generere sammenfattende statistikker og individuelle fiberegenskaber for de valgte fibre.

4. Fiber analyse med CurveAlign

BEMÆRK: CurveAlign blev oprindeligt udviklet til automatisk at måle vinkler af fibre med hensyn til brugerdefinerede grænser. Den aktuelle version af CurveAlign kan bruges til massevurdering af tætheds- og justeringsbaserede funktioner ud over den relative vinkelmåling ved enten at indlæse de enkelte fiberoplysninger, der er udvundet af CT-FIRE, eller direkte ved hjælp af kurvernes lokale orientering. CurveAlign beregner op til tredive funktioner relateret til globale eller lokale funktioner primært herunder tæthed og tilpasning samt individuelle fiber egenskaber, når CT-FIRE er vedtaget som fiber tracking metode.

  1. Fiberanalyse med kurver
    1. Start APP som beskrevet i 2.3.
    2. Klik på knappen Nulstil for at nulstille APPEN til dens oprindelige status, hvis der er udført andre handlinger.
    3. I hoved-GUI ' en (Figur 6A) skal du kontrollere indstillingen Fiberanalysemetode for at sikre, at CT er valgt (standardindstilling).
      BEMÆRK: I denne tilstand udføres CT på billedet, og retningen af hver kurve repræsenterer retningen af en fiber på det tilsvarende sted.
    4. Klik på rullemenuen Grænsemetode, og vælg grænsebehandlingstilstanden i følgende indstillinger i rullemenuen: Ingen grænse, CSV-grænse og TIFF-grænse.
      BEMÆRK: Hvis der ikke er behov for en grænse, skal du springe dette trin over. Se 4.3 for hvordan man beregner fibervinkler med hensyn til en grænse.
    5. Klik på knappen Hent billede(er) i hoved-GUI' en (Figur 6A), og vælg derefter et eller flere billeder/eller billedstakke i promptvinduet. Brug den teknik, der passer til operativsystemet, til at markere flere billeder i dialogboksen (f.eks. i Windows skal du holde CTRL nede, mens du markerer flere filer).
      BEMÆRK: Hvis der er valgt to eller flere billedfiler, skal alle billederne bruge de samme kørende parametre til analyse. Sørg for, at alle billederne er erhvervet under de samme eller lignende forhold.
    6. I billedstakken skal du flytte udsnitsskyderen under fillisten for at vælge det udsnit, der skal analyseres.
    7. Angiv den del af coefs , der skal bevares. Denne værdi er den brøkdel af de største koefficienter for CT, der vil blive brugt i fiberanalysen.
      BEMÆRK: Hvis billedet har en stor variation i fiberintensitet eller kontrast, kommenterer interesseområder med jævn kontrast til fiberanalysen, da denne tilstand kun registrerer de lyseste fibre i et billede. Derudover er det sådan, at jo større billedstørrelsen er, angiv en mindre værdi for denne brøk.
    8. Bevar alle parametrene i outputindstillingerne og andre i indstillingen Avanceret som standard. outputfilerne kan være nødvendige i andre fremtidige operationer.
    9. Klik på knappen Kør nederst i hoved-GUI (Figur 6A).
      BEMÆRK: Statusoplysningerne vises i et meddelelsesvindue, der er fremhævet med grøn farve nederst. Når processen er udført, vises nogle oversigtsstatistikker for hvert billede i outputtabellen (Figur 6B), og alle outputfiler gemmes automatisk i en undermappe med navnet CA_Out i mappen med det eller de originale billeder.
    10. Klik på et element i outputtabellen (Figur 6B) for at se histogrammet (Figur 6E) eller kompasplottet (Figur 6F) af fibervinkler.
      BEMÆRK: Overlejringsbilledet (Figur 6C) og varmekortet (Figur 6D) af justering eller vinkel vises også.
    11. Klik på knappen Nulstil for at køre andre handlinger, eller luk hoved-GUI'en for at afslutte APPEN.
  2. Individuel fiberanalyse med CT-FIRE
    BEMÆRK: Proceduren er den samme som den, der er beskrevet i punkt 4.1, bortset fra at i trin 4.1.3 skal du vælge CT-FIRE-relateret fiberanalysetilstandog springe trin 4.1.7 over, da det ikke er relevant og deaktiveret i CT-FIRE-tilstand. I trin 4.1.3 skal du vælge en blandt følgende tre CT-FIRE-baserede individuelle fiberanalysemetoder:
    1. Vælg CT-FIRE Fibre til at bruge fiber center punkt og fiber vinkel til at repræsentere fiber.
      BEMÆRK: Denne mulighed overvejer ikke ændringerne i fiberorientering langs fiberens længde.
    2. Vælg CT-FIRE Slutpunkter for at bruge de to slutpunkter for en fiber og tilsvarende fibervinkel til at repræsentere fiberen.
      BEMÆRK: Sammenlignet med 4.2.1 bruger denne indstilling to positioner til at repræsentere en fiber i stedet for en (fiberens midtpunkt).
    3. Vælg CT-FIRE Segmenter for at bruge segmenter af en fiber til at repræsentere fiberen.
      BEMÆRK: Hvert segment har en lige lang længde (indstillet til 5 pixel som standard i CT-FIRE) samt dets retning og placering, hvilket afspejler ændringen i retning langs hele fiberens længde. Denne mulighed ville være den mest tidskrævende, men ville være den bedste løsning blandt de tre CT-FIRE-baserede fiberanalysemetoder til at spore ændringer i den lokale orientering af en kurvet fiber.
  3. Relativ justeringsanalyse med grænse
    BEMÆRK: Sammenlignet med den regelmæssige analyse uden grænsebetingelser, der er beskrevet i punkt 4.2 og 4.3, skal der følgende relative justeringsanalyser med grænsebetingelser:
    1. I trin 4.1.3 skal du vælge tiff-grænsebetingelsen.
      BEMÆRK: Brugeren skal bruge en tilsvarende grænsefil for hvert billede eller hver stak. Følg vejledningen på skærmen for manuelt at anmærke enten en CSV-grænsefil (kommasepareret værdiformat baseret, x-y-koordinater) eller en Tiff-grænsefil. De grænsefiler, der oprettes i CurveAlign, gemmes automatisk i henhold til de konventioner for navngivning af filer og filer, der er beskrevet i manualen. Hvis der findes et par H&E-lysfelts- og SHG-billeder, skal du bruge det automatiske grænseoprettelsesmodul, der er beskrevet i afsnit 4.4, til at generere grænsefilen.
    2. I panelet Primære parametre skal du indtaste afstanden fra den nærmeste grænse for kun at evaluere fibrene inden for dette afstandsområde.
    3. Markér grænsetilknytningsboksen Bdry Assoc i panelet Outputindstillinger for at visualisere det punkt på grænsen, der er knyttet til en fiber, fibersegment eller curvelet.
  4. Automatisk oprettelse af grænser
    1. Start APP som beskrevet i 2.3.
    2. Klik på knappen Nulstil for at nulstille APPEN til dens oprindelige status, hvis der allerede er udført andre handlinger.
    3. Klik på BD-oprettelsesknappen for at starte det automatiske grænseoprettelsesmodul.
    4. Følg vejledningen/ledetrådene på skærmen for at oprette grænsefil til et eller flere billeder baseret på et par H&E-lysfelts- og SHG-billeder.
    5. Luk modulvinduet, eller klik på knappen Nulstil i hoved-GUI' en (Figur 6A) for at afslutte dette modul.
  5. CurveAlign region af interesseanalyse
    1. ROI-anmærkning ved hjælp af ROI Manager
      1. Klik på knappen Hent billede(er) i hoved-GUI(Figur6A)for at indlæse et eller flere billeder.
      2. Vælg det billede, der skal kommenteres på fillisten.
      3. Klik på ROI Manager for at starte ROI Manager modulet (Figur 7A).
      4. Følg trin 3.2.1.5-3.2.1.13 i punkt 3.2.1.
    2. ROI-analyse for et enkelt billede i ROI Manager
      1. Hvis der er udført fuldbilledanalyse af CurveAlign, og resultaterne gemmes i standardmappen, skal du klikke på en eller flere ROI'er på roi-listen og derefter klikke på knappen CA ROI Analyzer for at køre post-ROI-analyse.
        BEMÆRK: Når analysen er færdig, vises der sammenfattende statistikker i en outputtabel (figur 7C) samt en histogramfigur (Figur 7D), der viser vinkelfordelingen.
      2. Klik på et element i output tabellen for at visualisere fibrene i en given ROI (Figur 7B) samt histogrammet af fibervinkler.
      3. Kontroller de outputfiler, der er gemt i en undermappe, der er placeret i \\[billedmappe]\ CA_ROI\Individuel\ROI_post_analysis\.
      4. Hvis der ikke er foretaget en full-image CA-analyse, skal du klikke på en eller flere ROI'er på ROI-listen og klikke på knappen Anvend nøglecenter på ROI for direkte at anvende nøglecenteranalyse på de valgte ROI'er. Følg instruktionerne i promptvinduet for at køre analysen.
        BEMÆRK: Parametrene for kørsel af nøglecenteranalysen sendes gennem hoved-GUI'en. opdatere de kørende parametre, der er beskrevet i trin 4.1.7 efter behov. Når analysen er færdig, vises resultaterne af den sammenfattende statistik over fibermålpunkter i outputtabellen. Resultaterne gemmes automatisk i en undermappe, der er placeret i \\[billedmappe]\ CA_ROI\Individuel\ROI_analysis\.
    3. ROI-analyse for flere billeder ved hjælp af ROI Analyzer
      1. Følg trinnene i 4.5.1 for at kommentere ROI'er for de billeder, der skal analyseres.
      2. Åbn et eller flere billeder ved at klikke på knappen Hent billede(er).
      3. Hvis du vil køre ROI-indlægsanalyse, når de fulde billedanalyseresultater er tilgængelige, skal du klikke på knappen ROI-analyse og vælge indstillingen ROI efter behandling.
      4. Kontroller de statusoplysninger, der vises i meddelelsesvinduet nederst i gui'en og i kommandovinduet.
      5. Når analysen er fuldført, skal du kontrollere oversigtsstatistikken for hvert investeringsafkast, der vises i en outputtabel.
        BEMÆRK: De detaljerede outputfiler gemmes automatisk i en undermappe, der er placeret på \\ [billedmappe]\CA_ROI\Batch\ROI_post_analysis\.
      6. Hvis du vil køre en direkte analyse med CT-tilstand, når resultaterne af den fulde billedanalyse ikke er tilgængelige, skal du følge trin 4.5.3.1-4.5.3.5, bortset fra følgende ændringer: Rediger trin 4.5.3.3 ved at vælge indstillingsnøglecenteret for beskåret rektangulær ROI eller nøglecenter på maske med ROI af enhver form. Hvis alle de kommenterede ROI'er er rektangulære, skal du vælge indstillingen Rektangulær ROI. Efter trin 4.5.3.2 skal du opdatere de kørende parametre som beskrevet i 4.1.7.
        BEMÆRK: Resultaterne af roi-analysen gemmes i en undermappe, der er placeret på \\ [billedmappe]\CA_ROI\Batch\ROI_analysis\.
  6. Efterbehandling af CurveAlign
    1. Start APP'en som beskrevet i afsnit 2.3.
    2. Klik på knappen Nulstil for at nulstille APPEN til dens oprindelige status, hvis der allerede er udført andre handlinger.
    3. Klik på knappen Efterbehandling for at starte efterbehandlingsmodulet.
    4. Følg vejledningen/ledetrådene på skærmen for at kombinere outputfunktionerne eller -værdierne fra forskellige billeder.
    5. Luk modulvinduet, eller klik på knappen Nulstil i hoved-GUI' en (Figur 6A) for at afslutte dette modul.

5. Anslået driftstid

  1. Vent den anslåede køretid for behandling af et billede med en størrelse på 1024 pixel x 1024 pixel med moderat fibertæthed. Den faktiske beregningstid afhænger generelt af flere faktorer, herunder filens størrelse, analysetilstanden, de funktioner, der skal installeres, CPU-typen (Central Processing Unit) og mængden af tilgængelig hukommelse med tilfældig adgang (eller RAM). CT-FIRE individuel fiberudvinding tager et par minutter. CurveAlign CT-tilstand uden grænse tager et par sekunder. CurveAlign CT-FIRE fiber eller fiber ender tilstand uden grænse tager snesevis af sekunder. CurveAlign CT-FIRE fiber mode uden grænse tager hundredvis af sekunder. CurveAlign analyse med grænse tager snesevis af sekunder til flere minutter, afhængigt af kompleksiteten af grænserne.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Disse metoder er blevet anvendt med succes i adskillige undersøgelser. Nogle typiske applikationer omfatter: 1) Conklin et al.22 brugte CurveAlign til at beregne tumor-associerede kollagen signaturer, og fandt, at kollagen fibre var oftere justeret vinkelret på kanalen omkreds i ductal carcinoma in situ (DCIS) læsioner; 2) Drifka et al.10 brugte CT-FIRE mode i CurveAlign at kvantificere den stromale kollagen tilpasning til bugspytkirtelkanalen adenocarcinoma og normal / kronisk pancreatitis væv, og fandt, at der var en øget tilpasning i kræftvæv i forhold til normal / kronisk væv; 3) Alkmin et al.7 brugte CurveAlign til at kvantificere den kantede fordeling af F-actin fibre og samlede kollagen tilpasning fra SHG billeder af æggestokkene stromal kollagen, og viste, at matrix morfologi spiller en vigtig rolle i at drive celle motilitet og F-actin tilpasning; 4) LeBert et al.3 anvendt CT-FIRE til SHG billeder af en zebrafisk sår reparation model og fundet en stigning i tykkelsen af kollagen fibre efter akut sår; 5) Devine et al.45 brugte CT-FIRE-tilstand i CurveAlign til SHG-billeder af vokalfoldkollagen fra forskellige dyremodeller til at måle individuelle fiberegenskaber og samlet justering og viste, at svin og hunde vokalfoldcollagen havde en højere justering og straightness ringere; 6) Keikhosravi et al.13 brugte CurveAlign til at kvantificere kollagenjustering i histopatologiprøver afbildet med LC-PolScope og viste, at LC-PolScope og SHG er sammenlignelige med hensyn til justering og orienteringsmåling for nogle typer væv.

Figure 1
Figur 1: Brug CurveAlign at finde tumor-associerede kollagen signaturer fra SHG billeder af et menneske brystkræft væv mikroarray (TMA). (A) Overlejringsbillede af en TMA-kerne med SHG-billede (gul) overlejret på det tilsvarende lyse H&E-feltbillede. (B) Den region, der er af interesse for (A). (C) Det lyse feltbillede af (B). (D) SHG-billedet af (B). (F) Den maske, der er knyttet til det lyse feltbillede (C). (E) Den CurveAlign output overlay billede, der viser tumor grænser (gul) fra (F), repræsentative fiber steder, og orientering (grønne linjer); de blå linjer bruges til at forbinde fibre med deres nærmeste grænser. De grønne pile i (B) og (E) viser fibrene parallelt med tumorgrænsen, mens de røde pile der viser fibrene vinkelret på grænsen. Skalalinjen i (A) er lig med 200 μm. Billeder i (B)–(F) vises i samme skala, og den repræsentative skalalinje i (D) er lig med 50 μm. Forkortelser: SHG = anden harmoniske generation; H&E = hematoxylin og eosin. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Skematisk arbejdsproces for kvantificering af et fibrillar-kollagenbillede. (A) SHG-billede, der skal analyseres af CT-FIRE og/eller CurveAlign. (B) Overlejring af billedoutput fra CT-FIRE. (C) Maskegrænse(A)er et valgfrit CurveAlign-input. (D) Overlejring af billedoutput efter CurveAlign. Farvelinjerne i (B) repræsenterer de ekstraherede fibre. I (D) angiver de grønne linjer placeringen og retningen af fibre, der er uden for grænserne (gule linjer) og ligger inden for den angivne afstand fra deres nærmeste grænser, de røde linjer er de andre fibre, og de blå linjer bruges til at forbinde fibre med deres nærmeste grænser. Billeder i (A)–(D) vises i samme skala, og den repræsentative skalalinje i (A) er lig med 200 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Regelmæssig analyse af CT-FIRE. (a)Hoved-GUI. (B) Outputtabel, der viser de sammenfattende statistikker. (C) og (F) viser henholdsvis histogrammer af vinkel og bredde. (E) Outputbillede, der viser de udvundne fibre (farvelinjer), der er overlejret på det oprindelige SHG-billede (D). Forkortelser: GUI = CT = curvelet transform; grafisk brugergrænseflade; SHG = anden harmoniske generation. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Modul til styring af CT-FIRE ROI. (a) Modul-GUI. (B) ROI efter analyse af fire ROI'er med forskellige former, der viser fibrene inden for hvert investeringsafkast. (C) ROI histogrammer af forskellige fiber egenskaber. Forkortelser: CT = curvelet transform; GUI = grafisk brugergrænseflade; INVESTERINGSAFKAST = interesseregion. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: Avanceret efterbehandlingsmodul CT-FIRE. (a) Modul-GUI. (B) Målinger af udvalgte tre fibre. (C) Visualisering af de tre udvalgte fibre i (B). (D) Oversigtsstatistik efter anvendelse af en længdetærskel (>60 pixel). (E) Visualisering af de fibre, der er valgt i (D) med længdebaseret farvelinje. Forkortelser: CT = curvelet transform; GUI = grafisk brugergrænseflade. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: Kurvejustering af regelmæssig analyse. (a)Hoved-GUI. (B) Outputtabel, der viser de sammenfattende statistikker. (C) Outputbillede, der viser placeringen og retningen af repræsentative fibre (grønne linjer) og grænser (gule linjer) overlejret på det originale SHG-billede, de blå linjer bruges til at forbinde fibre med deres nærmeste grænser, røde linjer viser fibrenes placeringer og retninger inden for en grænse eller udenfor langt væk fra grænsen (>bruger specificeret afstand, f.eks. 250 pixels her). (D) Heatmap af vinklerne: rød (> 60 grader), gul (45-60] grader, grøn (10, 45] grader. (E)–(F) viser vinkelfordelingen ved hjælp af henholdsvis histogram- og kompasplottet. Forkortelser: GUI = grafisk brugergrænseflade; SHG = anden harmoniske generation. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7: CurveAlign ROI management modul. (a) Modulet GUI. (B) Fire kommenterede rektangulære ROIs overlejret på det oprindelige billede. (C) Outputtabel for investeringsafkast efter analyse. (D) Vinkel histogram af hvert investeringsafkast. Forkortelser: ROI = interesseregion; GUI = grafisk brugergrænseflade. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokol beskriver brugen af CT-FIRE og CurveAlign til fibrillar kollagen kvantificering og kan anvendes på ethvert billede med kollagen fibre eller andre linje-lignende eller fiber-lignende aflange strukturer egnet til analyse af CT-FIRE eller CurveAlign. For eksempel kan elastin eller elastiske fibre behandles på samme måde på denne platform. Vi har testet begge værktøjer på beregningsmæssigt genererede syntetiske fibre21. Afhængigt af applikationen skal brugerne vælge den analysetilstand, der passer bedst til deres data. CT fiberanalysetilstanden kan direkte bruge kurver i CT til at repræsentere fiberplacering og orientering, og den er følsom over for ændringer i den lokale fiberstruktur. CT-tilstanden kan bruges til at lokalisere fibre og deres orientering under komplekse forhold, f.eks. hvor støjniveauet er højt, fiberen er kurvet, eller variationen i fibertykkelsen er høj. Men da CT-tilstand kun opfanger de lyseste dele af et billede, ville det gå glip af nogle fibre med lavere intensitet, når der er en stor variation i billedintensiteten.

Desuden giver CT-tilstanden ikke oplysninger om individuelle fibre. I modsætning til CT-tilstand beregner CT-FIRE-tilstanden individuelle fiberegenskaber og kan analysere alle de fibre, hvis intensitet er over en bestemt tærskel. Udfordringerne i forbindelse med CT-FIRE-tilstanden omfatter: 1) nøjagtigheden af en intakt fiberudvinding kan reduceres eller kompromitteres, når der er stor variation i intensiteten langs en fiber eller fibertykkelsen på tværs af et billede; og 2) den nuværende standardanalyse er beregningsmæssigt krævende som nævnt i protokollen. Flere detaljer om fordele og begrænsninger ved disse metoder kan ses i vores tidligere publikationer20,21.

For så vidt angår nøjagtigheden af fibersporing, kan brugeren hovedsageligt stole på visuel inspektion for at kontrollere det overlappende billede, hvor de udvundne fibre eller repræsentative retninger er overlejret på det originale billede. Derudover kan brugeren for CT-FIRE bruge det avancerede efterbehandlingsmodul til at identificere egenskaberne for udvalgte individuelle fibre og sammenligne dem med målinger ved hjælp af andre billedanalyseværktøjer som Fiji46. For CurveAlign kan brugeren sammenligne orienterings- eller justeringsresultaterne med dem, der er beregnet af andre værktøjer, f.eks.

Blandt de funktioner, der er tilgængelige for output fra platformen, bruges justeringsrelaterede funktioner oftest og er de mest pålidelige og robuste. For at bruge individuelle fiberfunktioner skal brugeren bekræfte udvindingen af repræsentative fiberfunktioner. Bemærk, en intakt fiber kan opdeles i flere kortere segmenter i nogle tilfælde, som brugeren bør tage i betragtning, når du vælger fiber analyse mode eller foretage yderligere statistisk analyse. Selv når fiberlængden ikke direkte kan bruges som en sammenlignelig egenskab, kan orienteringen eller bredden af fibersegmenter, der vægtes i forhold til deres længder, stadig indikere nyttige oplysninger. For så vidt angår SHG billeddannelse er bekymret, numerisk blænde (NA) af den objektive linse kan påvirke detektionen af bredden og længden af en fiber, men det har mindre indflydelse på orientering og justering målinger. I vores erfaring med SHG billedbehandling, vi normalt nødt til at bruge objektiv linse med 40x forstørrelse eller højere med NA ≥ 1,0 for at opnå en robust fiber tykkelse måling.

"Justering" kan fortolkes på tre forskellige måder: 1) justering i forhold til den positive vandrette retning med navnet "vinkel", der spænder fra 0 til 180 grader, hvor vinkler tæt på 0 har samme retning som vinkler tæt på 180 grader; 2) tilpasning med hensyn til en grænse med navnet "relativ vinkel", der spænder fra 0 til 90 grader, med 0 grader, der angiver en fiber parallelt med grænsen og 90, der angiver en vinkelret fiber; og 3) tilpasning af fibre i forhold til hinanden med navnet "justeringskoefficient", der spænder fra 0 til 1, med 1, der angiver perfekt justerede fibre og mindre værdier, der repræsenterer mere tilfældigt fordelte fibre.

Udover fiberfunktionerne beregnet i denne platform blev nogle målinger baseret på teksturanalyse47,48,49 også foreslået at kvantificere ECM-mønstre. Disse teksturrelaterede funktioner kan give en alternativ eller yderligere deskriptor af ECM i nogle applikationer. Udfordringerne for udviklingen af denne type målinger ligger i samspillet mellem den mulige biologiske relevans, lokaliseret karakterisering og nøjagtigheden af sporing af individuelle fibre.

For at optimere de kørende parametre og udføre fejlfinding kan brugeren henvise til manualen, relevante publikationer20,21 samt FAQ-sidebjælkerne på GitHub Wiki-siderne i curvelets-lageret: https://github.com/uw-loci/curvelets/wiki. For nogle knapper kan der forekomme et funktionstip, der guider brugeren til den aktuelle eller næste handling, når brugeren flytter museikonet over en knap. Følg oplysningerne i gui- eller kommandovinduet for at udføre fejlfindingen.

For at behandle et stort datasæt opfordres brugeren til at bruge parallelle computerindstillinger, som gør det muligt for værktøjet at behandle flere billeder samtidigt. En mulighed er at bruge flere CPU-kerner, hvis de er tilgængelige på den computer, der udnyttes. Alternativt leveres en hovedløs version af begge APP'er og er med succes blevet kompileret i kompileringsnoden gennem serveren, der blev afholdt på condor-baserede50 Center for High Throughput Computing (CHTC) ved University of Wisconsin-Madison. CHTC-arbejdsgangen til storstilet fiberkvantificering er udviklet, testet og brugt med succes på rigtige billedsæt, der består af tusinder af billeder. Brugeren kunne tilpasse de hovedløse MATLAB-funktioner i både CT-FIRE og CurveAlign til at køre kvantificering på andre cloud computing-systemer, herunder kommercielle tjenester som dem, der tilbydes af Amazon, Google og Microsoft.

Den igangværende og fremtidige udvikling retninger omfatter: 1) inkorporering af deep learning neurale netværk til at udtrække eller generere høj kvalitet syntetisk kollagen fiber billeder og forbedre robusthed og nøjagtighed fiber sporing algoritme; 2) integration af alle moduler i en omfattende platform, samtidig med at koden og dokumentationen optimeres efter den bedste software engineering praksis; 3) implementering af alle kernefunktionerne på en cloud computing-platform; 4) forbedring af arbejdsgangen for fiberanalyse ved hjælp af CHTC-service; og 5) forbedring af funktionaliteten af den syntetiske fiber generator.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Vi takker mange bidragydere og brugere til CT-FIRE og CurveAlign gennem årene, herunder Dr. Rob Nowak, Dr. Carolyn Pehlke, Dr. Jeremy Bredfeldt, Guneet Mehta, Andrew Leicht, Dr. Adib Keikhosravi, Dr. Matt Conklin, Dr. Jayne Squirrell, Dr. Paolo Provenzano, Dr. Brenda Ogle, Dr. Patricia Keely, Dr. Joseph Szulczewski, Dr. Suzanne Ponik og yderligere tekniske bidrag fra Swati Anand og Curtis Rueden. Dette arbejde blev støttet af finansiering fra Semiconductor Research Corporation, Morgridge Institute for Research, og NIH tilskud R01CA199996, R01CA181385 og U54CA210190 til K.W.E.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CT-FIRE Univerity of Wisconsin-Madison N/A open source software available from https://eliceirilab.org/software/ctfire/
CurveAlign University of Wisconsin-Madison N/A open source software available from https://eliceirilab.org/software/curvealign/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nadiarnykh, O., et al. Second harmonic generation imaging microscopy studies of osteogenesis imperfecta. Journal of Biomedical Optics. 12 (5), 051805 (2007).
  2. Kouris, N. A., et al. A nondenatured, noncrosslinked collagen matrix to deliver stem cells to the heart. Regenerative Medicine. 6 (5), 569-582 (2011).
  3. LeBert, D. C., et al. Matrix metalloproteinase 9 modulates collagen matrices and wound repair. Development. 142 (12), 2136-2146 (2015).
  4. Provenzano, P. P., et al. Collagen reorganization at the tumor-stromal interface facilitates local invasion. BMC Medicine. 4 (1), 38 (2006).
  5. Provenzano, P. P., et al. Collagen density promotes mammary tumor initiation and progression. BMC Medicine. 6 (1), 1 (2008).
  6. Conklin, M. W., et al. Aligned collagen is a prognostic signature for survival in human breast carcinoma. The American Journal of Pathology. 178 (3), 1221-1232 (2011).
  7. Alkmin, S., et al. Migration dynamics of ovarian epithelial cells on micro-fabricated image-based models of normal and malignant stroma. Acta Biomaterialia. 100, 92-104 (2019).
  8. Campbell, K. R., Campagnola, P. J. Assessing local stromal alterations in human ovarian cancer subtypes via second harmonic generation microscopy and analysis. Journal of Biomedical Optics. 22 (11), 116008 (2017).
  9. Best, S. L., et al. Collagen organization of renal cell carcinoma differs between low and high grade tumors. BMC Cancer. 19 (1), 490 (2019).
  10. Drifka, C. R., et al. Periductal stromal collagen topology of pancreatic ductal adenocarcinoma differs from that of normal and chronic pancreatitis. Modern Pathology. 28 (11), 1470-1480 (2015).
  11. Campagnola, P. J., et al. Three-dimensional high-resolution second-harmonic generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues. Biophysical Journal. 82 (1), 493-508 (2002).
  12. Arun Gopinathan, P., et al. Study of collagen birefringence in different grades of oral squamous cell carcinoma using picrosirius red and polarized light microscopy. Scientifica. 2015, 1-7 (2015).
  13. Keikhosravi, A., et al. Quantification of collagen organization in histopathology samples using liquid crystal based polarization microscopy. Biomedical Optics Express. 8 (9), 4243-4256 (2017).
  14. Quan, B. D., Sone, E. D. Cryo-TEM analysis of collagen fibrillar structure. Methods in Enzymology. 532, 189-205 (2013).
  15. Boudaoud, A., et al. FibrilTool, an ImageJ plug-in to quantify fibrillar structures in raw microscopy images. Nature Protocols. 9 (2), 457-463 (2014).
  16. Rezakhaniha, R., et al. Experimental investigation of collagen waviness and orientation in the arterial adventitia using confocal laser scanning microscopy. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 11 (3-4), 461-473 (2012).
  17. Kartasalo, K., et al. CytoSpectre: a tool for spectral analysis of oriented structures on cellular and subcellular levels. BMC Bioinformatics. 16 (1), 1 (2015).
  18. Bredfeldt, J. S., et al. Computational segmentation of collagen fibers from second-harmonic generation images of breast cancer. Journal of Biomedical Optics. 19 (1), 016007 (2014).
  19. Bredfeldt, J. S., et al. Automated quantification of aligned collagen for human breast carcinoma prognosis. Journal of Pathology Informatics. 5 (1), 28 (2014).
  20. Liu, Y., Keikhosravi, A., Mehta, G. S., Drifka, C. R., Eliceiri, K. W. Methods for quantifying fibrillar collagen alignment. Methods in Molecular Biology. 1627, 429-451 (2017).
  21. Liu, Y., et al. Fibrillar collagen quantification with curvelet transform based computational methods. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 198 (2020).
  22. Conklin, M. W., et al. Collagen alignment as a predictor of recurrence after ductal carcinoma in situ. Cancer Epidemiology and Prevention Biomarkers. 27 (2), 138-145 (2018).
  23. Jallow, F., et al. Dynamic interactions between the extracellular matrix and estrogen activity in progression of ER+ breast cancer. Oncogene. 38 (43), 6913-6925 (2019).
  24. Smirnova, T., et al. Serpin E2 promotes breast cancer metastasis by remodeling the tumor matrix and polarizing tumor associated macrophages. Oncotarget. 7 (50), 82289 (2016).
  25. Fanous, M., Keikhosravi, A., Kajdacsy-Balla, A., Eliceiri, K. W., Popescu, G. Quantitative phase imaging of stromal prognostic markers in pancreatic ductal adenocarcinoma. Biomedical Optics Express. 11 (3), 1354-1364 (2020).
  26. Jiménez-Torres, J. A., Virumbrales-Muñoz, M., Sung, K. E., Lee, M. H., Abel, E. J., Beebe, D. J. Patient-specific organotypic blood vessels as an in vitro model for anti-angiogenic drug response testing in renal cell carcinoma. EBioMedicine. 42, 408-419 (2019).
  27. Govindaraju, P., Todd, L., Shetye, S., Monslow, J., Puré, E. CD44-dependent inflammation, fibrogenesis, and collagenolysis regulates extracellular matrix remodeling and tensile strength during cutaneous wound healing. Matrix Biology. 75, 314-330 (2019).
  28. Henn, D., et al. Cryopreserved human skin allografts promote angiogenesis and dermal regeneration in a murine model. International Wound Journal. 17 (4), 925-936 (2020).
  29. Rico-Jimenez, J., et al. Non-invasive monitoring of pharmacodynamics during the skin wound healing process using multimodal optical microscopy. BMJ Open Diabetes Research and Care. 8 (1), 000974 (2020).
  30. Israel, J. S., et al. Quantification of collagen organization after nerve repair. Plastic and Reconstructive Surgery Global Open. 5 (12), (2017).
  31. Rentchler, E. C., Gant, K. L., Drapkin, R., Patankar, M., Campagnola, P. J. Imaging collagen alterations in STICs and high grade ovarian cancers in the fallopian tubes by second harmonic generation microscopy. Cancers. 11 (11), 1805 (2019).
  32. Hu, C., et al. Imaging collagen properties in the uterosacral ligaments of women with pelvic organ prolapse using spatial light interference microscopy (SLIM). Frontiers in Physics. 7, 72 (2019).
  33. Guirado, E., et al. Disrupted protein expression and altered proteolytic events in hypophosphatemic dentin can be rescued by dentin matrix protein 1. Frontiers in Physiology. 11, 82 (2020).
  34. Kiss, N., et al. Quantitative analysis on ex vivo nonlinear microscopy images of basal cell carcinoma samples in comparison to healthy skin. Pathology & Oncology Research. 25 (3), 1015-1021 (2019).
  35. Lewis, D. M., et al. Collagen fiber architecture regulates hypoxic sarcoma cell migration. ACS Biomaterials Science & Engineering. 4 (2), 400-409 (2018).
  36. Moura, C. C., Bourdakos, K. N., Tare, R. S., Oreffo, R. O., Mahajan, S. Live-imaging of Bioengineered Cartilage Tissue using Multimodal Non-linear Molecular Imaging. Scientific Reports. 9 (1), 1-9 (2019).
  37. Murtada, S. I., et al. Paradoxical aortic stiffening and subsequent cardiac dysfunction in Hutchinson-Gilford progeria syndrome. Journal of The Royal Society Interface. 17 (166), 0066 (2020).
  38. Nichol, R. H., Catlett, T. S., Onesto, M. M., Hollender, D., Gómez, T. M. Environmental elasticity regulates cell-type specific RHOA signaling and neuritogenesis of human neurons. Stem Cell Reports. 13 (6), 1006-1021 (2019).
  39. Pointer, K. B., et al. Association of collagen architecture with glioblastoma patient survival. Journal of Neurosurgery. 126 (6), 1812-1821 (2016).
  40. Razavi, M. S., Leonard-Duke, J., Hardie, B., Dixon, J. B., Gleason, R. L. Axial stretch regulates rat tail collecting lymphatic vessel contractions. Scientific Reports. 10 (1), 1-11 (2020).
  41. Xue, Y., et al. Valve leaflet-inspired elastomeric scaffolds with tunable and anisotropic mechanical properties. Polymers for Advanced Technologies. 31 (1), 94-106 (2020).
  42. Zhou, Z. H., et al. Reorganized collagen in the tumor microenvironment of gastric cancer and its association with prognosis. Journal of Cancer. 8 (8), 1466 (2017).
  43. Zinn, A., et al. The small GTPase RhoG regulates microtubule-mediated focal adhesion disassembly. Scientific Reports. 9 (1), 1-15 (2019).
  44. Zwaans, B. M., et al. Radiation cystitis modeling: A comparative study of bladder fibrosis radio-sensitivity in C57BL/6, C3H, and BALB/c mice. Physiological Reports. 8 (4), (2020).
  45. Devine, E. E., Liu, Y., Keikhosravi, A., Eliceiri, K. W., Jiang, J. J. Quantitative second harmonic generation imaging of leporine, canine, and porcine vocal fold collagen. The Laryngoscope. 129 (11), 2549-2556 (2019).
  46. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  47. Zeitoune, A. A., et al. Epithelial ovarian cancer diagnosis of second-harmonic generation images: A semiautomatic collagen fibers quantification protocol. Cancer Informatics. 16, (2017).
  48. Wershof, E., et al. Matrix feedback enables diverse higher-order patterning of the extracellular matrix. PLoS Computational Biology. 15 (10), 1007251 (2019).
  49. Mostaço-Guidolin, L. B., et al. Fractal dimension and directional analysis of elastic and collagen fiber arrangement in unsectioned arterial tissues affected by atherosclerosis and aging. Journal of Applied Physiology. 126 (3), 638-646 (2019).
  50. Thain, D., Tannenbaum, T., Livny, M. Distributed computing in practice: the Condor experience. Concurrency and Computation: Practice and Experience. 17 (2-4), 323-356 (2005).

Tags

Bioengineering tumor mikromiljø ekstracellulær matrix kræft kollagen fiber organisation fibrillar kollagen kvantificering curvelet transformering anden harmoniske generation mikroskopi billedanalyse software
Kvantificering af Fibrillar Kollagen organisation med Curvelet Transform-baserede værktøjer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Liu, Y., Eliceiri, K. W. Quantifying … More

Liu, Y., Eliceiri, K. W. Quantifying Fibrillar Collagen Organization with Curvelet Transform-Based Tools. J. Vis. Exp. (165), e61931, doi:10.3791/61931 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter