Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Het kwantificeren van fibrillar collageen organisatie met Curvelet transform-based tools

Published: November 11, 2020 doi: 10.3791/61931
Automatic Translation
1, 1,2,3
1Laboratory for Optical and Computational Instrumentation, Center for Quantitative Cell Imaging, University of Wisconsin-Madison, 2Departments of Medical Physics and Biomedical Engineering, University of Wisconsin-Madison, 3Morgridge Institute for Research, Madison, Wisconsin, 4test, test

Summary

Hier presenteren we een protocol om een curvelet transform-gebaseerde, open-source MATLAB-softwaretool te gebruiken voor het kwantificeren van fibrillaire collageenorganisatie in de extracellulaire matrix van zowel normale als zieke weefsels. Deze tool kan worden toegepast op afbeeldingen met collageenvezels of andere soorten lijnachtige structuren.

Abstract

Fibrillar collageens zijn prominente extracellulaire matrix (ECM) componenten, en hun topologie veranderingen zijn aangetoond te worden geassocieerd met de progressie van een breed scala van ziekten, waaronder borst-, eierstok-, nier- en alvleesklierkanker. Vrij beschikbare softwaretools voor vezelkwantificering zijn voornamelijk gericht op de berekening van vezeluitlijning of -oriëntatie, en ze zijn onderhevig aan beperkingen zoals de vereiste van handmatige stappen, onnauwkeurigheid in de detectie van de vezelrand op een lawaaierige achtergrond of gebrek aan gelokaliseerde functiekarakterisering. De collageenvezelkwantificeringstool die in dit protocol wordt beschreven, wordt gekenmerkt door het gebruik van een optimale afbeeldingsweergave op meerdere schaal die wordt ingeschakeld door curvelettransformatie (CT). Deze algoritmische benadering maakt het mogelijk om ruis uit fibrillaire collageenafbeeldingen te verwijderen en de vezelranden te verbeteren om locatie- en oriëntatie-informatie rechtstreeks van een vezel te bieden, in plaats van de indirecte pixel- of venstergewijze informatie te gebruiken die is verkregen uit andere tools. Dit op CT gebaseerde framework bevat twee afzonderlijke, maar gekoppelde pakketten met de naam "CT-FIRE" en "CurveAlign" die glasvezelorganisatie kunnen kwantificeren op een globale, region of interest (ROI) of individuele vezelbasis. Dit kwantificeringskader is al meer dan tien jaar ontwikkeld en is nu uitgegroeid tot een uitgebreid en gebruikersgedreven collageenkwantificeringsplatform. Met behulp van dit platform kan men tot ongeveer dertig vezelfuncties meten, waaronder individuele vezeleigenschappen zoals lengte, hoek, breedte en rechtheid, evenals bulkmetingen zoals dichtheid en uitlijning. Bovendien kan de gebruiker de vezelhoek meten ten opzichte van handmatig of automatisch gesegmenteerde grenzen. Dit platform biedt ook verschillende extra modules, waaronder modules voor ROI-analyse, automatische grenscreatie en nabewerking. Het gebruik van dit platform vereist geen voorafgaande ervaring met programmeren of beeldverwerking en het kan grote datasets verwerken, waaronder honderden of duizenden afbeeldingen, waardoor een efficiënte kwantificering van de collageenvezelorganisatie voor biologische of biomedische toepassingen mogelijk is.

Introduction

Fibrillar collageens zijn prominente, structurele ECM componenten. Hun organisatie verandert impact weefselfunctie en zijn waarschijnlijk geassocieerd met de progressie van vele ziekten variërend van osteogenese imperfecta1,hartdisfunctie2, en wondgenezing3 tot verschillende soorten kanker, waaronder borst4,5,6,eierstok7,8,nier9, en alvleesklierkanker10. Veel gevestigde beeldvormingsmodaliteiten kunnen worden gebruikt om fibrillar collageen te visualiseren, zoals microscopie van de tweede harmonische generatie11,vlekken of kleurstoffen in combinatie met heldere veld- of fluorescentiemicroscopie of gepolariseerde lichtmicroscopie12,vloeibare kristalgebaseerde polarisatiemicroscopie (LC-PolScope)13en elektronenmicroscopie14. Naarmate het belang van fibrillaire collageenorganisatie duidelijker is geworden en het gebruik van deze methoden is toegenomen, is de behoefte aan verbeterde collageenvezelanalysebenaderingen ook toegenomen.

Er zijn veel inspanningen geleverd om computationele methoden te ontwikkelen voor geautomatiseerde meting van fibrillar collageen. Vrij beschikbare softwaretools zijn voornamelijk gericht op de berekening van vezeluitlijning of oriëntatie door ofwel de eerste afgeleide of structuur tensor voor pixels15,16, of Fourier transformatie-gebaseerde spectrumanalyse voor beeldtegels17. Al deze tools zijn onderhevig aan beperkingen, zoals de vereiste van handmatige stappen, onnauwkeurigheid in de detectie van de vezelrand op een lawaaierige achtergrond of gebrek aan gelokaliseerde functiekarakterisering.

In vergelijking met andere vrij beschikbare open-source vrije softwaretools gebruiken de methoden die in dit protocol worden beschreven CT - een optimale, multiscale, directionele beeldweergavemethode - om ruis uit fibrillaire collageenafbeeldingen te verwijderen en vezelranden te verbeteren of bij te houden. Informatie over locatie en oriëntatie kan rechtstreeks vanuit een vezel worden verstrekt in plaats van door de indirecte pixel- of venstergewijze informatie te gebruiken om de statistieken van glasvezelorganisatie af te leiden. Dit op CT gebaseerde framework18,19,20,21 kan glasvezelorganisatie kwantificeren op een wereldwijde, ROI- of vezelbasis, voornamelijk via twee afzonderlijke, maar gekoppelde pakketten met de naam "CT-FIRE"18,21 en "CurveAlign"19,21. Wat de implementatie van de software betreft, kunnen in CT-FIRE CT-coëfficiënten op meerdere schalen worden gebruikt om een afbeelding te reconstrueren die randen verbetert en ruis vermindert. Vervolgens wordt een individueel vezelextractiealgoritme toegepast op de CT-gereconstrueerde afbeelding om vezels te volgen voor het vinden van hun representatieve middelpunten, het uitbreiden van vezeltakken vanaf de middelpunten en het koppelen van vezeltakken om een glasvezelnetwerk te vormen. In CurveAlign kunnen CT-coëfficiënten op een door de gebruiker opgegeven schaal worden gebruikt om de lokale vezeloriëntatie bij te houden, waarbij de oriëntatie en locaties van curvelets worden geëxtraheerd en gegroepeerd om de vezeloriëntatie op de overeenkomstige locaties te schatten. Dit resulterende kwantificeringskader is al meer dan tien jaar ontwikkeld en is sterk geëvolueerd in vele aspecten zoals functionaliteit, gebruikersinterface en modulariteit. Deze tool kan bijvoorbeeld de lokale vezeloriëntatie visualiseren en stelt de gebruiker in staat om tot dertig vezelfuncties te meten, waaronder individuele vezeleigenschappen zoals lengte, hoek, breedte en rechtheid, evenals bulkmetingen zoals dichtheid en uitlijning. Bovendien kan de gebruiker de vezelhoek meten ten opzichte van handmatig of automatisch gesegmenteerde grenzen, wat bijvoorbeeld een belangrijke rol speelt in de ontwikkeling van beeldgebaseerde biomarker in borstkanker22 en alvleesklierkankerstudies10. Dit platform biedt verschillende functiemodules, waaronder modules voor ROI-analyse, automatische grenscreatie en nabewerking. De ROI-module kan worden gebruikt om verschillende vormen van ROI te annoteren en de bijbehorende ROI-analyse uit te voeren. Als toepassingsvoorbeeld kan de automatische module voor het maken van grenzen worden gebruikt om hematoxyline en eosine (H&E) heldere veldafbeeldingen te registreren met SHG-afbeeldingen (Second Harmonic Generation) en het afbeeldingsmasker van tumorgrenzen te genereren uit de geregistreerde H&E-afbeeldingen. De module na verwerking kan helpen bij het vergemakkelijken van de verwerking en integratie van uitvoergegevensbestanden uit afzonderlijke afbeeldingen voor mogelijke statistische analyse.

Dit kwantificeringsplatform vereist geen voorafgaande ervaring met programmeren of beeldverwerking en kan grote datasets verwerken, waaronder honderden of duizenden afbeeldingen, waardoor een efficiënte kwantificering van de collageenorganisatie voor biologische of biomedische toepassingen mogelijk is. Het is op grote schaal gebruikt op verschillende onderzoeksgebieden door veel onderzoekers over de hele wereld, waaronder wijzelf. Er zijn vier hoofdpublicaties over CT-FIRE en CurveAlign18,19,20,21, waarvan de eerste drie 272 keer zijn geciteerd (vanaf 2020-05-04 volgens Google Scholar). Een overzicht van de publicaties die dit platform citeerden (CT-FIRE of CurveAlign) geeft aan dat er ongeveer 110 tijdschriftstukken zijn die het direct gebruikten voor hun analyse, waarin ongeveer 35 publicaties samenwerkten met onze groep, en de andere (~ 75) werden geschreven door andere groepen. Bijvoorbeeld: dit platform werd gebruikt voor de volgende studies: borstkanker22,23,24, alvleesklierkanker10,25, nierkanker9,26, wondgenezing3,27,28,29,30, eierstokkanker8,31,7, uterosacrale ligament32, hypofosfaterem dentine33, basaalcelcarcinoom34, hypoxisch sarcoom35, kraakbeenweefsel36, hartdisfunctie37, neuronen38, glioblastoom39, lymfatische contracties40, vezelige cacffolds41, maagkanker42, microtubuli43, en blaasfibrose44. Figuur 1 toont de kankerbeeldvormingstoepassing van CurveAlign om de tumor-geassocieerde collageenhandtekeningen van borstkanker19 uit het SHG-beeld te vinden. Figuur 2 beschrijft een typische schematische workflow van dit platform. Hoewel deze tools technisch zijn herzien18,19,21, en een regelmatig protocol20 voor uitlijningsanalyse met CurveAlign ook beschikbaar is, kan een visueel protocol dat alle essentiële functies demonstreert nuttig zijn. Een gevisualiseerd protocol, zoals hier gepresenteerd, zal het leerproces van het gebruik van dit platform vergemakkelijken en efficiënter omgaan met zorgen en vragen die gebruikers zouden kunnen hebben.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

OPMERKING: Dit protocol beschrijft het gebruik van CT-FIRE en CurveAlign voor collageenkwantificering. Deze twee instrumenten hebben complementaire, maar verschillende, hoofddoelen en zijn tot op zekere hoogte met elkaar verbonden. CT-FIRE kan worden gestart vanuit de CurveAlign-interface om de meeste bewerkingen uit te voeren, behalve voor geavanceerde nabewerking en ROI-analyse. Voor een volledige werking van CT-FIRE moet het afzonderlijk worden gestart.

1. Beeldverzameling en beeldeis

OPMERKING: De tool kan elk afbeeldingsbestand verwerken met lijnachtige structuren die door MATLAB kunnen worden gelezen, ongeacht de beeldvormingsmodaliteit die wordt gebruikt om het te verzamelen.

  1. Gebruik 8-bits grijswaarden als afbeeldingstype, omdat de standaard actieve parameters op deze indeling zijn gebaseerd.
    OPMERKING: SHG-beeldvorming is een veelgebruikte labelvrije en hoge resolutie fibrillar collageen beeldvormingsmethode. SHG-afbeeldingen uit een borstkankerstudie19 zullen hier worden gebruikt voor demonstratie.

2. Software-installatie en systeemvereisten

OPMERKING: Zowel standalone als source-code versies zijn vrij beschikbaar. De broncodeversie vereist een volledige MATLAB-installatie, inclusief toolboxen voor signaalverwerking, beeldverwerking, statistiekenanalyse en parallel computing. Om de broncodeversie uit te voeren, moeten alle benodigde mappen, waaronder sommige van de bronnen van derden, worden toegevoegd aan het MATLAB-pad. Het gebruik van de zelfstandige toepassing (APP) wordt aanbevolen voor de meeste gebruikers, waarvoor een vrij beschikbare MATLAB Compiler Runtime (MCR) van de opgegeven versie moet worden geïnstalleerd. De procedure voor het installeren en starten van de APP wordt hieronder beschreven.

  1. Download CT-FIRE versie 3.0 (CTF3.0) en CurveAlign Version 5.0 (CA5.0) APP pakketten van respectievelijk https://eliceirilab.org/software/ctfire/ en https://eliceirilab.org/software/curvealign/.
    OPMERKING: Elk pakket bevat de zelfstandige APP, handmatige en testafbeeldingen.
  2. Volg de gedetailleerde vereisten en installatie-instructies van de bovenstaande websites om MATLAB MCR 2018bte installeren.
  3. Start de APP.
    1. Voor een Windows 64-bits systeem dubbelklikt u op het APP-pictogram om het te starten.
    2. Volg voor een Mac-systeem de volgende stappen om het te starten: Klik met de rechtermuisknop op de APP (ctrl-click) | Inhoud van pakket weergeven | Inhoud | MacOS-| applauncher (klik met de rechtermuisknop en kies openen).
      OPMERKING: Andere details zijn te zien op de softwarewebsites in 2.1.

3. Individuele vezelextractie met CT-FIRE

OPMERKING: CT-FIRE gebruikt CT om het beeld te denoise, de vezelranden te verbeteren en gebruikt vervolgens een vezelextractiealgoritme om individuele vezels te volgen. Lengte, hoek, breedte en rechtheid worden berekend voor afzonderlijke vezels.

  1. CT-FIRE op één afbeelding of meerdere afbeeldingen
    1. Start de APP zoals beschreven in 2.3.
    2. Klik op de knop Bestand(en) openen in de belangrijkste grafische gebruikersinterface (GUI, figuur 3A)en selecteer vervolgens een of meer afbeeldingen/of afbeeldingsstapels in het promptvenster. Gebruik de techniek die geschikt is voor het besturingssysteem om meerdere afbeeldingen in het dialoogvenster te selecteren (houd ctrl bijvoorbeeld in Windows ingedrukt terwijl u meerdere bestanden selecteert).
      OPMERKING: Als twee of meer afbeeldingsbestanden zijn geselecteerd, moeten alle afbeeldingen dezelfde actieve parameters voor de analyse gebruiken. Zorg ervoor dat alle afbeeldingen onder dezelfde of vergelijkbare omstandigheden worden verkregen.
    3. Selecteer parallelle computeropties door het selectievakje Parallel in de rechterbovenhoek in te schakelen voor analyse van meerdere afbeeldingen.
    4. Voor de afbeeldingsstack verplaatst u de schuifregelaar van het segment onder de bestandslijst om het te analyseren segment te selecteren.
    5. Actieve eigenschappen instellen. Gebruik standaardparameters voor een eerste analyse van sommige afbeeldingen. Als u standaardparameters gebruikt, gaat u verder met stap 3.1.6. Als u verschillende parameters wilt instellen, klikt u op de knop Bijwerken in het deelvenster Parameters. Volg de handleiding om de parameters goed af te stemmen.
      OPMERKING: De meest aangepaste parameters zijn de achtergronddrempel (thresh_im2) en de zoekradius van de nucleatie (s_xlinkbox). Als het achtergrondgeluidsniveau hoog is, stelt u thresh_im2 in op een grotere waarde; s_xlinkbox is gekoppeld aan de gemiddelde straal van de vezels, stelt u een kleinere waarde in om dunne vezels te detecteren.
    6. Klik op de knop Uitvoeren.
      OPMERKING: De voortgangsinformatie wordt zowel in het informatievenster als in het opdrachtvenster weergegeven. Nadat de analyse is voltooid, wordt de uitvoertabel weergegeven (figuur 3B).
    7. Klik op een item in de uitvoertabel om het histogram van vezelmetingen(figuur 3C en figuur 3F)van de afbeelding te zien, inclusief lengte, breedte, hoek en rechtheid.
      OPMERKING: De vezelafbeeldingen met vezels die op de oorspronkelijke afbeelding zijn bedekt, worden ook weergegeven(figuur 3E).
    8. Controleer de submap met de naam ctFIREout onder de afbeeldingsmap voor de uitvoerbestanden, waaronder het overlappende afbeeldingsbestand ".tiff", het bestand ".csv" en het bestand ".mat".
  2. CT-FIRE regio van belang (ROI) analyse
    1. ROI-annotatie met ROI Manager
      1. Klik op de knop Bestand(en) openen in de hoofd-GUI (figuur 3A) om een of meer afbeeldingen te laden.
      2. Selecteer de afbeelding die moet worden geannoteerd in de bestandslijst.
      3. Selecteer ROI Manager in het vervolgkeuzemenu van het deelvenster ROI-opties.
      4. Klik op de run-knop om de ROI Manager-module te starten (figuur 3A).
      5. Klik in de GUI van DE ROI-manager(figuur 4A)op het vervolgkeuzemenu onder ROI-menu(d) tekenenom de ROC's één voor één te tekenen.
        OPMERKING: De ROI-vorm kan rechthoek, vrije hand, ellips, veelhoek of opgegeven rechthoek zijn. Volg de instructies op het scherm om roi-annotatie te tekenen, op te slaan en af te sluiten.
      6. Nadat u de methode hebt geselecteerd om de ROI te tekenen, sleept u de gele rechthoek die op de oorspronkelijke afbeelding wordt weergegeven naar de gewenste positie en klikt u vervolgens op de knop ROI(s) opslaan of drukt u op de toetsen s om deze ROI aan de ROI-lijst toe te voegen. Deze ROI wordt automatisch benoemd.
      7. Teken een nieuwe ROI door de vorige ROI naar een nieuwe positie te slepen en op te slaan zoals vermeld in 3.2.1.6, of herhaal stap 3.2.1.5–3.2.1.6 om een nieuwe ROI te tekenen.
      8. Druk op x of selecteer Nieuwe ROI? in het vervolgkeuzemenu ROI-vorm om de ROI-annotatie af te sluiten.
      9. Schakel de selectievakjes Alles en labels weergeven in om alle gedefinieerde ROC's in de lijst en hun namen op de oorspronkelijke afbeelding weer te geven.
      10. Selecteer de ROI in de ROI-lijst om basis ROI-bewerkingen uit te voeren, waaronder ROI hernoemen, ROI verwijderen, ROI-tekst opslaan, ROI laden uit tekst, ROI-masker opslaan, ROI laden uit maskeren ROC's combineren.
      11. Controleer het uitvoerbestand van de ROI-manager dat is opgeslagen als het bestand ".mat" in een submap met de naam ROI_management onder de oorspronkelijke afbeeldingsmap.
      12. Als u een andere afbeelding in de lijst met geopende bestanden wilt aantekeningen maken, herhaalt u stap 3.2.1.2–3.2.1.11.
      13. Nadat de annotatie is voltooid, sluit u de GUI van de ROI-manager en stelt u de hoofd-GUI opnieuw in door op de knop Reset in de hoofd-GUI te klikken.
    2. ROI-analyse voor één installatiekopie in ROI Manager
      1. Als ct-fire-analyse met volledige afbeelding wordt uitgevoerd en de resultaten worden opgeslagen in de standaardmap, klikt u op een of meer ROC's in de ROI-lijst en klikt u vervolgens op de ctFIRE ROI Analyzer-knop om de post-ROI-analysemodule te starten.
        OPMERKING: De resultaten worden automatisch opgeslagen in een submap op \\[afbeeldingsmap]\ CTF_ROI\Individueel\ROI_post_analysis\.
      2. Klik in het pop-upvenster op de knop Vezels controleren om vezels binnen de geselecteerde ROC's weer te geven (figuur 4B).
      3. Klik op Plotstatistieken om histogrammen van elke ROI weer te geven (Figuur 4C). De bijbehorende uitvoercijfers worden weergegeven.
      4. Als er geen ct-fire-analyse met volledige afbeelding is uitgevoerd, klikt u op een of meer ROC's in de ROI-lijst en klikt u op de knop CtFIRE toepassen op ROI om ct-fire-analyse rechtstreeks toe te passen op de geselecteerde ROC's.
      5. Volg de instructies in het promptvenster om de analyse uit te voeren.
        OPMERKING: De parameters voor het uitvoeren van de CT-FIRE worden doorgegeven via de hoofd-GUI en de gebruiker kan de actieve parameters zoals beschreven in stap 3.1.5 indien nodig bijwerken. Nadat de analyse is voltooid, worden de overzichtsstatistieken van vezelmetingen weergegeven in de uitvoertabel. De resultaten worden automatisch opgeslagen in een submap op \\[afbeeldingsmap]\ CTF_ROI\Individueel\ROI_analysis\.
    3. ROI-analyse voor meerdere images met ROI Analyzer
      1. Volg de stappen in 3.2.1 om aantekeningen te maken bij ROC's voor de te analyseren afbeeldingen.
      2. Open een of meer afbeeldingen door op de knop Bestand(en) openen te klikken.
      3. Als u de ROI-postanalyse wilt uitvoeren wanneer de volledige resultaten van de afbeeldingsanalyse beschikbaar zijn, klikt u op het vervolgkeuzemenu in het deelvenster Opties uitvoeren en selecteert u de optie CTF-analyse na ROI.
      4. Klik op de run-knop om ROI-analyse uit te voeren voor alle geladen afbeeldingen.
      5. Controleer de voortgangsinformatie die wordt weergegeven in het berichtvenster onder aan de GUI en in het opdrachtvenster.
      6. Nadat de analyse is voltooid, controleert u de overzichtsstatistieken voor elke ROI die in een uitvoertabel wordt weergegeven.
        OPMERKING: De gedetailleerde uitvoerbestanden worden automatisch opgeslagen in een submap op \\ [afbeeldingsmap]\CTF_ROI\Batch\ROI_post_analysis\.
      7. Als u een directe analyse wilt uitvoeren wanneer de volledige resultaten van de beeldanalyse niet beschikbaar zijn, volgt u de stappen 3.2.3.1–3.2.3.6, behalve dat u in stap 3.2.3.3 de optie CTF ROI-analyser selecteert; in stap 3.2.3.4, voordat u op de RUN-knop klikt, werkt u de actieve parameters bij zoals beschreven in stap 3.1.5. Nadat u op de knop RUN hebt geklikt, kiest u in een snel dialoogvenster tussen rechthoekig ROI- en ROI-masker in elke vorm.
        OPMERKING: Als alle geannoteerde ROC's rechthoekig zijn, kan de gebruiker de "Rechthoekige ROI" kiezen. In stap 3.2.3.6 worden de ROI-analyseresultaten opgeslagen in een submap op \\[afbeeldingsmap]\CTF_ROI\Batch\ROI_analysis\.
  3. Nabewerking met CT-FIRE
    OPMERKING: Na de in punt 3.1 beschreven regelmatige CT-FIRE-analyse kan de gebruiker verdere nabewerking uitvoeren. Zonder de tijdrovende vezelextractie opnieuw uit te voeren, kan regelmatige nabewerking, beschreven in 3.3.1, enkele basiseigenschappen van uitvoercijfers bijwerken, terwijl de geavanceerde nabewerking die in 3.3.2 wordt beschreven, individuele vezels en hun eigenschappen kan visualiseren, complexe drempelwaarden tussen alle vier de vezeleigenschappen kan uitvoeren, overzichtsstatistieken van de geselecteerde vezels kan genereren en de geselecteerde vezels kan visualiseren met behulp van een aangepaste kleurenkaart.
    1. Regelmatige nabewerking met CT-FIRE
      1. Start de CT-FIRE-app of klik op de resetknop na andere bewerkingen om de ct-fire-hoofd-GUI te initialiseren (figuur 3A).
      2. Vink het selectievakje .mat aan de bovenkant van de hoofd-GUI aan.
      3. Klik op de knop Bestand(en) openen om het CT-FIRE-uitvoer .mat-bestand in de submap ctFIREout te selecteren.
        OPMERKING: Als meerdere bestanden zijn geselecteerd, wordt het selectievakje Batch automatisch ingeschakeld. De bestandsnaam van de bijbehorende afbeeldingen wordt weergegeven in de lijst met vakjes.
      4. Werk de opties bij in het configuratiescherm voor uitvoer cijfers.
      5. Houd de standaardopties in Uitvoeropties,die ervoor zorgen dat alle uitvoerbestanden worden bijgewerkt volgens de nieuwe set parameters die zijn ingesteld in 3.3.1.4.
      6. Klik op de knop Nabewerking. Controleer de voortgangsinformatie in het berichtvenster onder aan de hoofd-GUI en in het opdrachtvenster.
      7. Nadat de analyse is voltooid, klikt u op een item in de uitvoertabel om het histogram van vezelmetingen van de afbeelding te zien, inclusief lengte, breedte, hoek en rechtheid.
        OPMERKING: Nieuwe uitvoerbestanden overschrijven de oude in de ctFIREout-submap.
    2. Geavanceerde nabewerking van CT-FIRE
      1. Start de CT-FIRE-app of klik op de resetknop na andere bewerkingen om de ct-fire-hoofd-GUI te initialiseren (figuur 3A).
      2. Schakel het selectievakje OUT.adv boven aan de hoofd-GUI in (figuur 3A).
      3. Klik op de knop Nabewerking om de geavanceerde GUI na verwerking genaamd "Analysis Module" (Figuur 5A) te starten.
      4. Klik op de knop Bestand selecteren om een afbeelding te selecteren.
      5. Klik op de knop Fibers visualiseren om het vezelnummer in te voeren op basis van de labels in de tabfiguur Original-fibers.
        OPMERKING: De metingen van de geselecteerde vezels worden weergegeven in een uitvoertabel(figuur 5B),en de bijbehorende vezels worden bedekt op de oorspronkelijke afbeelding in de tabfiguur met de naam Measured-Fibers (Figuur 5C).
      6. Klik op de knop Bevestigen/bijwerken om naar de drempelbewerking te gaan.
      7. Schakel het drempelvakje in om de drempelwaarde-instellingen in te schakelen.
      8. Kies een van de vier drempelopties in het vervolgkeuzemenu.
      9. Voer de gewenste drempelwaarden in het deelvenster Drempelwaarden in voor een of meer vezeleigenschappen.
      10. Klik op de knop Nu drempel om de bovenstaande drempelvoorwaarden toe te passen.
      11. Controleer de promptfiguur met de naam die eindigt met metrische visualisatie om de geselecteerde vezels op de oorspronkelijke afbeeldingen te zien met de aangepaste kleurenkaarten zoals weergegeven in figuur 5E.
      12. Herhaal stap 3.3.2.9–3.3.2.11 om de gewenste drempelwaarden in te stellen.
      13. Klik op de knop Vezels opslaan om de geselecteerde vezelinformatie op te slaan.
        OPMERKING: Overeenkomstige geselecteerde vezels worden weergegeven in de tabfiguur met de naam Na-drempelwaarden.
      14. Klik op de knop Statistieken genereren en klik vervolgens op de knop OK in het pop-upvenster om overzichtsstatistieken te genereren.
        OPMERKING: Een uitvoertabel (figuur 5D) toont de gemiddelde waarde van de geselecteerde vezels. Andere statistieken van de geselecteerde vezels worden opgeslagen in een Excel-bestand waarvan de locatie wordt weergegeven in het statusvenster onder aan deze GUI.
      15. Als u de geselecteerde afzonderlijke vezelgegevens in het uitvoerbestand wilt opnemen, schakelt u het selectievakje Blad genereren voor onbewerkte gegevens in voordat u op de knop OK klikt.
      16. Als u resultaten van meerdere afbeeldingen wilt combineren, schakelt u in stap 3.3.2.4 het vakje Batchmodus of Stackmodus in en selecteert u de meerdere afbeeldingen of stack(s) die moeten worden geanalyseerd; stap 3.3.2.5–3.3.2.6 overslaan. Stel in stap 3.3.2.8–3.3.2.9 drempelwaarden in, maar aangezien de knoppen nu drempelwaarde en Bespaarvezels zijn uitgeschakeld, slaat u stap 3.3.2.10–3.3.2.13 over; en tot slot, volg de instructies in stap 3.3.2.14 om samenvattingsstatistieken en individuele vezeleigenschappen van de geselecteerde vezels te genereren.

4. Vezelanalyse met CurveAlign

OPMERKING: CurveAlign werd in eerste instantie ontwikkeld om automatisch hoeken van vezels te meten met betrekking tot door de gebruiker gedefinieerde grenzen. De huidige versie van CurveAlign kan worden gebruikt voor bulkbeoordeling van dichtheids- en uitlijningsgebaseerde functies naast de relatieve hoekmeting door ofwel de individuele vezelinformatie te laden die door CT-FIRE is geëxtraheerd of rechtstreeks met behulp van de lokale oriëntatie van de curvelets. CurveAlign berekent maximaal dertig functies met betrekking tot globale of lokale kenmerken, voornamelijk met inbegrip van dichtheid en uitlijning, evenals individuele vezeleigenschappen wanneer CT-FIRE wordt aangenomen als de fiber tracking methode.

  1. Vezelanalyse met curvelets
    1. Start de APP zoals beschreven in 2.3.
    2. Klik op de knop Reset om de APP terug te zetten naar de oorspronkelijke status als er andere bewerkingen zijn uitgevoerd.
    3. Controleer in de hoofd-GUI(figuur 6A)de optie Fiber analysis method om ervoor te zorgen dat CT is geselecteerd (standaardoptie).
      OPMERKING: In deze modus wordt CT op de afbeelding uitgevoerd en de richting van elke curvelet vertegenwoordigt de richting van een vezel op de overeenkomstige locatie.
    4. Klik op het vervolgkeuzemenu grensmethode en selecteer de grensverwerkingsmodus in de volgende vervolgkeuzemenuopties: Geen grens, CSV-grens en TIFF-grens.
      OPMERKING: Als er geen grens nodig is, slaat u deze stap over. Raadpleeg 4.3 voor het berekenen van vezelhoeken ten opzichte van een grens.
    5. Klik op de knop Afbeelding(en) ophalen in de hoofd-GUI(figuur 6A)en selecteer vervolgens een of meer afbeeldingen/of afbeeldingsstapels in het promptvenster. Gebruik de techniek die geschikt is voor uw besturingssysteem om meerdere afbeeldingen in het dialoogvenster te selecteren (houd ctrl bijvoorbeeld in Windows ingedrukt terwijl u meerdere bestanden selecteert).
      OPMERKING: Als twee of meer afbeeldingsbestanden zijn geselecteerd, moeten alle afbeeldingen dezelfde actieve parameters gebruiken voor analyse. Zorg ervoor dat alle afbeeldingen onder dezelfde of vergelijkbare omstandigheden worden verkregen.
    6. Voor de afbeeldingsstack verplaatst u de schuifregelaar van het segment onder de bestandslijst om het te analyseren segment te selecteren.
    7. Voer de fractie van coefs in om te behouden. Deze waarde is de fractie van de grootste COËfficiënten van CT die zal worden gebruikt in de vezelanalyse.
      OPMERKING: Als de afbeelding een grote variatie in vezelintensiteit of contrast heeft, annoteert u interessegebieden met zelfs contrast voor de vezelanalyse, omdat deze modus alleen de helderste vezels in een afbeelding detecteert. Bovendien, hoe groter de afbeeldingsgrootte is, stel een kleinere waarde in voor deze fractie.
    8. Houd standaard alle parameters in de uitvoeropties en andere in de optie Geavanceerd. de uitvoerbestanden kunnen nodig zijn bij andere toekomstige bewerkingen.
    9. Klik op de knop Uitvoeren onder aan de hoofd-GUI (figuur 6A).
      OPMERKING: De voortgangsinformatie wordt weergegeven in een berichtvenster dat onderaan in groene kleur is gemarkeerd. Nadat het proces is voltooid, worden enkele overzichtsstatistieken voor elke afbeelding weergegeven in de uitvoertabel (figuur 6B) en worden alle uitvoerbestanden automatisch opgeslagen in een submap met de naam CA_Out in de map van de oorspronkelijke afbeelding(en).
    10. Klik op een item in de uitvoertabel (figuur 6B) om het histogram (figuur 6E) of kompasplot(figuur 6F)van vezelhoeken te zien.
      OPMERKING: De overlayafbeelding (figuur 6C) en de heatmap (figuur 6D) van uitlijning of hoek worden ook weergegeven.
    11. Klik op de knop Reset om andere bewerkingen uit te voeren of sluit de hoofd-GUI om de APP af te sluiten.
  2. Individuele vezelanalyse met CT-FIRE
    OPMERKING: De procedure is dezelfde als die beschreven in punt 4.1, behalve dat u in stap 4.1.3 de CT-FIRE-gerelateerde vezelanalysemodusselecteert en stap 4.1.7 overslaat omdat deze niet van toepassing is en is uitgeschakeld in de CT-FIRE-modus. Selecteer in stap 4.1.3 specifiek een van de volgende drie op CT-FIRE gebaseerde individuele vezelanalysemethoden:
    1. Selecteer CT-FIRE Fibers om het vezelcentrumpunt en de vezelhoek te gebruiken om de vezel weer te geven.
      OPMERKING: Bij deze optie wordt geen rekening gehouden met de veranderingen in vezeloriëntatie over de lengte van de vezel.
    2. Selecteer CT-FIRE-eindpunten om de twee eindpunten van een vezel en de bijbehorende vezelhoek te gebruiken om de vezel weer te geven.
      OPMERKING: In vergelijking met 4.2.1 gebruikt deze optie twee posities om een vezel weer te geven in plaats van één (middelpunt van de vezel).
    3. Selecteer CT-FIRE-segmenten om segmenten van een vezel te gebruiken om de vezel weer te geven.
      OPMERKING: Elk segment heeft een gelijke lengte (standaard ingesteld op 5 pixels in CT-FIRE) en de oriëntatie en locatie, die de verandering in oriëntatie over de hele lengte van de vezel weerspiegelt. Deze optie zou het meest tijdrovend zijn, maar zou de beste optie zijn onder de drie op CT-FIRE gebaseerde vezelanalysemethoden om veranderingen in de lokale oriëntatie van een bochtige vezel bij te houden.
  3. Relatieve uitlijningsanalyse met grens
    OPMERKING: In vergelijking met de reguliere analyse zonder randvoorwaarden zoals beschreven in de punten 4.2 en 4.3, heeft de relatieve uitlijningsanalyse met de randvoorwaarden het volgende nodig:
    1. Selecteer in stap 4.1.3 de grensvoorwaarde tiff.
      OPMERKING: De gebruiker heeft een bijbehorend grensbestand nodig voor elke afbeelding of elke stack. Volg de instructies op het scherm om handmatig aantekeningen te maken van een CSV-grensbestand (op basis van komma-gescheiden waarden, x-y-coördinaten) of een Tiff-grensbestand. De grensbestanden die in CurveAlign zijn gemaakt, worden automatisch opgeslagen volgens de bestandsmap en bestandsnaamgevingsconventies die in de handleiding worden beschreven. Als er een paar H&E bright-field- en SHG-afbeeldingen worden geleverd, gebruikt u de automatische module voor het maken van grenzen die wordt beschreven in sectie 4.4 om het grensbestand te genereren.
    2. Voer in het deelvenster Primaire parameters de afstand tot de dichtstbijzijnde grens in om alleen de vezels binnen dit afstandsbereik te evalueren.
    3. Schakel in het deelvenster Uitvoeropties het selectievakje grenskoppeling Bdry Assoc in om het punt op de grens te visualiseren dat is gekoppeld aan een vezel, vezelsegment of curvelet.
  4. Automatische grenscreatie
    1. Start de APP zoals beschreven in 2.3.
    2. Klik op de knop Reset om de APP terug te zetten naar de oorspronkelijke status als er al andere bewerkingen zijn uitgevoerd.
    3. Klik op de knop BD-creatie om de automatische module voor het maken van grenzen te starten.
    4. Volg de instructies/aanwijzingen op het scherm om een grensbestand te maken voor een of meer afbeeldingen op basis van een paar H&E bright-field- en SHG-afbeeldingen.
    5. Sluit het modulevenster of klik op de knop Reset in de hoofd-GUI (figuur 6A) om deze module af te sluiten.
  5. CurveAlign regio van belang analyse
    1. ROI-annotatie met ROI Manager
      1. Klik op de knop Afbeelding(en) ophalen in de hoofd-GUI (figuur 6A) om een of meer afbeeldingen te laden.
      2. Selecteer de afbeelding die moet worden geannoteerd in de bestandslijst.
      3. Klik op de ROI Manager om de ROI Manager module te starten (Figuur 7A).
      4. Volg stap 3.2.1.5–3.2.1.13 in punt 3.2.1.
    2. ROI-analyse voor één installatiekopie in ROI Manager
      1. Als de volledige curvealign-analyse is uitgevoerd en de resultaten zijn opgeslagen in de standaardmap, klikt u op een of meer ROC's in de ROI-lijst en klikt u vervolgens op de knop CA ROI Analyzer om post-ROI-analyse uit te voeren.
        OPMERKING: Nadat de analyse is voltooid, worden overzichtsstatistieken weergegeven in een uitvoertabel (figuur 7C) en een histogramfiguur (figuur 7D) die de hoekverdeling weergeeft.
      2. Klik op een item in de uitvoertabel om de vezels in een bepaalde ROI(figuur 7B)en het histogram van de vezelhoeken te visualiseren.
      3. Controleer de uitvoerbestanden die zijn opgeslagen in een submap op \\[afbeeldingsmap]\ CA_ROI\Individueel\ROI_post_analysis\.
      4. Als er geen volledige CA-analyse is uitgevoerd, klikt u op een of meer ROC's in de ROI-lijst en klikt u op de knop CA toepassen op ROI om ca-analyse rechtstreeks toe te passen op de geselecteerde ROC's. Volg de instructies in het promptvenster om de analyse uit te voeren.
        OPMERKING: De parameters voor het uitvoeren van de CA-analyse worden doorgegeven via de hoofd-GUI; de actieve parameters die in stap 4.1.7 worden beschreven, indien nodig bijwerken. Nadat de analyse is voltooid, worden de resultaten van de overzichtsstatistieken van vezelmetingen weergegeven in de uitvoertabel. De resultaten worden automatisch opgeslagen in een submap op \\[afbeeldingsmap]\ CA_ROI\Individueel\ROI_analysis\.
    3. ROI-analyse voor meerdere images met ROI Analyzer
      1. Volg de stappen in 4.5.1 om aantekeningen te maken bij ROC's voor de te analyseren afbeeldingen.
      2. Open een of meer afbeeldingen door op de knop Afbeelding(en) ophalen te klikken.
      3. Als u de ROI-postanalyse wilt uitvoeren wanneer de volledige resultaten van de afbeeldingsanalyse beschikbaar zijn, klikt u op de knop ROI-analyse en selecteert u de optie ROI-nabewerking.
      4. Controleer de voortgangsinformatie die wordt weergegeven in het berichtvenster onder aan de GUI en in het opdrachtvenster.
      5. Nadat de analyse is voltooid, controleert u de overzichtsstatistieken voor elke ROI die in een uitvoertabel wordt weergegeven.
        OPMERKING: De gedetailleerde uitvoerbestanden worden automatisch opgeslagen in een submap op \\ [afbeeldingsmap]\CA_ROI\Batch\ROI_post_analysis\.
      6. Als u een directe analyse met ct-modus wilt uitvoeren wanneer de volledige resultaten van de afbeeldingsanalyse niet beschikbaar zijn, volgt u stap 4.5.3.1–4.5.3.5, met uitzondering van de volgende wijzigingen: wijzig stap 4.5.3.3 door de optie CA op bijgesneden rechthoekige ROI of CA op masker met ROI van welke vorm dan ookte selecteren. Als alle geannoteerde ROC's een rechthoekige vorm hebben, kiest u de optie Rechthoekige ROI. Werk na stap 4.5.3.2 de actieve parameters bij, zoals beschreven in 4.1.7.
        OPMERKING: De ROI-analyseresultaten worden opgeslagen in een submap op \\ [afbeeldingsmap]\CA_ROI\Batch\ROI_analysis\.
  6. Nabewerking van CurveAlign
    1. Start de APP zoals beschreven in sectie 2.3.
    2. Klik op de knop Reset om de APP terug te zetten naar de oorspronkelijke status als er al andere bewerkingen zijn uitgevoerd.
    3. Klik op de knop Nabewerking om de nabewerkingsmodule te starten.
    4. Volg de instructies/aanwijzingen op het scherm om de uitvoerfuncties of waarden van verschillende afbeeldingen te combineren.
    5. Sluit het modulevenster of klik op de knop Reset in de hoofd-GUI (figuur 6A) om deze module af te sluiten.

5. Geschatte looptijd

  1. Wacht op de geschatte looptijd voor het verwerken van een afbeelding met een grootte van 1024 pixels x 1024 pixels met een matige vezeldichtheid. De werkelijke rekentijd is over het algemeen afhankelijk van meerdere factoren, waaronder de grootte van het bestand, de analysemodus, de functies die moeten worden geïmplementeerd, het cpu-type (Central Processing Unit) en de hoeveelheid beschikbaar geheugen met willekeurige toegang (of RAM). CT-FIRE individuele vezelextractie duurt een paar minuten. CurveAlign CT-modus zonder grens duurt enkele seconden. CurveAlign CT-FIRE vezel of vezel eindigt modus zonder grens duurt tientallen seconden. CurveAlign CT-FIRE vezelmodus zonder grens duurt honderden seconden. CurveAlign-analyse met grens duurt tientallen seconden tot enkele minuten, afhankelijk van de complexiteit van de grenzen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Deze methoden zijn met succes toegepast in tal van studies. Enkele typische toepassingen zijn: 1) Conklin et al.22 gebruikten CurveAlign om tumor-geassocieerde collageenhandtekeningen te berekenen, en ontdekten dat collageenvezels vaker loodrecht op de kanaalperimeter werden uitgelijnd in ductaal carcinoom in situ (DCIS) laesies; 2) Drifka et al.10 gebruikten de CT-FIRE-modus in CurveAlign om de stromale collageenuitlijning voor pancreas ductaal adenocarcinoom en normale/ chronische pancreatitisweefsels te kwantificeren, en ontdekten dat er een verhoogde uitlijning was in kankerweefsels in vergelijking met die in normale / chronische weefsels; 3) Alkmin et al.7 gebruikten CurveAlign om de hoekige verdeling van F-actinevezels en algehele collageenuitlijning uit de SHG-afbeeldingen van ovariële stromal collageen te kwantificeren, en toonden aan dat matrixmorfologie een belangrijke rol speelt bij het stimuleren van celmotiliteit en F-actine-uitlijning; 4) LeBert et al.3 pasten CT-FIRE toe op de SHG-afbeeldingen van een zebraviswondherstelmodel en vonden een toename van de dikte van collageenvezels na acute verwonding; 5) Devine et al.45 gebruikten de CT-FIRE-modus in CurveAlign voor SHG-afbeeldingen van stemplooicollageen uit verschillende diermodellen om individuele vezeleigenschappen en algehele uitlijning te meten, en toonden aan dat varkens- en hondenvocaal vouwcollageen een hogere uitlijning en rechtheid inferieur hadden; 6) Keikhosravi et al.13 gebruikten CurveAlign om collageenuitlijning te kwantificeren in histopathologiemonsters in beeld gebracht met LC-PolScope, en toonden aan dat LC-PolScope en SHG vergelijkbaar zijn in termen van uitlijning en oriëntatiemeting voor sommige soorten weefsel.

Figure 1
Figuur 1: CurveAlign gebruiken om tumor-geassocieerde collageen handtekeningen te vinden uit SHG afbeeldingen van een menselijke borstkanker weefsel microarray (TMA). (A) Overlay afbeelding van een TMA kern met SHG afbeelding (geel) bedekt op de bijbehorende H&E helder veld afbeelding. (B) De regio van belang van (A). (C) Het heldere veldbeeld van (B). (D) De SHG-afbeelding van (B). (F) Het masker dat is gekoppeld aan de heldere veldafbeelding (C). (E) De CurveAlign output overlay afbeelding die de tumorgrenzen (geel) van (F),representatieve vezellocaties en oriëntatie (groene lijnen) toont; de blauwe lijnen worden gebruikt om vezels te associëren met hun dichtstbijzijnde grenzen. De groene pijlen in (B) en (E) tonen de vezels parallel aan de tumorgrens, terwijl de rode pijlen daar de vezels loodrecht op de grens laten zien. De schaalbalk in (A) is gelijk aan 200 μm. Afbeeldingen in (B)–(F) worden in dezelfde schaal weergegeven en de representatieve schaalbalk in (D) is gelijk aan 50 μm. Afkortingen: SHG = tweede harmonische generatie; H&E = hematoxyline en eosine. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Schematische workflow van kwantificering van een fibrillar collageen afbeelding. (A) SHG-afbeelding die moet worden geanalyseerd door CT-FIRE en/of CurveAlign. (B) Overlay beelduitvoer door CT-FIRE. (C) Maskergrens van (A) is een optionele CurveAlign-ingang. (D) Overlay beelduitvoer door CurveAlign. De kleurlijnen in (B) vertegenwoordigen de geëxtraheerde vezels. In (D) geven de groene lijnen de locaties en oriëntaties aan van vezels die zich buiten de grenzen bevinden (gele lijnen) en zich binnen de opgegeven afstand van hun dichtstbijzijnde grenzen bevinden, de rode lijnen die van andere vezels zijn en de blauwe lijnen worden gebruikt om vezels te associëren met hun dichtstbijzijnde grenzen. Afbeeldingen in (A)–(D) worden in dezelfde schaal weergegeven en de representatieve schaalbalk in (A) is gelijk aan 200 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: CT-FIRE regelmatige analyse. (A) Belangrijkste GUI. (B) Uitvoertabel met de overzichtsstatistieken. (C) en (F) tonen respectievelijk de histogrammen van hoek en breedte. (E) Uitvoerafbeelding met de geëxtraheerde vezels (kleurlijnen) bedekt op de originele SHG-afbeelding (D). Afkortingen: GUI = CT = curvelet transform; grafische gebruikersinterface; SHG = tweede harmonische generatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: CT-FIRE ROI management module. (A) Module GUI. (B) ROI na analyse van vier ROC's met verschillende vormen die de vezels binnen elke ROI laten zien. (C) ROI histogrammen van verschillende vezeleigenschappen. Afkortingen: CT = curvelet transformatie; GUI = grafische gebruikersinterface; ROI = interessegebied. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: CT-FIRE geavanceerde nabewerkingsmodule. (A) Module GUI. (B) Metingen van geselecteerde drie vezels. (C) Visualisatie van de geselecteerde drie vezels in (B). (D) Overzichtsstatistieken na toepassing van een lengtedrempel (>60 pixels). (E) Visualisatie van de vezels geselecteerd in (D) met lengte-gebaseerde kleurbalk. Afkortingen: CT = curvelet transformatie; GUI = grafische gebruikersinterface. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 6
Figuur 6: CurveAlign regelmatige analyse. (A) Belangrijkste GUI. (B) Uitvoertabel met de overzichtsstatistieken. (C) Uitvoerafbeelding met de locaties en oriëntatie van representatieve vezels (groene lijnen) en grenzen (gele lijnen) bedekt op de oorspronkelijke SHG-afbeelding, de blauwe lijnen worden gebruikt om vezels te koppelen aan hun dichtstbijzijnde grenzen, rode lijnen tonen de locaties en oriëntaties van vezels binnen een grens of buiten ver weg van de grens (>door de gebruiker opgegeven afstand, bijvoorbeeld 250 pixels hier). (D) Heatmap van de hoeken: rood (> 60 graden), geel (45-60] graden, groen (10, 45] graden. (E)–(F) tonen de hoekverdeling met behulp van respectievelijk histogram en kompasplot. Afkortingen: GUI = grafische gebruikersinterface; SHG = tweede harmonische generatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 7
Figuur 7: CurveAlign ROI management module. (A) De module GUI. (B) Vier geannoteerde rechthoekige ROC's bedekt op de oorspronkelijke afbeelding. (C) ROI-uitvoertabel na analyse. (D) Hoek histogram van elke ROI. Afkortingen: ROI = interessegebied; GUI = grafische gebruikersinterface. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Dit protocol beschrijft het gebruik van CT-FIRE en CurveAlign voor fibrillaire collageenkwantificering en kan worden toegepast op elk beeld met collageenvezels of andere lijnachtige of vezelachtige langwerpige structuren die geschikt zijn voor analyse door CT-FIRE of CurveAlign. Elastine of elastische vezels kunnen bijvoorbeeld op dit platform op een vergelijkbare manier worden verwerkt. We hebben beide tools getest op rekenkundig gegenereerde synthetische vezels21. Afhankelijk van de toepassing moeten gebruikers de analysemodus kiezen die het meest geschikt is voor hun gegevens. De CT-vezelanalysemodus kan curvelets in CT direct gebruiken om de locatie en oriëntatie van glasvezel weer te geven, en deze is gevoelig voor veranderingen in de lokale vezelstructuur. De CT-modus kan worden gebruikt om vezels en hun oriëntatie in complexe omstandigheden te lokaliseren, bijvoorbeeld wanneer het geluidsniveau hoog is, de vezel bochtig is of de variatie in vezeldikte hoog is. Omdat de CT-modus echter alleen de helderste delen van een afbeelding oppikt, zou deze sommige vezels met een lagere intensiteit missen wanneer er een grote variatie in beeldintensiteit is.

Bovendien geeft de CT-modus geen informatie over individuele vezels. In tegenstelling tot de CT-modus berekent de CT-FIRE-modus individuele vezeleigenschappen en kan alle vezels analyseren waarvan de intensiteit boven een opgegeven drempelwaarde ligt. De uitdagingen in verband met de CT-FIRE-modus zijn onder meer: 1) de nauwkeurigheid van een intacte vezelextractie kan worden verminderd of aangetast wanneer er grote variatie is in de intensiteit langs een vezel of de vezeldikte over een afbeelding; en 2) de huidige standaardanalyse is rekenkundig veeleisend zoals vermeld in het protocol. Meer details over de voordelen en beperkingen van deze methoden zijn te zien in onze vorige publicaties20,21.

Wat de nauwkeurigheid van vezeltracering betreft, kan de gebruiker voornamelijk vertrouwen op visuele inspectie om het overlappende beeld te controleren waar de geëxtraheerde vezels of representatieve oriëntaties op de originele afbeelding zijn bedekt. Bovendien kan de gebruiker voor CT-FIRE de geavanceerde nabewerkingsmodule gebruiken om de eigenschappen van geselecteerde afzonderlijke vezels te identificeren en deze te vergelijken met metingen met behulp van andere beeldanalysetools zoals Fiji46. Voor CurveAlign kan de gebruiker de oriëntatie- of uitlijningsresultaten vergelijken met de resultaten die zijn berekend door andere hulpmiddelen zoals OrientationJ16 en CytoSpectre17.

Onder de functies die beschikbaar zijn voor uitvoer door het platform, worden uitlijningsgerelateerde functies het meest gebruikt en zijn ze het meest betrouwbaar en robuust. Om individuele vezelfuncties te gebruiken, moet de gebruiker de extractie van representatieve vezelfuncties bevestigen. Van belang is dat een intacte vezel in sommige omstandigheden in verschillende kortere segmenten kan worden verdeeld, waarmee de gebruiker rekening moet houden bij het selecteren van de vezelanalysemodus of het uitvoeren van verdere statistische analyse. Zelfs wanneer de vezellengte niet direct als vergelijkbare eigenschap kan worden gebruikt, kan de oriëntatie of breedte van vezelsegmenten die tegen hun lengte worden gewogen, nog steeds nuttige informatie aangeven. Wat SHG-beeldvorming betreft, kan numerieke diafragma (NA) van de objectieve lens de detectie van de breedte en lengte van een vezel aanzienlijk beïnvloeden, maar het heeft minder invloed op de oriëntatie- en uitlijningsmetingen. In onze ervaring in SHG-beeldvorming moeten we meestal objectieve lens met 40x vergroting of hoger gebruiken met NA ≥ 1,0 om een robuuste vezeldiktemeting te bereiken.

"Uitlijning" kan op drie verschillende manieren worden geïnterpreteerd: 1) uitlijning ten opzichte van de positieve horizontale richting met de naam "hoek", variërend van 0 tot 180 graden, waarbij hoeken dicht bij 0 een vergelijkbare oriëntatie hebben als hoeken dicht bij 180 graden; 2) uitlijning ten opzichte van een grens met de naam "relatieve hoek", variërend van 0 tot 90 graden, met 0 graden die een vezel aanduidt die evenwijdig aan de grens loopt en 90 die een loodrechte vezel aangeeft; en 3) uitlijning van vezels met betrekking tot elkaar genaamd "uitlijningscoëfficiënt", variërend van 0 tot 1, waarbij 1 perfect uitgelijnde vezels aangeeft en kleinere waarden die willekeuriger verdeelde vezels vertegenwoordigen.

Naast de vezelfuncties die in dit platform zijn berekend, werden ook enkele statistieken op basis van textuuranalyse47,48,49 voorgesteld om ECM-patronen te kwantificeren. Deze textuurgerelateerde functies kunnen in sommige toepassingen een alternatieve of aanvullende descriptor van het ECM bieden. De uitdagingen voor de ontwikkeling van dit type statistieken liggen in de interoperatie van de mogelijke biologische relevantie, gelokaliseerde karakterisering en de nauwkeurigheid van het traceren van individuele vezels.

Om de actieve parameters te optimaliseren en probleemoplossing uit te voeren, kan de gebruiker verwijzen naar de handmatige, relevante publicaties20,21 en de FAQ-zijbalken op de GitHub Wiki-pagina's van de curvelets repository: https://github.com/uw-loci/curvelets/wiki. Voor sommige knoppen kan een functiehint verschijnen om de gebruiker te begeleiden voor de huidige of volgende bewerking wanneer de gebruiker het muispictogram boven een knop beweegt. Volg de informatie in de GUI of het opdrachtvenster om de probleemoplossing uit te voeren.

Om een grote gegevensset te verwerken, wordt de gebruiker aangemoedigd om parallelle computeropties te gebruiken, waarmee de tool meerdere afbeeldingen tegelijkertijd kan verwerken. Een optie is het gebruik van meerdere CPU-kernen indien beschikbaar op de computer die wordt gebruikt. Als alternatief wordt een headless versie van beide APPs geleverd en is deze met succes gecompileerd in het compilatieknooppunt via de server van het condor-gebaseerde50 Center for High Throughput Computing (CHTC) aan de Universiteit van Wisconsin-Madison. De CHTC-workflow voor grootschalige vezelkwantificering is ontwikkeld, getest en met succes gebruikt op echte afbeeldingensets bestaande uit duizenden afbeeldingen. De gebruiker zou de headless MATLAB-functies van zowel CT-FIRE als CurveAlign kunnen aanpassen om kwantificering uit te voeren op andere cloudcomputingsystemen, waaronder commerciële services zoals die van Amazon, Google en Microsoft.

De lopende en toekomstige ontwikkelingsrichtingen omvatten: 1) integratie van deep learning neuraal netwerk om hoogwaardige synthetische collageenvezelbeelden te extraheren of te genereren en de robuustheid en nauwkeurigheid van het fiber tracing-algoritme te verbeteren; 2) integratie van alle modules in een uitgebreid platform en het optimaliseren van de code en documentatie volgens de beste software engineering praktijken; 3) implementatie van alle kernfuncties op een cloud computing platform; 4) verbetering van de workflow van vezelanalyse met behulp van CHTC-service; en 5) verbetering van de functionaliteit van de synthetische vezelgenerator.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

We danken vele bijdragers en gebruikers aan CT-FIRE en CurveAlign door de jaren heen, waaronder Dr. Rob Nowak, Dr. Carolyn Pehlke, Dr. Jeremy Bredfeldt, Guneet Mehta, Andrew Leicht, Dr. Adib Keikhosravi, Dr. Matt Conklin, Dr. Jayne Squirrell, Dr. Paolo Provenzano, Dr. Brenda Ogle, Dr. Patricia Keely, Dr. Joseph Szulczewski, Dr. Suzanne Ponik en aanvullende technische bijdragen van Swati Anand en Curtis Rueden. Dit werk werd ondersteund door financiering van Semiconductor Research Corporation, Morgridge Institute for Research en NIH-subsidies R01CA199996, R01CA181385 en U54CA210190 aan K.W.E.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CT-FIRE Univerity of Wisconsin-Madison N/A open source software available from https://eliceirilab.org/software/ctfire/
CurveAlign University of Wisconsin-Madison N/A open source software available from https://eliceirilab.org/software/curvealign/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nadiarnykh, O., et al. Second harmonic generation imaging microscopy studies of osteogenesis imperfecta. Journal of Biomedical Optics. 12 (5), 051805 (2007).
  2. Kouris, N. A., et al. A nondenatured, noncrosslinked collagen matrix to deliver stem cells to the heart. Regenerative Medicine. 6 (5), 569-582 (2011).
  3. LeBert, D. C., et al. Matrix metalloproteinase 9 modulates collagen matrices and wound repair. Development. 142 (12), 2136-2146 (2015).
  4. Provenzano, P. P., et al. Collagen reorganization at the tumor-stromal interface facilitates local invasion. BMC Medicine. 4 (1), 38 (2006).
  5. Provenzano, P. P., et al. Collagen density promotes mammary tumor initiation and progression. BMC Medicine. 6 (1), 1 (2008).
  6. Conklin, M. W., et al. Aligned collagen is a prognostic signature for survival in human breast carcinoma. The American Journal of Pathology. 178 (3), 1221-1232 (2011).
  7. Alkmin, S., et al. Migration dynamics of ovarian epithelial cells on micro-fabricated image-based models of normal and malignant stroma. Acta Biomaterialia. 100, 92-104 (2019).
  8. Campbell, K. R., Campagnola, P. J. Assessing local stromal alterations in human ovarian cancer subtypes via second harmonic generation microscopy and analysis. Journal of Biomedical Optics. 22 (11), 116008 (2017).
  9. Best, S. L., et al. Collagen organization of renal cell carcinoma differs between low and high grade tumors. BMC Cancer. 19 (1), 490 (2019).
  10. Drifka, C. R., et al. Periductal stromal collagen topology of pancreatic ductal adenocarcinoma differs from that of normal and chronic pancreatitis. Modern Pathology. 28 (11), 1470-1480 (2015).
  11. Campagnola, P. J., et al. Three-dimensional high-resolution second-harmonic generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues. Biophysical Journal. 82 (1), 493-508 (2002).
  12. Arun Gopinathan, P., et al. Study of collagen birefringence in different grades of oral squamous cell carcinoma using picrosirius red and polarized light microscopy. Scientifica. 2015, 1-7 (2015).
  13. Keikhosravi, A., et al. Quantification of collagen organization in histopathology samples using liquid crystal based polarization microscopy. Biomedical Optics Express. 8 (9), 4243-4256 (2017).
  14. Quan, B. D., Sone, E. D. Cryo-TEM analysis of collagen fibrillar structure. Methods in Enzymology. 532, 189-205 (2013).
  15. Boudaoud, A., et al. FibrilTool, an ImageJ plug-in to quantify fibrillar structures in raw microscopy images. Nature Protocols. 9 (2), 457-463 (2014).
  16. Rezakhaniha, R., et al. Experimental investigation of collagen waviness and orientation in the arterial adventitia using confocal laser scanning microscopy. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 11 (3-4), 461-473 (2012).
  17. Kartasalo, K., et al. CytoSpectre: a tool for spectral analysis of oriented structures on cellular and subcellular levels. BMC Bioinformatics. 16 (1), 1 (2015).
  18. Bredfeldt, J. S., et al. Computational segmentation of collagen fibers from second-harmonic generation images of breast cancer. Journal of Biomedical Optics. 19 (1), 016007 (2014).
  19. Bredfeldt, J. S., et al. Automated quantification of aligned collagen for human breast carcinoma prognosis. Journal of Pathology Informatics. 5 (1), 28 (2014).
  20. Liu, Y., Keikhosravi, A., Mehta, G. S., Drifka, C. R., Eliceiri, K. W. Methods for quantifying fibrillar collagen alignment. Methods in Molecular Biology. 1627, 429-451 (2017).
  21. Liu, Y., et al. Fibrillar collagen quantification with curvelet transform based computational methods. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 198 (2020).
  22. Conklin, M. W., et al. Collagen alignment as a predictor of recurrence after ductal carcinoma in situ. Cancer Epidemiology and Prevention Biomarkers. 27 (2), 138-145 (2018).
  23. Jallow, F., et al. Dynamic interactions between the extracellular matrix and estrogen activity in progression of ER+ breast cancer. Oncogene. 38 (43), 6913-6925 (2019).
  24. Smirnova, T., et al. Serpin E2 promotes breast cancer metastasis by remodeling the tumor matrix and polarizing tumor associated macrophages. Oncotarget. 7 (50), 82289 (2016).
  25. Fanous, M., Keikhosravi, A., Kajdacsy-Balla, A., Eliceiri, K. W., Popescu, G. Quantitative phase imaging of stromal prognostic markers in pancreatic ductal adenocarcinoma. Biomedical Optics Express. 11 (3), 1354-1364 (2020).
  26. Jiménez-Torres, J. A., Virumbrales-Muñoz, M., Sung, K. E., Lee, M. H., Abel, E. J., Beebe, D. J. Patient-specific organotypic blood vessels as an in vitro model for anti-angiogenic drug response testing in renal cell carcinoma. EBioMedicine. 42, 408-419 (2019).
  27. Govindaraju, P., Todd, L., Shetye, S., Monslow, J., Puré, E. CD44-dependent inflammation, fibrogenesis, and collagenolysis regulates extracellular matrix remodeling and tensile strength during cutaneous wound healing. Matrix Biology. 75, 314-330 (2019).
  28. Henn, D., et al. Cryopreserved human skin allografts promote angiogenesis and dermal regeneration in a murine model. International Wound Journal. 17 (4), 925-936 (2020).
  29. Rico-Jimenez, J., et al. Non-invasive monitoring of pharmacodynamics during the skin wound healing process using multimodal optical microscopy. BMJ Open Diabetes Research and Care. 8 (1), 000974 (2020).
  30. Israel, J. S., et al. Quantification of collagen organization after nerve repair. Plastic and Reconstructive Surgery Global Open. 5 (12), (2017).
  31. Rentchler, E. C., Gant, K. L., Drapkin, R., Patankar, M., Campagnola, P. J. Imaging collagen alterations in STICs and high grade ovarian cancers in the fallopian tubes by second harmonic generation microscopy. Cancers. 11 (11), 1805 (2019).
  32. Hu, C., et al. Imaging collagen properties in the uterosacral ligaments of women with pelvic organ prolapse using spatial light interference microscopy (SLIM). Frontiers in Physics. 7, 72 (2019).
  33. Guirado, E., et al. Disrupted protein expression and altered proteolytic events in hypophosphatemic dentin can be rescued by dentin matrix protein 1. Frontiers in Physiology. 11, 82 (2020).
  34. Kiss, N., et al. Quantitative analysis on ex vivo nonlinear microscopy images of basal cell carcinoma samples in comparison to healthy skin. Pathology & Oncology Research. 25 (3), 1015-1021 (2019).
  35. Lewis, D. M., et al. Collagen fiber architecture regulates hypoxic sarcoma cell migration. ACS Biomaterials Science & Engineering. 4 (2), 400-409 (2018).
  36. Moura, C. C., Bourdakos, K. N., Tare, R. S., Oreffo, R. O., Mahajan, S. Live-imaging of Bioengineered Cartilage Tissue using Multimodal Non-linear Molecular Imaging. Scientific Reports. 9 (1), 1-9 (2019).
  37. Murtada, S. I., et al. Paradoxical aortic stiffening and subsequent cardiac dysfunction in Hutchinson-Gilford progeria syndrome. Journal of The Royal Society Interface. 17 (166), 0066 (2020).
  38. Nichol, R. H., Catlett, T. S., Onesto, M. M., Hollender, D., Gómez, T. M. Environmental elasticity regulates cell-type specific RHOA signaling and neuritogenesis of human neurons. Stem Cell Reports. 13 (6), 1006-1021 (2019).
  39. Pointer, K. B., et al. Association of collagen architecture with glioblastoma patient survival. Journal of Neurosurgery. 126 (6), 1812-1821 (2016).
  40. Razavi, M. S., Leonard-Duke, J., Hardie, B., Dixon, J. B., Gleason, R. L. Axial stretch regulates rat tail collecting lymphatic vessel contractions. Scientific Reports. 10 (1), 1-11 (2020).
  41. Xue, Y., et al. Valve leaflet-inspired elastomeric scaffolds with tunable and anisotropic mechanical properties. Polymers for Advanced Technologies. 31 (1), 94-106 (2020).
  42. Zhou, Z. H., et al. Reorganized collagen in the tumor microenvironment of gastric cancer and its association with prognosis. Journal of Cancer. 8 (8), 1466 (2017).
  43. Zinn, A., et al. The small GTPase RhoG regulates microtubule-mediated focal adhesion disassembly. Scientific Reports. 9 (1), 1-15 (2019).
  44. Zwaans, B. M., et al. Radiation cystitis modeling: A comparative study of bladder fibrosis radio-sensitivity in C57BL/6, C3H, and BALB/c mice. Physiological Reports. 8 (4), (2020).
  45. Devine, E. E., Liu, Y., Keikhosravi, A., Eliceiri, K. W., Jiang, J. J. Quantitative second harmonic generation imaging of leporine, canine, and porcine vocal fold collagen. The Laryngoscope. 129 (11), 2549-2556 (2019).
  46. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  47. Zeitoune, A. A., et al. Epithelial ovarian cancer diagnosis of second-harmonic generation images: A semiautomatic collagen fibers quantification protocol. Cancer Informatics. 16, (2017).
  48. Wershof, E., et al. Matrix feedback enables diverse higher-order patterning of the extracellular matrix. PLoS Computational Biology. 15 (10), 1007251 (2019).
  49. Mostaço-Guidolin, L. B., et al. Fractal dimension and directional analysis of elastic and collagen fiber arrangement in unsectioned arterial tissues affected by atherosclerosis and aging. Journal of Applied Physiology. 126 (3), 638-646 (2019).
  50. Thain, D., Tannenbaum, T., Livny, M. Distributed computing in practice: the Condor experience. Concurrency and Computation: Practice and Experience. 17 (2-4), 323-356 (2005).

Tags

Bio-engineering tumor micromilieu extracellulaire matrix kanker collageenvezel organisatie fibrillar collageen kwantificering curvelet transformatie tweede harmonische generatie microscopie beeldanalyse software
Het kwantificeren van fibrillar collageen organisatie met Curvelet transform-based tools
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Liu, Y., Eliceiri, K. W. Quantifying … More

Liu, Y., Eliceiri, K. W. Quantifying Fibrillar Collagen Organization with Curvelet Transform-Based Tools. J. Vis. Exp. (165), e61931, doi:10.3791/61931 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter