Summary
在这里，我们提出了一个协议，使用基于曲线转换的开源 MATLAB 软件工具，用于量化正常组织和患病组织的细胞外基质中的纤维状胶原蛋白组织。此工具可应用于胶原纤维或其他类型的线状结构的图像。
Abstract
纤维状胶原蛋白是突出的细胞外基质 （ECM） 成分，其拓扑变化已证明与乳腺癌、卵巢癌、肾脏癌和胰腺癌等多种疾病的进展有关。免费提供的光纤量化软件工具主要侧重于光纤对齐或方向的计算，它们受到手动步骤要求、嘈杂背景中光纤边缘检测不准确或缺乏本地化特征特征等限制。本文中描述的胶原纤维定量工具的特点是使用曲线变换 （CT） 启用的最佳多尺度图像表示。这种算法方法允许去除纤维胶原蛋白图像中的噪声，并增强光纤边缘，直接从光纤中提供位置和方向信息，而不是使用从其他工具获得的间接像素或窗口信息。此基于 CT 的框架包含两个单独但链接的包，名为"CT-FIRE"和"曲线对齐"，可在全球、感兴趣区域 （ROI） 或单个光纤基础上量化光纤组织。这个量化框架已经开发了十多年，现在已经发展成为一个全面和用户驱动的胶原蛋白量化平台。使用此平台，可以测量多达 30 种光纤功能，包括长度、角度、宽度和直度等单个纤维特性，以及密度和对齐度等批量测量。此外，用户可以测量光纤角度相对于手动或自动分割的边界。该平台还提供了多个附加模块，包括用于投资回报率分析、自动边界创建和后处理的模块。使用此平台不需要事先的编程或图像处理经验，它可以处理包括数百或数千张图像在内的大型数据集，从而能够高效量化用于生物或生物医学应用的胶原纤维组织。
Introduction
纤维胶原蛋白是突出的结构 ECM 成分。他们的组织变化影响组织功能，并可能与许多疾病的进展有关，从骨质疏松症1，心脏功能障碍2，伤口愈合3到不同类型的癌症，包括乳腺癌4，5，6，卵巢7，8，肾9，胰腺癌10。许多已建立的成像模式可用于可视化纤维胶原蛋白，如第二谐波一代显微镜11，污渍或染料与明亮的场或荧光显微镜或偏振光显微镜12，液晶基极化显微镜（LC-PolScope）13，电子显微镜14。随着纤维胶原蛋白组织的重要性越来越明显，而且这些方法的使用也越来越多，改进胶原纤维分析方法的需求也越来越大。
有许多努力来开发自动测量纤维状胶原蛋白的计算方法。免费提供的软件工具主要侧重于光纤对齐或方向的计算，采用第一个衍生或结构张力像素15，16，或傅立业基于转换的频谱分析图像磁贴17。所有这些工具都受到限制，例如手动步骤的要求、在嘈杂的背景中检测光纤边缘的不准确性或缺乏本地化特征特征。
与其他免费提供的开源免费软件工具相比，本协议中描述的方法使用CT——一种最佳、多尺度、定向的图像表示方法——去除纤维胶原蛋白图像中的噪声，增强或跟踪光纤边缘。有关位置和方向的信息可以直接从光纤提供，而不是使用间接像素或窗口信息来推断光纤组织的指标。这种基于CT的框架18、19、20、21可以在全球、ROI或光纤的基础上量化光纤组织，主要通过两个单独但相互关联的包，分别命名为"CT-FIRE"18、21和"曲线对齐"19、21。就软件的实现而言，在 CT-FIRE 中，多比例的 CT 系数可用于重建增强边缘和降低噪音的图像。然后，将单个光纤提取算法应用于 CT 重建图像中，以跟踪光纤以查找其代表性的中心点，将光纤分支从中心点延伸，并将光纤分支连接起来，形成光纤网络。在 Curve 对齐中，用户指定比例的 CT 系数可用于跟踪本地光纤方向，其中提取曲线小径的方向和位置并进行分组，以估计相应位置的光纤方向。由此产生的量化框架已经开发了十多年，在功能、用户界面和模块化等许多方面都取得了长足的发展。例如，此工具可以可视化局部光纤方向，并允许用户测量多达 30 个光纤功能，包括长度、角度、宽度和直度等单个光纤特性，以及密度和对齐等批量测量。此外，用户可以测量光纤角度相对于手动或自动分割的边界，例如，在基于图像的生物标志物发展在乳腺癌22和胰腺癌研究10发挥重要作用。此平台提供多个功能模块，包括用于投资回报率分析、自动边界创建和后处理的功能模块。投资回报率模块可用于注释不同形状的投资回报率，并进行相应的投资回报率分析。作为应用示例，自动边界创建模块可用于用第二谐波生成 （SHG） 图像注册血氧林和 eosin （H&E） 亮场图像，并从注册的 H&E 图像中生成肿瘤边界的图像掩膜。后处理模块可以帮助处理和集成来自单个图像的输出数据文件，以便进行可能的统计分析。
此量化平台不需要事先的编程或图像处理经验，可以处理包括数百或数千张图像在内的大型数据集，从而能够高效量化用于生物或生物医学应用的胶原蛋白组织。它已被包括我们在内的世界各地许多研究人员广泛应用于不同的研究领域。有四个主要出版物CT-FIRE和曲线对齐18，19，20，21，其中前三个已被引用272次（根据谷歌学者2020-05-04年）。对引用该平台（CT-FIRE 或曲线对齐）的出版物的审查表明，大约有 110 篇期刊论文直接用于分析，其中大约 35 篇出版物与我们的小组合作，其他出版物（约 75 篇）由其他组撰写。例如， 该平台用于以下研究：乳腺癌22，23，24，胰腺癌10，25，肾癌9，26，伤口愈合3，27，28，29，30，卵巢癌8，31，7，子宫韧带32，缺氧登丁3 3、基底细胞癌34例、缺氧肉瘤35例、软骨组织36例、心脏功能障碍37例、神经元38例、胶质母细胞瘤39例、淋巴收缩40例、纤维化41例、胃癌42例、微管癌43例、膀胱纤维化44例。图 1演示了 Curve 对齐的癌症成像应用，从 SHG 图像中查找乳腺癌19的肿瘤相关胶原蛋白特征。图 2描述了此平台的典型示意图工作流程。虽然这些工具已经审查技术18，19，21，和常规协议20对齐分析曲线对齐也可用，一个视觉协议，显示所有的基本功能可能是有用的。如本文所示，可视化协议将促进使用此平台的学习过程，并更有效地解决用户可能提出的问题和问题。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
注：此协议描述了使用 CT-FIRE 和曲线对齐进行胶原蛋白量化。这两种工具具有互补但不同的主要目标，并在一定程度上联系在一起。CT-FIRE 可以从曲线对齐接口启动，以执行大多数操作，但高级处理后和投资回报率分析除外。对于CT-FIRE的完整操作，应单独启动。
1. 图像收集和图像要求
注：该工具可以处理任何图像文件与线状结构可读的MATLAB，无论用于收集它的成像方式。
- 使用 8 位灰度作为图像类型，因为默认运行参数基于此格式。
注：SHG成像是一种广泛使用的无标签和高分辨率纤维状胶原蛋白成像方法。19日 乳腺癌研究的SHG图像将在这里用于演示。
2. 软件安装和系统要求
注：独立版本和源代码版本均免费提供。源代码版本需要安装完整的 MATLAB，包括信号处理、图像处理、统计分析和并行计算的工具箱。要运行源代码版本，所有必要的文件夹（包括来自第三方源的一些文件夹）应添加到 MATLAB 路径中。建议大多数用户使用独立应用程序 （APP），这需要安装指定版本的免费 MATLAB 编译器运行时间 （MCR）。安装和启动 APP 的过程如下。
- 分别从 https://eliceirilab.org/software/ctfire/ 和 https://eliceirilab.org/software/curvealign/ 下载 CT-FIRE 版本 3.0 （CTF3.0） 和曲线对齐版本 5.0 （CA5.0） APP 包。
注：每个包都包含独立的 APP、手动和测试图像。 - 按照上述网站的详细要求和安装说明安装MATLAB MCR 2018b。
- 启动应用程序。
- 对于 Windows 64 位系统，请双击 APP 图标以启动它。
- 对于 Mac 系统，请按照以下步骤启动它：右键单击 APP（点击）|显示包内容|内容|马科斯|启动器（右键单击并选择打开）。
注：其他详细信息可在 2.1 中列出的软件网站上看到。
3. 带CT-FIRE的单个纤维提取
注意：CT-FIRE 使用 CT 来除臭图像，增强纤维边缘，然后使用光纤提取算法跟踪单个纤维。长度、角度、宽度和直度用于计算单个纤维。
- 单个图像或多个图像上的 CT-FIRE
- 启动 2.3 中描述的 APP。
- 单击主图形用户界面（GUI，图3A）中的"打开文件"按钮，然后从提示窗口中选择一个或多个图像/或图像堆栈。使用适合操作系统的技术在对话中选择多个图像（例如，在 Windows 中，在选择多个文件时保持CTRL）。
注：如果选择两个或两个以上的图像文件，所有图像必须使用相同的运行参数进行分析。确保所有图像都是在相同或类似的条件下获得的。 - 通过检查右上角的平行复选框以进行多个图像分析，选择 并行 计算选项。
- 对于图像堆栈，请在文件列表框下移动切片滑块以选择要分析的切片。
- 设置运行属性。使用默认参数对某些图像进行初始分析。如果使用默认参数，请跳到步骤 3.1.6。要设置不同的参数，请单击参数面板中的更新按钮。按照手册正确调整参数。
注：最常调整的参数包括背景阈值（thresh_im2）和核搜索半径（s_xlinkbox）。如果背景噪声水平较高，则将 thresh_im2 设置为更大的值： s_xlinkbox 与纤维的平均半径相关联，为检测稀薄纤维设定了较小的值。 - 单击 "运行 "按钮。
注：进度信息将同时显示在信息窗口和命令窗口中。分析完成后，将显示输出表（图 3B）。 - 单击输出表中的任何项目，查看图像的光纤测量直方图（图 3C 和 图 3F），包括长度、宽度、角度和直度。
注：还将显示覆盖在原始图像上的光纤图像（图3E）。 - 检查图像文件夹下方名为 ctFIREout 的子折叠器，了解输出文件，包括叠加的图像".tiff"文件、".csv"文件和".mat"文件。
- CT-火区（ROI）分析
- 使用投资回报率管理器的投资回报率注释
- 单击主GUI（图3A）中的"打开文件"按钮以加载一个或多个图像。
- 选择要在文件列表中注释的图像。
- 在投资回报率选项面板的下拉菜单中选择投资回报率管理器。
- 单击RUN按钮启动投资回报率管理器模块（图3A）。
- 在 ROI 经理 GUI （图 4A）中，单击下拉 ROI 菜单 （d）下方的下拉菜单，逐一绘制 ROI。
注：ROI 形状可以是矩形、徒手、椭圆、多边形或指定矩形。按照屏幕上的说明进行绘制、保存和退出投资回报率注释。 - 选择绘制 ROI 的方法后，将原始图像上显示的黄色矩形拖动到所需位置，然后单击 "保存 ROI" 按钮或 按键将 此 ROI 添加到 ROI 列表中。此投资回报率将自动命名。
- 通过将以前的投资回报率拖入新位置来绘制新的投资回报率，并将其保存在 3.2.1.6 中，或重复步骤 3.2.1.5-3.2.1.6 以绘制新的投资回报率。
- 按 x 或在 ROI 形状下拉菜单中选择 新的 ROI？ 以退出 ROI 注释。
- 检查复选框 显示全部 和 标签 ，以显示列表中所有定义的 ROI 及其名称在原始图像上。
- 选择 ROI 列表中的 ROI 以执行基本 ROI 操作，包括重命名 ROI、删除 ROI、保存 ROI 文本、从文本中加载 ROI、保存投资回报率面膜、从掩体中加载投资回报率以及合并投资回报率。
- 在原始图像文件夹下名为 ROI_management 的子folder 中，检查作为".mat"文件保存的 ROI 管理器的输出文件。
- 要注释打开的文件列表中的另一个图像，请重复步骤 3.2.1.2-3.2.1.11。
- 注释完成后，关闭投资回报率管理器GUI，然后通过单击主GUI中的 重置 按钮重置主GUI。
- 投资回报率管理器中单个图像的投资回报率分析
- 如果进行全图像 CT-FIRE 分析并将结果保存在默认目录中，请单击 ROI 列表中的一个或多个 ROI，然后单击 ctFIRE 投资回报率分析器 按钮以启动后 ROI 分析模块。
注：结果将自动保存在位于 [[图像文件夹]\CTF_ROI[个人]ROI_post_analysis的子folder中。 - 在弹出窗口中，单击"检查光纤"按钮以显示所选 ROI 中的光纤（图 4B）。
- 单击 绘图统计 以显示每个投资回报率的直方图（图 4C）。将显示相应的输出数字。
- 如果没有进行完整的图像 CT-FIRE 分析，请单击投资回报率列表中的一个或多个投资回报率，然后单击 ROI 按钮上的应用 ctFIRE， 直接将 CT-FIRE 分析应用于选定的 ROI。
- 按照提示窗口中的说明运行分析。
注：运行 CT-FIRE 的参数通过主 GUI 传递，用户可以根据需要更新步骤 3.1.5 中描述的运行参数。分析完成后，纤维测量的汇总统计将显示在输出表中。结果将自动保存在位于 [[图像文件夹]\CTF_ROI[个人]ROI_analysis\的子折叠器中。
- 如果进行全图像 CT-FIRE 分析并将结果保存在默认目录中，请单击 ROI 列表中的一个或多个 ROI，然后单击 ctFIRE 投资回报率分析器 按钮以启动后 ROI 分析模块。
- 使用投资回报率分析仪对多个图像进行投资回报率分析
- 按照 3.2.1 中的步骤为要分析的图像注释 ROI。
- 单击 "打开文件" 按钮，打开一个或多个图像。
- 若要在有完整图像分析结果时运行 ROI 后分析，请单击 "运行选项" 面板中的下拉菜单，并选择 选项 CTF 后 ROI 分析仪。
- 单击 "运行" 按钮以运行所有加载图像的 ROI 分析。
- 检查 GUI 底部的消息窗口和命令窗口中显示的进度信息。
- 分析完成后，检查输出表中显示的每个投资回报率的汇总统计数据。
注：详细的输出文件自动保存在位于 \\[图像文件夹]\CTF_ROI\batch=ROI_post_analysis\的子折叠器中。 - 要在无法提供完整图像分析结果时运行直接分析，请按照步骤 3.2.3.1-3.2.3.6 执行，但步骤 3.2.3.3 除外，请选择 选项 CTF ROI 分析r：在步骤 3.2.3.4 中，在单击 "运行" 按钮之前，更新步骤 3.1.5 中描述的运行参数。单击 RUN 按钮后，在提示对话窗口中，在矩 形投资回报率 和 任何形状的 ROI 掩膜之间进行选择。
注：如果所有注释的 ROI 都是矩形的，用户可以选择"矩形 ROI"。在第 3.2.3.6 步中，ROI 分析结果保存在位于 [[[图像文件夹] CTF_ROI]batch=ROI_analysis\的子folder 中。
- 使用投资回报率管理器的投资回报率注释
- 带CT-火的后处理
注：在 3.1 中描述的常规 CT-FIRE 分析之后，用户可以执行进一步的后处理。无需再次运行耗时的光纤提取，3.3.1 中描述的常规后处理可以更新一些基本输出图属性，而 3.3.2 中描述的高级后处理可以可视化单个纤维及其属性，在所有四个光纤属性之间执行复杂的阈值，生成所选光纤的摘要统计数据，并使用自定义的彩色地图可视化所选的光纤。- 带CT-FIRE的常规后处理
- 启动 CT-FIRE 应用，或在其他操作后单击重置按钮以初始化 CT-FIRE 主 GUI （图 3A）。
- 检查主GUI顶部的 。mat 复选框。
- 单击 "打开文件" 按钮以选择 ct-FIRE 输出。mat 文件在 ctFIREout 子折叠器中。
注：如果选择多个文件，将自动检查 批次 复选框。相应的图像的文件名称将显示在框列表中。 - 更新 输出图控制 面板中的选项。
- 保留 输出选项中的默认选项，这将确保所有输出文件将根据设置在 3.3.1.4 中的新一组参数进行更新。
- 单击 后处理 按钮。在主 GUI 底部的消息窗口以及命令窗口中检查进度信息。
- 分析完成后，单击输出表中的任何项目，查看图像中纤维测量的直方图，包括长度、宽度、角度和直度。
注：新的输出文件将覆盖 ctFIREout 子折叠器中的旧文件。
- CT-火的先进后处理
- 启动 CT-FIRE 应用，或在其他操作后单击重置按钮以初始化 CT-FIRE 主 GUI （图 3A）。
- 查看主GUI顶部的OUT.adv复选框（图 3A）。
- 点击 后处理 按钮，启动名为"分析模块"（图5A）的高级后处理GUI。
- 单击" 选择文件" 按钮以选择图像。
- 单击 可视化光纤 按钮，根据 Tab 图中的" 原始纤维"标签输入光纤编号。
注：所选纤维的测量结果将显示在输出表（图 5B），相应的纤维将覆盖在名为 "测量纤维 "（图 5C）的标签图中显示的原始图像上。 - 单击 "确认/更新" 按钮以移动到阈值操作。
- 检查阈值框以启用阈值设置。
- 从下拉菜单中选择四个阈值选项之一。
- 在 阈值 面板中输入所需的阈值，以获得一个或多个光纤属性。
- 单击 "立即阈值" 按钮以应用上述阈值条件。
- 检查以 指标可视化 结尾的提示图，查看所选的光纤覆盖在原始图像上，并带有 图 5E中所示的定制彩色地图。
- 重复步骤 3.3.2.9-3.3.2.11 以设置理想的阈值。
- 单击 "保存光纤" 按钮以保存选定的光纤信息。
注：相应的选定纤维将显示在名为 "阈值后"的标签图中。 - 单击 "生成"统计 按钮，然后单击弹出窗口中的 "确定 "按钮以生成摘要统计。
注：输出表（图5D）将显示所选纤维的平均值。所选光纤的其他统计数据将保存在 Excel 文件中，其位置显示在此 GUI 底部 的状态 窗口中。 - 若要将选定的单个光纤信息包含在输出文件中，请在单击"确定"按钮之前检查生成表以获取原始数据框。
- 要将多个图像的结果（第 3.3.2.4 步）组合在一起，请选中 批次模式 框或 堆栈模式 ，并选择要分析的多个图像或堆栈：跳过步骤3.3.2.5-3.3.2.6。在步骤 3.3.2.8-3.3.2.9 中，设置阈值条件，但随着 按钮阈值现在 和 保存光纤 被禁用，跳过步骤 3.3.2.10-3.3.2.13：最后，按照步骤 3.3.2.14 中的说明生成所选纤维的摘要统计和单个纤维特性。
- 带CT-FIRE的常规后处理
4. 带曲线对齐的光纤分析
注：曲线对齐最初是为了自动测量光纤与用户定义的边界有关的角度而开发的。除了通过加载 CT-FIRE 提取的单个光纤信息或直接使用曲线的局部方向进行相对角度测量之外，曲线对齐的当前版本还可用于对密度和对齐功能进行批量评估。Curve对齐计算多达30个与全球或本地特征相关的功能，主要包括密度和对齐度，以及CT-FIRE作为光纤跟踪方法时的单个光纤特性。
- 带曲线的光纤分析
- 启动 2.3 中描述的 APP。
- 如果已执行其他操作，请单击 "重置 "按钮，将应用重置为初始状态。
- 在主GUI（图6A）中，检查 光纤分析方法 选项，以确保选择 CT（ 默认选项）。
注：在此模式下，CT 在图像上执行，每个曲线的方向表示相应位置的光纤方向。 - 单击 "边界法 "下拉菜单，然后从以下下拉菜单选项中选择边界处理模式：无边界、CSV 边界和 TIFF 边界。
注意：如果不需要边界，请跳过此步骤。有关如何计算与边界有关光纤角度的参考 4.3。 - 单击主 GUI 中的"获取图像"按钮（图 6A），然后从提示窗口选择一个或多个图像/或图像堆栈。使用适合操作系统的技术在对话中选择多个图像（例如，在 Windows 中，在选择多个文件时保持CTRL）。
注：如果选择两个或两个以上的图像文件，所有图像必须使用相同的运行参数进行分析。确保所有图像都是在相同或类似的条件下获得的。 - 对于图像堆栈，请在文件列表框下移动切片滑块以选择要分析的切片。
- 输入 鳕鱼的分数以保持。此值是用于光纤分析的最大 CT 系数的一小部分。
注意：如果图像在光纤强度或对比度方面有较大差异，则注释感兴趣的区域，甚至对光纤分析进行对比，因为此模式仅检测图像中最亮的纤维。此外，图像大小越大，为该分数设置较小的值。 - 将 输出选项 中的所有参数和其他参数保留在 高级 选项中作为默认值：输出文件可能需要在其他未来的操作。
- 单击主GUI底部的运行按钮（图6A）。
注：进度信息将显示在底部以绿色突出显示的消息窗口中。完成流程后，每个图像的一些摘要统计数据将显示在输出表（图6B），并且所有输出文件将自动保存在原始图像目录中名为 CA_Out 的子文件夹中。 - 单击输出表（图 6B）中的任何项目，查看光纤角度的直方图（图 6E）或指南针图（图 6F）。
注：还将显示对齐或角度的叠加图像（图6C）和热图（图6D）。 - 单击 "重置 "按钮以运行其他操作，或关闭主GUI以退出应用。
- 带CT-FIRE的单个光纤分析
注：该过程与第 4.1 节中描述的程序相同，但步骤 4.1.3 中，选择 CT-FIRE 相关光纤分析模式，跳过步骤 4.1.7，因为它不适用，在 CT-FIRE 模式下被禁用。具体来说，在第 4.1.3 步中，从以下三种基于 CT-FIRE 的单个光纤分析方法中选择一种：- 选择 CT-FIRE纤维 使用纤维中心点和纤维角度来表示纤维。
注意：此选项不考虑纤维长度沿线纤维方向的变化。 - 选择 CT-FIRE 端点 ，使用纤维的两个端点和相应的纤维角度来表示纤维。
注：与 4.2.1 相比，此选项使用两个位置来表示纤维而不是一个（纤维的中心点）。 - 选择 CT-FIRE 段 ，使用光纤片段表示光纤。
注：每个段的长度相等（在 CT-FIRE 中默认设置为 5 像素），以及其方向和位置，这反映了光纤整个长度的方向变化。此选项将最耗时，但将是三种基于 CT-FIRE 的光纤分析方法中的最佳选择，以跟踪弯曲纤维局部方向的变化。
- 选择 CT-FIRE纤维 使用纤维中心点和纤维角度来表示纤维。
- 与边界的相对对齐分析
注：与第4.2和4.3节中描述的无边界条件的常规分析相比，与边界条件的相对对齐分析需要以下几点：- 在第 4.1.3 步中，选择蒂夫边界条件。
注：用户需要每个图像或每个堆栈的相应边界文件。按照屏幕上的说明手动注释 CSV（ 基于逗号分离值格式、x-y 坐标）边界文件或 Tiff 边界文件。曲线对齐中创建的边界文件将根据手册中描述的文件目录和文件命名约定自动保存。如果提供了一对 H&E 亮场和 SHG 图像，请使用第 4.4 节中描述的自动边界创建模块生成边界文件。 - 在 主参数面板中 ，输入距离最近的边界仅在此距离范围内评估光纤的距离。
- 在 输出选项 面板中，检查边界关联框 Bdry Assoc 以可视化与纤维、纤维段或曲线带相关的边界上的点。
- 在第 4.1.3 步中，选择蒂夫边界条件。
- 自动创建边界
- 启动 2.3 中描述的 APP。
- 如果已执行其他操作，请单击 "重置 "按钮，将应用重置为初始状态。
- 单击 BD 创建 按钮以启动自动边界创建模块。
- 按照屏幕上的说明/线索，根据一对 H&E 明亮字段和 SHG 图像创建一个或多个图像的边界文件。
- 关闭模块窗口，或单击主GUI（图6A）中的重置按钮以退出此模块。
- 曲线对齐兴趣分析区域
- 使用投资回报率管理器的投资回报率注释
- 单击主GUI（图6A）中的获取图像按钮以加载一个或多个图像。
- 选择要在文件列表中注释的图像。
- 单击投资回报率管理器以启动投资回报率管理器模块（图 7A）。
- 按照步骤 3.2.1.5-3.2.1.13 在第 3.2.1 节。
- 投资回报率管理器中单个图像的投资回报率分析
- 如果已进行完整图像曲线对齐分析，并将结果保存在默认目录中，请单击 ROI 列表中的一个或多个 ROI，然后单击 CA 投资回报率分析器 按钮以运行后 ROI 分析。
注：分析完成后，汇总统计将显示在输出表（图7C）以及显示角度分布的直方图图（图7D）中。 - 单击输出表中的任何项目，可视化给定 ROI （图7B）中的纤维以及纤维角度的直方图。
- 检查保存在 位于[[[图像文件夹]\CA_ROI[个人]ROI_post_analysis\的子折叠中保存的输出文件。
- 如果没有进行全图像 CA 分析，请单击 ROI 列表中的一个或多个投资回报率，然后单击 ROI 按钮上的应用 CA， 直接将 CA 分析应用于选定的 ROI。按照提示窗口中的说明运行分析。
注：运行 CA 分析的参数通过主 GUI 传递：根据需要更新步骤 4.1.7 中描述的运行参数。分析完成后，纤维测量的汇总统计结果将显示在输出表中。结果将自动保存在位于 [[图像文件夹]\CA_ROI[个人]ROI_analysis的子folder中。
- 如果已进行完整图像曲线对齐分析，并将结果保存在默认目录中，请单击 ROI 列表中的一个或多个 ROI，然后单击 CA 投资回报率分析器 按钮以运行后 ROI 分析。
- 使用投资回报率分析仪对多个图像进行投资回报率分析
- 按照 4.5.1 中的步骤为要分析的图像注释 ROI。
- 单击 "获取图像" 按钮，打开一个或多个图像。
- 要在有完整图像分析结果时运行 ROI 后分析，请单击ROI 分析按钮并选择处理后的选项 ROI。
- 检查 GUI 底部的消息窗口和命令窗口中显示的进度信息。
- 分析完成后，检查输出表中显示的每个投资回报率的汇总统计数据。
注：详细的输出文件自动保存在位于 \\[图像文件夹]\CA_ROI\batch\ROI_post_analysis\的子folder中。 - 要在无法获得完整图像分析结果时使用 CT 模式运行直接分析，请按照步骤 4.5.3.1-4.5.3.5 执行，但以下更改除外：通过选择带任何形状的 ROI的裁剪矩形 ROI 或面膜上的 CA 选项 CA 来修改步骤 4.5.3.3。如果所有注释的 ROI 都是矩形形状，请选择矩形投资回报率选项。步骤 4.5.3.2 之后，更新 4.1.7 中描述的运行参数。
注：投资回报率分析结果将保存在位于 [[图像文件夹]CA_ROI\batch=ROI_analysis\的子折叠器中。
- 使用投资回报率管理器的投资回报率注释
- 曲线对齐处理后
- 启动第 2.3 节中描述的 APP。
- 如果已执行其他操作，请单击 "重置 "按钮，将应用重置为初始状态。
- 单击 "后处理 "按钮以启动后处理模块。
- 按照屏幕上的说明/线索，结合来自不同图像的输出功能或值。
- 关闭模块窗口，或单击主GUI（图6A）中的重置按钮以退出此模块。
5. 估计运行时间
- 等待预计运行时间，以处理大小为 1024 像素 x 1024 像素、光纤密度适中的图像。实际计算时间通常取决于多种因素，包括文件大小、分析模式、要部署的功能、中央处理单元 （CPU） 类型以及可用的随机存取内存 （或 RAM） 数量。CT-FIRE 单个纤维提取需要几分钟时间。无边界的曲线对齐CT模式需要几秒钟。曲线对准CT-FIRE纤维或无边界的光纤端模式需要几十秒。曲线对齐CT-FIRE光纤模式无边界需要数百秒。曲线对齐分析与边界需要几十秒到几分钟，这取决于边界的复杂性。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
这些方法已成功地应用于许多研究。一些典型应用包括：1） Conklin 等人22 使用曲线对齐来计算肿瘤相关的胶原蛋白特征，并发现胶原纤维更频繁地垂直于原位导管癌 （DCIS） 病变中的导管周长：2） Drifka等人使用曲线 对齐中的CT-FIRE模式来量化胰腺导管腺癌和正常/慢性胰腺炎组织的频闪胶原对齐，发现与正常/慢性组织相比，癌组织中的对齐度有所提高：3） Alkmin等人使用曲线 对齐来量化卵巢频闪胶原蛋白的SHG图像中F-actin纤维和整体胶原蛋白对齐的角分布，并表明矩阵形态在驱动细胞动力学和F-actin对齐方面起着重要作用：4） LeBert等人将 CT-FIRE应用于斑马鱼伤口修复模型的SHG图像，发现急性受伤后胶原纤维厚度增加：5） Devine等人使用曲线 对齐中的CT-FIRE模式，从不同的动物模型中拍摄声乐折叠胶原蛋白的SHG图像，以测量单个纤维特性和整体对齐度，并表明猪和犬声折叠胶原蛋白的对齐度和直度较低：6） Keikhosravi 等人13 使用曲线对齐来量化与 LC-PolScope 成像的组织病理学样本中的胶原蛋白对齐，并表明 LC-PolScope 和 SHG 在某些类型的组织对齐和方向测量方面具有可比性。
图1：使用曲线对齐从人类乳腺癌组织微阵列（TMA）的SHG图像中查找与肿瘤相关的胶原蛋白特征。（A） TMA 核心的叠加图像与 SHG 图像（黄色）覆盖在相应的 H&E 明亮场图像上。（B） 感兴趣的区域 （A） 。（C） 明亮的场图像 （B） 。（D） （B） 的 SHG 图像。（F） 与明亮的字段图像相关的面膜 （C） 。（E） 曲线对齐输出叠加图像，显示肿瘤边界（黄色）从（F）， 代表性纤维位置， 和方向 （绿线）：蓝线用于将纤维与其最近的边界关联在一起。（B）和（E）中的绿色箭头显示与肿瘤边界平行的纤维，而红色箭头显示与边界垂直的纤维。（A ）中的刻度条等于 200μm。（B）-（F） 中的图像以相同的比例显示，（D） 中的代表性比例栏等于 50 μm。缩写：SHG=第二谐波一代：H&E = 血氧素和欧辛。请点击这里查看此数字的较大版本。
图2：纤维胶原蛋白图像量化的示意图工作流程。（A） 由CT-FIRE和/或曲线对齐分析的SHG图像。（B） CT-FIRE 覆盖图像输出。（C）（A） 的面具边界是可选的曲线对齐输入。（D） 按曲线对齐覆盖图像输出。（B ）中的色线表示提取的纤维。在（D）中，绿线表示边界（黄线）之外的纤维的位置和方向，并且距离其最近的边界在指定距离内，红线是其他纤维的红线，蓝线用于将纤维与其最近的边界关联在一起。（A）-（D）中的图像以相同的比例显示，并且（A） 中的代表性刻度栏等于 200 μm。请单击此处查看此数字的较大版本。
图3：CT-火常规分析。（A） 主要桂。（B） 显示汇总统计的输出表。（C） 和（F） 分别显示角度和宽度的直方图。（E） 输出图像，显示覆盖在原始 SHG 图像（D）上的提取纤维（色线）。缩写：GUI=CT=曲线转换：图形用户界面;SHG=第二谐波生成。 请点击这里查看此数字的较大版本。
图4：CT-FIRE投资回报率管理模块。（A） 模块GUI。（B） 对四个形状不同的投资回报率进行投资回报率分析后，显示每个投资回报率中的纤维。（C） 不同纤维特性的投资回报率直方图。缩写：CT=曲线转换：GUI=图形用户界面：投资回报率=感兴趣的区域。 请点击这里查看此数字的较大版本。
图5：CT-FIRE高级后处理模块。（A） 模块GUI。（B） 对选定的三种纤维的测量。（C） 选定的三种纤维的可视化 （B） 。（D） 应用长度阈值（+60 像素）后的摘要统计。（E） 以长度为基础的色条在（D） 中选择的纤维的可视化。缩写：CT=曲线转换：GUI=图形用户界面。 请点击这里查看此数字的较大版本。
图6：曲线对齐定期分析。（A） 主要桂。（B） 显示汇总统计的输出表。（C） 输出图像显示覆盖在原始 SHG 图像上的代表性纤维（绿线）和边界（黄线）的位置和方向，蓝线用于将光纤与其最近的边界关联起来，红线显示边界内或远离边界的外部的光纤的位置和方向（+用户指定的距离，例如，此处的 250 像素）。（D） 角度的热图：红色（+60度）、黄色（45-60度）、绿色（10至45度）。（E） -（F） 分别使用直方图和指南针图显示角度分布。缩写：GUI =图形用户界面：SHG=第二谐波生成。 请点击这里查看此数字的较大版本。
图7：曲线对齐投资回报率管理模块。（A） 模块GUI。（B） 四个注释的矩形投资回报率覆盖在原始图像上。（C） 投资回报率分析后输出表。（D） 每个投资回报率的角度直方图。缩写：投资回报率=感兴趣的区域：GUI=图形用户界面。 请点击这里查看此数字的较大版本。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
此协议描述了使用 CT-FIRE 和曲线对齐进行纤维胶原蛋白量化，可应用于任何具有胶原纤维或其他线状或纤维状拉伸结构的图像，这些结构适合 CT-FIRE 或曲线对齐进行分析。例如，弹性蛋白或弹性纤维可以在此平台上以类似的方式进行处理。我们已经在计算产生的合成纤维21上测试了这两种工具。根据应用情况，用户应选择最适合其数据的分析模式。CT纤维分析模式可以直接使用CT中的曲线来表示光纤的位置和方向，并且对局部纤维结构的变化非常敏感。CT模式可用于在复杂条件下定位纤维及其方向，例如，噪音水平高、纤维弯曲或纤维厚度变化大。但是，由于 CT 模式仅可拾取图像最亮的部分，因此当图像强度发生较大变化时，它会错过一些强度较低的纤维。
此外，CT模式不提供有关单个纤维的信息。与 CT 模式相比，CT-FIRE 模式计算单个光纤特性，并可以分析其强度高于指定阈值的所有纤维。与CT-FIRE模式相关的挑战包括：1） 当沿纤维的强度或图像上的纤维厚度发生较大变化时，完整纤维提取的精度可能会降低或降低：2） 目前的标准分析在计算上要求在协议中提到。更多有关这些方法的优势和局限性的详情，见我们以往的刊物20、21。
就光纤跟踪的准确性而言，用户可以主要依靠目视检查来检查提取的光纤或代表方向覆盖在原始图像上的重叠图像。此外，对于CT-FIRE，用户可以使用先进的后处理模块来识别所选单个纤维的属性，并通过使用斐济46等其他图像分析工具将其与测量进行比较。对于曲线对齐，用户可以将方向或对齐结果与其他工具（如方向J16 和细胞光谱17）计算的结果进行比较。
在平台可供输出的功能中，与对齐相关的功能最常用，并且最可靠、最坚固。要使用单个光纤功能，用户需要确认提取具有代表性的光纤功能。需要注意的是，在某些情况下，完整的光纤可以分为几个较短的部分，用户在选择光纤分析模式或进行进一步统计分析时应考虑这些段。即使纤维长度不能直接用作可比属性，根据长度加权的光纤段的方向或宽度可能仍然表示有用的信息。就SHG成像而言，客观透镜的数字光圈（NA）可以显著影响纤维宽度和长度的检测，但对方向和对齐度测量的影响较小。根据我们在 SHG 成像方面的经验，我们通常需要使用具有 40 倍或更高 NA ≥ 1.0 的 40 倍或更高倍的客观透镜，以实现强大的纤维厚度测量。
"对齐"可以用三种不同的方式解释：1） 与称为"角度"的正水平方向对齐，范围从 0 到 180 度不等，其中接近 0 的角度与接近 180 度的角度具有相似的方向：2） 与名为"相对角度"的边界对齐，范围为 0 至 90 度，0 度表示与边界平行的纤维，90 度表示垂直光纤：和 3） 相互对齐的纤维命名为"对齐系数"，范围从 0 到 1，1 表示完全对齐的纤维和较小的值代表更随机分布的纤维。
除了在此平台中计算的光纤功能外，还提出了基于纹理分析47、48、49的一些指标来量化 ECM 模式。这些与纹理相关的功能可以在某些应用中提供 ECM 的替代或附加描述符。开发这类指标的挑战在于可能的生物相关性、本地化特征和跟踪单个纤维的准确性的互操作。
为了优化运行参数并执行故障排除，用户可以参考手册、相关出版物20、21以及 GitHub Wiki 页面曲线存储库上的常见问题侧边栏：https://github.com/uw-loci/curvelets/wiki。对于某些按钮，当用户将鼠标图标移到按钮上方时，可能会显示一个功能提示来指导用户当前或下一个操作。按照GUI或命令窗口上的信息执行故障排除。
要处理大型数据集，我们鼓励用户使用并行计算选项，使该工具能够同时处理多个图像。一种选择是使用多个CPU内核（如果在正在使用的计算机上可用）。或者，通过位于康多的威斯康星大学麦迪逊分校高通量计算中心 （CHTC） 的服务器，提供了两个 APP 的无头版本，并在编译节点中成功编译。大规模光纤量化的 CHTC 工作流程已开发、测试并成功应用于由数千张图像组成的真实图像集。用户可以调整 CT-FIRE 和曲线对齐的无头 MATLAB 功能，以便对其他云计算系统（包括亚马逊、谷歌和微软提供的商业服务）进行量化。
当前和今后的发展方向包括：1）整合深度学习神经网络，提取或生成高质量的合成胶原纤维图像，提高光纤追踪算法的稳健性和准确性：2） 将所有模块集成到一个综合平台中，同时按照最佳软件工程实践优化代码和文档：3） 在云计算平台上部署所有核心功能：4） 利用CHTC服务增强光纤分析的工作流程：5） 改进合成纤维发生器的功能。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢许多贡献者和用户的CT-FIRE和曲线对齐多年来，包括罗布诺瓦克博士， 卡罗琳·佩尔克博士、杰里米·布雷德费尔特博士、古内特·梅塔博士、安德鲁·莱希特博士、阿迪布·凯霍斯拉维博士、马特·康克林博士、杰恩·松鼠博士、保罗·普罗文扎诺博士、布伦达·奥格尔博士、帕特里夏·基利博士、约瑟夫·舒尔切夫斯基博士、苏珊娜·波尼克博士以及斯瓦蒂·阿南德和柯蒂斯·鲁登的其他技术贡献。这项工作得到了半导体研究公司、莫格里奇研究所的资助，国家卫生研究院向K.W.E.提供了R01CA19996、R01CA181385和U54CA210190。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CT-FIRE | Univerity of Wisconsin-Madison | N/A | open source software available from https://eliceirilab.org/software/ctfire/ |
| CurveAlign | University of Wisconsin-Madison | N/A | open source software available from https://eliceirilab.org/software/curvealign/ |
References
- Nadiarnykh, O., et al. Second harmonic generation imaging microscopy studies of osteogenesis imperfecta. Journal of Biomedical Optics. 12 (5), 051805 (2007).
- Kouris, N. A., et al. A nondenatured, noncrosslinked collagen matrix to deliver stem cells to the heart. Regenerative Medicine. 6 (5), 569-582 (2011).
- LeBert, D. C., et al. Matrix metalloproteinase 9 modulates collagen matrices and wound repair. Development. 142 (12), 2136-2146 (2015).
- Provenzano, P. P., et al. Collagen reorganization at the tumor-stromal interface facilitates local invasion. BMC Medicine. 4 (1), 38 (2006).
- Provenzano, P. P., et al. Collagen density promotes mammary tumor initiation and progression. BMC Medicine. 6 (1), 1 (2008).
- Conklin, M. W., et al. Aligned collagen is a prognostic signature for survival in human breast carcinoma. The American Journal of Pathology. 178 (3), 1221-1232 (2011).
- Alkmin, S., et al. Migration dynamics of ovarian epithelial cells on micro-fabricated image-based models of normal and malignant stroma. Acta Biomaterialia. 100, 92-104 (2019).
- Campbell, K. R., Campagnola, P. J. Assessing local stromal alterations in human ovarian cancer subtypes via second harmonic generation microscopy and analysis. Journal of Biomedical Optics. 22 (11), 116008 (2017).
- Best, S. L., et al. Collagen organization of renal cell carcinoma differs between low and high grade tumors. BMC Cancer. 19 (1), 490 (2019).
- Drifka, C. R., et al. Periductal stromal collagen topology of pancreatic ductal adenocarcinoma differs from that of normal and chronic pancreatitis. Modern Pathology. 28 (11), 1470-1480 (2015).
- Campagnola, P. J., et al. Three-dimensional high-resolution second-harmonic generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues. Biophysical Journal. 82 (1), 493-508 (2002).
- Arun Gopinathan, P., et al. Study of collagen birefringence in different grades of oral squamous cell carcinoma using picrosirius red and polarized light microscopy. Scientifica. 2015, 1-7 (2015).
- Keikhosravi, A., et al. Quantification of collagen organization in histopathology samples using liquid crystal based polarization microscopy. Biomedical Optics Express. 8 (9), 4243-4256 (2017).
- Quan, B. D., Sone, E. D. Cryo-TEM analysis of collagen fibrillar structure. Methods in Enzymology. 532, 189-205 (2013).
- Boudaoud, A., et al. FibrilTool, an ImageJ plug-in to quantify fibrillar structures in raw microscopy images. Nature Protocols. 9 (2), 457-463 (2014).
- Rezakhaniha, R., et al. Experimental investigation of collagen waviness and orientation in the arterial adventitia using confocal laser scanning microscopy. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 11 (3-4), 461-473 (2012).
- Kartasalo, K., et al. CytoSpectre: a tool for spectral analysis of oriented structures on cellular and subcellular levels. BMC Bioinformatics. 16 (1), 1 (2015).
- Bredfeldt, J. S., et al. Computational segmentation of collagen fibers from second-harmonic generation images of breast cancer. Journal of Biomedical Optics. 19 (1), 016007 (2014).
- Bredfeldt, J. S., et al. Automated quantification of aligned collagen for human breast carcinoma prognosis. Journal of Pathology Informatics. 5 (1), 28 (2014).
- Liu, Y., Keikhosravi, A., Mehta, G. S., Drifka, C. R., Eliceiri, K. W. Methods for quantifying fibrillar collagen alignment. Methods in Molecular Biology. 1627, 429-451 (2017).
- Liu, Y., et al. Fibrillar collagen quantification with curvelet transform based computational methods. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 198 (2020).
- Conklin, M. W., et al. Collagen alignment as a predictor of recurrence after ductal carcinoma in situ. Cancer Epidemiology and Prevention Biomarkers. 27 (2), 138-145 (2018).
- Jallow, F., et al. Dynamic interactions between the extracellular matrix and estrogen activity in progression of ER+ breast cancer. Oncogene. 38 (43), 6913-6925 (2019).
- Smirnova, T., et al. Serpin E2 promotes breast cancer metastasis by remodeling the tumor matrix and polarizing tumor associated macrophages. Oncotarget. 7 (50), 82289 (2016).
- Fanous, M., Keikhosravi, A., Kajdacsy-Balla, A., Eliceiri, K. W., Popescu, G. Quantitative phase imaging of stromal prognostic markers in pancreatic ductal adenocarcinoma. Biomedical Optics Express. 11 (3), 1354-1364 (2020).
- Jiménez-Torres, J. A., Virumbrales-Muñoz, M., Sung, K. E., Lee, M. H., Abel, E. J., Beebe, D. J. Patient-specific organotypic blood vessels as an in vitro model for anti-angiogenic drug response testing in renal cell carcinoma. EBioMedicine. 42, 408-419 (2019).
- Govindaraju, P., Todd, L., Shetye, S., Monslow, J., Puré, E. CD44-dependent inflammation, fibrogenesis, and collagenolysis regulates extracellular matrix remodeling and tensile strength during cutaneous wound healing. Matrix Biology. 75, 314-330 (2019).
- Henn, D., et al. Cryopreserved human skin allografts promote angiogenesis and dermal regeneration in a murine model. International Wound Journal. 17 (4), 925-936 (2020).
- Rico-Jimenez, J., et al. Non-invasive monitoring of pharmacodynamics during the skin wound healing process using multimodal optical microscopy. BMJ Open Diabetes Research and Care. 8 (1), 000974 (2020).
- Israel, J. S., et al. Quantification of collagen organization after nerve repair. Plastic and Reconstructive Surgery Global Open. 5 (12), (2017).
- Rentchler, E. C., Gant, K. L., Drapkin, R., Patankar, M., Campagnola, P. J. Imaging collagen alterations in STICs and high grade ovarian cancers in the fallopian tubes by second harmonic generation microscopy. Cancers. 11 (11), 1805 (2019).
- Hu, C., et al. Imaging collagen properties in the uterosacral ligaments of women with pelvic organ prolapse using spatial light interference microscopy (SLIM). Frontiers in Physics. 7, 72 (2019).
- Guirado, E., et al. Disrupted protein expression and altered proteolytic events in hypophosphatemic dentin can be rescued by dentin matrix protein 1. Frontiers in Physiology. 11, 82 (2020).
- Kiss, N., et al. Quantitative analysis on ex vivo nonlinear microscopy images of basal cell carcinoma samples in comparison to healthy skin. Pathology & Oncology Research. 25 (3), 1015-1021 (2019).
- Lewis, D. M., et al. Collagen fiber architecture regulates hypoxic sarcoma cell migration. ACS Biomaterials Science & Engineering. 4 (2), 400-409 (2018).
- Moura, C. C., Bourdakos, K. N., Tare, R. S., Oreffo, R. O., Mahajan, S. Live-imaging of Bioengineered Cartilage Tissue using Multimodal Non-linear Molecular Imaging. Scientific Reports. 9 (1), 1-9 (2019).
- Murtada, S. I., et al. Paradoxical aortic stiffening and subsequent cardiac dysfunction in Hutchinson-Gilford progeria syndrome. Journal of The Royal Society Interface. 17 (166), 0066 (2020).
- Nichol, R. H., Catlett, T. S., Onesto, M. M., Hollender, D., Gómez, T. M. Environmental elasticity regulates cell-type specific RHOA signaling and neuritogenesis of human neurons. Stem Cell Reports. 13 (6), 1006-1021 (2019).
- Pointer, K. B., et al. Association of collagen architecture with glioblastoma patient survival. Journal of Neurosurgery. 126 (6), 1812-1821 (2016).
- Razavi, M. S., Leonard-Duke, J., Hardie, B., Dixon, J. B., Gleason, R. L. Axial stretch regulates rat tail collecting lymphatic vessel contractions. Scientific Reports. 10 (1), 1-11 (2020).
- Xue, Y., et al. Valve leaflet-inspired elastomeric scaffolds with tunable and anisotropic mechanical properties. Polymers for Advanced Technologies. 31 (1), 94-106 (2020).
- Zhou, Z. H., et al. Reorganized collagen in the tumor microenvironment of gastric cancer and its association with prognosis. Journal of Cancer. 8 (8), 1466 (2017).
- Zinn, A., et al. The small GTPase RhoG regulates microtubule-mediated focal adhesion disassembly. Scientific Reports. 9 (1), 1-15 (2019).
- Zwaans, B. M., et al. Radiation cystitis modeling: A comparative study of bladder fibrosis radio-sensitivity in C57BL/6, C3H, and BALB/c mice. Physiological Reports. 8 (4), (2020).
- Devine, E. E., Liu, Y., Keikhosravi, A., Eliceiri, K. W., Jiang, J. J. Quantitative second harmonic generation imaging of leporine, canine, and porcine vocal fold collagen. The Laryngoscope. 129 (11), 2549-2556 (2019).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Zeitoune, A. A., et al. Epithelial ovarian cancer diagnosis of second-harmonic generation images: A semiautomatic collagen fibers quantification protocol. Cancer Informatics. 16, (2017).
- Wershof, E., et al. Matrix feedback enables diverse higher-order patterning of the extracellular matrix. PLoS Computational Biology. 15 (10), 1007251 (2019).
- Mostaço-Guidolin, L. B., et al. Fractal dimension and directional analysis of elastic and collagen fiber arrangement in unsectioned arterial tissues affected by atherosclerosis and aging. Journal of Applied Physiology. 126 (3), 638-646 (2019).
- Thain, D., Tannenbaum, T., Livny, M. Distributed computing in practice: the Condor experience. Concurrency and Computation: Practice and Experience. 17 (2-4), 323-356 (2005).
