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Bioengineering

ठोस कैंसर की रीकैपिटलिंग पैथोलॉजिक प्रगति के लिए 3डी सेल-मुद्रित हाइपोक्सिक कैंसर-ऑन-ए-चिप

Published: January 5, 2021 doi: 10.3791/61945
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2, 1, 1,3
1Department of Mechanical Engineering, Pohang University of Science and Technology (POSTECH), 2Department of Creative IT Engineering, Pohang University of Science and Technology (POSTECH), 3Department of Rural and Biosystems Engineering, College of Agriculture and Life Sciences, Chonnam National University
* These authors contributed equally

Summary

हाइपोक्सिया ट्यूमर माइक्रोएनवायरमेंट की एक बानगी है और कैंसर की प्रगति में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। यह लेख कैंसर की हाइपोक्सिया से संबंधित विकृति को फिर से काटना करने के लिए 3 डी सेल-प्रिंटिंग तकनीक पर आधारित एक हाइपोक्सिक कैंसर-ऑन-ए-चिप की निर्माण प्रक्रिया का वर्णन करता है।

Abstract

कैंसर माइक्रोएनवायरमेंट रोग की प्रगति पर एक महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ता है। विशेष रूप से, हाइपोक्सिया कैंसर के अस्तित्व, आक्रमण और रसायनवाद का प्रमुख चालक है। यद्यपि हाइपोक्सिया से संबंधित कैंसर विकृति का अध्ययन करने के लिए कई इन विट्रो मॉडल विकसित किए गए हैं, लेकिन सटीक स्थानिक नियंत्रण की कमी के कारण वीवो में देखे गए कैंसर माइक्रोएनवायरमेंट के जटिल परस्पर क्रिया को अभी तक पुन: पेश नहीं किया गया है। इसके बजाय, कैंसर पारिस्थितिकी और सटीक कैंसर रोधी उपचार मूल्यांकन के बेहतर अनुकरण के लिए माइक्रोफिजियोलॉजिकल सिस्टम बनाने के लिए 3 डी बायोफैब्रिकेशन दृष्टिकोण का प्रस्ताव किया गया है। इसके साथ ही, हम हाइपोक्सिक कैंसर-ऑन-ए-चिप बनाने के लिए 3डी सेल-प्रिंटिंग दृष्टिकोण का प्रस्ताव करते हैं। चिप में हाइपोक्सिया-उत्प्रेरण घटकों को ऑक्सीजन वितरण के कंप्यूटर सिमुलेशन के आधार पर निर्धारित किया गया था। कैंसर-स्ट्रोमा गाढ़ा छल्ले ग्लियोब्लास्टोमा कोशिकाओं और एंडोथेलियल कोशिकाओं से युक्त बायोइंक का उपयोग करके मुद्रित किए गए थे ताकि एक प्रकार के ठोस कैंसर का पुनर्पूंजीकरण किया जा सके । जिसके परिणामस्वरूप चिप केंद्रीय हाइपोक्सिया का एहसास है और प्रतिनिधि रोगविज्ञानी मार्कर के गठन के साथ कैंसर में बढ़ द्रोह । कुल मिलाकर, एक ठोस कैंसर-मिमेटिक माइक्रोफिजियोलॉजिकल सिस्टम बनाने के लिए प्रस्तावित दृष्टिकोण से कैंसर अनुसंधान के लिए वीवो और इन विट्रो मॉडलों के बीच की खाई को पाटने की उम्मीद है ।

Introduction

कैंसर माइक्रोएनवायरमेंट कैंसर प्रगति ड्राइविंग एक महत्वपूर्ण कारक है। जैव रासायनिक, जैव भौतिकी और सेलुलर संकेतों सहित कई घटक, कैंसर की रोग विशेषताओं को निर्धारित करते हैं। इनमें से, हाइपोक्सिया दृढ़ता से कैंसर के अस्तित्व, प्रसार और आक्रमण1से जुड़ा हुआ है। कैंसर कोशिकाओं के असीमित विकास और विभाजन के कारण, पोषक तत्व और ऑक्सीजन लगातार समाप्त हो जाते हैं, और एक हाइपोक्सिक ढाल उत्पन्न होता है। कम ऑक्सीजन की स्थिति में, कोशिकाएं हाइपोक्सिया-अक्षुण्ण प्रतिलेखन कारक (एचआईएफ) से जुड़े आणविक झरना को सक्रिय करती हैं। यह प्रक्रिया एक परिगलित कोर को प्रेरित करती है, मेटाबोलिक परिवर्तनों को ट्रिगर करती है, और रक्त वाहिका हाइपरप्लासिया और मेटास्टेसिस2,3शुरू करती है। इसके बाद, कैंसर कोशिकाओं में हाइपोक्सिया पड़ोसी सामान्य ऊतकों के विनाश का कारण बनता है। इसके अलावा, हाइपोक्सिया बहुकार्य शिष्टाचार में ठोस ट्यूमर के चिकित्सीय प्रतिरोध से दृढ़ता से जुड़ा हुआ है। हाइपोक्सिया रेडियोथेरेपी को गंभीर रूप से बाधित कर सकता है, क्योंकि प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों1,4के कारण रेडियोसेंसिटिविटी सीमित है। इसके अलावा, यह कैंसर माइक्रोएनवायरमेंटमेंट्स के पीएच स्तर को कम करता है, जो दवा संचय1को कम करता है। इसलिए, विट्रो में हाइपोक्सिया से संबंधित रोग सुविधाओं को पुन: उत्पन्न करना वैज्ञानिक और पूर्व-नैदानिक निष्कर्षों के लिए एक आशाजनक रणनीति है।

कैंसर के विकास को समझने और उचित उपचार की खोज के लिए कैंसर का एक विशिष्ट माइक्रोएनवायरमेंट मॉडलिंग आवश्यक है। यद्यपि पशु मॉडलों का व्यापक रूप से उपयोग किया गया है क्योंकि उनकी मजबूत शारीरिक प्रासंगिकता है, प्रजातियों के मतभेदों और नैतिक समस्याओं से संबंधित मुद्दे5मौजूद हैं। इसके अलावा, हालांकि पारंपरिक 2D और 3 डी मॉडल में गहराई से विश्लेषण के लिए कैंसर कोशिकाओं के हेरफेर और वास्तविक समय इमेजिंग के लिए अनुमति देते हैं, उनकी वास्तुशिल्प और सेलुलर जटिलता को पूरी तरह से पुनः संक्षिप्त नहीं किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, कैंसर स्फेरॉइड मॉडल का व्यापक रूप से उपयोग किया गया है, क्योंकि एक स्फेरॉइड में कैंसर सेल एकत्रीकरण स्वाभाविक रूप से कोर में हाइपोक्सिया उत्पन्न कर सकता है। इसके अलावा, प्लास्टिक या सिलिकॉन आधारित मल्टी-वेल सिस्टम6,7का उपयोग करके एक समान आकार के सेलुलर गोलाकारों की बड़ी संख्या का उत्पादन किया गया है। हालांकि, पारंपरिक प्लेटफार्मों के साथ कैंसर ऊतकों की सटीक विषम संरचना पर कब्जा करने के संबंध में कम लचीलेपन ने कैंसर अनुसंधान8में सुधार के लिए एक अत्यधिक बायोमिमेटिक प्लेटफॉर्म बनाने के लिए एक उन्नत बायोफैब्रिकेशन तकनीक की स्थापना की आवश्यकता है।

3 डी माइक्रोफिजियोलॉजिकल सिस्टम (एमपीएस) कैंसर कोशिकाओं की जटिल ज्यामिति और रोग प्रगति को फिर से काटना उपयोगी उपकरण हैं9। कैंसर कोशिकाओं के रूप में विकास कारकों और केमोकिंस और यांत्रिक विषमता प्रणाली पर पुन: पेश के जैव रासायनिक ढाल भावना, कैंसर के विकास की महत्वपूर्ण सुविधाओं विट्रो में जांच की जा सकती है । उदाहरण के लिए, अलग-अलग ऑक्सीजन सांद्रता के आधार पर कैंसर व्यवहार्यता, मेटास्टैटिक द्रोह और दवा प्रतिरोध का अध्ययन किया गया है, जिसमें एमपीएसएस10, 11का उपयोग करके अध्ययन किया गया है। हाल की प्रगति के बावजूद, इन विट्रो मॉडल की हाइपोक्सिक स्थितियां पैदा करना जटिल निर्माण प्रक्रियाओं पर निर्भर करता है, जिसमें भौतिक गैस पंपों के साथ संबंध शामिल है। इसलिए, कैंसर-विशिष्ट माइक्रोएनवायरमेंट बनाने के लिए सरल, और लचीले तरीकों की आवश्यकता है।

3डी सेल प्रिंटिंग तकनीक ने देशी जैविक आर्किटेक्चर12को फिर से शुरू करने के लिए बायोमैटेरियल्स की स्थानिक व्यवस्था के सटीक नियंत्रण के कारण काफी ध्यान प्राप्त किया है । विशेष रूप से, यह तकनीक कैंसर माइक्रोएनवायरमेंट की स्थानिक विशेषताओं के निर्माण के लिए अपनी उच्च नियंत्रणीयता और व्यवहार्यता के कारण 3 डी हाइपोक्सिया मॉडल की मौजूदा सीमाओं पर काबू पा रही है। 3 डी प्रिंटिंग एक परत-दर-परत प्रक्रिया के माध्यम से कंप्यूटर-एडेड विनिर्माण की सुविधा भी प्रदान करती है, जिससे वास्तविक ऊतक आर्किटेक्चर की नकल करने के लिए जटिल ज्यामिति का तेजी से, सटीक और प्रजनन योग्य निर्माण प्रदान होता है। 3 डी एमपीएस के लिए मौजूदा विनिर्माण रणनीतियों के फायदों के अलावा, कैंसर की प्रगति की रोगविज्ञानी विशेषताओं को जैव रासायनिक, सेलुलर और जैव भौतिक घटकों13, 14को पैटर्न करके पुन: पेश किया जा सकता है।

इसके साथ ही, हम एक ठोस कैंसर(चित्रा 1)15की विषमता को पुनः प्राप्त करने के लिए हाइपोक्सिक कैंसर-ऑन-ए-चिप के लिए 3डी सेल-प्रिंटिंग रणनीति प्रस्तुत करते हैं। निर्माण मापदंडों प्रणाली में केंद्रीय हाइपोक्सिया गठन के एक कम्प्यूटेशनल सिमुलेशन के माध्यम से निर्धारित किया गया । कैंसर-स्ट्रोमा गाढ़ा छल्ले ग्लियोब्लास्टोमा कोशिकाओं और एंडोथेलियल कोशिकाओं से युक्त कोलेजन बायोिंक का उपयोग करके मुद्रित किए गए थे ताकि ग्लियोब्लास्टोमा के रोगविज्ञान का अनुकरण किया जा सके, जो एक प्रकार का ठोस कैंसर है । रेडियल ऑक्सीजन ग्रेडिएंट के बनने से कैंसर द्रोह बढ़ गया, जो आक्रामकता को मजबूत करता है। इसके अलावा, हम रोगी-विशिष्ट प्रीक्लिनिकल मॉडल के लिए चिप के अनुप्रयोगों के लिए भविष्य के दृष्टिकोण का संकेत देते हैं। एक ठोस कैंसर-मिमेटिक माइक्रोफिजियोलॉजिकल सिस्टम बनाने के लिए प्रस्तावित दृष्टिकोण से कैंसर के वीवो और इन विट्रो मॉडलों के बीच की खाई को पाटने की उम्मीद है ।

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Protocol

1. ऑक्सीजन ढाल गठन के कंप्यूटर सिमुलेशन

  1. हाइपोक्सिक कैंसर-ऑन-ए-चिप प्रिंटिंग के लिए 3डी ज्यामिति मॉडल का उत्पादन
    1. 3डी सीएडी सॉफ्टवेयर चलाएं।
    2. हाइपोक्सिक कैंसर-ऑन-ए-चिप के ज्यामिति मॉडल को स्केच करें। स्केच पर क्लिक करें और ज्यामिति आकर्षित करने के लिए वांछित विमान का चयन करें। प्रत्येक भाग के विस्तार पैमाने के लिए ड्राइंग(चित्रा 2A)को देखें।
    3. फीचर-प्रोट्रूसियन बॉस/बेसपर क्लिक करके ज्यामिति की मोटाई सेट करें । खाली बॉक्स में वांछित मोटाई (चित्रा 2 एको देखें) दर्ज करें और 3डी ज्यामिति बनाने के लिए हरे रंग की जांच आइकन का चयन करें।
      नोट: कैंसर पर एक चिप के आयाम मीडिया और हाइड्रोगेल की वांछित मात्रा के आधार पर परिभाषित किया गया है । वर्तमान प्रयोग में, एक्सट्रूशन-आधारित बायोप्रिंटर के समाधान के लिए पिछले व्यावहारिक अनुभवों के आधार पर मीडिया और हाइड्रोजेल की वांछित मात्रा क्रमशः लगभग 1,500 माइक्रोन और 500 माइक्रोन थी।
    4. ज्यामिति फ़ाइल को 3D सीएडी फाइल प्रारूप (.prt या.stl) के रूप में सहेजें।
  2. हाइपोक्सिक कोर को शामिल करने के लिए सेलुलर घनत्व का निर्धारण
    1. एक भौतिक प्रसार सिमुलेशन कार्यक्रम चलाएं।
    2. LiveLink पर क्लिक करें और सीएडी प्रोग्राम का चयन करें। सिमुलेशन कार्यक्रम पर हाइपोक्सिक कैंसर-ऑन-ए-चिप की ज्यामिति आयात करने के लिए सिंक्रोनाइज़ पर क्लिक करें। चूंकि कक्ष की आंतरिक जगह एक वास्तविक प्रयोगात्मक सेटिंग में संस्कृति माध्यम से भरी जाएगी, ऑक्सीजन कक्ष के भीतरी स्थान और सेलुलर निर्माण में फैलाना होगा, जो सेल से लदे हाइड्रोगेल से बना होगा।
      नोट: भौतिक मापदंडों पर विवरण के लिए पिछले अध्ययन का उल्लेख15।
    3. आयातित 3डी ज्यामिति को अंतरिक्ष की नियंत्रण मात्रा के रूप में परिभाषित करें जिसमें ऑक्सीजन फैलती है, और कोशिकाएं ऑक्सीजन(चित्रा 2B)का उपभोग करती हैं।
    4. एक उपयोगकर्ता गाइड और पहले स्थापित तरीकों के बाद गैस प्रसार विश्लेषण के लिए एक कंप्यूटर विश्लेषण चलाएं16,17।
    5. कंप्यूटर विश्लेषण परिणामों से, उपयोगकर्ता गाइड के बाद हर समय बिंदु पर क्रॉस-सेक्शन ए-ए पर अनुमानित ऑक्सीजन एकाग्रता डेटा का निर्यात करें। शासी समीकरण फिक के पहले कानून पर आधारित है, जैसा कि Eq.(1)(चित्रा 2C)में व्यक्त किया गया है।
      Equation 1
      जहां सी एकाग्रता है, डी ऑक्सीजन प्रसार गुणांक है, एनसेल कोशिकाओं का घनत्व Equation 2 है, ऑक्सीजन की अधिकतम अप-टेक दर है, और किमी माइकलिस-मेंटेन स्थिर है। पिछले प्रकाशन15में वर्णित स्थिरांकों को लागू किया गया था ।
      नोट: हर बार बिंदु समय के साथ ऑक्सीजन प्रसार परिवर्तन का निरीक्षण करने के लिए एक कदम बिंदु का मतलब है ।
    6. मूल्यांकन करें कि न्यूनतम ऑक्सीजन स्तर हाइपोक्सिया की दहलीज तक पहुंचता है या नहीं और कंप्यूटर विश्लेषण प्रक्रिया को वेतन वृद्धि या सेलुलर घनत्व के पतन के साथ दोहराएं।
      नोट: परिभाषित करें कि हाइपोक्सिया ढाल निर्माण में बनता है यदि हाइड्रोगेल क्षेत्र में 80% का ऑक्सीजन स्तर 24 घंटे के बाद 0.02 m M से कम है।
    7. मध्य क्षेत्र में ऑक्सीजन ढाल उत्प्रेरण हाइपोक्सिया उत्पन्न करने के लिए आवश्यक कोशिकाओं की संख्या की पुष्टि करें जो 1.2.5 चरण में फिक के पहले कानून से है और सिमुलेशन चरण 1.2.6 से परिणाम है।
      नोट: इस प्रोटोकॉल में, सेल संख्या 2 × 106 कोशिकाओं/

2. कैंसर कोशिकाओं और स्ट्रोमल कोशिकाओं की कोशिका संस्कृति

  1. शारीरिक तनाव से बचने के लिए सेल कल्चर मीडिया की तैयारी
    1. यू-87 एमजी कोशिकाओं (अमर मानव ग्लियोब्लास्टोमा सेल लाइन) के लिए, उच्च ग्लूकोज Dulbecco संशोधित ईगल माध्यम के 12 मिलीएल जगह 10% भ्रूण गोजातीय सीरम युक्त, 37 डिग्री सेल्सियस में टी-75 सेल कल्चर फ्लास्क में 100 यू/एमएल पेनिसिलिन, और 100 माइक्रोग्राम/एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन, 5% सीओ2 आर्द्रीकृत इनक्यूबेटर 30 मिनट के लिए कोशिकाओं पर माध्यम के थर्मल और क्षारीय प्रभाव को कम करने के लिए।
      नोट: ग्लियोब्लास्टोमा को एक प्रकार के ठोस कैंसर के रूप में चुना गया था क्योंकि इसमें हाइपोक्सिक वातावरण में आक्रामक विशेषताएं हैं। इस मॉडल पर अन्य विभिन्न प्रकार के कैंसर लागू किए जा सकते हैं।
    2. मानव गर्भनाल नस एंडोथेलियल कोशिकाओं (HUVECs) के लिए, एक टी-75 सेल कल्चर फ्लास्क में एंडोथेलियल सेल ग्रोथ मीडियम के 12 एमएल को 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ2 आर्द्रीकृत इनक्यूबेटर में रखें।
      नोट: HUVECs चुना गया था क्योंकि यह सबसे प्रतिनिधि एंडोथेलियल सेल लाइनों में से एक है । इस मॉडल पर विभिन्न प्रकार की स्ट्रोमल कोशिकाएं भी लागू की जा सकती हैं।
  2. क्रायोप्रीप्रेड कैंसर कोशिकाओं और स्ट्रोमल कोशिकाओं और उनके रखरखाव का तेजी से विगलन
    1. तरल नाइट्रोजन कंटेनर से 5 x 105 यू-87 एमजी कोशिकाओं और एचयूवीसी युक्त क्रायोवियल्स को लैमिनार प्रवाह कैबिनेट में ले जाएं। आंतरिक दबाव को जारी करने के लिए तुरंत ढीला और टोपी को फिर से कड़ा करें।
    2. धीरे-धीरे क्रीमें से कैप को पानी से बाहर रखते हुए 2 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान में क्रायोप्रीवसेव कोशिकाओं को रखें। प्रदूषण को रोकने के लिए लैमिनार प्रवाह के तहत 70% इथेनॉल के साथ शीशियों को कुल्ला।
    3. गल कोशिकाओं को चरण 2.1 में वर्णित तैयार सेल कल्चर मीडिया वाले फ्लास्क में स्थानांतरित करें और सेल रिकवरी के लिए सेल-युक्त फ्लैस्क को 5% सीओ2 आर्द्रीकृत इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
    4. सेल कल्चर मीडिया को हर 2 दिन में ताज़ा करें और सेल ग्रोथ बनाए रखें।
    5. 24 घंटे के विगलन के बाद, सेल कल्चर मीडिया को बदलें ताकि डाइमेथिल सल्फोक्साइड (डीएमएसओ) की साइटोटॉक्सिक्स से बचा जा सके, जिसका उपयोग सेल फ्रीजिंग के लिए किया जाता था। HUVECs का उपयोग करें, जो 6 मार्ग से कम समय से गुजरा है।

3. कोलेजन प्री-जेल समाधान की तैयारी

  1. 0.1 एन हाइड्रोक्लोरिक एसिड (एचसीएल) के साथ कोलेजन स्पंज का घुलनशीलता
    1. 0.1 एन एचसीएल का समाधान तैयार करें और इसे 0.2 माइक्रोन सिरिंज फिल्टर के साथ फ़िल्टर करें।
    2. 1% (w/v) बेअसर कोलेजन प्री-जेल समाधान के 3 एमएल के लिए, कोलेजन स्पंज को 5 x 5 मिमी2 टुकड़ों में काटकर और 30 मिलीग्राम वजनी तैयार करें।
    3. कट कोलेजन के टुकड़ों को बाँझ 10 एमएल ग्लास शीशी में स्थानांतरित करें।
      नोट: कोलेजन समाधान की चिपचिपा विशेषता के कारण हाइड्रोगेल के नुकसान को ध्यान में रखते हुए आवश्यक कोलेजन हाइड्रोगेल की 1.5 गुना मात्रा तैयार करें।
    4. कोलेजन युक्त ग्लास शीशी में 0.1 एन एचसीएल का 2.4 एमएल जोड़ें और इसे 15 आरपीएम और 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 दिनों के लिए घुमाव पर इनक्यूबेट करें।
      नोट: 0.1 एन एचसीएल समाधान की मात्रा आवश्यक कोलेजन हाइड्रोगेल की अंतिम मात्रा का चार-पचासों था। इस मामले में कोलेजन का 3 एमएल तैयार किया गया था।
    5. पाचन के बाद, 40 माइक्रोन सेल छलनी का उपयोग करके अपाच्य कोलेजन कणों को छलनी करें। अम्लीय कोलेजन के घोल को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें और 7 दिनों के भीतर इस्तेमाल करें।
  2. 1% बेअसर कोलेजन प्री-जेल समाधान के लिए पीएच समायोजन
    1. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 1224 x g पर अम्लीय कोलेजन समाधान अपकेंद्रित्र करें।
    2. कोलेजन प्री-जेल समाधान में 10% (v/v) की अंतिम एकाग्रता के लिए पीएच संकेतक के रूप में फिनॉल लाल समाधान के 30 माइक्रोन जोड़ें और 10x फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) बफर के 300 माइक्रोन जोड़ें।
    3. 1 एन सोडियम हाइड्रोक्साइड (NaOH) के साथ पीएच को 7 तक बेअसर करें, रंग परिवर्तन की पुष्टि करें।
      नोट: सूत्र के आधार पर, मोल्स एच+ = मोलेरिटी एच+ एक्स वॉल्यूम एच+ = मोल्स ओह-= मोलेरिटी ओह- एक्स वॉल्यूम ओह-,नाओएच के 240 माइक्रोल जोड़ें।
    4. 3 एमएल की कुल मात्रा प्राप्त करने के लिए आसुत पानी जोड़ें।
    5. पीएच समायोजन के बाद, 1% (w/v) कोलेजन प्री-जेल समाधान को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें और 3 दिनों के भीतर उपयोग करें।
      नोट: बेअसर कोलेजन प्री-जेल समाधान के जेलेशन को प्रीचेक करने के लिए, एक सकारात्मक विस्थापन पिपेट का उपयोग करके एक छोटे पकवान पर 50 माइक्रोन कोलेजन बूंदें बनाएं और उन्हें 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में इनक्यूबेट करें। कोलेजन बूंदों के क्रॉस-लिंकिंग को सत्यापित करने के लिए निम्नलिखित तीन तरीकों का उल्लेख करें।
    6. जांच करें कि कोलेजन का रंग पारदर्शी रंग से अपारदर्शी सफेद में बदल गया है या नहीं।
    7. कंटेनर को झुकाएं और जांचें कि कोलेजन कंटेनर के नीचे का पालन किया जाता है या नहीं।
    8. बूंदों पर 1x पीबीएस डालें और जांचें कि क्या कोलेजन निर्माण समाधान में टूटा नहीं है।

4.3D गैस पारम करने योग्य बाधा की छपाई

  1. एक बलि पाली (एथिलीन-विनाइल एसीटेट) (पीईएवा) मोल्ड की 3 डी प्रिंटिंग
    1. 3डी सीएडी सॉफ्टवेयर(चित्रा3 ए) का उपयोग करके चरण 1 में परिभाषित बलि पेवा मोल्ड की 3डी ज्यामिति उत्पन्न करें।
      नोट: 3 डी ज्यामिति और आयाम, इकाइयों और लाइन प्रकारों सहित विस्तृत मॉडल पैमाने को चित्र 2 एमें दिखाया गया था।
    2. फाइल | पर क्लिक करके 3डी सीएडी फाइल को एसटीएल फाइल फॉर्मेट में कन्वर्ट करें एसटीएल के रूप में सेव-फाइल प्रकार। साथ ही ऑप्शन | पर भी क्लिक करें जी-कोड जनरेशन के लिए एएससीआईआई के रूप में आउटपुट फॉर्म।
    3. फाइल | पर क्लिक करें एसटीएल फाइल खोलें और उत्पन्न एसटीएल फाइल आयात करने के लिए सेव किए गए एसटीएल फाइल का चयन करें। स्टैकिंग पेवा मोल्ड(चित्रा 3 बी,सी)के जी-कोड को स्वचालित रूप से जेनरेट करने के लिए एसटीएल-सीएडी एक्सचेंजर के स्लाइस मॉडल पर क्लिक करें।
      नोट: प्रिंटिंग पथ एसटीएल फ़ाइल और स्लाइसिंग प्लेन (यानी, परत) के मौलिक आंकड़े के बीच एक दूसरे को जोड़ने वाले बिंदुओं के कनेक्शन के साथ उत्पन्न होता है। असल में, एसटीएल फ़ाइल में एक टुकड़े का मौलिक आंकड़ा एक त्रिकोण है जिसमें 3 डी निर्देशांक शामिल हैं। त्रिकोण और परत के बीच एक-दूसरे बिंदुओं को प्राप्त करने के बाद, एक परत18पर छा पथ के बिना प्रत्येक बिंदु को जोड़कर मुद्रण के लिए जी-कोड उत्पन्न होता है। बोर्ड सॉफ्टवेयर पर किसी भी जी-कोड जनरेशन एल्गोरिदम का उपयोग चिप निर्माण के लिए प्रिंटिंग पथ उत्पन्न करने के लिए किया जा सकता है।
    4. एक बाँझ चिपकने वाला और हाइड्रोफिलिक हिस्टोलॉजी स्लाइड तैयार करें।
      नोट: हाइड्रोफिलिक स्लाइड ग्लास ग्लास पर पॉलीडिमिथाइलसिलोक्सेन (पीडीएमएस) के स्थायी संबंध के लिए महत्वपूर्ण है और कोलेजन का आसंजन कैंसर कोशिकाओं और स्ट्रोमल कोशिकाओं को एनकैप्सुलेट करता है।
    5. 110 डिग्री सेल्सियस पर 500 kPa के वायवीय दबाव पर एक 50 जी सटीक नोजल के साथ स्लाइड पर बलि PEVA मोल्ड प्रिंट करें।
      नोट: लाइन चौड़ाई फ़ीड दर, नोजल गेज, और सामग्री के तापमान से प्रभावित होती है। 50 जी नोजल का उपयोग किया गया था और बलि की दीवार के लिए 500 माइक्रोन लाइन चौड़ाई उत्पन्न करने के लिए 400 की फ़ीड दर लागू की गई थी। नोजल गेज, वायवीय दबाव, और फ़ीड दर व्यावहारिक परिणाम19के साथ परिभाषित कर रहे हैं । बलि की दीवार को पीडीएमएस समाधान को पकड़ने के लिए पर्याप्त रूप से मोटी होने की आवश्यकता है, जो अगला निर्माण कदम है।
  2. पॉलीडिमिथाइलसिलोक्सेन (पीडीएमएस) बैरियर की कास्टिंग
    1. प्लास्टिक जलाशय में 5 मिनट से अधिक 6 एमएल पीडीएमएस बेस इलास्टोमर और 0.6 एमएल इलाज एजेंट को मिलाएं। यह पीडीएमएस की चिपचिपा विशेषता के कारण होने वाले नुकसान को देखते हुए 6 हाइपोक्सिक कैंसर-ऑन-चिप्स बना सकता है।
    2. मिश्रित पीडीएमएस समाधान को 10 एमएल डिस्पोजेबल सिरिंज में लोड करें और सिरिंज सिर को 20 ग्राम प्लास्टिक पतला डिस्पेंस टिप के साथ फिट करें।
    3. सिरिंज में मिश्रित पीडीएमएस समाधान के साथ बलि पीवा मोल्ड भरें। मिश्रित पीडीएमएस एक उत्तल सतह के साथ बलि पेवा मोल्ड भर जाएगा। पीडीएम बैरियर की ऊंचाई पेवा मोल्ड की तुलना में अधिक होगी।
    4. पीडब्ल्यूए के पिघलने से बचने के लिए 36 घंटे से अधिक के लिए 40 डिग्री सेल्सियस पर एक ओवन में पीडीएमएस बाधा का इलाज करें। तापमान को 88 डिग्री सेल्सियस से अधिक न बढ़ाएं, जो पेवा का पिघलता हुआ तापमान है।
    5. बलि पेवा मोल्ड को सटीक चिमटी की एक जोड़ी के साथ अलग करें और एक ऑटोक्लेव में 120 डिग्री सेल्सियस पर गैस-पारमेबल बैरियर को निष्फल करें।

5. सेल-एन्केसेटेड कोलेजन बायो-इन्क्स की तैयारी

  1. तैयार कैंसर कोशिकाओं और स्ट्रोमल कोशिकाओं की टुकड़ी
    नोट: सेल व्यवहार्यता को ध्यान में रखते हुए, कोशिकाओं को अलग करने के बाद पूरी प्रिंटिंग प्रक्रिया को जितनी जल्दी हो सके पूरा किया जाना चाहिए।
    1. एक सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करके 1x पीबीएस के 10 एमएल के साथ कैंसर और स्ट्रोमल कोशिकाओं को धोएं; 0.25% ट्राइप्सिन-एथिलेनडाइमाइन्टेट्राएक्टेटिक एसिड (ईडीटीए) के 2 मिलीलन के साथ एक पिपेट का उपयोग करके इलाज करें और उन्हें 37 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    2. सेल कल्चर मीडिया के 3 एमएल के साथ ट्राइपसिनाइज्ड कोशिकाओं को बेअसर करें; कोशिकाओं के निलंबन को 15 एमएल शंकु नलियों में इकट्ठा करें और 20 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 516 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र करें।
    3. धीरे-धीरे सुपरनेट को एस्पिरेट करें; 5 एमएल सेल कल्चर मीडिया में सेल छर्रों को फिर से खर्च करें और हीमोसाइटोमीटर का उपयोग करके कोशिकाओं की संख्या गिनें।
    4. प्रत्येक सेल की 5 x 106 कोशिकाओं को नए 15 एमएल शंकु नलियों में स्थानांतरित करें और उन्हें 20 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 516 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र करें।
    5. सुपरनेट ऑफ को एस्पिरेट करें और इसे गीली बर्फ पर रखें।
  2. 1% बेअसर कोलेजन प्री-जेल समाधान के साथ प्रत्येक सेल प्रकार का मिश्रण
    नोट: 1% निष्प्रभावी कोलेजन प्री-जेल समाधान के थर्मल जमना से बचने के लिए, इस प्रक्रिया को गीली बर्फ पर किया जाना चाहिए।
    1. प्रत्येक प्रकार के सेल पेलेट को सेल कल्चर मीडिया के 20 माइक्रोन के साथ चरण 5.1.4 में एकत्र किया गया है।
    2. प्रत्येक पुनर् निलंबित सेल निलंबन में 1% बेअसर कोलेजन प्री-जेल समाधान के 1 एमएल जोड़ें और सकारात्मक विस्थापन पिपेट का उपयोग करके उन्हें समरूप रूप से मिलाएं। प्रत्येक कोशिका प्रकार की अंतिम एकाग्रता 5 x 106 कोशिकाओं/एमएल होगी ।
    3. सेल-एनकैप्सुलेटेड कोलेजन बायोइंक को सकारात्मक डिस्पोजेबल पिपेट का उपयोग करके 3 एमएल डिस्पोजेबल सीरिंज में स्थानांतरित करें और सीरिंज को 3 डी सेल-प्रिंटिंग तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

6.3D कैंसर-स्ट्रोमा गाढ़ा छल्ले की सेल प्रिंटिंग

  1. कोलेजन बायोइंक की 3डी सेल-प्रिंटिंग कैंसर कोशिकाओं और स्ट्रोमल कोशिकाओं को एनकैप्सुलेट करती है
    1. 3डी सीएडी सॉफ्टवेयर का उपयोग करके चरण 1.2 में परिभाषित कैंसर-स्ट्रोमा गाढ़ा छल्ले की 3डी ज्यामिति उत्पन्न करें।
      नोट: कैंसर स्ट्रोमा गाढ़ा छल्ले के आयामों नकली मापदंडों के माध्यम से परिभाषित कर रहे हैं । अंतिम आयाम पैरामीटर आयाम चित्र 3 एमें दिखाए गए हैं ।
    2. 3डी सीएडी फाइल को एसटीएल फाइल फॉर्मेट में कन्वर्ट करें और एसटीएल-सीएडी एक्सचेंजर का इस्तेमाल करते हुए कैंसर-स्ट्रोमा गाढ़ा छल्ले का जी-कोड जेनरेट करें ।
      नोट: जी-कोड जनरेशन एल्गोरिदम के लिए चरण 4.1.2 में नोट का उल्लेख करें।
    3. 3 डी प्रिंटर के सिर पर 3 एमएल डिस्पोजेबल सीरिंज में निहित सेल-एन्कैप्सुलेटेड कोलेजन बायोकिंस लोड करें और सिर और प्लेट के तापमान को 15 डिग्री सेल्सियस तक सेट करें।
      नोट: यदि प्रिंटर के सिर और प्लेट का तापमान 37 डिग्री सेल्सियस से अधिक पहुंचता है, तो बायोइंक क्रॉस-लिंक हो जाता है और अब प्रिंट नहीं होता है।
    4. 3 डी प्रिंटर के नियंत्रण सॉफ्टवेयर पर उत्पन्न मुद्रण पथ लोड करें।
    5. स्टार्ट बटन पर क्लिक करके, 15 डिग्री सेल्सियस पर लगभग 20 केपीए के वायवीय दबाव पर 18 जी प्लास्टिक सुई के साथ लोडेड जी-कोड के बाद गैस-पारमेबल बैरियर पर कैंसर कोशिकाओं और स्ट्रोमल कोशिकाओं को एनकैप्सुलेट करने वाले कोलेजन बायोइंक प्रिंट करें ।
    6. हर प्रिंटिंग ऑपरेशन के अंत में, मैन्युअल रूप से हाइपोक्सिक ढाल उत्पन्न करने के लिए गैस-पारगम्य बाधा के शीर्ष पर एक निष्फल 22 मिमी x 50 मिमी ग्लास कवर रखें।
      नोट: हाइपोक्सिक ढाल की पीढ़ी को सत्यापित करने के लिए ग्लास कवर (जीआर +) और अनुपस्थिति (जीआर-) की उपस्थिति के आधार पर दो समूहों की तुलना करें।
    7. तीन हाइपोक्सिक कैंसर-ऑन-चिप्स पैदा करने के बाद, कोलेजन बायोइंक को क्रॉस-लिंक करने के लिए चिप्स को 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक इनक्यूबेटर में स्थानांतरित करें।
  2. निर्माण प्रक्रिया और हाइपोक्सिक कैंसर के रखरखाव पर एक चिप के पूरा होने
    1. हाइपोक्सिक कैंसर-ऑन-ए-चिप की सभी 3डी सेल-प्रिंटिंग प्रक्रियाओं के पूरा होने के बाद, तंग बॉन्डिंग(चित्रा 4 ए,बी)के लिए सेल-स्क्रैपर के साथ गैस-पारमेबल बाधाओं के शीर्ष पर कवर ग्लास को धीरे से रगड़ें।
      नोट: कवर ग्लास और गैस पार पार करने योग्य बाधा रासायनिक गोंद के बिना हाइड्रोफोबिक संबंध के माध्यम से इकट्ठे होते हैं, बस कवर ग्लास और पीडीएमएस बाधा के बीच बंधुआ हिस्से को स्क्रैप करते हैं।
    2. प्रत्येक चिप के लिए एंडोथेलियल सेल विकास माध्यम के 1.5 एमएल परिचय। कैंसर निर्माण की टुकड़ी से बचने के लिए, चिप के एक तरफ से सेल संस्कृति माध्यम शुरू करें। सेल कल्चर मीडिया को पिपेट का उपयोग करके प्रवाहित करने की अनुमति देने के लिए चिप को झुकाएं।
    3. सेल कल्चर मीडिया को हर दिन एक हफ्ते तक रिफ्रेश करें। सेल संस्कृति माध्यम को आकांक्षी करने के लिए एक पिपेट का उपयोग करें; प्रेशर पंप का इस्तेमाल न करें।

7. पोस्ट-प्रिंटिंग सेल व्यवहार्यता का मूल्यांकन

  1. कैल्सीन एएम और एटीएचडी-1 समाधान के साथ नमूने और उपचार की तैयारी
    1. 37 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान में गर्म 1x पीबीएस।
    2. परख समाधान तैयार कैल्सीन एसीटॉक्सीमिथिल (कैल्सीन एएम) के 0.75 माइक्रोन और एथिडियम होमाडिमर (एटीएचडी-1) के 3 माइक्रोन को 1.5 एमएल प्री-गर्म पीबीएस में जोड़कर तैयार करें।
    3. ध्यान से एक पिपेट का उपयोग कर चिप से सभी मीडिया आकांक्षी।
    4. कैंसर का निर्माण प्रीवार्मेड पीबीएस के साथ धोएं। एक पिपेट का उपयोग कर चिप में 1.5 एमएल पीबीएस भरें और इसे कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए खड़े होने दें। कैंसर के निर्माण के विरूपण से बचने के लिए, चिप्स के एक तरफ से 1x पीबीएस परिचय और 1x PBS प्रवाह करने के लिए अनुमति देने के लिए चिप्स झुकाव ।
    5. चिप से पीबीएस को एस्पिरेट करें; 1.5 मिलील परख समाधान का इलाज करें और प्रकाश से बचाने के लिए एक पन्नी का उपयोग करके 20 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर चिप को इनक्यूबेट करें। 1x पीबीएस को एस्पिरेट करने के लिए एक पिपेट का उपयोग करें; सक्शन पंप का उपयोग न करें।
  2. फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप का उपयोग करके कोशिका व्यवहार्यता की इमेजिंग
    1. फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप(चित्रा 4C)का उपयोग करके लेबल की गई कोशिकाओं को देखें और कैप्चर करें।
      नोट: Calcein AM हरे फ्लोरेसेंस (तरंग दैर्ध्य ~ 488 एनएम) के साथ लाइव कोशिकाओं को चिह्नित करता है। एटीएचडी-1 लाल फ्लोरेसेंस (तरंगदैर्ध्य ~ 594 एनएम) के साथ मृत कोशिकाओं के संकेत का प्रतिनिधित्व करता है।
    2. इमेजिंग सॉफ्टवेयर, एक ओपन-सोर्स इमेज-प्रोसेसिंग प्रोग्राम का उपयोग करके लाइव और मृत कोशिकाओं की संख्या गिनें, और संख्याओं के साथ व्यवहार्यता की गणना करें।

8. केंद्रीय हाइपोक्सिया के गठन और कैंसर द्रोह पर इसके प्रभाव को मान्य करने के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस

  1. कैंसर के निर्माण का निर्धारण, पारमेबिलाइजेशन और अवरुद्ध
    1. कमरे के तापमान पर 1x पीबीएस, 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए), ०.१% (v/v) ट्राइटन एक्स-१००, और 2% (w/v) गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) तैयार करें ।
    2. ध्यान से एक पिपेट का उपयोग कर चिप से सभी मीडिया आकांक्षी और 1x PBS के साथ तीन बार चिप कुल्ला । कैंसर के निर्माण के विरूपण से बचने के लिए, चिप्स के एक तरफ से 1x पीबीएस परिचय और 1x PBS प्रवाह करने के लिए अनुमति देने के लिए चिप्स झुकाव । प्रत्येक वाशिंग चरण के बीच, अवशिष्ट समाधानों को हटाने के लिए चिप को 5 मिनट के लिए 1x पीबीएस के साथ खड़ा होने दें।
      नोट: 1x पीबीएस एक पिपेट का उपयोग कर के रूप में उत्साहित किया गया था, नहीं एक दबाव पंप ।
    3. एक पिपेट का उपयोग कर चिप पर कैंसर निर्माण के लिए 4% पीएफए के 500 μL जोड़ें; इसे 15 मिनट के लिए छोड़ दें और कैंसर निर्माण में कोशिकाओं को ठीक करने के लिए 1x पीबीएस के साथ तीन बार धोएं।
    4. कैंसर का इलाज 0.1% ट्राइटन एक्स-100 के 500 माइक्रोन के साथ 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर एक पिपेट का उपयोग करके और कोशिका झिल्ली को घुलनशील और पार करने के लिए 1x पीबीएस के साथ तीन बार धोएं।
    5. प्रतिक्रियाशील एपिटोप्स को ब्लॉक करने के लिए कमरे के तापमान पर एक पिपेट का उपयोग करके 2% बीएसए के 500 माइक्रोन के साथ कैंसर का निर्माण करें।
      नोट: वाष्पीकरण को रोकने के लिए पैराफिन फिल्म के साथ चिप को कवर करें।
    6. 1 एच के बाद चिप को 1x पीबीएस से तीन बार धोएं।
  2. प्राथमिक एंटीबॉडी, माध्यमिक एंटीबॉडी, और दापी और कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके संरचना की इमेजिंग के साथ उपचार।
    1. प्रत्येक वांछित कामकाजी एकाग्रता के लिए 1x पीबीएस में एंटीबॉडी को पतला करके आइसोटाइप नियंत्रण एंटीबॉडी और प्राथमिक एंटीबॉडी का कॉकटेल तैयार करें।
      नोट: एंटीबॉडी के विशिष्ट विवरण सामग्री की तालिकामें सूचीबद्ध हैं । प्राथमिक एंटीबॉडी के रूप में आइसोटाइप नियंत्रण एंटीबॉडी की एक ही काम सांद्रता का उपयोग किया जाना चाहिए।
    2. ध्यान से एक पिपेट का उपयोग कर चिप से सभी 1x PBS aspirate और 4 डिग्री सेल्सियस पर 200 μL प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान के साथ चिप का इलाज रात भर। वाष्पीकरण को रोकने के लिए चिप्स को पैराफिन फिल्म से कवर करें।
    3. प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान को एस्पिरेट करें और चिप को 1x पीबीएस के साथ तीन बार धोएं।
    4. वांछित काम एकाग्रता के लिए 1x PBS में माध्यमिक एंटीबॉडी और DAPI पतला।
      नोट: इस मामले में 1:200 के अनुपात में एक हरे रंग की फ्लोरेसेंस-संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी का उपयोग किया जाता है। DAPI का उपयोग 1:1000 के अनुपात में किया गया था।
    5. एक पिपेट का उपयोग करके चिप से सभी 1x पीबीएस को ध्यान से एस्पिरेट करें और चिप को 3 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 200 माइक्रोन सेकेंडरी एंटीबॉडी-डीएपीआई समाधान के साथ इलाज करें। वाष्पीकरण को रोकने के लिए पैराफिन फिल्म के साथ चिप को कवर करें और फिर फोटोब्लैचिंग को रोकने के लिए इसे एल्यूमीनियम पन्नी के साथ लपेटें।
    6. माध्यमिक एंटीबॉडी-डीएपीआई समाधान को एस्पिरेट करें और चिप को 1x पीबीएस के साथ तीन बार धोएं।
    7. धुंधला कदम खत्म करने के बाद, कैंसर धीरे संदंश के साथ मनोरंजक द्वारा एक confocal पकवान के लिए निर्माण हस्तांतरण ।
    8. कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप(चित्रा 5)का उपयोग करके लेबल की गई कोशिकाओं की कल्पना करें और कैप्चर करें।
      नोट: कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप की तरंगदैर्ध्य को फ्लोरोसेंट मार्कर के प्रकार के आधार पर समायोजित किया गया था। एंटीबॉडी के विशिष्ट विवरण सामग्री तालिकामें सूचीबद्ध हैं। सेल की स्थिति का कुशलतापूर्वक पता लगाने के लिए, पहले निर्माण के डीएपीआई दाग नाभिक का निरीक्षण करना बेहतर होगा। फ्लोरोसेंट संकेतों का पता लगाने की उमंग/उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य 358/461 एनएम (DAPI, ब्लू), 494/517 एनएम (ग्रीन), और 590/617 एनएम (लाल) थे । आवर्धन 4x, 10x, और 20x थे, सबसे कम से उच्चतम करने के लिए समायोजित ।

9. सांख्यिकीय विश्लेषण

  1. छवि प्रसंस्करण कार्यक्रम के साथ सेल गिनती
    1. लाइव और मृत कोशिकाओं की संख्या गिनने के लिए एक छवि प्रसंस्करण कार्यक्रम चलाएं।
    2. फ्लोरोसेंट इमेज फाइल्स खोलें। फाइल | पर क्लिक करें झगड़ा छवियों को खोलें और आयात करें।
    3. छवियों को 16-बिट ग्रेस्केल छवियों में परिवर्तित करें। इमेज | पर क्लिक करें | टाइप करें 16-बिट ग्रेस्केल।
    4. इमेज | पर क्लिक करके दहलीज को समायोजित करें | समायोजित करें दहलीज और फिर कोशिकाओं के रंग का चयन करने के लिए काला हो ।
    5. प्रोसेस | पर क्लिक करके विलय कोशिकाओं को अलग करें बाइनरी | सटीक सेल गिनती के लिए वाटरशेड।
    6. विश्लेषण पर क्लिक करके कोशिकाओं की संख्या गिनें और फिर तीन बार कणों का विश्लेषण करें; औसत की गणना करें और डेटा को मानक त्रुटि के ± मतलब के रूप में प्रस्तुत करें।
      नोट: फ्लोरोरेसेंस तीव्रता की तुलना करके इम्यूनोफ्लोरेसेंस मार्कर का विश्लेषण किया गया।

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Representative Results

हाइपोक्सिक कैंसर-ऑन-ए-चिप को कंप्यूटर-एडेड 3डी सेल-प्रिंटिंग तकनीक का उपयोग करके हाइपोक्सिया और कैंसर से संबंधित विकृति(चित्रा 1)को फिर से काटना विकसित किया गया था। ऑक्सीजन परिवहन और खपत 3 डी ज्यामिति मॉडल का उपयोग कर नकली थे । चिप को कैंसर के ऊतकों(चित्रा 2 ए)में रेडियल ऑक्सीजन प्रसार और कमी की नकल करने के लिए गाढ़ा छल्ले के रूप में डिजाइन किया गया था। एक अंतरिक्ष जहां ऑक्सीजन फैलाया और कोशिकाओं द्वारा भस्म किया गया था की नियंत्रण मात्रा को परिभाषित करने के बाद, केंद्रीय हाइपोक्सिया पीढ़ी के लिए एक उपयुक्त सेलुलर घनत्व कम्प्यूटेशनल परिमित तत्व विश्लेषण(चित्रा 2B,सी)के माध्यम से निर्धारित किया गया था ।

पिछले परिणामों (चित्रा 3) के आधार पर हाइपोक्सिक कैंसर-ऑन-ए-चिप के लिए एक3डीप्रिंटिंग पाथ कोड उत्पन्न किया गया था। बलि पेवा मोल्ड और कैंसर निर्माण की सीएडी फाइलों को एसटीएल फाइल प्रारूप(चित्रा 3 ए,बी)में परिवर्तित कर दिया गया था। प्रिंटिंग पथ को कोडित किया गया था और इन-हाउस सॉफ्टवेयर प्रोग्राम(चित्रा 3 सी)का उपयोग करके बहु-मुद्रण प्रणाली में स्थानांतरित कर दिया गया था।

एक हाइपोक्सिक कैंसर पर एक चिप 3 डी सेल प्रिंटिंग प्रौद्योगिकी का उपयोग कर गढ़े गया था । ठोस कैंसर की संरचनात्मक, जैव रासायनिक और जैव भौतिक विषमता को फिर से काटना, कैंसर निर्माण और गैस-पारगम्य बाधा के लिए एक सौतेली निर्माण प्रक्रिया स्थापित की गई थी, जो एकमात्र तरीका है जिसमें ऑक्सीजन प्रणाली(चित्रा 4A)में प्रवेश कर सकती है। ठोस कैंसर(चित्रा 4B)की शारीरिक विशेषताओं को पुन: पेश करने के लिए एक विभाजित कैंसर-स्ट्रोमा गाढ़ा-रिंग संरचना बनाई गई थी। कैंसर ऊतक की विषम ज्यामिति 3 डी सेल-प्रिंटिंग तकनीक का उपयोग करके विट्रो में महसूस की गई थी। निर्माण प्रक्रिया के दौरान रासायनिक और यांत्रिक तनाव की पुष्टि करने के लिए मुद्रण के बाद सेल व्यवहार्यता का मूल्यांकन किया गया था। हरे रंग की जीवित कोशिकाओं का अनुपात लाल दाग वाली मृत कोशिकाओं की तुलना में काफी अधिक था। मात्रात्मक रूप से, पोस्ट-प्रिंटिंग सेल व्यवहार्यता 2.46%(चित्रा 4C)± 96.92% से अधिक थी। यह परिणाम इस बात की पुष्टि करता है कि विनिर्माण की स्थिति कैंसर कोशिकाओं और स्ट्रोमल कोशिकाओं के लिए उपयुक्त थी।

कैंसर प्रगति(चित्रा 5A)पर हाइपोक्सिक ढाल के प्रभावों को सत्यापित करने के लिए ऑक्सीजन ढाल की उपस्थिति (जीआर+)और अनुपस्थिति (जीआर-)के आधार पर दो समूहों की तुलना की गई थी। दोनों स्थितियों के तहत, परिपक्व सीडी 31+ एंडोथेलियल कोशिकाएं परिधीय क्षेत्रों में मौजूद थीं, जिसने संकेत दिया कि 3 डी बायोप्रिंटिंग तकनीक का उपयोग करके स्थानिक रूप से पैटर्न वाले जीवित निर्माण का उत्पादन किया गया था। जीआर- स्थिति के साथ तुलना में, जीआर+ स्थिति ने एक हाइपोक्सिक ढाल दिखाया, जो HIF1α(चित्रा 5B)की क्रमिक अभिव्यक्ति का संकेत देता है, जहां SHMT2+ छद्मपालीसेडिंग कोशिकाओं और SOX2+ प्लूपिपोटेंट कोशिकाओं को देखा गया, जो ठोस कैंसर की आक्रामक रोगविज्ञानी विशेषता(चित्रा 5C)का प्रतिनिधित्व करता है। अर्थात्, ग्लियोब्लास्टोमा की रोग विशेषताओं को इंजीनियर हाइपोक्सिक स्थिति15के तहत पुनः प्राप्त किया गया था।

Figure 1
चित्रा 1:हाइपोक्सिक कैंसर के विकास का एक योजनाबद्ध-पर-एक चिप। यह आंकड़ा नेचर बायोमेडिकल इंजीनियरिंग 15 (कॉपीराइट,2019) से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2:हाइपोक्सिक कैंसर पर ऑक्सीजन ढाल के गठन का कम्प्यूटेशनल सिमुलेशन ऑन-ए-चिप। (ए)हाइपोक्सिक कैंसर-ऑन-ए-चिप की 3डी ज्यामिति। (ख)ऑक्सीजन वितरण विश्लेषण के लिए क्षेत्र का संकेत देने वाली योजनाबद्ध । यह आंकड़ा नेचर बायोमेडिकल इंजीनियरिंग 15 (कॉपीराइट,2019) से संशोधित किया गया है। (ग)ऑक्सीजन वितरण प्रोफाइल की एक जेट रंग मानचित्र छवि। यह आंकड़ा नेचर बायोमेडिकल इंजीनियरिंग 15 (कॉपीराइट,2019) से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3:हाइपोक्सिक कैंसर-ऑन-ए-चिप के लिए 3डी प्रिंटिंग पाथ कोड का उत्पादन। (ए)बलि पेवा मोल्ड की 3डी ज्यामिति। (ख)एसटीएल फाइल फॉर्मेट में बलि पेवा मोल्ड की एक छवि । (ग)बलि पेवा मोल्ड का जी-कोड । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4:3डी सेल-हाइपोक्सिक कैंसर-ऑन-ए-चिप की प्रिंटिंग। (ए)हाइपोक्सिक कैंसर-ऑन-ए-चिप की निर्माण प्रक्रिया की एक योजनाबद्ध। (ख)कैंसर-स्ट्रोमा गाढ़ा छल्ले की एक मुद्रित हाइपोक्सिक कैंसर-ऑन-ए-चिप और विभाजित संरचना; स्केल बार 200 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करते हैं।(C)व्यवहार्यता का मूल्यांकन करने के लिए 3 डी सेल-मुद्रित कैंसर निर्माण की एक फ्लोरेसेंस छवि; स्केल बार 200 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्र 5:हाइपोक्सिक ढाल का उत्पादन और इंजीनियर ठोस कैंसर की रोग विशेषताओं का मूल्यांकन। (ए)दो अलग-अलग ऑक्सीजन पारगम्यता स्थितियों के तहत प्रायोगिक समूह। (ख)HIF1α का उपयोग कर ऑक्सीजन ढाल की पीढ़ी की छवियों को इम्यूनोदाता; स्केल बार 200 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करते हैं।(C)एसएचएमटी2, SOX2, और सीडी 31 का उपयोग करके हाइपोक्सिक कैंसर की रोग विशेषताओं की छवियों को शामिल करने वाले प्रतिनिधि इम्यूनोसदात; स्केल बार 200 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करते हैं। यह आंकड़ा नेचर बायोमेडिकल इंजीनियरिंग 15 (कॉपीराइट,2019) से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

इस अध्ययन में, हम 3 डी सेल-प्रिंटिंग तकनीक पर आधारित हाइपोक्सिक कैंसर-ऑन-ए-चिप की निर्माण प्रक्रिया का वर्णन करते हैं। डिजाइन की गई चिप में हाइपोक्सिक रेडिएंट के बनने की भविष्यवाणी कंप्यूटर सिमुलेशन के जरिए की गई थी। पर्यावरण जो विषम हाइपोक्सिक ढाल को प्रेरित कर सकता है, उसे 3डी-मुद्रित गैस-पारगम्य बाधा और ग्लास कवर के संयोजन के लिए एक सरल रणनीति के माध्यम से पुन: पेश किया गया था। सिडोपालिसेड और कैंसर स्टेम सेल की एक छोटी आबादी सहित ग्लियोब्लास्टोमा की हाइपोक्सिया से संबंधित रोग विशेषताओं को चिप की हाइपोक्सिक ढाल स्थितियों के तहत फिर से समझाया गया था ।

उत्पादकता और दोहराव में सुधार करने के लिए, पहले प्रकाशित मॉडल15की तुलना में दो प्रमुख निर्माण कदम क्रमिक रूप से संशोधित किए गए थे। पहला, एक पीडीएमएस बाधा का उत्पादन अप्रत्यक्ष रूप से एक इलाज एजेंट युक्त पीडीएमएस की खराब प्रिंटेबिलिटी को दूर करने के लिए किया गया था, जो एक कदम-प्रत्यक्ष मुद्रण विधि के माध्यम से वास्तविक समय में ठीक हो जाता है । इसलिए, उच्च मुद्रण क्षमता वाले जैव संगत पीईडब्ल्यूए को बलि मोल्ड बनाने के लिए अनुकूलित किया गया था और गैस-पारगम्य बाधा बनाने के लिए पीडीएमएस को जोड़ा गया था। दूसरा, स्लाइड ग्लास के प्रकार को हाइड्रोफिलिक-लेपित स्लाइड ग्लास में बदल दिया गया था, जो बायोइंक जमाव और आकार निष्ठा का समर्थन करने के लिए अनुकूल है। अंत में, चिप कुशल मध्यम विनिमय के दोनों सिरों पर मध्यम जलाशयों का निर्माण संभव बनाया गया था ।

3 डी बायोप्रिंटिंग के माध्यम से हाइपोक्सिक कैंसर-ऑन-ए-चिप के प्रत्येक निर्माण चरण में महत्वपूर्ण कारकों को सावधानी से नियंत्रित किया जाना चाहिए। कास्टिंग के दौरान, पीडीएमएस की ऊंचाई बलि पेवा मोल्ड की तुलना में अधिक होनी चाहिए, अन्यथा कवर ग्लास के साथ कड़ा चिप ढीली हो जाती है, जिसका हाइपोक्सिक कोर जेनरेशन पर नकारात्मक प्रभाव पड़ता है। कोलेजन, एक थर्मल संवेदनशील हाइड्रोगेल की छपाई के दौरान, सोल-जेल संक्रमण घटना के कारण नोजल को रोकने के लिए प्रिंटिंग हेड का तापमान 15 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा जाना चाहिए। यदि हाइड्रोगेल अस्थायी रूप से क्रॉस-लिंक हो जाता है, तो अवरुद्ध नोजल को उच्च वायवीय दबाव और तेज सुई का उपयोग करके आसानी से साफ किया जा सकता है। हालांकि, अगर अवरुद्ध गंभीर है, तो हाइड्रोगेल को फिर से तैयार किया जाना चाहिए। इसके अलावा, सेल-प्रिंटिंग प्रक्रिया को सेल व्यवहार्यता को ध्यान में रखते हुए 1 घंटे के भीतर पूरा किया जाना चाहिए।

3 डी बायोप्रिंटिंग तकनीक एक हाइपोक्सिक कैंसर-ऑन-ए-चिप की इंजीनियरिंग की सुविधा प्रदान करती है जिसका उपयोग कैंसर के अंतर्निहित तंत्र का अध्ययन करने और विभिन्न ठोस ट्यूमर15के चिकित्सीय प्रतिरोध की भविष्यवाणी करने के लिए किया जा सकता है। विशेष रूप से, एक्सट्रूशन-आधारित 3 डी बायोप्रिंटिंग तकनीक के उपयोग ने उच्च स्तर की स्वतंत्रता के साथ तेजी से और दोहराव वाले उत्पादन को सक्षम किया। इसके अलावा, कैंसर मॉडलिंग के लिए प्रजनन क्षमता और तेजी से समय सीमा दवा क्षेत्र कैंसर के इलाज के लिए दवा संयोजन उंमीदवारों का एक डेटासेट बनाने के लिए अनुमति देते हैं । हालांकि, प्रौद्योगिकी के सीमित संकल्प के कारण, मुद्रित हाइपोक्सिक-कैंसर-ऑन-ए-चिप कई सौ माइक्रोमीटर की सीमा में उत्पादित होती है, जिसमें बड़ी मात्रा में सामग्री की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, अंतरिक्ष मजबूरी20के तहत उच्च थ्रूपुट दवा स्क्रीनिंग मंच विकसित करना मुश्किल है। इसलिए, सीमित संसाधनों और स्थानिक सीमा के साथ बहुपराघात अध्ययन का समर्थन करने में सक्षम मॉडल विकसित करने के लिए प्रौद्योगिकी में सुधार किया जाना चाहिए ।

विकसित हाइपोक्सिक-कैंसर-ऑन-ए-चिप को ऊतक-विशिष्ट सामग्रियों को नियोजित करके ऊतक-विशिष्ट कैंसर मॉडलिंग पर लागू किया जा सकता है, जैसे कि एक डिसेलुलरीकृत एक्सट्रासेलुलर मैट्रिक्स (ईसीएम) से प्राप्त हाइड्रोजेल। क्योंकि ईसीएम की जैव रासायनिक और शारीरिक भिन्नताएं सेलुलर कार्यों को प्रभावित करती हैं, इसलिए अंग-विशिष्ट कैंसर माइक्रोएनवायरमेंट के साथ कई कैंसर प्रकारों का बेहतर अनुकरण21का एहसास हो सकता है। इसके अलावा, इंजीनियर रक्त वाहिकाओं सहित अन्य इंजीनियर ऊतक निर्माणों के साथ संयोजन करके, जिनका कैंसर विकास पर महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ता है, एंजियोजेनिक, इम्यूनोजेनिक और मेटास्टैटिक गुणों में गतिशील रोगविज्ञानी परिवर्तनों का अध्ययन किया जा सकता है। इसके अलावा, व्यक्तिगत कैंसर चिकित्सा रोगी व्युत्पन्न कोशिकाओं15को रोजगार के द्वारा विकसित चिप के साथ पूरा किया जा सकता है । नैदानिक उपचार से पहले दवा संवेदनशीलता का परीक्षण समय में एक व्यक्तिगत रोगी के लिए एक उपयुक्त चिकित्सीय आहार खोजने की प्रक्रिया के दौरान चिकित्सा की प्रभावकारिता में सुधार करने के लिए एक महत्वपूर्ण कदम होगा। रोगी-व्युत्पन्न स्रोत के साथ एक रोगी-विशिष्ट कैंसर मॉडल से रोगी प्रोफाइलिंग में सुधार होने की उम्मीद है ताकि प्रत्येक रोगी की रोगविज्ञान और रसायनोसेंसिटिवता में अंतर की भविष्यवाणी की जा सके। पिछले अध्ययन में, विभिन्न दवा संयोजनों के खिलाफ रोगी-विशिष्ट चिकित्सीय प्रभावों की भविष्यवाणी 3 डी मुद्रित हाइपोक्सिक कैंसर-ऑन-ए-चिप का उपयोग करके उचित समय सीमा (1-2 सप्ताह) के भीतर की गई थी, जिसके परिणामस्वरूप अन्य तरीकों की तुलना में अपेक्षाकृत त्वरित निष्कर्ष निकलते हैं, जो रोगी-विशिष्ट प्रीक्लिनिकल मॉडल15के लिए क्षमता का सुझाव देते हैं।

संक्षेप में, कैंसर-ऑन-ए-चिप की 3डी सेल-प्रिंटिंग एक विषम कैंसर माइक्रोएनवायरमेंट को फिर से काटने के लिए अनुकूल है। नकल किए गए माइक्रोएनवायरमेंट कैंसर की रोग प्रगति को चलाते हैं, जिसमें हाइपोक्सिया के परिणामस्वरूप एक परिगलित कोर का गठन शामिल है। इस प्रोटोकॉल को कैंसर रोधी दवा परीक्षण और रोगी-विशिष्ट कैंसर मॉडल पर लागू किया जा सकता है। इस संबंध में, हम उम्मीद करते हैं कि यह अत्यधिक नियंत्रणीय दृष्टिकोण विभिन्न कैंसर मॉडलों के निर्माण के लिए फायदेमंद हो सकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास कोई खुलासे नहीं हैं ।

Acknowledgments

इस शोध को नेशनल रिसर्च फाउंडेशन ऑफ कोरिया (एनआरएफ) द्वारा समर्थित किया गया था जो शिक्षा मंत्रालय (नंबर 2020R1A6A1A03047902 और एनआरएफ-2018H1A1A1062091) और कोरिया सरकार (MSIT) (No) द्वारा वित्त पोषित था । एनआरएफ-2019R1C1C1009606 और एनआरएफ-2019R1A3A3005437) ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cells
Human umbilical vein endothelial cells Promocell C-12200
U-87 MG cells ATCC ATCC HTB-14
Disposable
0.2 μm syringe filter Sartorius 16534-K
10 mL disposable syringe Jung Rim 10ml 21G32
10 mL glass vial Hubena A0039
10 mL Serological pipette tip SPL lifescience 91010
15 mL conical tube SPL lifescience 50015
18G plastic needle Musashi engineering PN-18G-B
20G plastic tapered dispense tip Musashi engineering TPND-20G-U
22x50 glass cover MARIENFIELD 0101142
25 mL Serological pipette tip SPL lifescience 90125
3 mL disposable syringes HENKE-JET 4020-X00V0
40 µm cell strainer Falcon 352360
5 mL Serological pipette tip SPL lifescience 91005
50 mL conical tube SPL lifescience 50050
50 mL Serological pipette tip SPL lifescience 90150
50N precision nozzle Musashi engineering HN-0.5ND
Aluminum foil SINKWANG
Capillary tips Gilson CP1000
Cell-scrapper SPL lifescience 90030
Confocal dish SPL lifescience 200350
Parafilm Bemis PM996
Pre-coated histology slide MATSUNAMI MAS-11
Reservoir SPL lifescience 23050
T-75 cell culture flask SPL lifescience 70075
Equipment
3DX printer T&R Biofab
Autoclave JEIOTECH AC-12
Centrifuger Cyrozen 1580MGR
Confocal laser microscopy Olympus Life Science FV 1000
Fluorescence microscope FISHER SCEINTIFIC O221S366
Forcep Korea Ace Scientific HC.203-30
Hand tally counter KTRIO
Hemocytometer MARIENFIELD 0650030
Incubator Panasonic MCO-170AIC
Laminar flow cabinet DAECHUNG SCIENCE CB-BMMS C-001
Metal syringe IWASHITA engineering SUS BARREL 10CC
Operating Scissors Hirose HC.13-122
Oven JEIOTECH OF-12, H070023
Positive displacement pipette GILSON NJ05652
Refrigerator SAMSUNG CRFD-1141
Voltex Mixer DAIHAN scientific VM-10
Water bath DAIHAN SCIENTIFIC WB-11
Water purifier WASSER LAB DI-GR
Materials
0.25 % Trypsin-EDTA Gibco 25200-072
10x PBS Intron IBS-BP007a
4% Paraformaldehyde Biosesang
70% Ethanol Daejung 4018-4410
Anti-CD31 antibody Abcam ab28364
Anti-HIF-1 alpha antibody Abcam ab16066
Anti-SHMT2/SHMT antibody Abcam ab88664
Anti-SOX2 antibody Abcam ab75485
Bovine Serum Albumin Thermo scientific J10857-22
Collagen from porcine skin Dalim tissen PC-001-1g
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) Thermofisher D1306
Endothelial Cell Growth Medium-2 Promocell C22011
Fetal bovine serum Gibco 12483-020
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Theromofisher A-11001
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 Theromofisher A-11012
High-glucose Dulbecco’s Modified Eagle Medium(DMEM) Hyclone SH30243-0
Hydrochloric acid Sigma-Aldrich 311413-100ML
Live/dead assay kit Invitrogen L3224
Mouse IgG1, kappa monoclonal [15-6E10A7] - Isotype Control Abcam ab170190
Penicillin/streptomycin Gibco 15140-122
Phenol red solution Sigma-Aldrich P0290-100ML
Poly(ethylene-vinyl acetate)  Poly science 06108-500
Polydimethylsiloxane Dowhitech sylgard 184
Rabbit IgG, polyclonal - Isotype Control Abcam ab37415
Sodium hydroxide solution Samchun S0610
Triton X-100 Biosesang TRI020-500-50
Trypan Blue Sigma-Aldrich T8154
Software
COMSOL Multiphysics 3.5a COMSOL AB
IMS beamer in-house software
SolidWorks Package Dassault Systems SolidWorks Corporation

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References

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बायोइंजीनियरिंग अंक 167 3डी सेल-प्रिंटिंग 3डी माइक्रोफिजियोलॉजिकल सिस्टम ऑर्गन-ऑन-ए-चिप सॉलिड कैंसर माइक्रोएनवायरनमेंट हाइपोक्सिया ऑक्सीजन रेडिएंट पैथोलॉजी
ठोस कैंसर की रीकैपिटलिंग पैथोलॉजिक प्रगति के लिए 3डी सेल-मुद्रित हाइपोक्सिक कैंसर-ऑन-ए-चिप
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Park, W., Bae, M., Hwang, M., Jang,… More

Park, W., Bae, M., Hwang, M., Jang, J., Cho, D. W., Yi, H. G. 3D Cell-Printed Hypoxic Cancer-on-a-Chip for Recapitulating Pathologic Progression of Solid Cancer. J. Vis. Exp. (167), e61945, doi:10.3791/61945 (2021).

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