3D Cell-Printed Hypoxic Cancer-on-a-Chip Para Recapitular la Progresión Patológica Del Cáncer Sólido
Summary
La hipoxia es un sello distintivo del microambiente tumoral y desempeña un papel crucial en la progresión del cáncer. Este artículo describe el proceso de la fabricación de un cáncer-en-una-viruta hipóxico basado en tecnología de célula-impresión 3D para recapitular una patología hipoxia-relacionada del cáncer.
Abstract
El microambiente del cáncer tiene un impacto significativo en la progresión de la enfermedad. Particularmente, la hipoxia es el conductor dominante de la supervivencia, de la invasión, y de la quimiorresistencia del cáncer. Aunque varios modelos ines vitro se hayan desarrollado para estudiar patología hipoxia-relacionada del cáncer, la interacción compleja del microambiente del cáncer observado in vivo no se ha reproducido todavía debido a la carencia del control espacial exacto. En cambio, se han propuesto enfoques de biofabricación 3D para crear sistemas microfisiológicos para una mejor emulación de la ecología del cáncer y una evaluación precisa del tratamiento contra el cáncer. Adjunto, proponemos un acercamiento de la célula-impresión 3D para fabricar un cáncer-en-un-viruta hipóxico. Los componentes hipoxia-que inducían en la viruta fueron determinados basados en una simulación de computadora de la distribución del oxígeno. los anillos concéntricos del Cáncer-tejido conectador fueron impresos usando los bioinks que contenían las células del glioblastoma y las células endoteliales para recapitular un tipo de cáncer sólido. La viruta resultante realizó hipoxia central y agravó malignidad en cáncer con la formación de marcadores patofisiológicos representativos. En general, se espera que el enfoque propuesto para crear un sistema microfisiológico sólido-cáncer-mimético cierre la brecha entre los modelos in vivo e in vitro para la investigación del cáncer.
Introduction
El microambiente del cáncer es un factor crítico que impulsa la progresión del cáncer. Los componentes múltiples, incluyendo señales bioquímicas, biofísicas, y celulares, determinan las características patológicas del cáncer. Entre éstos, la hipoxia se asocia fuertemente a supervivencia, a la proliferación, y a la invasión del cáncer1. Debido al crecimiento y a la división ilimitados de células cancerosas, los alimentos y el oxígeno se agotan continuamente, y se genera un gradiente hipóxico. En condiciones de bajo oxígeno, las células activan el factor de transcripción inducible por hipoxia (HIF)-cascada molecular asociada. Este proceso induce un núcleo necrótico, desencadena cambios metabólicos e inicia hiperplasia de vasos sanguíneos y metástasis2,3. Posteriormente, la hipoxia en las células cancerosas causa la destrucción de los tejidos normales vecinos. Además, la hipoxia se asocia fuertemente a la resistencia terapéutica de tumores sólidos de maneras multifactoriales. La hipoxia puede impedir gravemente la radioterapia, ya que la radiosensibilidad es limitada debido a las especies reactivas de oxígeno1,4. Además, disminuye los niveles de pH de los microambientes de cáncer, lo que disminuye la acumulación de fármacos1. Por lo tanto, la reproducción de las características patológicas relacionadas con la hipoxia in vitro es una estrategia prometedora para los resultados científicos y preclínicos.
Modelar un microambiente específico del cáncer es esencial para comprender el desarrollo del cáncer y explorar los tratamientos apropiados. Aunque los modelos animales han sido ampliamente utilizados debido a su fuerte relevancia fisiológica, existen cuestiones relacionadas con las diferencias de especies y problemas éticos5. Además, aunque los modelos 2D y 3D convencionales permiten la manipulación y la proyección de imagen en tiempo real de células cancerosas para un análisis profundizado, su complejidad arquitectónica y celular no se puede recapitular completamente. Por ejemplo, los modelos esferoides de cáncer han sido ampliamente utilizados, ya que la agregación de células cancerosas en un esferoide puede generar naturalmente hipoxia en el núcleo. Además, se ha producido un gran número de esferoides celulares de tamaño uniforme utilizando sistemas de múltiples pozos basados en plástico o silicona6,7. Sin embargo, la menor flexibilidad con respecto a la captura de la estructura heterogénea exacta de los tejidos cancerosos con plataformas convencionales ha requerido el establecimiento de una tecnología avanzada de biofabricación para construir una plataforma altamente biomimética para mejorar la investigación del cáncer8.
Los sistemas microfisiológicos 3D (MPS) son herramientas útiles para recapitular la geometría compleja y la progresión patológica de las células cancerosas9. Mientras que las células cancerosas detectan el gradiente bioquímico de factores de crecimiento y de chemokines y la heterogeneidad mecánica reproducida en el sistema, las características importantes del desarrollo del cáncer se pueden investigar in vitro. Por ejemplo, la viabilidad del cáncer, la malignidad metastática, y la resistencia a los medicamentos dependiendo de las concentraciones diversas del oxígeno se ha estudiado usandompss 10,11. A pesar de los avances recientes, la generación de condiciones hipóxicas de modelos in vitro se basa en procedimientos de fabricación complejos, incluida la conexión con bombas de gas físicas. Por lo tanto, se necesitan métodos simples y flexibles para construir microambientes específicos del cáncer.
La tecnología de impresión celular 3D ha ganado considerable atención debido a su control preciso de la disposición espacial de los biomateriales para recapitular arquitecturas biológicas nativas12. En particular, esta tecnología supera las limitaciones existentes de los modelos de hipoxia 3D debido a su alta controlabilidad y viabilidad para construir las características espaciales del microambiente del cáncer. La impresión 3D también facilita la fabricación asistida por computadora a través de un proceso capa por capa, proporcionando así una construcción rápida, precisa y reproducible de geometrías complejas para imitar arquitecturas de tejidos reales. Además de las ventajas de las estrategias de fabricación existentes para los MPS 3D, las características fisiopatológicas de la progresión del cáncer se pueden reproducir modelando los componentes bioquímicos, celulares y biofísicos13,14.
Aquí, presentamos una estrategia de impresión celular 3D para un cáncer hipóxico en un chip para recapitular la heterogeneidad de un cáncer sólido(Figura 1)15. Los parámetros de fabricación se determinaron mediante una simulación computacional de la formación de hipoxia central en el sistema. los anillos concéntricos del Cáncer-tejido conectador fueron impresos usando los bioinks del colágeno que contenían las células del glioblastoma y las células endoteliales para emular la patofisiología del glioblastoma, un tipo de cáncer sólido. La formación de un gradiente radial del oxígeno agravó malignidad del cáncer, indicando agresividad consolidada. Además, indicamos perspectivas futuras para las aplicaciones del chip a modelos preclínicos específicos del paciente. Se espera que el enfoque propuesto para crear un sistema microfisiológico sólido-cáncer-mimético cierre la brecha entre los modelos in vivo e in vitro de cáncer.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este estudio, describimos el proceso de fabricación de un cáncer-en-un-viruta hipóxico basado en tecnología de la célula-impresión 3D. La formación del gradiente hipóxico en el chip diseñado se predijo a través de simulaciones por computadora. El ambiente que puede inducir un gradiente hipóxico heterogéneo se reprodujo a través de una estrategia simple que combina la barrera permeable al gas impresa en 3D y la cubierta de vidrio. Las características patológicas hipoxia-relacionadas del glioblastoma, inc…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta investigación fue apoyada por la Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF) financiada por el Ministerio de Educación (No. 2020R1A6A1A03047902 y NRF-2018H1A2A1062091) y el gobierno de Corea (MSIT) (No. NRF-2019R1C1C1009606 y NRF-2019R1A3A3005437).
Materials
| Cells | |||
| Human umbilical vein endothelial cells | Promocell | C-12200 | |
| U-87 MG cells | ATCC | ATCC HTB-14 | |
| Disposable | |||
| 0.2 μm syringe filter | Sartorius | 16534-K | |
| 10 mL disposable syringe | Jung Rim | 10ml 21G32 | |
| 10 mL glass vial | Hubena | A0039 | |
| 10 mL Serological pipette tip | SPL lifescience | 91010 | |
| 15 mL conical tube | SPL lifescience | 50015 | |
| 18G plastic needle | Musashi engineering | PN-18G-B | |
| 20G plastic tapered dispense tip | Musashi engineering | TPND-20G-U | |
| 22×50 glass cover | MARIENFIELD | 0101142 | |
| 25 mL Serological pipette tip | SPL lifescience | 90125 | |
| 3 mL disposable syringes | HENKE-JET | 4020-X00V0 | |
| 40 µm cell strainer | Falcon | 352360 | |
| 5 mL Serological pipette tip | SPL lifescience | 91005 | |
| 50 mL conical tube | SPL lifescience | 50050 | |
| 50 mL Serological pipette tip | SPL lifescience | 90150 | |
| 50N precision nozzle | Musashi engineering | HN-0.5ND | |
| Aluminum foil | SINKWANG | ||
| Capillary tips | Gilson | CP1000 | |
| Cell-scrapper | SPL lifescience | 90030 | |
| Confocal dish | SPL lifescience | 200350 | |
| Parafilm | Bemis | PM996 | |
| Pre-coated histology slide | MATSUNAMI | MAS-11 | |
| Reservoir | SPL lifescience | 23050 | |
| T-75 cell culture flask | SPL lifescience | 70075 | |
| Equipment | |||
| 3DX printer | T&R Biofab | ||
| Autoclave | JEIOTECH | AC-12 | |
| Centrifuger | Cyrozen | 1580MGR | |
| Confocal laser microscopy | Olympus Life Science | FV 1000 | |
| Fluorescence microscope | FISHER SCEINTIFIC | O221S366 | |
| Forcep | Korea Ace Scientific | HC.203-30 | |
| Hand tally counter | KTRIO | ||
| Hemocytometer | MARIENFIELD | 0650030 | |
| Incubator | Panasonic | MCO-170AIC | |
| Laminar flow cabinet | DAECHUNG SCIENCE | CB-BMMS C-001 | |
| Metal syringe | IWASHITA engineering | SUS BARREL 10CC | |
| Operating Scissors | Hirose | HC.13-122 | |
| Oven | JEIOTECH | OF-12, H070023 | |
| Positive displacement pipette | GILSON | NJ05652 | |
| Refrigerator | SAMSUNG | CRFD-1141 | |
| Voltex Mixer | DAIHAN scientific | VM-10 | |
| Water bath | DAIHAN SCIENTIFIC | WB-11 | |
| Water purifier | WASSER LAB | DI-GR | |
| Materials | |||
| 0.25 % Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-072 | |
| 10x PBS | Intron | IBS-BP007a | |
| 4% Paraformaldehyde | Biosesang | ||
| 70% Ethanol | Daejung | 4018-4410 | |
| Anti-CD31 antibody | Abcam | ab28364 | |
| Anti-HIF-1 alpha antibody | Abcam | ab16066 | |
| Anti-SHMT2/SHMT antibody | Abcam | ab88664 | |
| Anti-SOX2 antibody | Abcam | ab75485 | |
| Bovine Serum Albumin | Thermo scientific | J10857-22 | |
| Collagen from porcine skin | Dalim tissen | PC-001-1g | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermofisher | D1306 | |
| Endothelial Cell Growth Medium-2 | Promocell | C22011 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 12483-020 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Theromofisher | A-11001 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 | Theromofisher | A-11012 | |
| High-glucose Dulbecco’s Modified Eagle Medium(DMEM) | Hyclone | SH30243-0 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 311413-100ML | |
| Live/dead assay kit | Invitrogen | L3224 | |
| Mouse IgG1, kappa monoclonal [15-6E10A7] – Isotype Control | Abcam | ab170190 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Phenol red solution | Sigma-Aldrich | P0290-100ML | |
| Poly(ethylene-vinyl acetate) | Poly science | 06108-500 | |
| Polydimethylsiloxane | Dowhitech | sylgard 184 | |
| Rabbit IgG, polyclonal – Isotype Control | Abcam | ab37415 | |
| Sodium hydroxide solution | Samchun | S0610 | |
| Triton X-100 | Biosesang | TRI020-500-50 | |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| Software | |||
| COMSOL Multiphysics 3.5a | COMSOL AB | ||
| IMS beamer | in-house software | ||
| SolidWorks Package | Dassault Systems SolidWorks Corporation | ||
References
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