Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

3D Celle-Printed Hypoxic Cancer-on-a-Chip for at opsummere Patologisk Progression af solid kræft

Published: January 5, 2021 doi: 10.3791/61945
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2, 1, 1,3
1Department of Mechanical Engineering, Pohang University of Science and Technology (POSTECH), 2Department of Creative IT Engineering, Pohang University of Science and Technology (POSTECH), 3Department of Rural and Biosystems Engineering, College of Agriculture and Life Sciences, Chonnam National University
* These authors contributed equally

Summary

Hypoxi er kendetegnende for tumor mikromiljø og spiller en afgørende rolle i kræft progression. Denne artikel beskriver fremstillingsprocessen for en hypoksisk kræft-on-a-chip baseret på 3D-celle-udskrivning teknologi til at opsummere en hypoxi-relateret patologi af kræft.

Abstract

Kræftmikromiljø har en betydelig indvirkning på sygdommens progression. Især hypoxi er den vigtigste drivkraft for kræft overlevelse, invasion, og chemoresistance. Selv om der er udviklet flere in vitro-modeller til undersøgelse af hypoxirelateret kræftpatologi, er det komplekse samspil mellem det kræftmikromiljø, der er observeret in vivo, endnu ikke blevet gengivet på grund af manglen på præcis rumlig kontrol. I stedet er der foreslået 3D-biofabrikationsmetoder for at skabe mikrofysiologiske systemer til bedre emulering af kræftøkologi og nøjagtig evaluering af kræftbehandling. Heri foreslår vi en 3D-celleudskrivningsmetode for at fremstille en hypoksisk kræft-på-en-chip. De hypoxifremkaldende komponenter i chippen blev bestemt baseret på en computersimulering af iltfordelingen. Kræft-stroma koncentriske ringe blev trykt ved hjælp af bioinks indeholder glioblastoma celler og endotelceller til at opsummere en type af fast kræft. Den resulterende chip realiseret centrale hypoxi og forværret malignitet i kræft med dannelsen af repræsentative patofysilogiske markører. Samlet set forventes den foreslåede metode til oprettelse af et mikrofysiologiske system med fast kræft-mimetisk at bygge bro mellem in vivo- og in vitro-modeller for kræftforskning.

Introduction

Kræftmikromiljøet er en kritisk faktor, der driver kræftfremgang. Flere komponenter, herunder biokemiske, biofysiske og cellulære signaler, bestemmer kræftens patologiske træk. Blandt disse er hypoxi stærkt forbundet med kræft overlevelse, spredning og invasion1. På grund af den ubegrænsede vækst og opdeling af kræftceller, næringsstoffer og ilt er løbende udtømt, og en hypoxisk gradient genereres. Under forhold med lavt iltindhold aktiverer celler hypoxi-induktionsfaktor (HIF)-associeret molekylær kaskade. Denne proces fremkalder en nekrotisk kerne, udløser metaboliske ændringer og indleder blodkarhyperplasi og metastase2,3. Efterfølgende forårsager hypoxi i kræftceller ødelæggelsen af nærliggende normale væv. Desuden er hypoxi stærkt forbundet med den terapeutiske resistens af faste tumorer i multifaktorielle manerer. Hypoxi kan hæmme strålebehandlingen alvorligt, da strålefølsomhed er begrænset på grund af reaktiv iltart1,4. Derudover reducerer det pH-niveauer af kræftmikromiljøer, hvilket reducerer lægemiddelakkumulering1. Derfor er reproduktion af patologiske træk relateret til hypoxi in vitro en lovende strategi for videnskabelige og prækliniske fund.

Modellering af et specifikt mikromiljø af kræft er afgørende for at forstå kræftudvikling og udforske passende behandlinger. Selv om dyremodeller er blevet udbredt på grund af deres stærke fysiologiske relevans, findes der spørgsmål vedrørende artsforskelle og etiske problemer5. Selv om konventionelle 2D- og 3D-modeller giver mulighed for manipulation og realtidsbilleddannelse af kræftceller til en dybdegående analyse, kan deres arkitektoniske og cellulære kompleksitet ikke opsummeres fuldt ud. For eksempel har kræft sfæroid modeller været meget udbredt, som kræft celle sammenlægning i en sfæroide kan naturligt generere hypoxi i kernen. Desuden er der produceret et stort antal cellulære sfæroider af ensartet størrelse ved hjælp af plast- eller silikonebaserede multibrøndsystemer6,7. Den lavere fleksibilitet med hensyn til at indfange den nøjagtige heterogene struktur af kræftvæv med konventionelle platforme har imidlertid krævet etablering af en avanceret biofabrikationsteknologi for at opbygge en meget biomatisk platform til forbedring afkræftforskningen 8.

3D-mikrofysiologiske systemer (MPS'er) er nyttige værktøjer til at opsummere kræftcellernes komplekse geometri og patologiske progression9. Som kræftceller forstand biokemiske gradient af vækstfaktorer og kemokser og den mekaniske heterogenitet gengivet på systemet, vigtige træk ved kræft udvikling kan undersøges in vitro. For eksempel, kræft levedygtighed, metastatisk malignitet, og resistens over for lægemidler afhængigt af de forskellige iltkoncentrationer er blevet undersøgt ved hjælp af MPSs10,11. På trods af de seneste fremskridt er generering af hypoksiske forhold for in vitro-modeller afhængig af komplekse fabrikationsprocedurer, herunder forbindelse med fysiske gaspumper. Derfor er der behov for enkle og fleksible metoder til opbygning af kræftspecifikke mikromiljøer.

3D-celletrykteknologien har fået betydelig opmærksomhed på grund af dens præcise kontrol med det rumlige arrangement af biomaterialer til at sammenfatte indfødte biologiske arkitekturer12. Denne teknologi overvinder især de eksisterende begrænsninger i 3D-hypoximodeller på grund af dens høje kontrollerbarhed og gennemførlighed for opbygning af de rumlige træk ved kræftmikromiljøet. 3D-udskrivning letter også computerstøttet produktion gennem en lag-for-lag-proces, hvilket giver en hurtig, præcis og reproducerbar konstruktion af komplekse geometrier til at efterligne faktiske vævsarkitekturer. Ud over fordelene ved eksisterende produktionsstrategier for 3D MPS'er kan de patofysiologiske træk ved kræftsprogression reproduceres ved at mønstre de biokemiske, cellulære og biofysiske komponenter13,14.

Heri præsenterer vi en 3D-celleudskrivningsstrategi for en hypoksisk kræft-på-en-chip til at opsummere heterogeniteten af en solid kræft (Figur 1)15. Fabrikationsparametrene blev bestemt gennem en beregningssimulering af central hypoxidannelse i systemet. Kræft-stroma koncentriske ringe blev trykt ved hjælp af kollagen bioinks indeholder glioblastoma celler og endotelceller til at efterligne patofysiologi af glioblastoma, en type af solid kræft. Dannelsen af en radial ilt gradient forværret kræft malignitet, hvilket indikerer styrket aggressivitet. Desuden angiver vi fremtidige perspektiver for chippens anvendelse på patientspecifikke prækliniske modeller. Den foreslåede metode til oprettelse af et mikrofysiologiske system med fast kræft forventes at bygge bro mellem in vivo- og in vitro-modeller af kræft.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Computersimulering af iltgradientdannelse

  1. Generation af en 3D-geometrimodel til hypoksisk kræft-on-a-chip-udskrivning
    1. Kør en 3D CAD-software.
    2. Skitse geometri model af hypoksisk kræft-on-a-chip. Klik på Skitse og vælg det ønskede plan for at tegne geometrien. Se tegningen (Figur 2A) for detaljeskalaen for hver del.
    3. Angiv geometriens tykkelse ved at klikke på Funktionsfremspringsbolig/-base. Angiv den ønskede tykkelse (se figur 2A) i den tomme boks, og vælg det grønne kontrolikon for at danne 3D-geometrien.
      BEMÆRK: Dimensionen af kræft-on-a-chip er defineret ud fra de ønskede mængder af medier og hydrogel. I dette eksperiment var de ønskede mængder medier og hydrogel henholdsvis ca. 1.500 μL og 500 μL baseret på de tidligere praktiske erfaringer med opløsning af ekstruderingsbaseret bioprinter.
    4. Gem geometrifilen som et 3D CAD-filformat (.prt eller .stl).
  2. Bestemmelse af celletæthed til induktion af hypoksisk kerne
    1. Kør et fysisk diffusionssimuleringsprogram.
    2. Klik på LiveLink, og vælg det anvendte CAD-program. Klik på Synkroniser for at importere geometrien af den hypoksiske kræft-on-a-chip på simuleringsprogrammet. Da kammerets indre rum vil blive fyldt med et kulturmedium i en faktisk eksperimentel indstilling, vil ilt spredes over kammerets indre rum og den cellulære konstruktion, som vil bestå af cellebelastede hydrogeler.
      BEMÆRK: Se tidligere undersøgelse for at få nærmere oplysninger om de fysiske parametre15.
    3. Definer den importerede 3D-geometri som et kontrolvolumen af det rum, hvori ilt diffunderer, og cellerne forbruger ilt (Figur 2B).
    4. Kør en computeranalyse for gasspredningsanalyse efter en brugervejledning og tidligere etablerede metoder16,17.
    5. Eksporter de anslåede iltkoncentrationsdata over tværsnit A-A' på hvert tidspunkt efter brugervejledningen. Den styrende ligning er baseret på Ficks første lov, som udtrykt i Eq. (1) (Figur 2C).
      Equation 1
      hvor c er koncentrationen, D er ilt diffusion koefficienten, Ncelle er tætheden af cellerne, Equation 2 er den maksimale op-take sats af ilt, og Km er Michaelis-Menten konstant. Konstanterne blev anvendt som beskrevet i en tidligere publikation15.
      BEMÆRK: Hvert tidspunkt betyder et trinpunkt for at observere iltspredning ændre sig over tid.
    6. Vurder, om det minimale iltniveau når en tærskel for hypoxi, og gentag computeranalyseprocessen med en forøgelse eller reduktion af celletætheden.
      BEMÆRK: Definer, at hypoxigradient dannes i konstruktionen, hvis iltniveauet på 80% i hydrogelområdet er mindre end 0,02 mM efter 24 timer.
    7. Bekræft antallet af celler, der kræves for at generere den iltgradientfremkaldende hypoxi i den centrale region fra Ficks første lov i trin 1.2.5, og simuleringsresultaterne fra trin 1.2.6.
      BEMÆRK: I denne protokol var cellenummeret 2 × 106 celler/hver konstruktion.

2. Cellekultur af kræftceller og stromale celler

  1. Forberedelse af cellekulturmedier for at undgå fysiologisk stress
    1. For U-87 MG-celler (udødeliggjort human glioblastoma cellelinje) skal du placere 12 mL af dulbeccos modificerede Eagle-medium med 10% føtalt kvægserum 100 U/mL penicillin og 100 μg/mL streptomycin i en T-75 cellekulturkolbe i en 37 °C, 5% CO2 befugtet inkubator i 30 minutter for at minimere mediumets termiske og alkaliske virkninger på cellerne.
      BEMÆRK: Glioblastoma blev valgt som en form for solid kræft, fordi det har aggressive egenskaber i et hypoksisk miljø. Andre forskellige typer af kræft kan anvendes på denne model.
    2. For humane navlestrengsåre endotelceller (HUVECs), sted 12 mL endotelcelle vækstmedium i en T-75 cellekultur kolbe i en 5% CO2 befugtet inkubator ved 37 °C i 30 min.
      BEMÆRK: HUVEC'er blev valgt, fordi det er en af de mest repræsentative endotelcellelinjer. Forskellige typer af stromale celler kan også anvendes på denne model.
  2. Hurtig optøning af kryopreserverede kræftceller og stromale celler og vedligeholdelse af dem
    1. Flyt kryoovials indeholdende 5 x 105 U-87 MG-celler og HUVEC'er fra væske nitrogenbeholderen til et laminar flowkabinet. Løsn og retighten straks hætten for at frigøre det indre tryk.
    2. Læg forsigtigt de kryopreserverede celler i et vandbad ved 37 °C i 2 minutter, og hold hætten ude af vandet. Skyl hætteglassene med 70% ethanol under laminar flow for at forhindre forurening.
    3. De optøede celler overføres til de kolber, der indeholder det forberedte cellekulturmedie, der er beskrevet i trin 2.1, og de celleholdige kolber anbringes i en 5% CO 2-befugtet inkubator ved 37 °C til cellegenvinding.
    4. Opdater cellekulturmediet hver anden dag, og bevar cellevæksten.
    5. Efter 24 timers optøning skal cellekulturmedierne udskiftes for at undgå cytotoksicitet af dimethylsulfoxid (DMSO), som blev brugt til cellefrysning. Brug HUVEC'er, som har gennemgået mindre end 6 passager.

3. Fremstilling af kollagen præ-gel opløsning

  1. Opløselighed af kollagensvamp med 0,1 N saltsyre (HCl)
    1. Der fremstilles en opløsning på 0,1 N HCl, og den filtreres med et 0,2 μm sprøjtefilter.
    2. For 3 ml af en 1% (w/v) neutraliseret kollagen præ-gel opløsning, forberede kollagen svampe skåret i 5 x 5 mm2 stykker og vejer 30 mg.
    3. Overfør de udskårne kollagenstykker til et sterilt 10 mL glasglas.
      BEMÆRK: Forbered 1,5 gange volumen af den krævede kollagen hydrogel, i betragtning af tabet af hydrogel på grund af den klæbrige egenskab ved kollagenopløsningen.
    4. Der tilsættes 2,4 mL 0,1 N HCl i det kollagenholdige glasglas, og det inkuberes på vippen ved 15 omdrejninger i minuttet og 4 °C i 3 dage.
      BEMÆRK: Mængden af 0,1 N HCl-opløsningen var fire femtedele af det sidste volumen af påkrævet kollagenhydrogel. I dette tilfælde blev der forberedt 3 mL kollagen.
    5. Efter fordøjelsen sigtes de ufordøjede kollagenpartikler ved hjælp af en 40 μm cellesien. Den sure kollagenopløsning opbevares ved 4 °C og anvendes inden for 7 dage.
  2. pH-justering for 1% neutraliseret kollagen pre-gel opløsning
    1. Centrifuge den sure kollagenopløsning ved 1224 x g i 5 min ved 4 °C.
    2. Der tilsættes 30 μL phenolrød opløsning som pH-indikator til en endelig koncentration på 1% (v/v) og 300 μL 10x fosfatbuffer (PBS) buffer til en endelig koncentration på 10% (v/v) i kollagenforgelopløsningen.
    3. Neutralisere pH til 7 med 1 N natriumhydroxid (NaOH), kontrollere farveændringen.
      BEMÆRK: Baseret på formlen, mol H+ = molarity H+ x volumen H+ = mol OH-= molarity OH- x volumen OH-, tilsæt 240 μL Af NaOH.
    4. Tilsæt destilleret vand for at opnå et samlet volumen på 3 mL.
    5. Efter pH-justering opbevares den neutraliserede kollagenforgelopløsning på 1 % (w/v) ved 4 °C og anvendes inden for 3 dage.
      BEMÆRK: For at forkontrollere geleringen af den neutraliserede kollagenforgelopløsning skal der laves 50 μL kollagendråber på en lille skål ved hjælp af en positiv forskydningspipette og inkuberes i en 37 °C inkubator i 1 time. Se følgende tre metoder til at kontrollere krydslinking af kollagendråber.
    6. Kontroller, om farven på kollagen er ændret til uigennemsigtig hvid fra gennemsigtig farve.
    7. Vip beholderen og kontroller, om kollagenen klæbes til bunden af beholderen.
    8. Hæld 1x PBS på dråberne og kontroller, om kollagenkonstruktionen ikke er brudt i opløsningen.

4.3D trykning af gas-gennemtrængelig barriere

  1. 3D-print af en offerpoly (ethylen-vinylacetat) (PEVA) skimmelsvamp
    1. Generer 3D-geometrien af den offer PEVA-form, der er defineret i trin 1, ved hjælp af en 3D CAD-software (Figur 3A).
      BEMÆRK: 3D-geometrien og den detaljerede modelskala, herunder dimension, enheder og linjetyper, blev vist i figur 2A.
    2. Konverter 3D CAD-filen til et STL-filformat ved at klikke på Filer | Filtypen Gem som STL. Klik også på Mulighed | Outputformular som ASCII til oprettelse af G-kode.
    3. Klik på Filer | Åbn STL-filen, og vælg den gemte STL-fil for at importere den genererede STL-fil. Klik på Slice model af STL-CAD veksler til automatisk at generere G-koden for den hellige PEVA skimmel(Figur 3B, C).
      BEMÆRK: Trykstien genereres med tilslutning af gennemskærede punkter mellem STL-filens grundlæggende figur og udskæringsplanet (dvs. lag). Dybest set er den grundlæggende figur af et fragment i en STL-fil en trekant, der indeholder 3D-koordinaterne. Når de gennemskærede punkter mellem trekanten og laget er opnået, genereres en G-kode til udskrivning ved at forbinde hvert punkt uden en overlappet kurve på et lag18. Enhver G-kodegenereringsalgoritme om bord på software kan bruges til at generere udskrivningsstier til chipfremstillingen.
    4. Forbered en steril klæbemiddel og hydrofil histologi dias.
      BEMÆRK: Det hydrofile slideglas er afgørende for permanent binding af polydimethylsiloxan (PDMS) på glasset, og vedhæftningen af kollagen konstruerer indkapslende kræftceller og stromale celler.
    5. Udskriv den hellige PEVA-form på rutsjebanen med en præcisionsdyse på 50 G ved et pneumatisk tryk på 500 kPa ved 110 °C.
      BEMÆRK: Linjebredden påvirkes af tilførselshastigheden, dysemåleren og materialets temperatur. Dysen på 50 G blev anvendt, og der blev anvendt en tilførselshastighed på 400 for at generere 500 μm linjebredde til offervæggen. Dysemåleren, det pneumatiske tryk og tilspændingshastigheden defineres med praktiske resultater19. Offervæggen skal være tilstrækkelig tyk til at holde PDMS-opløsningen, som er det næste fabrikationstrin.
  2. Barriere for støbning af polydimethylsiloxan (PDMS)
    1. Der blandes 6 mL PDMS-basiselastomer og 0,6 mL hærdningsmiddel homogent over 5 minutter i et plastbeholder. Dette kan fremstille 6 hypoksiske kræft-on-chips, overvejer tab på grund af den klæbrige karakteristisk for PDMS.
    2. Lad den blandede PDMS-opløsning i en 10 mL engangssprøjte og sæt sprøjtehovedet med en 20 G plast konisk dispenserspids.
    3. Fyld offer PEVA-formen med den blandede PDMS-opløsning i sprøjten. Den blandede PDMS vil fylde offer PEVA skimmel med en konveks overflade. Højden af PDMS barrieren vil være højere end peva formen.
    4. PDMS-barrieren hærdes i en ovn ved 40 °C i over 36 timer for at undgå smeltning af PEVA. Temperaturen må ikke øges til over 88 °C, som er PEVA's smeltetemperatur.
    5. Tag den hellige PEVA-form af med et par præcisionscweezer, og steriliser den gasgennemtrængelige barriere ved 120 °C i en autoklave.

5. Fremstilling af celleindkapslede kollagenbiopfarver

  1. Løsrivelse af de forberedte kræftceller og stromale celler
    BEMÆRK: I betragtning af celledygtigheden skal hele udskrivningsprocessen afsluttes så hurtigt som muligt efter afmontering af cellerne.
    1. Vask kræft og stromale celler med 10 mL 1x PBS ved hjælp af en serologisk pipette; 2 mL 0,25% trypsin-ethylendiaminetetraeddikesyre (EDTA) ved hjælp af en pipette og inkuberes i 3 min ved 37 °C.
    2. De trypsiniserede celler neutraliseres med 3 mL cellekulturmedier. opslæb suspensionerne af celler i 15 mL koniske rør og centrifuge ved 516 x g i 5 min ved 20 °C.
    3. Aspirere supernatant langsomt; resuspend cell pellets i 5 mL cellekultur medier og tælle antallet af celler ved hjælp af en hæmocytometer.
    4. 5 x 106 celler af hver celletype overføres til nye 15 mL koniske rør, og de centrifuges ved 516 x g i 5 min ved 20 °C.
    5. Aspirere supernatant ud og læg den på våd is.
  2. Blanding af hver celletype med den 1% neutraliserede kollagenforgelopløsning
    BEMÆRK: For at undgå termisk størkning af den 1% neutraliserede kollagenforgelopløsning skal denne proces udføres på vådis.
    1. Hver type cellepille, der er indsamlet i trin 5.1.4, opsuspendes igen med hver 20 μL cellekulturmedier.
    2. Der tilsættes 1 ml af den 1% neutraliserede kollagenforgelopløsning til hver af de genanvendelige celleophæng, og de blandes homogent ved hjælp af en positiv forskydningspipette. Den endelige koncentration af hver celletype vil være 5 x 106 celler/mL.
    3. De celleindkapslede kollagenbioinks overføres til 3 mL engangssprøjter ved hjælp af en positiv engangspipette, og sprøjterne opbevares ved 4 °C indtil 3D-celleudskrivning.

6.3D celle-udskrivning af kræft-stroma koncentriske ringe

  1. 3D celle-udskrivning af kollagen bioinks indkapsle kræftceller og stromale celler
    1. Generer 3D-geometrien af kræft-stroma koncentriske ringe defineret i trin 1.2 ved hjælp af en 3D CAD-software.
      BEMÆRK: Dimensionerne af kræft stroma koncentriske ringe er defineret via simulerede parametre. Dimensionernes endelige parameterdimensioner er vist i figur 3A.
    2. Konverter 3D CAD-filen til et STL-filformat, og generer en G-kode for kræft-stroma koncentriske ringe ved hjælp af en STL-CAD-veksler.
      BEMÆRK: Se noten i trin 4.1.2 for G-kodegenereringsalgoritmen.
    3. De celleindkapslede kollagenbioinks i 3 mL engangssprøjter indlæses i hovedet på 3D-printeren, og temperaturen på hoved og plade indstilles til 15 °C.
      BEMÆRK: Hvis temperaturen på printerens hoved og plade når over 37 °C, bliver bioinkn krydsbundet og udskrives ikke længere.
    4. Indlæs den genererede udskrivningssti på 3D-printerens kontrolsoftware.
    5. Ved at klikke på startknappen skal du udskrive kollagenbioinks, der indkapsler kræftceller og stromale celler på den gasgennemtrængelige barriere efter den indlæste G-kode med en 18 G plastiknål ved pneumatisk tryk på ca. 20 kPa ved 15 °C.
    6. Ved afslutningen af hver trykning skal du manuelt placere et steriliseret 22 mm x 50 mm glasdæksel oven på den gasgennemtrængelige barriere for at generere den hypoksiske hældning.
      BEMÆRK: Sammenlign to grupper afhængigt af tilstedeværelsen af glasdæksel (GR+) og fravær (GR-) af det for at kontrollere genereringen af den hypoksiske gradient.
    7. Efter at have genereret tre hypoksiske kræft-on-chips, overføre chips til en inkubator ved 37 °C i 1 time for at krydskoble kollagen bioinks.
  2. Afslutning af fabrikationsprocessen og vedligeholdelse af hypoksisk kræft-on-a-chip
    1. Efter afslutningen af alle 3D-celle-udskrivning processer af hypoksisk kræft-on-a-chip, forsigtigt gnide dækslet briller på toppen af gas-gennemtrængelige barrierer med celle-scrapper for stram limning (Figur 4A, B).
      BEMÆRK: Dækglasset og den gasgennemtrængelige barriere samles via hydrofobisk limning uden kemisk lim, der blot skraber den sammenbundne del mellem dækglasset og PDMS-barrieren.
    2. Der indføres 1,5 mL endotelcellevækstmedium til hver chip. For at undgå løsrivelse af kræft konstruere, indføre cellekultur medium fra den ene side af chippen. Vip chippen, så cellekulturmediet kan flyde ved hjælp af en pipette.
    3. Opdater cellekulturmedierne hver dag i en uge. Brug en pipette til at aspirere cellekulturmediet. brug ikke en trykpumpe.

7. Vurdering af cellerens levedygtighed efter udskrivning

  1. Forberedelse af prøver og behandling med calcein AM og EthD-1 opløsning
    1. Varm 1x PBS i et vandbad ved 37 °C.
    2. Analysen fremstilles ved tilsætning af 0,75 μL calceinacetoxymethyl (calcein AM) og 3 μL ethidium homodimer (EthD-1) til 1,5 ml forvarmet PBS.
    3. Udsug forsigtigt alle medier fra chippen ved hjælp af en pipette.
    4. Vask kræft konstruere med prewarmed PBS. Fyld 1,5 mL PBS i chippen ved hjælp af en pipette og lad den stå i 10 minutter ved stuetemperatur. For at undgå deformation af kræft konstruere, indføre 1x PBS fra den ene side af chips og vippe chips til at tillade 1x PBS til at flyde.
    5. Aspirere PBS fra chippen; 1,5 ml analyseopløsningen behandles, og chippen inkuberes ved 37 °C i 20 minutter ved hjælp af en folie for at beskytte mod lys. Brug en pipette til at suge 1x PBS; brug ikke en sugepumpe.
  2. Billeddannelse af cellens levedygtighed ved hjælp af et fluorescensmikroskop
    1. Få vist og indfang de mærkede celler ved hjælp af et fluorescensmikroskop (Figur 4C).
      BEMÆRK: Calcein AM markerer levende celler med grøn fluorescens (bølgelængde ~ 488 nm). EthD-1 repræsenterer signalet af døde celler med rød fluorescens (bølgelængde ~ 594 nm).
    2. Tæl antallet af levende og døde celler ved hjælp af billedbehandlingssoftware, et open source-billedbehandlingsprogram, og beregn levedygtigheden med tallene .

8. Immunfluorescens til at validere dannelsen af centrale hypoxi og dens virkning på kræft malignitet

  1. Fiksering, gennemtrængning, og blokering af kræft konstruere
    1. Forbered 1x PBS, 4% paraformaldehyd (PFA), 0,1% (v/v) Triton X-100 og 2% (w/v) kvæg serum albumin (BSA) ved stuetemperatur.
    2. Indsug forsigtigt alle medier fra chippen ved hjælp af en pipette, og skyl chippen tre gange med 1x PBS. For at undgå deformation af kræft konstruere, indføre 1x PBS fra den ene side af chips og vippe chips til at tillade 1x PBS til at flyde. Lad spånen stå med 1x PBS i 5 minutter for at fjerne restopløsninger mellem hvert vasketrin.
      BEMÆRK: 1x PBS blev indsugning ved hjælp af en pipette, ikke en trykpumpe.
    3. Tilsæt 500 μL på 4% PFA til kræftkonstruktionen på chippen ved hjælp af en pipette; lad det stå i 15 min og vask tre gange med 1x PBS at fastsætte cellerne i kræft konstruere.
    4. Behandl kræftkonstruktion med 500 μL på 0,1% Triton X-100 ved hjælp af en pipette ved stuetemperatur i 5 minutter og vask tre gange med 1x PBS for at opløse og gennemtrænge cellemembranen.
    5. Behandl kræftkonstruktion med 500 μL på 2% BSA ved hjælp af en pipette ved stuetemperatur i 1 time for at blokere reaktive epitoper.
      BEMÆRK: Dæk chippen med paraffinfilm for at forhindre fordampning.
    6. Efter 1 time vaskes chippen tre gange med 1x PBS.
  2. Behandling med primært antistof, sekundært antistof og DAPI og billeddannelse af strukturen ved hjælp af et konfokalt mikroskop.
    1. Forbered isotypekontrolantistoffer og cocktail af primære antistoffer ved at fortynde antistofferne i 1x PBS til hver ønsket arbejdskoncentration.
      BEMÆRK: De specifikke oplysninger om antistofferne er anført i materialeoversigten. Der bør anvendes de samme arbejdskoncentrationer af isotypekontrolantistoffer som de primære antistoffer.
    2. Aspirer forsigtigt alle 1x PBS fra chippen ved hjælp af en pipette, og behandl chippen med 200 μL primær antistofopløsning ved 4 °C natten over. Dæk chipsene med paraffinfilm for at forhindre fordampning.
    3. Aspirere den primære antistofopløsning og vask chippen tre gange med 1x PBS.
    4. Fortynd sekundære antistoffer og DAPI i 1x PBS til den ønskede arbejdskoncentration.
      BEMÆRK: Der anvendes i dette tilfælde et grønt fluorescenskonjugeret sekundært antistof i et forhold på 1:200. DAPI blev brugt i forholdet 1:1000.
    5. Aspirer forsigtigt alle 1x PBS fra chippen ved hjælp af en pipette, og behandl chippen med 200 μL sekundær antistof-DAPI-opløsning ved 4 °C i 3 timer. Dæk chippen med paraffinfilm for at forhindre fordampning og pak den derefter ind med aluminiumsfolie for at forhindre fotobleaching.
    6. Aspirat den sekundære antistof-DAPI løsning og vask chippen tre gange med 1x PBS.
    7. Efter at have afsluttet farvning skridt, overføre kræft konstruere til en confocal parabol ved forsigtigt at gribe med pincet.
    8. Visualiser og indfang de mærkede celler ved hjælp af et konfokalt mikroskop (Figur 5).
      BEMÆRK: Bølgelængden af konfokalt mikroskop blev justeret, afhængigt af typen af fluorescerende markører. De specifikke oplysninger om antistofferne er anført i materialeoversigten. For effektivt at opdage cellepositionen ville det være bedre at observere DAPI-farvede kerner i konstruktionen i starten. Detektionsekspresseringen/emissionbølgelængderne af lysstofrørene var 358/461 nm (DAPI, Blå), 494/517 nm (Grøn) og 590/617 nm (rød). Forstørrelserne var 4x, 10x og 20x, justeret fra den laveste til den højeste.

9. Statistisk analyse

  1. Celleoptælling med billedbehandlingsprogram
    1. Kør et billedbehandlingsprogram for at tælle antallet af levende og døde celler.
    2. Åbn de fluorescerende billedfiler. Klik på Filer | Åbn og importer TIFF-billederne.
    3. Konverter billederne til 16-bit gråtonebilleder. Klik på Billede | Skriv | 16-bit gråtoneskala.
    4. Juster tærsklen ved at klikke på Billede | Juster | Tærskel, og vælg derefter farven på de celler, der skal være sorte.
    5. Skær flettede celler fra hinanden ved at klikke på Proces | Binær | Skelsættende for præcis celletælling.
    6. Tæl antallet af celler ved at klikke på Analyser og derefter på Analyser partikler tre gange; beregne gennemsnittet og præsentere dataene som middelværdien ± standardfejl.
      BEMÆRK: Immunfluorescensmarkører blev analyseret ved at sammenligne fluorescensintensiteten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den hypoksiske kræft-on-a-chip blev udviklet ved hjælp af computer-aided 3D celle-udskrivning teknologi til at opsummere hypoxi og kræft-relaterede patologi (Figur 1). Ilttransport og forbrug blev simuleret ved hjælp af 3D-geometrimodellen. Chippen blev designet i form af koncentriske ringe til at efterligne den radiale iltspredning og udtømning i kræftvæv (Figur 2A). Efter at have defineret kontrolvolumenet i et rum, hvor ilten spredte sig og blev indtaget af celler, blev en passende celletæthed for central hypoxigenerering bestemt ved beregningsmæssig finite elementanalyse (Figur 2B, C).

Der blev genereret en 3D-udskrivningskode for hypoksisk kræft-on-a-chip baseret på tidligere resultater (Figur 3). CAD-filerne af offer PEVA skimmel og kræft konstruktioner blev konverteret til STL filformat(Figur 3A,B). Udskrivningsstien blev kodet og overført til multiudskrivningssystemet ved hjælp af et internt softwareprogram (Figur 3C).

En hypoksisk kræft-on-a-chip blev fremstillet ved hjælp af 3D-celle-udskrivning teknologi. For at opsummere den strukturelle, biokemiske og biofysiske heterogenitet af fast kræft blev der etableret en trinvis fabrikationsproces for kræftkonstruktionen og den gasgennemtrængelige barriere, som er den eneste måde, hvorpå ilt kan trænge ind i systemet (Figur 4A). En opdelt kræft-stroma koncentrisk-ring struktur blev skabt for at reproducere de anatomiske træk ved den faste kræft (Figur 4B). Kræftvævets heterogene geometri blev realiseret in vitro ved hjælp af 3D-celletrykteknologien. Celle levedygtighed blev evalueret efter udskrivning for at bekræfte den kemiske og mekaniske stress under fremstillingsprocessen. Forholdet mellem de grøn-farvede levende celler var betydeligt højere end de rød-farvede døde celler. Kvantitativt var celledygtigheden efter udskrivningen på over 96,92 % ± 2,46 % (figur 4C). Dette resultat bekræfter, at fremstillingsbetingelserne var passende for kræftceller og stromale celler.

To grupper blev sammenlignet afhængigt af tilstedeværelsen (GR+) og fraværet (GR-) af iltgradienten for at verificere virkningerne af den hypoksiske gradient på kræftsprogression (Figur 5A). Under begge omstændigheder fandtes modnede CD31+ endotelceller i de perifere regioner, hvilket indikerede, at rumligt mønstret levende konstruktion blev produceret ved hjælp af 3D-bioprintteknologi. Sammenlignet med GR- betingelsen viste GR+ tilstanden en hypoxisk gradient, der indikerer det gradvise udtryk for HIF1α (Figur 5B), hvor SHMT2+ pseudopalisadingceller og SOX2+ pluripotente celler blev observeret, hvilket repræsenterede det aggressive patofysiologiske træk ved fast kræft (Figur 5C). Nemlig blev de patologiske træk ved glioblastoma opsummeret under den manipulerede hypoxiske tilstand15.

Figure 1
Figur 1: En skematisk over udviklingen af hypoksisk kræft-on-a-chip. Dette tal er blevet ændret fra Nature biomedicinsk teknik15 (Copyright, 2019). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Beregningssimulering af dannelse af oxygengradient på hypoksisk kræft on-a-chip. (A) En 3D-geometri af hypoksisk kræft-on-a-chip. (B) En skematisk angivelse af området for iltfordelingsanalyse. Dette tal er blevet ændret fra Nature biomedicinsk teknik15 (Copyright, 2019). (C) Et jetfarvekortbillede af iltfordelingsprofilen. Dette tal er blevet ændret fra Nature biomedicinsk teknik15 (Copyright, 2019). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Generering af 3D-printbanekode til hypoxisk kræft-on-a-chip. (A) En 3D-geometri af offer PEVA-skimmel. (B) Et billede af offer PEVA skimmelsva i STL-filformat. (C)En G-kode for offer PEVA skimmel. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: 3D-celletryk af hypoxisk kræft-on-a-chip. (B) En trykt hypoksisk kræft-on-a-chip og opdelt struktur af kræft-stroma koncentriske ringe; skalastænger repræsenterer 200 μm. (C) Et fluorescensbillede af den 3D-celletrykte kræftkonstruktion til vurdering af levedygtigheden; skalalinjer repræsenterer 200 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5:Generering af hypoksisk gradient og evaluering af patologiske træk ved manipuleret fast kræft. b) repraesentative immundæmpende billeder af iltgradient ved hv.p.P.P.; skalastænger repræsenterer 200 μm. (C) Repræsentative immunostainingbilleder af patologiske træk ved hypoksisk kræft ved hjælp af SHMT2, SOX2 og CD31; skalastænger repræsenterer 200 μm. Dette tal er blevet ændret fra Nature biomedicinsk teknik15 (Copyright, 2019). Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denne undersøgelse beskriver vi fremstillingsprocessen for en hypoksisk kræft-on-a-chip baseret på 3D-celleudskrivningsteknologi. Dannelsen af den hypoksiske gradient i den designede chip blev forudsagt gennem computersimulationer. Det miljø, der kan fremkalde en heterogen hypoxisk gradient, blev gengivet gennem en simpel strategi, der kombinerer den 3D-printede gasgennemtrængelige barriere og glasdækslet. De hypoxi-relaterede patologiske træk ved glioblastoma, herunder pseudopalisade og en lille population af kræftstamceller, blev sammenfattet under hypoksiske gradientforhold af chippen.

For at forbedre produktiviteten og repeterbarheden blev to større fabrikationstrin ændret sekventielt sammenlignet med den tidligere offentliggjorte model15. For det første blev der indirekte fremstillet en PDMS-barriere for at overvinde den dårlige printbarhed af PDMS, der indeholder et hærdemiddel, som helbredes i realtid snarere end gennem en et-trins-direkte udskrivningsmetode. Derfor blev biokompatibel PEVA med højere printbarhed tilpasset til at fremstille offerformen, og PDMS blev tilføjet for at skabe den gasgennemtrængelige barriere. For det andet blev typen af slideglas ændret til et hydrofilt belagt diasglas, som er gunstigt for at understøtte bioink-deposition og form troskab. Endelig blev det muligt at bygge de mellemstore reservoirer i begge ender af den chipeffektive medium udveksling.

Kritiske faktorer i hvert fabrikationstrin af hypoksisk kræft-on-a-chip via 3D bioprinting bør kontrolleres forsigtigt. Under støbning skal PDMS's højde være større end den hellige PEVA-form, ellers strammes chippen med dækglasset løs, hvilket har en negativ effekt på hypoxisk kernegeneration. Under trykning af kollagen, en termisk følsom hydrogel, skal temperaturen på trykhovedet holdes ved 15 °C for at forhindre dysestopning på grund af et sol-gel overgangsfænomen. Hvis hydrogelen bliver tidsmæssigt krydsbundet, kan den blokerede dyse let rengøres ved hjælp af et højt pneumatisk tryk og en skarp nål. Men hvis blokeringen er alvorlig, skal hydrogelen fremstilles igen. Desuden skal celleudskrivningsprocessen være afsluttet inden for 1 time under hensyntagen til celledygtighed.

3D bioprinting teknologi letter konstruktionen af en hypoksisk kræft-on-a-chip, der kan bruges til at studere den underliggende mekanisme for kræft og til at forudsige den terapeutiske resistens af forskellige solide tumorer15. Især gjorde brugen af ekstruderingsbaseret 3D-bioprintteknologi det muligt at levere hurtige og gentagne produktioner med et højt frihedsniveau. Desuden reproducerbarhed og hurtig tidsramme for kræft modellering gør det muligt for det farmaceutiske område til at opbygge et datasæt af lægemiddel kombination kandidater til kræftbehandling. Men på grund af teknologiens begrænsede opløsning produceres den trykte hypoxic-cancer-on-a-chip i rækken af flere hundrede mikrometer, der kræver stor mængde materialer. Derudover er det svært at udvikle høj gennemstrømningsmedicinscreeningsplatform under pladsbegrænsningerne20. Derfor bør teknologien forbedres for at udvikle modeller, der kan understøtte multiparameterundersøgelser med begrænsede ressourcer og rumligt omfang.

Den udviklede hypoxic-cancer-on-a-chip kan anvendes til vævsspecifikke kræft modellering ved at anvende væv-specifikke materialer, såsom en hydrogel stammer fra en decellulariseret ekstracellulær matrix (ECM). Fordi de biokemiske og fysiologiske variationer af ECM påvirker cellulære funktioner, overlegen emulering af mange kræfttyper med et organspecifikt kræftmikromiljø kan realiseres21. Hertil kommer, ved at kombinere med andre manipuleret væv konstruktioner, herunder manipuleret blodkar, der har kritiske virkninger på udviklingen af kræft, dynamisk patofysiologiske ændringer i angiogene, immunogen, og metastatiske egenskaber kan studeres. Desuden kan personlig kræftbehandling opnås med den udviklede chip ved at ansætte patient-afledte celler15. Test af lægemiddelfølsomhed forud for klinisk behandling ville være et vigtigt skridt til at forbedre effekten af behandlingen under processen med at finde et passende terapeutisk regime for en individuel patient i tide. En patientspecifik kræftmodel med en patientafledt kilde forventes at forbedre patientprofileringen for at forudsige forskelle i patofysiologi og chemosensitivitet hos hver patient. I den foregående undersøgelse blev patientspecifikke terapeutiske virkninger mod forskellige lægemiddelkombinationer forudsagt inden for en rimelig tidsramme (1-2 uger) ved hjælp af 3D-trykt hypoksisk kræft-on-a-chip, hvilket resulterer i relativt hurtige konklusioner sammenlignet med andre metoder, hvilket tyder på potentialet for den patientspecifikke prækliniske model15.

Sammenfattende, 3D celle-udskrivning af kræft-on-a-chip er gunstig for at opsummere en heterogen kræft mikromiljø. Det efterlignede mikromiljø driver kræftens patologiske progression, herunder dannelsen af en nekrotisk kerne som følge af hypoxi. Denne protokol kan anvendes til kræft test af lægemidler og patient-specifikke kræftmodeller. I denne henseende forventer vi, at denne meget kontrollerbare tilgang kan være gavnlig for opbygningen af forskellige kræftmodeller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen oplysninger.

Acknowledgments

Denne forskning blev støttet af National Research Foundation of Korea (NRF) finansieret af Undervisningsministeriet (nr. 2020R1A6A1A03047902 og NRF-2018H1A2A1062091) og Korea-regeringen (MSIT) (nr. NRF-2019R1C1C1009606 og NRF-2019R1A3A3005437).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cells
Human umbilical vein endothelial cells Promocell C-12200
U-87 MG cells ATCC ATCC HTB-14
Disposable
0.2 μm syringe filter Sartorius 16534-K
10 mL disposable syringe Jung Rim 10ml 21G32
10 mL glass vial Hubena A0039
10 mL Serological pipette tip SPL lifescience 91010
15 mL conical tube SPL lifescience 50015
18G plastic needle Musashi engineering PN-18G-B
20G plastic tapered dispense tip Musashi engineering TPND-20G-U
22x50 glass cover MARIENFIELD 0101142
25 mL Serological pipette tip SPL lifescience 90125
3 mL disposable syringes HENKE-JET 4020-X00V0
40 µm cell strainer Falcon 352360
5 mL Serological pipette tip SPL lifescience 91005
50 mL conical tube SPL lifescience 50050
50 mL Serological pipette tip SPL lifescience 90150
50N precision nozzle Musashi engineering HN-0.5ND
Aluminum foil SINKWANG
Capillary tips Gilson CP1000
Cell-scrapper SPL lifescience 90030
Confocal dish SPL lifescience 200350
Parafilm Bemis PM996
Pre-coated histology slide MATSUNAMI MAS-11
Reservoir SPL lifescience 23050
T-75 cell culture flask SPL lifescience 70075
Equipment
3DX printer T&R Biofab
Autoclave JEIOTECH AC-12
Centrifuger Cyrozen 1580MGR
Confocal laser microscopy Olympus Life Science FV 1000
Fluorescence microscope FISHER SCEINTIFIC O221S366
Forcep Korea Ace Scientific HC.203-30
Hand tally counter KTRIO
Hemocytometer MARIENFIELD 0650030
Incubator Panasonic MCO-170AIC
Laminar flow cabinet DAECHUNG SCIENCE CB-BMMS C-001
Metal syringe IWASHITA engineering SUS BARREL 10CC
Operating Scissors Hirose HC.13-122
Oven JEIOTECH OF-12, H070023
Positive displacement pipette GILSON NJ05652
Refrigerator SAMSUNG CRFD-1141
Voltex Mixer DAIHAN scientific VM-10
Water bath DAIHAN SCIENTIFIC WB-11
Water purifier WASSER LAB DI-GR
Materials
0.25 % Trypsin-EDTA Gibco 25200-072
10x PBS Intron IBS-BP007a
4% Paraformaldehyde Biosesang
70% Ethanol Daejung 4018-4410
Anti-CD31 antibody Abcam ab28364
Anti-HIF-1 alpha antibody Abcam ab16066
Anti-SHMT2/SHMT antibody Abcam ab88664
Anti-SOX2 antibody Abcam ab75485
Bovine Serum Albumin Thermo scientific J10857-22
Collagen from porcine skin Dalim tissen PC-001-1g
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) Thermofisher D1306
Endothelial Cell Growth Medium-2 Promocell C22011
Fetal bovine serum Gibco 12483-020
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Theromofisher A-11001
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 Theromofisher A-11012
High-glucose Dulbecco’s Modified Eagle Medium(DMEM) Hyclone SH30243-0
Hydrochloric acid Sigma-Aldrich 311413-100ML
Live/dead assay kit Invitrogen L3224
Mouse IgG1, kappa monoclonal [15-6E10A7] - Isotype Control Abcam ab170190
Penicillin/streptomycin Gibco 15140-122
Phenol red solution Sigma-Aldrich P0290-100ML
Poly(ethylene-vinyl acetate)  Poly science 06108-500
Polydimethylsiloxane Dowhitech sylgard 184
Rabbit IgG, polyclonal - Isotype Control Abcam ab37415
Sodium hydroxide solution Samchun S0610
Triton X-100 Biosesang TRI020-500-50
Trypan Blue Sigma-Aldrich T8154
Software
COMSOL Multiphysics 3.5a COMSOL AB
IMS beamer in-house software
SolidWorks Package Dassault Systems SolidWorks Corporation

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jing, X., et al. Role of hypoxia in cancer therapy by regulating the tumor microenvironment. Molecular Cancer. 18 (1), 157 (2019).
  2. Al Tameemi, W., Dale, T. P., Al-Jumaily, R. M. K., Forsyth, N. R. Hypoxia-modified cancer cell metabolism. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 4 (2019).
  3. Petrova, V., Annicchiarico-Petruzzelli, M., Melino, G., Amelio, I. The hypoxic tumour microenvironment. Oncogenesis. 7 (1), 1-13 (2018).
  4. Hockel, M., Vaupel, P. Tumor hypoxia: definitions and current clinical, biologic, and molecular aspects. Journal of the National Cancer Institute. 93 (4), 266-276 (2001).
  5. Kim, H., Lin, Q., Glazer, P. M., Yun, Z. The hypoxic tumor microenvironment in vivo selects the cancer stem cell fate of breast cancer cells. Breast Cancer Research. 20 (1), 16 (2018).
  6. Jeong, G. S., Lee, J., Yoon, J., Chung, S., Lee, S. -H. Viscoelastic lithography for fabricating self-organizing soft micro-honeycomb structures with ultra-high aspect ratios. Nature Communications. 7 (1), 1-9 (2016).
  7. Razian, G., Yu, Y., Ungrin, M. Production of large numbers of size-controlled tumor spheroids using microwell plates. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (81), e50665 (2013).
  8. Nunes, A. S., Barros, A. S., Costa, E. C., Moreira, A. F., Correia, I. J. 3D tumor spheroids as in vitro models to mimic in vivo human solid tumors resistance to therapeutic drugs. Biotechnology and Bioengineering. 116 (1), 206-226 (2019).
  9. Wan, L., Neumann, C., LeDuc, P. Tumor-on-a-chip for integrating a 3D tumor microenvironment: chemical and mechanical factors. Lab on a Chip. 20 (5), 873-888 (2020).
  10. Nam, H., Funamoto, K., Jeon, J. S. Cancer cell migration and cancer drug screening in oxygen tension gradient chip. Biomicrofluidics. 14 (4), 044107 (2020).
  11. Palacio-Castañeda, V., Kooijman, L., Venzac, B., Verdurmen, W. P., Le Gac, S. Metabolic switching of tumor cells under hypoxic conditions in a tumor-on-a-chip model. Micromachines. 11 (4), 382 (2020).
  12. Ronaldson-Bouchard, K., Vunjak-Novakovic, G. Organs-on-a-chip: a fast track for engineered human tissues in drug development. Cell Stem Cell. 22 (3), 310-324 (2018).
  13. Mi, S., Du, Z., Xu, Y., Sun, W. The crossing and integration between microfluidic technology and 3D printing for organ-on-chips. Journal of Materials Chemistry B. 6 (39), 6191-6206 (2018).
  14. Yi, H. -G., Lee, H., Cho, D. -W. 3D printing of organs-on-chips. Bioengineering. 4 (1), 10 (2017).
  15. Yi, H. -G., et al. A bioprinted human-glioblastoma-on-a-chip for the identification of patient-specific responses to chemoradiotherapy. Nature Biomedical Engineering. 3 (7), 509-519 (2019).
  16. Kang, T. -Y., Hong, J. M., Jung, J. W., Yoo, J. J., Cho, D. -W. Design and assessment of a microfluidic network system for oxygen transport in engineered tissue. Langmuir. 29 (2), 701-709 (2013).
  17. Woo Jung, J., et al. Evaluation of the effective diffusivity of a freeform fabricated scaffold using computational simulation. Journal of Biomechanical Engineering. 135 (8), (2013).
  18. Brown, A. C., De Beer, D. Development of a stereolithography (STL) slicing and G-code generation algorithm for an entry level 3-D printer. 2013 Africon (IEEE). , 1-5 (2013).
  19. Shim, J. -H., Lee, J. -S., Kim, J. Y., Cho, D. -W. Bioprinting of a mechanically enhanced three-dimensional dual cell-laden construct for osteochondral tissue engineering using a multi-head tissue/organ building system. Journal of Micromechanics and Microengineering. 22 (8), 085014 (2012).
  20. Gillispie, G., et al. Assessment methodologies for extrusion-based bioink printability. Biofabrication. 12 (2), 022003 (2020).
  21. Kim, B. S., Das, S., Jang, J., Cho, D. -W. Decellularized extracellular matrix-based bioinks for engineering tissue-and organ-specific microenvironments. Chemical Reviews. 120 (19), 10608-10661 (2020).

Tags

Bioengineering Problem 167 3D-celleudskrivning 3D-mikrofysiologisk system organ-on-a-chip solid kræft mikromiljø hypoxi iltgradient patologi
3D Celle-Printed Hypoxic Cancer-on-a-Chip for at opsummere Patologisk Progression af solid kræft
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Park, W., Bae, M., Hwang, M., Jang,… More

Park, W., Bae, M., Hwang, M., Jang, J., Cho, D. W., Yi, H. G. 3D Cell-Printed Hypoxic Cancer-on-a-Chip for Recapitulating Pathologic Progression of Solid Cancer. J. Vis. Exp. (167), e61945, doi:10.3791/61945 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter