Summary
Hypoxie is een kenmerk van tumormicromilieu en speelt een cruciale rol bij de progressie van kanker. Dit artikel beschrijft het fabricageproces van een hypoxische kanker-op-een-chip op basis van 3D-celprinttechnologie om een hypoxiegerelateerde pathologie van kanker samen te vatten.
Abstract
Micromilieu van kanker heeft een aanzienlijke invloed op de progressie van de ziekte. In het bijzonder is hypoxie de belangrijkste oorzaak van overleving, invasie en chemoresistentie van kanker. Hoewel verschillende in vitro modellen zijn ontwikkeld om hypoxiegerelateerde kankerpathologie te bestuderen, is het complexe samenspel van de in vivo waargenomen micromilieu voor kanker nog niet gereproduceerd vanwege het gebrek aan nauwkeurige ruimtelijke controle. In plaats daarvan zijn 3D-biofabrication-benaderingen voorgesteld om microfysiologische systemen te creëren voor een betere emulatie van kankerecologie en nauwkeurige evaluatie van de behandeling van kanker. Hierin stellen we een 3D-celprintbenadering voor om een hypoxische kanker-op-een-chip te fabriceren. De hypoxie-inducerende componenten in de chip werden bepaald op basis van een computersimulatie van de zuurstofverdeling. Kanker-stroma concentrische ringen werden afgedrukt met behulp van bioinks die glioblastoomcellen en endotheelcellen bevatten om een type solide kanker samen te vatten. De resulterende chip realiseerde centrale hypoxie en verergerde maligniteit bij kanker met de vorming van representatieve pathofysiologische markers. Over het geheel genomen zal de voorgestelde aanpak voor het creëren van een solide kanker-mimetisch microfysiologisch systeem naar verwachting de kloof overbruggen tussen in vivo en in vitro modellen voor kankeronderzoek.
Introduction
De micromilieu van kanker is een kritische factor die de progressie van kanker aansturen. Meerdere componenten, waaronder biochemische, biofysische en cellulaire signalen, bepalen de pathologische kenmerken van kanker. Onder deze, hypoxie is sterk geassocieerd met kanker overleving, proliferatie, en invasie1. Door de onbeperkte groei en deling van kankercellen raken voedingsstoffen en zuurstof continu uitgeput en ontstaat er een hypoxische gradiënt. Onder zuurstofarme omstandigheden activeren cellen hypoxie-induceerbare transcriptiefactor (HIF)-geassocieerde moleculaire cascade. Dit proces induceert een necrotische kern, activeert metabolische veranderingen en initieert hyperplasie en metastase van bloedvaten2,3. Vervolgens veroorzaakt hypoxie in kankercellen de vernietiging van naburige normale weefsels. Bovendien wordt hypoxie sterk geassocieerd met de therapeutische weerstand van solide tumoren op multifactoriële manieren. Hypoxie kan radiotherapie ernstig belemmeren, aangezien de radiogevoeligheid beperkt is als gevolg van reactieve zuurstofsoorten1,4. Bovendien verlaagt het de pH-niveaus van micromilieus voor kanker, wat de accumulatie van geneesmiddelen vermindert1. Daarom is het reproduceren van pathologische kenmerken met betrekking tot hypoxie in vitro een veelbelovende strategie voor wetenschappelijke en preklinische bevindingen.
Het modelleren van een specifiek micromilieu van kanker is essentieel voor het begrijpen van de ontwikkeling van kanker en het verkennen van geschikte behandelingen. Hoewel diermodellen veel zijn gebruikt vanwege hun sterke fysiologische relevantie, bestaan er problemen met betrekking tot soortenverschillen en ethische problemen5. Hoewel conventionele 2D- en 3D-modellen de manipulatie en real-time beeldvorming van kankercellen mogelijk maken voor een diepgaande analyse, kan hun architecturale en cellulaire complexiteit niet volledig worden samengevat. Kankersferoïdemodellen zijn bijvoorbeeld veel gebruikt, omdat kankercelaggregatie in een sferoïde van nature hypoxie in de kern kan genereren. Bovendien zijn grote aantallen cellulaire sferoïden van uniforme grootte geproduceerd met behulp van op plastic of siliconen gebaseerde multiputsystemen6,7. De lagere flexibiliteit met betrekking tot het vastleggen van de exacte heterogene structuur van kankerweefsels met conventionele platforms heeft echter de oprichting van een geavanceerde biofabrication-technologie vereist om een zeer biomimetisch platform te bouwen om kankeronderzoek te verbeteren8.
3D-microfysiologische systemen (MPS's) zijn nuttige hulpmiddelen om de complexe geometrie en pathologische progressie van kankercellen samen tevatten 9. Aangezien kankercellen de biochemische gradiënt van groeifactoren en chemokinen en de mechanische heterogeniteit die op het systeem wordt gereproduceerd, voelen, kunnen belangrijke kenmerken van kankerontwikkeling in vitro worden onderzocht. Bijvoorbeeld, kanker levensvatbaarheid, gemetastaseerde maligniteit, en resistentie tegen geneesmiddelen afhankelijk van de variërende zuurstofconcentraties is bestudeerd met behulp van MPSs10,11. Ondanks recente vooruitgang is het genereren van hypoxische omstandigheden van in vitro modellen afhankelijk van complexe fabricageprocedures, waaronder aansluiting op fysieke gaspompen. Daarom zijn eenvoudige en flexibele methoden nodig om kankerspecifieke micromilieus op te bouwen.
3D-celdruktechnologie heeft veel aandacht gekregen vanwege de nauwkeurige controle van de ruimtelijke ordening van biomaterialen om inheemse biologische architecturen samen tevatten 12. Deze technologie overwint met name de bestaande beperkingen van 3D-hypoxiemodellen vanwege de hoge beheersbaarheid en haalbaarheid voor het bouwen van de ruimtelijke kenmerken van het kankermicromilieu. 3D-printen vergemakkelijkt ook computerondersteunde productie door middel van een laag-voor-laag proces, waardoor een snelle, nauwkeurige en reproduceerbare constructie van complexe geometrieën wordt geboden om echte weefselarchitecturen na te bootsen. Naast de voordelen van bestaande productiestrategieën voor 3D-MPS 's, kunnen de pathofysiologische kenmerken van kankerprogressie worden gereproduceerd door de biochemische, cellulaire en biofysische componenten13,14te patroonen .
Hierin presenteren we een 3D-celprintstrategie voor een hypoxische kanker-op-een-chip voor het samenvatten van de heterogeniteit van een solide kanker (Figuur 1)15. De fabricageparameters werden bepaald via een computationele simulatie van centrale hypoxievorming in het systeem. Kanker-stroma concentrische ringen werden afgedrukt met behulp van collageenbioinks die glioblastoomcellen en endotheelcellen bevatten om de pathofysiologie van glioblastoom, een type vaste kanker, na te bootsen. De vorming van een radiale zuurstofgradiënt verergerde de maligniteit van kanker, wat wijst op versterkte agressiviteit. Verder geven we toekomstperspectieven aan voor de toepassingen van de chip op patiëntspecifieke preklinische modellen. De voorgestelde aanpak voor het creëren van een solide-kanker-mimetisch microfysiologisch systeem zal naar verwachting de kloof tussen in vivo en in vitro modellen van kanker overbruggen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Computersimulatie van zuurstofgradiëntvorming
-
Generatie van een 3D geometrie model voor hypoxische kanker-op-een-chip printen
- Voer een 3D CAD-software uit.
- Schets het geometriemodel van hypoxische kanker-op-een-chip. Klik op Schets en selecteer het gewenste vlak om de geometrie te tekenen. Raadpleeg de tekening (figuur 2A) voor de detailschaal van elk onderdeel.
- Stel de dikte van de geometrie in door te klikken op Feature-Protrusion Boss/Base. Voer de gewenste dikte (zie figuur 2A) in het lege vak in en selecteer het groene controlepictogram om de 3D-geometrie te vormen.
OPMERKING: De dimensie van de cancer-on-a-chip wordt gedefinieerd op basis van de gewenste hoeveelheden media en hydrogel. In dit experiment waren de gewenste volumes media en hydrogel respectievelijk ongeveer 1.500 μL en 500 μL, gebaseerd op de eerdere praktijkervaringen voor de oplossing van bioprinter op basis van extrusie. - Sla het geometriebestand op als een 3D CAD-bestandsindeling (.prt of .stl).
-
Bepaling van de cellulaire dichtheid voor inductie van hypoxische kern
- Voer een simulatieprogramma voor fysieke diffusie uit.
- Klik op LiveLink en selecteer het gebruikte CAD-programma. Klik op Synchroniseren om de geometrie van de hypoxische kanker-op-een-chip in het simulatieprogramma te importeren. Omdat de binnenruimte van de kamer zal worden gevuld met een kweekmedium in een daadwerkelijke experimentele omgeving, zal zuurstof zich verspreiden over de binnenruimte van de kamer en de cellulaire constructie, die zal bestaan uit met cellen beladen hydrogels.
OPMERKING: Raadpleeg het vorige onderzoek voor meer informatie over de fysische parameters15. - Definieer de geïmporteerde 3D-geometrie als een regelvolume van de ruimte waarin zuurstof verspreidt en de cellen zuurstof verbruiken (Figuur 2B).
- Voer een computeranalyse uit voor gasdiffusieanalyse volgens een gebruikershandleiding en eerder vastgestelde methoden16,17.
- Exporteer uit de computeranalyseresultaten de geschatte zuurstofconcentratiegegevens over doorsnede A-A' op elk tijdstip volgens de gebruikershandleiding. De bestuursvergelijking is gebaseerd op de eerste wet van Fick, uitgedrukt in Eq. (1) (Figuur 2C).
waarbij c de concentratie is, D de zuurstofdiffusiecoëfficiënt, N-cel de dichtheid van de cellen,
de maximale opnamesnelheid van zuurstof en Km de Michaelis-Menten-constante. De constanten werden toegepast zoals beschreven in een eerdere publicatie15.
OPMERKING: Elk keerpunt betekent een stappunt om de zuurstofdiffusie in de loop van de tijd te observeren. - Evalueer of het minimale zuurstofgehalte een drempel van hypoxie bereikt en herhaal het computeranalyseproces met een toename of degradatie van de cellulaire dichtheid.
OPMERKING: Definieer dat hypoxiegradiënt wordt gevormd in de constructie als het zuurstofgehalte van 80% in het hydrogelgebied na 24 uur minder dan 0,02 mM bedraagt. - Bevestig het aantal cellen dat nodig is om de zuurstofgradiënt te genereren die hypoxie induceert in de centrale regio uit de eerste wet van Fick in stap 1.2.5 en de simulatieresultaten van stap 1.2.6.
OPMERKING: In dit protocol was het celnummer 2 × 106 cellen/elke constructie.
de maximale opnamesnelheid van zuurstof en Km de Michaelis-Menten-constante. De constanten werden toegepast zoals beschreven in een eerdere publicatie15.2. Celkweek van kankercellen en stromale cellen
-
Voorbereiding van celkweekmedia om fysiologische stress te voorkomen
- Voor U-87 MG cellen (vereeuwigde menselijke glioblastoom cellijn), plaats 12 ml hoge glucose Dulbecco's gemodificeerde Eagle medium met 10% foetale runderserum, 100 U/ml penicilline en 100 μg/ml streptomycine in een T-75 celkweekkolf in een 37 °C, 5% CO2 bevochtigde incubator gedurende 30 minuten.
OPMERKING: Glioblastoom werd gekozen als een soort solide kanker omdat het agressieve kenmerken heeft in een hypoxische omgeving. Andere verschillende soorten kankers kunnen op dit model worden toegepast. - Plaats voor menselijke navelstreng endotheelcellen (HUVECs) 12 ml endotheelcelgroeimedium in een T-75 celkweekkolf in een 5% CO2 bevochtigde incubator bij 37 °C gedurende 30 minuten.
OPMERKING: HUVECs zijn gekozen omdat het een van de meest representatieve endotheelcellijnen is. Verschillende soorten stromale cellen kunnen ook op dit model worden toegepast.
- Voor U-87 MG cellen (vereeuwigde menselijke glioblastoom cellijn), plaats 12 ml hoge glucose Dulbecco's gemodificeerde Eagle medium met 10% foetale runderserum, 100 U/ml penicilline en 100 μg/ml streptomycine in een T-75 celkweekkolf in een 37 °C, 5% CO2 bevochtigde incubator gedurende 30 minuten.
-
Snelle ontdooiing van cryopreserved kankercellen en stromale cellen en hun onderhoud
- Verplaats cryovials met 5 x 105 U-87 MG cellen en HUVECs van de vloeibare stikstofcontainer naar een laminaire stromingskast. Maak de dop onmiddellijk los en draai deze weer vast om de interne druk los te maken.
- Plaats de cryopreserved cellen voorzichtig gedurende 2 minuten in een waterbad op 37 °C, zodat de dop uit het water blijft. Spoel de flacons af met 70% ethanol onder laminaire stroming om besmetting te voorkomen.
- Breng de ontdooide cellen over in de kolven die de in stap 2.1 beschreven bereide celkweekmedia bevatten en plaats de celbevattende kolven in een bevochtigde incubator van 5% CO2 bij 37 °C voor celterugwinning.
- Vernieuw de celkweekmedia om de 2 dagen en behoud de celgroei.
- Vervang na 24 uur ontdooien de celkweekmedia om cytotoxiciteit van dimethylsulfoxide (DMSO) te voorkomen, die werd gebruikt voor het bevriezen van cellen. Gebruik HUVECs, die minder dan 6 passages hebben ondergaan.
3. Bereiding van collageen pre-gel oplossing
-
Oplosbaarheid van collageenspons met 0,1 N zoutzuur (HCl)
- Bereid een oplossing van 0,1 N HCl voor en filtreer deze met een spuitfilter van 0,2 μm.
- Bereid voor 3 ml van een geneutraliseerde collageenvoorgeloplossing van 1% (w/v) collageensponsjes in 5 x 5 mm2 stukken en met een gewicht van 30 mg.
- Breng de gesneden collageenstukken over in een steriele glazen flacon van 10 ml.
OPMERKING: Bereid 1,5 keer het volume van de vereiste collageenhydrogel voor, gezien het verlies van de hydrogel als gevolg van het kleverige kenmerk van de collageenoplossing. - Voeg 2,4 ml 0,1 N HCl toe aan de collageenhoudende glazen flacon en incubeer deze gedurende 3 dagen op de rocker bij 15 tpm en 4 °C.
OPMERKING: Het volume van de 0,1 N HCl-oplossing was vier vijfde van het uiteindelijke volume van de vereiste collageenhydrogel. In dit geval werd 3 ml collageen bereid. - Zeef na de spijsvertering de onverteerd collageendeeltjes met behulp van een 40 μm celzeef. Bewaar de zure collageenoplossing bij 4 °C en gebruik binnen 7 dagen.
-
pH-aanpassing voor 1% geneutraliseerde collageen pre-gel oplossing
- Centrifugeer de zure collageenoplossing bij 1224 x g gedurende 5 min bij 4 °C.
- Voeg 30 μL fenolrode oplossing als pH-indicator toe aan een eindconcentratie van 1% (v/v) en 300 μL 10x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) tot een eindconcentratie van 10% (v/v) in de collageen pre-geloplossing.
- Neutraliseer de pH tot 7 met 1 N natriumhydroxide (NaOH) en controleer de kleurverandering.
OPMERKING: Op basis van de formule voegen moedervlekken H+ = molariteit H+ x volume H+ = moedervlekken OH-= molariteit OH- x volume OH-, 240 μL NaOH toe. - Voeg gedestilleerd water toe om een totaal volume van 3 ml te verkrijgen.
- Bewaar na pH-aanpassing de 1% (w/v) geneutraliseerde collageen pre-geloplossing bij 4 °C en gebruik binnen 3 dagen.
OPMERKING: Om de gelatie van de geneutraliseerde collageen pre-gel oplossing vooraf te controleren, maakt u 50 μL collageendruppels op een kleine schaal met behulp van een pipet met positieve verplaatsing en incubeert u ze gedurende 1 uur in een incubator van 37 °C. Raadpleeg de volgende drie methoden om de kruiskoppeling van collageendruppels te controleren. - Controleer of de kleur van collageen is veranderd in ondoorzichtig wit van transparante kleur.
- Kantel de container en controleer of het collageen aan de onderkant van de container is hecht.
- Giet 1x PBS op de druppels en controleer of de collageenconstructie niet kapot is in de oplossing.
4.3D afdrukken van gasdoorlatende barrière
-
3D-printen van een offerpoly (ethyleen-vinylacetaat) (PEVA) mal
- Genereer de 3D-geometrie van de offer-PEVA-mal die in stap 1 is gedefinieerd met behulp van een 3D CAD-software (figuur 3A).
OPMERKING: De 3D-geometrie en de gedetailleerde modelschaal, inclusief afmetingen, eenheden en lijntypen, zijn weergegeven in figuur 2A. - Converteer het 3D CAD-bestand naar een STL-bestandsindeling door op Bestand | te klikken Save-File type als STL. Klik ook op Optie | Uitvoerformulier als ASCII voor het genereren van G-code.
- Klik op Bestand | Open het STL-bestand en selecteer het opgeslagen STL-bestand om het gegenereerde STL-bestand te importeren. Klik op Segmentmodel van STL-CAD-wisselaar om automatisch de G-code van de offerende PEVA-mal te genereren (Figuur 3B, C).
OPMERKING: Het afdrukpad wordt gegenereerd met de verbinding van doorsneden punten tussen de fundamentele figuur van het STL-bestand en het snijvlak (d.w.z. laag). Kortom, de fundamentele figuur van een fragment in een STL-bestand is een driehoek die de 3D-coördinaten bevat. Nadat de doorsneden punten tussen de driehoek en de laag zijn verkregen, wordt een G-code voor afdrukken gegenereerd door elk punt te verbinden zonder een overlappend pad op een laag18. Elk algoritme voor het genereren van G-code aan boord van software kan worden gebruikt om afdrukpaden voor de chipfabricage te genereren. - Bereid een steriele lijm en hydrofiele histologie dia.
OPMERKING: Het hydrofiele schuifglas is van cruciaal belang voor de permanente hechting van polydimethylsiloxaan (PDMS) op het glas en de hechting van de collageenconstructies die kankercellen en stromale cellen inkapselen. - Print de offerPEVA mal op de glijbaan met een 50 G precisiemondstuk bij een pneumatische druk van 500 kPa bij 110 °C.
OPMERKING: De lijnbreedte wordt beïnvloed door de toevoersnelheid, de spuitmondmeter en de temperatuur van het materiaal. Het mondstuk van 50 G werd gebruikt en een toevoersnelheid van 400 werd toegepast om een lijnbreedte van 500 μm voor de offermuur te genereren. De mondstukmeter, pneumatische druk en toevoersnelheid worden gedefinieerd met praktische resultaten19. De offerwand moet voldoende dik zijn om de PDMS-oplossing vast te houden, wat de volgende fabricagestap is.
- Genereer de 3D-geometrie van de offer-PEVA-mal die in stap 1 is gedefinieerd met behulp van een 3D CAD-software (figuur 3A).
-
Gieten van polydimethylsiloxaan (PDMS) barrière
- Meng 6 ml PDMS-basis elastomeer en 0,6 ml uithardingsmiddel homogeen gedurende 5 minuten in een plastic reservoir. Dit kan 6 hypoxische kanker-op-chips fabriceren, gezien het verlies als gevolg van het kleverige kenmerk van PDMS.
- Plaats de gemengde PDMS-oplossing in een wegwerpspuit van 10 ml en plaats de spuitkop met een 20 G plastic taps toelopende doseertip.
- Vul de offer PEVA-mal met de gemengde PDMS-oplossing in de spuit. Het gemengde PDMS vult de offerende PEVA-mal met een bol oppervlak. De hoogte van de PDMS-barrière zal hoger zijn dan die van de PEVA-mal.
- Hard de PDMS-barrière meer dan 36 uur uit in een oven op 40 °C om het smelten van PEVA te voorkomen. Verhoog de temperatuur niet tot meer dan 88 °C, de smelttemperatuur van PEVA.
- Maak de offerende PEVA-mal los met een precisie-pincet en steriliseer de gasdoorlatende barrière bij 120 °C in een autoclaaf.
5. Bereiding van celgekapte collageenbio-inkten
-
Loslating van de voorbereide kankercellen en stromale cellen
OPMERKING: Gezien de levensvatbaarheid van de cel moet het hele afdrukproces zo snel mogelijk na het loskoppelen van de cellen worden voltooid.- Was kanker en stromale cellen met 10 ml 1x PBS met behulp van een serologische pipet; behandel met 2 ml trypsine-ethyleenaminetetraazijnzuur (EDTA) met 2 ml met behulp van een pipet en incubeer ze gedurende 3 minuten bij 37 °C.
- Neutraliseer de trypsinized cellen met 3 ml celkweekmedia; verzamel de suspensus van cellen in 15 ml conische buizen en centrifugeer bij 516 x g gedurende 5 minuten bij 20 °C.
- Aspireer de supernatant langzaam; resuspendeer de celkorrels in 5 ml celkweekmedia en tel het aantal cellen met behulp van een hemocytometer.
- Breng 5 x 106 cellen van elk celtype over in nieuwe conische buizen van 15 ml en centrifugeer ze gedurende 5 minuten bij 20 °C bij 516 x g.
- Aspireer de supernatant eraf en leg hem op nat ijs.
-
Mengen van elk celtype met de 1% geneutraliseerde collageen pre-gel oplossing
OPMERKING: Om thermische stolling van de 1% geneutraliseerde collageen pre-gel oplossing te voorkomen, moet dit proces worden uitgevoerd op nat ijs.- Resuspendeer elk type celpellet verzameld in stap 5.1.4 met elk 20 μL celkweekmedia.
- Voeg 1 ml van de 1% geneutraliseerde collageen pre-gel oplossing toe aan elk van de geresuspendeerde celsuspensussingen en meng ze homogeen met behulp van een positieve verplaatsing pipet. De uiteindelijke concentratie van elk celtype is 5 x 106 cellen/ml.
- Breng de met cellen ingekapselde collageenbioinks over in wegwerpspuiten van 3 ml met behulp van een positieve wegwerppipet en bewaar de spuiten bij 4 °C tot 3D-celprinten.
6.3D celdruk van kanker-stroma concentrische ringen
-
3D-celprinten van collageenbioinks die kankercellen en stromale cellen inkapselen
- Genereer de 3D-geometrie van de kanker-stroma concentrische ringen gedefinieerd in stap 1.2 met behulp van een 3D CAD-software.
OPMERKING: De afmetingen van de kanker stroma concentrische ringen worden gedefinieerd via gesimuleerde parameters. De afmetingen van de laatste dimensieparameter worden weergegeven in figuur 3A. - Converteer het 3D CAD-bestand naar een STL-bestandsformaat en genereer een G-code van de kanker-stroma concentrische ringen met behulp van een STL-CAD-wisselaar.
OPMERKING: Raadpleeg de notitie in stap 4.1.2 voor het algoritme voor het genereren van G-code. - Plaats de met cellen ingekapselde collageenbioinks in wegwerpspuiten van 3 ml op de kop van de 3D-printer en stel de temperatuur van het hoofd en de plaat in op 15 °C.
OPMERKING: Als de temperatuur van de kop en plaat van de printer meer dan 37 °C bereikt, wordt het bioink aan elkaar gekoppeld en wordt het niet meer afgedrukt. - Laad het gegenereerde afdrukpad op de besturingssoftware van de 3D-printer.
- Door op de startknop te klikken, drukt u de collageenbioinks af die kankercellen en stromale cellen inkapselen op de gasdoorlatende barrière volgens de geladen G-code met een 18 G plastic naald bij pneumatische druk van ongeveer 20 kPa bij 15 °C.
- Plaats aan het einde van elke drukbewerking handmatig een gesteriliseerde glazen afdekking van 22 mm x 50 mm bovenop de gasdoorlatende barrière om de hypoxische gradiënt te genereren.
OPMERKING: Vergelijk twee groepen, afhankelijk van de aanwezigheid van glasafdekking (GR+) en afwezigheid (GR-) daarvan om de generatie van de hypoxische gradiënt te verifiëren. - Na het genereren van drie hypoxische kanker-op-chips, breng de chips over naar een incubator bij 37 °C gedurende 1 uur om de collageenbioinks met elkaar te verbinden.
- Genereer de 3D-geometrie van de kanker-stroma concentrische ringen gedefinieerd in stap 1.2 met behulp van een 3D CAD-software.
-
Voltooiing van het fabricageproces en onderhoud van de hypoxische kanker-op-een-chip
- Na voltooiing van alle 3D-celprintprocessen van de hypoxische kanker-op-een-chip, wrijft u de afdekglazen voorzichtig over de gasdoorlatende barrières met de celschraper voor een strakke hechting(figuur 4A,B).
OPMERKING: Het afdekglas en de gasdoorlatende barrière worden geassembleerd via hydrofobe hechting zonder chemische lijmen, waarbij het verlijmde deel tussen het afdekglas en de PDMS-barrière eenvoudig wordt geschraapt. - Introduceer 1,5 ml endotheelcelgroeimedium in elke chip. Om loslating van de kankerconstructie te voorkomen, introduceert u celkweekmedium aan de ene kant van de chip. Kantel de chip zodat de celkweekmedia kunnen stromen met behulp van een pipet.
- Ververs de celkweekmedia een week lang elke dag. Gebruik een pipet om het celkweekmedium te aspireren; gebruik geen drukpomp.
- Na voltooiing van alle 3D-celprintprocessen van de hypoxische kanker-op-een-chip, wrijft u de afdekglazen voorzichtig over de gasdoorlatende barrières met de celschraper voor een strakke hechting(figuur 4A,B).
7. Evaluatie van de levensvatbaarheid van cellen na het afdrukken
-
Bereiding van monsters en behandeling met calceïne AM en EthD-1 oplossing
- Verwarm 1x PBS in een waterbad bij 37 °C.
- Bereid de testoplossing voor door 0,75 μL calceïneacetoxymethyl (calceïne AM) en 3 μL ethidium homodimeer (EthD-1) toe te voegen aan 1,5 ml voorverwarmd PBS.
- Aspireer voorzichtig alle media van de chip met behulp van een pipet.
- Was de kankerconstructie met voorverwarmde PBS. Vul 1,5 ml PBS in de chip met behulp van een pipet en laat deze 10 minuten staan bij kamertemperatuur. Om vervorming van de kankerconstructie te voorkomen, introduceert u 1x PBS aan één kant van de chips en kantelt u de chips om 1x PBS te laten stromen.
- Aspireer de PBS uit de chip; behandel de 1,5 ml testoplossing en incubeer de chip gedurende 20 minuten bij 37 °C met behulp van een folie ter bescherming tegen licht. Gebruik een pipet om 1x PBS te aspireren; gebruik geen zuigpomp.
-
Beeldvorming van de levensvatbaarheid van de cel met behulp van een fluorescentiemicroscoop
- Bekijk en leg de gelabelde cellen vast met behulp van een fluorescentiemicroscoop (figuur 4C).
OPMERKING: Calceïne AM markeert levende cellen met groene fluorescentie (golflengte ~488 nm). EthD-1 vertegenwoordigt het signaal van dode cellen met rode fluorescentie (golflengte ~594 nm). - Tel het aantal levende en dode cellen met behulp van imaging-software, een open-source beeldverwerkingsprogramma, en bereken de levensvatbaarheid met de getallen .
- Bekijk en leg de gelabelde cellen vast met behulp van een fluorescentiemicroscoop (figuur 4C).
8. Immunofluorescentie om de vorming van centrale hypoxie en het effect ervan op de maligniteit van kanker te valideren
-
Fixatie, permeabilisatie en blokkering van de kankerconstructie
- Bereid 1x PBS, 4% paraformaldehyde (PFA), 0,1% (v/v) Triton X-100 en 2% (w/v) runderserumalbumine (BSA) bij kamertemperatuur.
- Aspireer voorzichtig alle media van de chip met behulp van een pipet en spoel de chip drie keer af met 1x PBS. Om vervorming van de kankerconstructie te voorkomen, introduceert u 1x PBS aan één kant van de chips en kantelt u de chips om 1x PBS te laten stromen. Laat de chip tussen elke wasstap 5 minuten staan met 1x PBS om restoplossingen te verwijderen.
OPMERKING: 1x PBS werd aangezogen met behulp van een pipet, niet met een drukpomp. - Voeg 500 μL 4% PFA toe aan de kankerconstructie op de chip met behulp van een pipet; laat het 15 minuten staan en was drie keer met 1x PBS om de cellen in de kankerconstructie te fixeren.
- Behandel kankerconstructie met 500 μL van 0,1% Triton X-100 met behulp van een pipet op kamertemperatuur gedurende 5 minuten en was driemaal met 1x PBS om het celmembraan te solubiliseren en te permeabiliseren.
- Behandel kankerconstructie met 500 μL 2% BSA met behulp van een pipet bij kamertemperatuur gedurende 1 uur om reactieve epitopen te blokkeren.
OPMERKING: Bedek de chip met paraffinefilm om verdamping te voorkomen. - Was de chip na 1 uur driemaal met 1x PBS.
-
Behandeling met primair antilichaam, secundair antilichaam en DAPI en beeldvorming van de structuur met behulp van een confocale microscoop.
- Bereid isotypecontroleantistoffen en de cocktail van primaire antilichamen voor door de antilichamen in 1x PBS te verdunnen tot elke gewenste werkconcentratie.
OPMERKING: De specifieke details van de antilichamen zijn opgenomen in de tabel met materialen. Dezelfde werkconcentraties van isotypecontroleantistoffen als de primaire antilichamen moeten worden gebruikt. - Aspireer voorzichtig alle 1x PBS van de chip met behulp van een pipet en behandel de chip 's nachts met 200 μL primaire antilichaamoplossing bij 4 °C. Bedek de chips met paraffinefolie om verdamping te voorkomen.
- Aspireer de primaire antilichaamoplossing en was de chip drie keer met 1x PBS.
- Verdun secundaire antilichamen en DAPI in 1x PBS tot de gewenste werkconcentratie.
OPMERKING: In dit geval wordt een groen fluorescentiegeconjugeerd secundair antilichaam gebruikt in een verhouding van 1:200. DAPI werd gebruikt in een verhouding van 1:1000. - Aspireer voorzichtig alle 1x PBS van de chip met behulp van een pipet en behandel de chip met 200 μL secundaire antilichaam-DAPI oplossing bij 4 °C gedurende 3 uur. Bedek de chip met paraffinefolie om verdamping te voorkomen en wikkel deze vervolgens in met aluminiumfolie om fotobleaching te voorkomen.
- Aspireer de secundaire antilichaam-DAPI-oplossing en was de chip driemaal met 1x PBS.
- Nadat u de kleuringstap hebt voltooid, breng u de kankerconstructie over in een confocale schaal door voorzichtig vast te pakken met een tang.
- Visualiseer en leg de gelabelde cellen vast met behulp van een confocale microscoop (Figuur 5).
OPMERKING: De golflengte van de confocale microscoop werd aangepast, afhankelijk van het type fluorescerende markers. De specifieke details van de antilichamen zijn opgenomen in de tabel met materialen. Om de celpositie efficiënt te detecteren, is het beter om eerst de DAPI-bevlekte kernen van de constructie te observeren. De detectie-excitatie/emissiegolflengten van de fluorescerende signalen waren 358/461 nm (DAPI, Blauw), 494/517 nm (Groen) en 590/617 nm (Rood). De vergrotingen waren 4x, 10x en 20x, aangepast van de laagste naar de hoogste.
- Bereid isotypecontroleantistoffen en de cocktail van primaire antilichamen voor door de antilichamen in 1x PBS te verdunnen tot elke gewenste werkconcentratie.
9. Statistische analyse
-
Celtelling met beeldverwerkingsprogramma
- Voer een beeldverwerkingsprogramma uit om het aantal levende en dode cellen te tellen.
- Open de fluorescerende afbeeldingsbestanden. Klik op Bestand | Open en importeer de TIFF-afbeeldingen.
- Converteer de afbeeldingen naar 16-bits grijswaardenafbeeldingen. Klik op Afbeelding | Type | 16-bits grijswaarden.
- Pas de drempel aan door op Afbeelding | te klikken | aanpassen Drempel en selecteer vervolgens de kleur van de cellen die zwart moeten zijn.
- Knip samengevoegde cellen uit elkaar door te klikken op Proces | Binaire | Waterscheiding voor nauwkeurig celtelling.
- Tel het aantal cellen door drie keer op Analyseren en vervolgens op Deeltjes analyseren te klikken; bereken het gemiddelde en presenteer de gegevens als de gemiddelde ± standaardfout.
OPMERKING: Immunofluorescentiemarkers werden geanalyseerd door de fluorescentie-intensiteit te vergelijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De hypoxische kanker-op-een-chip is ontwikkeld met behulp van computerondersteunde 3D-celprinttechnologie om hypoxie en kankergerelateerde pathologie samen te vatten (figuur 1). Zuurstoftransport en -verbruik werden gesimuleerd met behulp van het 3D-geometriemodel. De chip is ontworpen in de vorm van concentrische ringen om de radiale zuurstofdiffusie en uitputting in kankerweefsels na te bootsen (figuur 2A). Na het definiëren van het regelvolume van een ruimte waar zuurstof verspreidde en werd verbruikt door cellen, werd een geschikte cellulaire dichtheid voor centrale hypoxiegeneratie bepaald door computationele eindige-elementenanalyse (Figuur 2B, C).
Op basis van eerdere resultaten werd een 3D-printpadcode voor de hypoxische kanker-op-een-chip gegenereerd (figuur 3). De CAD-bestanden van de offer peva schimmel en kanker constructies werden geconverteerd naar STL bestandsformaat (Figuur 3A, B). Het afdrukpad werd gecodeerd en overgebracht naar het multi-printing systeem met behulp van een intern softwareprogramma (Figuur 3C).
Een hypoxische kanker-op-een-chip werd vervaardigd met behulp van de 3D-celprinttechnologie. Om de structurele, biochemische en biofysische heterogeniteit van vaste kanker samen te vatten, werd een stapsgewijs fabricageproces opgezet voor de kankerconstructie en de gasdoorlatende barrière, de enige manier waarop zuurstof het systeem kan binnendringen (Figuur 4A). Een gecompartimenteerde kanker-stroma concentrische ringstructuur werd gecreëerd om de anatomische kenmerken van de solide kanker te reproduceren (Figuur 4B). De heterogene geometrie van het kankerweefsel werd in vitro gerealiseerd met behulp van de 3D-celprinttechnologie. De levensvatbaarheid van de cellen werd na het afdrukken geëvalueerd om de chemische en mechanische belasting tijdens het fabricageproces te bevestigen. De verhouding van de groen bevlekte levende cellen was aanzienlijk hoger dan die van de roodgevlekte dode cellen. Kwantitatief bedroeg de levensvatbaarheid van de cellen na het drukken meer dan 96,92% ± 2,46% (figuur 4C). Dit resultaat bevestigt dat de productieomstandigheden geschikt waren voor kankercellen en stromale cellen.
Afhankelijk van de aanwezigheid (GR+) en de afwezigheid (GR-) van de zuurstofgradiënt werden twee groepen vergeleken om de effecten van de hypoxische gradiënt op de progressie van kanker te verifiëren (figuur 5A). Onder beide omstandigheden bestonden gerijpte CD31+ endotheelcellen in de perifere regio's, wat aangaf dat ruimtelijk gevormde levende constructie werd geproduceerd met behulp van 3D-bioprinttechnologie. In vergelijking met de GR-toestand vertoonde de GR+ conditie een hypoxische gradiënt, wat wijst op de geleidelijke expressie van HIF1α (figuur 5B), waarbij SHMT2+ pseudopalisadingcellen en SOX2+ pluripotente cellen werden waargenomen, wat het agressieve pathofysiologische kenmerk van solide kanker vertegenwoordigde (Figuur 5C). Namelijk, de pathologische kenmerken van glioblastoom werden samengevat onder de ontworpen hypoxische aandoening15.
Figuur 1: Een schema van de ontwikkeling van hypoxische kanker-op-een-chip. Dit cijfer is overgenomen uit Nature biomedical engineering15 (Copyright, 2019). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2: Computationele simulatie van de vorming van zuurstofgradiënt op hypoxische kanker op een chip. (A) Een 3D geometrie van hypoxische kanker-op-een-chip. (B) Een schema dat het gebied voor zuurstofverdelingsanalyse aangeeft. Dit cijfer is overgenomen uit Nature biomedical engineering15 (Copyright, 2019). (C) Een straalkleurkaartbeeld van het zuurstofdistributieprofiel. Dit cijfer is overgenomen uit Nature biomedical engineering15 (Copyright, 2019). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3: Generatie van 3D-printpadcode voor hypoxische kanker-op-een-chip. (A) Een 3D-geometrie van offerende PEVA-mal. (B) Een afbeelding van offer PEVA schimmel in STL bestandsformaat. (C) Een G-code van offer PEVA schimmel. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4: 3D-celprinten van hypoxische kanker-op-een-chip. (A) Een schema van het fabricageproces van hypoxische kanker-op-een-chip. (B) Een gedrukte hypoxische kanker-op-een-chip en gecompartimenteerde structuur van kanker-stroma concentrische ringen; schaalbalken vertegenwoordigen 200 μm. (C) Een fluorescentiebeeld van de 3D-celgeprinte kankerconstructie voor het evalueren van de levensvatbaarheid; schaalbalken vertegenwoordigen 200 μm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 5: Generatie van hypoxische gradiënt en evaluatie van pathologische kenmerken van gemanipuleerde vaste kanker. (A) Experimentele groepen onder twee verschillende zuurstofdoorlaatbaarheidsomstandigheden. (B) Representatieve immunostaining beelden van de opwekking van zuurstofgradiënt met behulp van HIF1α; schaalstaven vertegenwoordigen 200 μm. (C) Representatieve immunostaining beelden van pathologische kenmerken van hypoxische kanker met behulp van SHMT2, SOX2 en CD31; schaalbalken vertegenwoordigen 200 μm. Dit cijfer is overgenomen uit Nature biomedical engineering15 (Copyright, 2019). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In deze studie beschrijven we het fabricageproces van een hypoxische kanker-op-een-chip op basis van 3D-celprinttechnologie. De vorming van de hypoxische gradiënt in de ontworpen chip werd voorspeld door middel van computersimulaties. De omgeving die een heterogene hypoxische gradiënt kan veroorzaken, werd gereproduceerd via een eenvoudige strategie die de 3D-geprinte gasdoorlatende barrière en de glazen afdekking combineert. De hypoxie-gerelateerde pathologische kenmerken van glioblastoom, waaronder pseudopalisade en een kleine populatie kankerstamcellen, werden samengevat onder hypoxische gradiëntomstandigheden van de chip.
Om de productiviteit en herhaalbaarheid te verbeteren, werden twee belangrijke fabricagestappen opeenvolgend gewijzigd in vergelijking met het eerder gepubliceerde model15. Ten eerste werd indirect een PDMS-barrière geproduceerd om de slechte afdrukbaarheid van PDMS met een uithardingsmiddel te overwinnen, dat in realtime wordt uitgehard in plaats van via een directe afdrukmethode in één stap. Daarom werd biocompatibele PEVA met een hogere afdrukbaarheid aangepast om de offervorm te fabriceren en werd PDMS toegevoegd om de gasdoorlatende barrière te creëren. Ten tweede werd het type diaglas veranderd in een hydrofiele glijbaanglas, wat gunstig is om de afzetting van bioinks en vormgetrouwheid te ondersteunen. Tot slot werd het bouwen van de medium reservoirs aan beide uiteinden van de chip efficiënte medium uitwisseling mogelijk gemaakt.
Kritische factoren in elke fabricagestap van hypoxische kanker-op-een-chip via 3D-bioprinting moeten voorzichtig worden gecontroleerd. Tijdens het gieten moet de hoogte van PDMS groter zijn dan die van de offerende PEVA-mal, anders wordt de spaan die met het afdekglas wordt vastgedraaid los, wat een negatief effect heeft op de hypoxische kerngeneratie. Tijdens het afdrukken van collageen, een thermisch gevoelige hydrogel, moet de temperatuur van de printkop op 15 °C worden gehouden om verstopping van het mondstuk als gevolg van een sol-gel overgangsfenomeen te voorkomen. Als de hydrogel tijdelijk met elkaar verbonden raakt, kan het geblokkeerde mondstuk eenvoudig worden gereinigd met een hoge pneumatische druk en een scherpe naald. Als de blokkering echter ernstig is, moet de hydrogel opnieuw worden voorbereid. Bovendien moet het celdrukproces binnen 1 uur worden voltooid, rekening houdend met de levensvatbaarheid van de cel.
De 3D-bioprinttechnologie vergemakkelijkt de engineering van een hypoxische kanker-op-een-chip die kan worden gebruikt om het onderliggende mechanisme van kanker te bestuderen en de therapeutische weerstand van verschillende solide tumoren te voorspellen15. Vooral het gebruik van op extrusie gebaseerde 3D-bioprinttechnologie maakte snelle en repetitieve productie met een hoge mate van vrijheid mogelijk. Bovendien stellen de reproduceerbaarheid en het snelle tijdsbestek voor kankermodellering het farmaceutische veld in staat om een dataset van kandidaten voor geneesmiddelencombinaties voor kankerbehandeling op te bouwen. Vanwege de beperkte resolutie van de technologie wordt de geprinte hypoxische kanker-op-een-chip echter geproduceerd in het bereik van enkele honderden micrometers, waarvoor grote hoeveelheden materialen nodig zijn. Bovendien is het moeilijk om een platform voor drugsscreening met hoge doorvoer te ontwikkelen onder de ruimtebeperkingen20. Daarom moet de technologie worden verbeterd om modellen te ontwikkelen die multiparameterstudies met beperkte middelen en ruimtelijke omvang kunnen ondersteunen.
De ontwikkelde hypoxische-kanker-op-een-chip kan worden toegepast op weefselspecifieke kankermodellering door gebruik te maken van weefselspecifieke materialen, zoals een hydrogel afgeleid van een gedecellulariseerde extracellulaire matrix (ECM). Omdat de biochemische en fysiologische variaties van het ECM cellulaire functies beïnvloeden, kan superieure emulatie van talrijke kankertypen met een orgaanspecifieke kankermicromilieu worden gerealiseerd21. Bovendien, door te combineren met andere gemanipuleerde weefselconstructies, waaronder gemanipuleerde bloedvaten, die kritieke effecten hebben op de ontwikkeling van kanker, kunnen dynamische pathofysiologische veranderingen in angiogene, immunogene en gemetastaseerde eigenschappen worden bestudeerd. Bovendien kan gepersonaliseerde kankertherapie worden bereikt met de ontwikkelde chip door gebruik te maken van patiënt-afgeleide cellen15. Het testen van de gevoeligheid van geneesmiddelen voorafgaand aan de klinische behandeling zou een belangrijke stap zijn om de werkzaamheid van de therapie te verbeteren tijdens het proces van het vinden van een geschikt therapeutisch regime voor een individuele patiënt op tijd. Een patiëntspecifiek kankermodel met een patiënt-afgeleide bron zal naar verwachting de patiëntprofilering verbeteren om verschillen in pathofysiologie en chemogevoeligheid van elke patiënt te voorspellen. In de vorige studie werden patiëntspecifieke therapeutische effecten tegen verschillende geneesmiddelcombinaties binnen een redelijk tijdsbestek (1-2 weken) voorspeld met behulp van de 3D-geprinte hypoxische kanker-op-een-chip, wat resulteert in relatief snelle conclusies in vergelijking met andere methoden, wat het potentieel voor het patiëntspecifieke preklinische modelsuggereert 15.
Samengevat is 3D-celprinten van kanker-op-een-chip gunstig voor het samenvatten van een heterogene kankermicromilieu. De nagebootste micro-omgeving stimuleert de pathologische progressie van kanker, inclusief de vorming van een necrotische kern als gevolg van hypoxie. Dit protocol kan worden toegepast op het testen van geneesmiddelen tegen kanker en patiëntspecifieke kankermodellen. In dit opzicht verwachten we dat deze zeer controleerbare aanpak gunstig kan zijn voor het bouwen van verschillende kankermodellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen onthullingen.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd ondersteund door de National Research Foundation of Korea (NRF) gefinancierd door het Ministerie van Onderwijs (nr. 2020R1A6A1A03047902 en NRF-2018H1A2A1062091) en de Koreaanse overheid (MSIT) (nr. NRF-2019R1C1C1009606 en NRF-2019R1A3A3005437).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cells | |||
| Human umbilical vein endothelial cells | Promocell | C-12200 | |
| U-87 MG cells | ATCC | ATCC HTB-14 | |
| Disposable | |||
| 0.2 μm syringe filter | Sartorius | 16534-K | |
| 10 mL disposable syringe | Jung Rim | 10ml 21G32 | |
| 10 mL glass vial | Hubena | A0039 | |
| 10 mL Serological pipette tip | SPL lifescience | 91010 | |
| 15 mL conical tube | SPL lifescience | 50015 | |
| 18G plastic needle | Musashi engineering | PN-18G-B | |
| 20G plastic tapered dispense tip | Musashi engineering | TPND-20G-U | |
| 22x50 glass cover | MARIENFIELD | 0101142 | |
| 25 mL Serological pipette tip | SPL lifescience | 90125 | |
| 3 mL disposable syringes | HENKE-JET | 4020-X00V0 | |
| 40 µm cell strainer | Falcon | 352360 | |
| 5 mL Serological pipette tip | SPL lifescience | 91005 | |
| 50 mL conical tube | SPL lifescience | 50050 | |
| 50 mL Serological pipette tip | SPL lifescience | 90150 | |
| 50N precision nozzle | Musashi engineering | HN-0.5ND | |
| Aluminum foil | SINKWANG | ||
| Capillary tips | Gilson | CP1000 | |
| Cell-scrapper | SPL lifescience | 90030 | |
| Confocal dish | SPL lifescience | 200350 | |
| Parafilm | Bemis | PM996 | |
| Pre-coated histology slide | MATSUNAMI | MAS-11 | |
| Reservoir | SPL lifescience | 23050 | |
| T-75 cell culture flask | SPL lifescience | 70075 | |
| Equipment | |||
| 3DX printer | T&R Biofab | ||
| Autoclave | JEIOTECH | AC-12 | |
| Centrifuger | Cyrozen | 1580MGR | |
| Confocal laser microscopy | Olympus Life Science | FV 1000 | |
| Fluorescence microscope | FISHER SCEINTIFIC | O221S366 | |
| Forcep | Korea Ace Scientific | HC.203-30 | |
| Hand tally counter | KTRIO | ||
| Hemocytometer | MARIENFIELD | 0650030 | |
| Incubator | Panasonic | MCO-170AIC | |
| Laminar flow cabinet | DAECHUNG SCIENCE | CB-BMMS C-001 | |
| Metal syringe | IWASHITA engineering | SUS BARREL 10CC | |
| Operating Scissors | Hirose | HC.13-122 | |
| Oven | JEIOTECH | OF-12, H070023 | |
| Positive displacement pipette | GILSON | NJ05652 | |
| Refrigerator | SAMSUNG | CRFD-1141 | |
| Voltex Mixer | DAIHAN scientific | VM-10 | |
| Water bath | DAIHAN SCIENTIFIC | WB-11 | |
| Water purifier | WASSER LAB | DI-GR | |
| Materials | |||
| 0.25 % Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-072 | |
| 10x PBS | Intron | IBS-BP007a | |
| 4% Paraformaldehyde | Biosesang | ||
| 70% Ethanol | Daejung | 4018-4410 | |
| Anti-CD31 antibody | Abcam | ab28364 | |
| Anti-HIF-1 alpha antibody | Abcam | ab16066 | |
| Anti-SHMT2/SHMT antibody | Abcam | ab88664 | |
| Anti-SOX2 antibody | Abcam | ab75485 | |
| Bovine Serum Albumin | Thermo scientific | J10857-22 | |
| Collagen from porcine skin | Dalim tissen | PC-001-1g | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermofisher | D1306 | |
| Endothelial Cell Growth Medium-2 | Promocell | C22011 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 12483-020 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Theromofisher | A-11001 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 | Theromofisher | A-11012 | |
| High-glucose Dulbecco’s Modified Eagle Medium(DMEM) | Hyclone | SH30243-0 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 311413-100ML | |
| Live/dead assay kit | Invitrogen | L3224 | |
| Mouse IgG1, kappa monoclonal [15-6E10A7] - Isotype Control | Abcam | ab170190 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Phenol red solution | Sigma-Aldrich | P0290-100ML | |
| Poly(ethylene-vinyl acetate) | Poly science | 06108-500 | |
| Polydimethylsiloxane | Dowhitech | sylgard 184 | |
| Rabbit IgG, polyclonal - Isotype Control | Abcam | ab37415 | |
| Sodium hydroxide solution | Samchun | S0610 | |
| Triton X-100 | Biosesang | TRI020-500-50 | |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| Software | |||
| COMSOL Multiphysics 3.5a | COMSOL AB | ||
| IMS beamer | in-house software | ||
| SolidWorks Package | Dassault Systems SolidWorks Corporation |
References
- Jing, X., et al. Role of hypoxia in cancer therapy by regulating the tumor microenvironment. Molecular Cancer. 18 (1), 157 (2019).
- Al Tameemi, W., Dale, T. P., Al-Jumaily, R. M. K., Forsyth, N. R.
- Petrova, V., Annicchiarico-Petruzzelli, M., Melino, G., Amelio, I.
- Hockel, M., Vaupel, P. Tumor hypoxia: definitions and current clinical, biologic, and molecular aspects. Journal of the National Cancer Institute. 93 (4), 266-276 (2001).
- Kim, H., Lin, Q., Glazer, P. M., Yun, Z. The hypoxic tumor microenvironment in vivo selects the cancer stem cell fate of breast cancer cells. Breast Cancer Research. 20 (1), 16 (2018).
- Jeong, G. S., Lee, J., Yoon, J., Chung, S., Lee, S. -H. Viscoelastic lithography for fabricating self-organizing soft micro-honeycomb structures with ultra-high aspect ratios. Nature Communications. 7 (1), 1-9 (2016).
- Razian, G., Yu, Y., Ungrin, M. Production of large numbers of size-controlled tumor spheroids using microwell plates. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (81), e50665 (2013).
- Nunes, A. S., Barros, A. S., Costa, E. C., Moreira, A. F., Correia, I. J. 3D tumor spheroids as in vitro models to mimic in vivo human solid tumors resistance to therapeutic drugs. Biotechnology and Bioengineering. 116 (1), 206-226 (2019).
- Wan, L., Neumann, C., LeDuc, P. Tumor-on-a-chip for integrating a 3D tumor microenvironment: chemical and mechanical factors. Lab on a Chip. 20 (5), 873-888 (2020).
- Nam, H., Funamoto, K., Jeon, J. S. Cancer cell migration and cancer drug screening in oxygen tension gradient chip. Biomicrofluidics. 14 (4), 044107 (2020).
- Palacio-Castañeda, V., Kooijman, L., Venzac, B., Verdurmen, W. P., Le Gac, S. Metabolic switching of tumor cells under hypoxic conditions in a tumor-on-a-chip model. Micromachines. 11 (4), 382 (2020).
- Ronaldson-Bouchard, K., Vunjak-Novakovic, G. Organs-on-a-chip: a fast track for engineered human tissues in drug development. Cell Stem Cell. 22 (3), 310-324 (2018).
- Mi, S., Du, Z., Xu, Y., Sun, W. The crossing and integration between microfluidic technology and 3D printing for organ-on-chips. Journal of Materials Chemistry B. 6 (39), 6191-6206 (2018).
- Yi, H. -G., Lee, H., Cho, D. -W.
- Yi, H. -G., et al. A bioprinted human-glioblastoma-on-a-chip for the identification of patient-specific responses to chemoradiotherapy. Nature Biomedical Engineering. 3 (7), 509-519 (2019).
- Kang, T. -Y., Hong, J. M., Jung, J. W., Yoo, J. J., Cho, D. -W. Design and assessment of a microfluidic network system for oxygen transport in engineered tissue. Langmuir. 29 (2), 701-709 (2013).
- Woo Jung, J., et al. Evaluation of the effective diffusivity of a freeform fabricated scaffold using computational simulation. Journal of Biomechanical Engineering. 135 (8), (2013).
- Brown, A. C., De Beer, D. Development of a stereolithography (STL) slicing and G-code generation algorithm for an entry level 3-D printer. 2013 Africon (IEEE). , 1-5 (2013).
- Shim, J. -H., Lee, J. -S., Kim, J. Y., Cho, D. -W. Bioprinting of a mechanically enhanced three-dimensional dual cell-laden construct for osteochondral tissue engineering using a multi-head tissue/organ building system. Journal of Micromechanics and Microengineering. 22 (8), 085014 (2012).
- Gillispie, G., et al. Assessment methodologies for extrusion-based bioink printability. Biofabrication. 12 (2), 022003 (2020).
- Kim, B. S., Das, S., Jang, J., Cho, D. -W. Decellularized extracellular matrix-based bioinks for engineering tissue-and organ-specific microenvironments. Chemical Reviews. 120 (19), 10608-10661 (2020).
