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Bioengineering

3D-zellgedruckter hypoxischer Krebs-on-a-Chip zur Rekapitulation des pathologischen Verlaufs von solidem Krebs

Published: January 5, 2021 doi: 10.3791/61945
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2, 1, 1,3
1Department of Mechanical Engineering, Pohang University of Science and Technology (POSTECH), 2Department of Creative IT Engineering, Pohang University of Science and Technology (POSTECH), 3Department of Rural and Biosystems Engineering, College of Agriculture and Life Sciences, Chonnam National University
* These authors contributed equally

Summary

Hypoxie ist ein Kennzeichen der Tumormikroumgebung und spielt eine entscheidende Rolle beim Fortschreiten des Krebses. Dieser Artikel beschreibt den Herstellungsprozess eines hypoxischen Krebs-auf-einem-Chip basierend auf der 3D-Zelldrucktechnologie, um eine hypoxiebedingte Pathologie von Krebs zu rekapitulieren.

Abstract

Die Mikroumgebung von Krebs hat einen signifikanten Einfluss auf das Fortschreiten der Krankheit. Insbesondere Hypoxie ist der Schlüsselfaktor für das Überleben, die Invasion und die Chemoresistenz von Krebs. Obwohl mehrere In-vitro-Modelle entwickelt wurden, um die hypoxiebedingte Krebspathologie zu untersuchen, wurde das komplexe Zusammenspiel der in vivo beobachteten Krebsmikroumgebung aufgrund des Mangels an präziser räumlicher Kontrolle noch nicht reproduziert. Stattdessen wurden 3D-Biofabrikationsansätze vorgeschlagen, um mikrophysiologische Systeme für eine bessere Nachbildung der Krebsökologie und eine genaue Bewertung der Krebsbehandlung zu schaffen. Hier schlagen wir einen 3D-Zelldruckansatz vor, um einen hypoxischen Krebs-auf-einem-Chip herzustellen. Die Hypoxie-induzierenden Komponenten im Chip wurden auf Basis einer Computersimulation der Sauerstoffverteilung bestimmt. Krebs-Stroma-Konzentrische Ringe wurden mit Biotinten gedruckt, die Glioblastomzellen und Endothelzellen enthielten, um eine Art von solidem Krebs zu rekapitulieren. Der resultierende Chip realisierte zentrale Hypoxie und verschlimmerte maligne bei Krebs mit der Bildung repräsentativer pathophysiologischer Marker. Insgesamt wird erwartet, dass der vorgeschlagene Ansatz zur Schaffung eines solid-krebsmimetischen mikrophysiologischen Systems die Lücke zwischen In-vivo- und In-vitro-Modellen für die Krebsforschung schließen wird.

Introduction

Die Mikroumgebung von Krebs ist ein kritischer Faktor, der das Fortschreiten des Krebses antreibt. Mehrere Komponenten, einschließlich biochemischer, biophysikalischer und zellulärer Hinweise, bestimmen die pathologischen Merkmale von Krebs. Unter diesen ist Hypoxie stark mit krebserhaltendem Überleben, Proliferation und Invasion verbunden1. Durch das unbegrenzte Wachstum und die Teilung von Krebszellen werden Nährstoffe und Sauerstoff kontinuierlich erschöpft und es entsteht ein hypoxischer Gradient. Unter sauerstoffarmen Bedingungen aktivieren Zellen eine mit Hypoxie induzierbare Transkriptionsfaktor (HIF) assoziierte molekulare Kaskade. Dieser Prozess induziert einen nekrotischen Kern, löst metabolische Veränderungen aus und initiiert Blutgefäßhyperplasie und Metastasierung2,3. Anschließend verursacht Hypoxie in Krebszellen die Zerstörung benachbarter normaler Gewebe. Darüber hinaus ist Hypoxie stark mit der therapeutischen Resistenz solider Tumoren in multifaktorieller Weise verbunden. Hypoxie kann die Strahlentherapie stark behindern, da die Strahlenempfindlichkeit aufgrund der reaktiven Sauerstoffspezies1,4begrenzt ist. Darüber hinaus senkt es den pH-Wert der Mikroumgebung von Krebs, was die Arzneimittelakkumulation verringert1. Daher ist die Reproduktion pathologischer Merkmale im Zusammenhang mit Hypoxie in vitro eine vielversprechende Strategie für wissenschaftliche und präklinische Befunde.

Die Modellierung einer spezifischen Mikroumgebung von Krebs ist für das Verständnis der Krebsentwicklung und die Erforschung geeigneter Behandlungen unerlässlich. Obwohl Tiermodelle aufgrund ihrer starken physiologischen Relevanz weit verbreitet sind, gibt es Fragen im Zusammenhang mit Artenunterschieden und ethischen Problemen5. Obwohl herkömmliche 2D- und 3D-Modelle die Manipulation und Echtzeit-Bildgebung von Krebszellen für eine eingehende Analyse ermöglichen, kann ihre architektonische und zelluläre Komplexität nicht vollständig rekapituliert werden. Zum Beispiel sind Krebs-Sphäroid-Modelle weit verbreitet, da die Aggregation von Krebszellen in einem Sphäroid auf natürliche Weise Hypoxie im Kern erzeugen kann. Darüber hinaus wurde eine große Anzahl von zellulären Sphäroiden einheitlicher Größe mit kunststoff- oder silikonbasierten Multi-Well-Systemenhergestellt 6,7. Die geringere Flexibilität in Bezug auf die Erfassung der genauen heterogenen Struktur von Krebsgewebe mit herkömmlichen Plattformen hat jedoch die Etablierung einer fortschrittlichen Biofabrikationstechnologie erfordert, um eine hochbiomimetische Plattform zur Verbesserung der Krebsforschung aufzubauen8.

Mikrophysiologische 3D-Systeme (MPS) sind nützliche Werkzeuge, um die komplexe Geometrie und das pathologische Fortschreiten von Krebszellen zu rekapitulieren9. Da Krebszellen den biochemischen Gradienten von Wachstumsfaktoren und Chemokinen und die auf dem System reproduzierte mechanische Heterogenität spüren, können wichtige Merkmale der Krebsentfaltung in vitro untersucht werden. Zum Beispiel wurden Krebslebensfähigkeit, metastasierende Malignität und Arzneimittelresistenz in Abhängigkeit von den unterschiedlichen Sauerstoffkonzentrationen mit MPSs10,11untersucht. Trotz der jüngsten Fortschritte beruht die Erzeugung hypoxischer Bedingungen von In-vitro-Modellen auf komplexen Herstellungsverfahren, einschließlich der Verbindung mit physikalischen Gaspumpen. Daher sind einfache und flexible Methoden zum Aufbau krebsspezifischer Mikroumgebungen erforderlich.

Die 3D-Zelldrucktechnologie hat aufgrund ihrer präzisen Kontrolle der räumlichen Anordnung von Biomaterialien zur Rekapitulation nativer biologischer Architekturen erhebliche Aufmerksamkeit erregt12. Insbesondere überwindet diese Technologie die bestehenden Einschränkungen von 3D-Hypoxiemodellen aufgrund ihrer hohen Kontrollierbarkeit und Machbarkeit für den Aufbau der räumlichen Merkmale der Krebsmikroumgebung. Der 3D-Druck erleichtert auch die computergestützte Fertigung durch einen Schicht-für-Schicht-Prozess und bietet so eine schnelle, genaue und reproduzierbare Konstruktion komplexer Geometrien, um tatsächliche Gewebearchitekturen nachzuahmen. Zusätzlich zu den Vorteilen bestehender Herstellungsstrategien für 3D-MPS können die pathophysiologischen Merkmale des Krebsprogressiones durch Musterung der biochemischen, zellulären und biophysikalischen Komponenten reproduziert werden13,14.

Hier stellen wir eine 3D-Zelldruckstrategie für einen hypoxischen Krebs-on-a-Chip vor, um die Heterogenität eines soliden Krebses zu rekapitulieren (Abbildung 1)15. Die Herstellungsparameter wurden durch eine computergestützte Simulation der zentralen Hypoxiebildung im System bestimmt. Krebs-Stroma-Konzentrische Ringe wurden mit Kollagen-Biotinten gedruckt, die Glioblastomzellen und Endothelzellen enthalten, um die Pathophysiologie des Glioblastoms, einer Art von solidem Krebs, nachzuahmen. Die Bildung eines radialen Sauerstoffgradienten verschlimmerte die Malignität des Krebses, was auf eine verstärkte Aggressivität hindeutet. Darüber hinaus zeigen wir Zukunftsperspektiven für die Anwendungen des Chips auf patientenspezifische präklinische Modelle auf. Der vorgeschlagene Ansatz zur Schaffung eines solid-krebsmimetischen mikrophysiologischen Systems soll die Lücke zwischen In-vivo- und In-vitro-Krebsmodellen schließen.

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Protocol

1. Computersimulation der Sauerstoffgradientenbildung

  1. Erstellung eines 3D-Geometriemodells für den hypoxischen Krebs-on-a-Chip-Druck
    1. Führen Sie eine 3D-CAD-Software aus.
    2. Skizzieren Sie das Geometriemodell von hypoxischem Krebs auf einem Chip. Klicken Sie auf Skizze und wählen Sie die gewünschte Ebene aus, um die Geometrie zu zeichnen. Die Detailskala der einzelnen Teile finden Sie in der Zeichnung (Abbildung 2A).
    3. Legen Sie die Dicke der Geometrie fest, indem Sie auf Feature-Protrusion Boss/Baseklicken. Geben Sie die gewünschte Dicke (siehe Abbildung 2A)in das leere Feld ein und wählen Sie das grüne Häkchensymbol aus, um die 3D-Geometrie zu bilden.
      HINWEIS: Die Dimension des Krebs-auf-einem-Chips wird basierend auf den gewünschten Volumina von Medien und Hydrogel definiert. Im vorliegenden Experiment lagen die gewünschten Medien- und Hydrogelvolumina bei ca. 1.500 μL bzw. 500 μL, basierend auf den bisherigen praktischen Erfahrungen zur Auflösung von extrusionsbasierten Bioprintern.
    4. Speichern Sie die Geometriedatei als 3D-CAD-Dateiformat (.prt oder .stl).
  2. Bestimmung der Zelldichte zur Induktion des hypoxischen Kerns
    1. Führen Sie ein Simulationsprogramm für physikalische Diffusion aus.
    2. Klicken Sie auf LiveLink und wählen Sie das verwendete CAD-Programm aus. Klicken Sie auf Synchronisieren, um die Geometrie des hypoxischen Krebs-on-a-Chips in das Simulationsprogramm zu importieren. Da der innere Raum der Kammer in einer tatsächlichen experimentellen Umgebung mit einem Kulturmedium gefüllt wird, diffundiert Sauerstoff über den inneren Raum der Kammer und das zelluläre Konstrukt, das aus zellbeladenen Hydrogelen besteht.
      HINWEIS: Einzelheiten zu den physikalischen Parametern finden Sie in der vorherigen Studie15.
    3. Definieren Sie die importierte 3D-Geometrie als Kontrollvolumen des Raumes, in dem Sauerstoff diffundiert und die Zellen Sauerstoff verbrauchen (Abbildung 2B).
    4. Führen Sie eine Computeranalyse für die Gasdiffusionsanalyse nach einem Benutzerhandbuch und zuvor etablierten Methoden16,17durch.
    5. Exportieren Sie aus den Ergebnissen der Computeranalyse die geschätzten Sauerstoffkonzentrationsdaten über den Querschnitt A-A' zu jedem Zeitpunkt gemäß der Bedienungsanleitung. Die maßgebliche Gleichung basiert auf dem ersten Gesetz von, wie es in Gleichung (1) ausgedrückt ist (Abbildung 2C).
      Equation 1
      wobei c die Konzentration, D der Sauerstoffdiffusionskoeffizient, N-Zelle die Dichte der Zellen, Equation 2 die maximale Aufnahmerate von Sauerstoff und Km die Michaelis-Menten-Konstante ist. Die Konstanten wurden wie in einer früheren Veröffentlichung15beschrieben angewendet.
      HINWEIS: Jeder Zeitpunkt bedeutet einen Schrittpunkt, um die Veränderung der Sauerstoffdiffusion im Laufe der Zeit zu beobachten.
    6. Bewerten Sie, ob der minimale Sauerstoffgehalt eine Hypoxieschwelle erreicht, und wiederholen Sie den Computeranalyseprozess mit einem Inkrement oder einer Abnahme der Zelldichte.
      HINWEIS: Definieren Sie, dass hypoxie Gradient im Konstrukt gebildet wird, wenn der Sauerstoffgehalt von 80% im Hydrogelbereich nach 24 h weniger als 0,02 mM beträgt.
    7. Bestätigen Sie die Anzahl der Zellen, die erforderlich sind, um den Sauerstoffgradienten zu erzeugen, der Hypoxie in der zentralen Region induziert, aus erstem Gesetz in Schritt 1.2.5 und die Simulationsergebnisse aus Schritt 1.2.6.
      HINWEIS: In diesem Protokoll war die Zellnummer 2 × 106 Zellen / jedes Konstrukt.

2. Zellkultur von Krebszellen und Stromazellen

  1. Herstellung von Zellkulturmedien zur Vermeidung physiologischer Belastungen
    1. Für U-87 MG-Zellen (immortalisierte menschliche Glioblastom-Zelllinie) legen Sie 12 ml des modifizierten Eagle-Mediums von Dulbecco mit hohem Glukosespiegel, das 10% fetales Rinderserum, 100 U / ml Penicillin und 100 μg / ml Streptomycin enthält, in einen T-75-Zellkulturkolben in einem 37 ° C, 5% CO2 befeuchteten Inkubator für 30 minuten, um die thermischen und alkalischen Wirkungen des Mediums auf die Zellen zu minimieren.
      HINWEIS: Glioblastom wurde als eine Art von solidem Krebs ausgewählt, weil es aggressive Eigenschaften in einer hypoxischen Umgebung hat. Andere verschiedene Krebsarten können auf dieses Modell angewendet werden.
    2. Bei humanen Nabelschnurvenendothelzellen (HUVECs) werden 12 ml Endotheliale Wachstumsmedium in einen T-75-Zellkulturkolben in einen 5% CO2 befeuchteten Inkubator bei 37 °C für 30 min geben.
      HINWEIS: HUVECs wurden ausgewählt, weil es eine der repräsentativsten Endothelzelllinien ist. Verschiedene Arten von Stromazellen können auch auf dieses Modell angewendet werden.
  2. Schnelles Auftauen von kryokonservierten Krebszellen und Stromazellen und deren Erhaltung
    1. Bewegen Sie Kryoviale mit 5 x 105 U-87 MG-Zellen und HUVECs aus dem Flüssigstickstoffbehälter in einen Laminar-Flow-Schrank. Lösen Und verkleinern Sie die Kappe sofort, um den Innendruck freizugeben.
    2. Legen Sie die kryokonservierten Zellen vorsichtig für 2 min in ein Wasserbad bei 37 °C und halten Sie die Kappe aus dem Wasser. Spülen Sie die Fläschchen mit 70% Ethanol unter laminarem Durchfluss ab, um eine Kontamination zu vermeiden.
    3. Die aufgetauten Zellen werden in die Kolben mit den in Schritt 2.1 beschriebenen vorbereiteten Zellkulturmedien überführen und die zellhaltigen Kolben zur Zellrückgewinnung in einen 5%igen CO 2-Befeuchtungsinkubator bei 37 °C eingelegt.
    4. Aktualisieren Sie das Zellkulturmedium alle 2 Tage und erhalten Sie das Zellwachstum.
    5. Ersetzen Sie nach 24 Stunden Auftauen die Zellkulturmedien, um eine Zytotoxizität von Dimethylsulfoxid (DMSO) zu vermeiden, das zum Einfrieren der Zellen verwendet wurde. Verwenden Sie HUVECs, die weniger als 6 Passagen durchlaufen haben.

3. Herstellung von Kollagen-Pre-Gel-Lösung

  1. Solubilisierung von Kollagenschwamm mit 0,1 N Salzsäure (HCl)
    1. Bereiten Sie eine Lösung von 0,1 N HCl vor und filtern Sie sie mit einem 0,2 μm Spritzenfilter.
    2. Für 3 ml einer 1% (w/ v) neutralisierten Kollagen-Pre-Gel-Lösung Kollagenschwämme in 5 x 5 mm2 Stück schneiden und 30 mg wiegen.
    3. Die geschnittenen Kollagenstücke in eine sterile 10-ml-Glasfläschchen geben.
      HINWEIS: Bereiten Sie das 1,5-fache Volumen des erforderlichen Kollagenhydrogels vor, wobei der Verlust des Hydrogels aufgrund der klebrigen Eigenschaft der Kollagenlösung berücksichtigt wird.
    4. 2,4 ml 0,1 N HCl in die kollagenhaltige Glasfläschchen geben und 3 Tage lang bei 15 U/min und 4 °C auf der Wippe inkubieren.
      HINWEIS: Das Volumen der 0,1 N HCl-Lösung betrug vier Fünftel des endgefeinten Volumens des erforderlichen Kollagenhydrogels. In diesem Fall wurden 3 ml Kollagen hergestellt.
    5. Nach der Verdauung die unverdauten Kollagenpartikel mit einem 40 μm Zellsieb sieben. Lagern Sie die saure Kollagenlösung bei 4 °C und verwenden Sie sie innerhalb von 7 Tagen.
  2. pH-Einstellung für 1% neutralisierte Kollagen-Pre-Gel-Lösung
    1. Zentrifuge die saure Kollagenlösung bei 1224 x g für 5 min bei 4 °C.
    2. 30 μL Phenolrotlösung als pH-Indikator zu einer Endkonzentration von 1% (v/v) und 300 μL 10x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) auf eine Endkonzentration von 10% (v/v) in der Kollagen-Pre-Gel-Lösung geben.
    3. Neutralisieren Sie den pH-Wert auf 7 mit 1 N Natriumhydroxid (NaOH) und überprüfen Sie die Farbänderung.
      HINWEIS: Basierend auf der Formel, Mol H+ = Molarität H+ x Volumen H+ = Mol OH-= Molarität OH- x Volumen OH-, addieren Sie 240 μL NaOH.
    4. Fügen Sie destilliertes Wasser hinzu, um ein Gesamtvolumen von 3 ml zu erhalten.
    5. Nach der pH-Einstellung die 1% (w/v) neutralisierte Kollagen-Pre-Gel-Lösung bei 4 °C lagern und innerhalb von 3 Tagen verwenden.
      HINWEIS: Um die Gelierung der neutralisierten Kollagen-Pre-Gel-Lösung vorzuprüfen, machen Sie 50 μL Kollagentröpfchen auf einer kleinen Schüssel mit einer Verdrängerpipette und inkubieren Sie sie in einem 37 °C-Inkubator für 1 h. Beziehen Sie sich auf die folgenden drei Methoden, um die Vernetzung von Kollagentröpfchen zu überprüfen.
    6. Überprüfen Sie, ob sich die Farbe des Kollagens von der transparenten Farbe in undurchsichtiges Weiß verwandelt hat.
    7. Kippen Sie den Behälter und überprüfen Sie, ob das Kollagen am Boden des Behälters haftet.
    8. Gießen Sie 1x PBS auf die Tröpfchen und prüfen Sie, ob das Kollagenkonstrukt in der Lösung nicht gebrochen ist.

4.3D Druck von gasdurchlässiger Barriere

  1. 3D-Druck einer Opfer-Polyform (Ethylen-Vinylacetat) (PEVA)
    1. Generieren Sie die 3D-Geometrie der in Schritt 1 definierten PEVA-Opferform mit einer 3D-CAD-Software (Abbildung 3A).
      HINWEIS: Die 3D-Geometrie und der detaillierte Modellmaßstab einschließlich Bemaßung, Einheiten und Linientypen wurden in Abbildung 2A dargestellt.
    2. Konvertieren Sie die 3D-CAD-Datei in ein STL-Dateiformat, indem Sie auf Datei | Dateityp als STL. Klicken Sie auch auf Option | Ausgabeformular als ASCII zur G-Code-Generierung.
    3. Klicken Sie auf Datei | Öffnen Sie die STL-Datei und wählen Sie die gespeicherte STL-Datei aus, um die generierte STL-Datei zu importieren. Klicken Sie auf Slice-Modell des STL-CAD-Austauschers, um automatisch den G-Code der PEVA-Opferform zu generieren (Abbildung 3B, C).
      HINWEIS: Der Druckpfad wird durch die Verbindung von schnittigen Punkten zwischen der Grundfigur der STL-Datei und der Slicing-Ebene (d. h. Der Ebene) generiert. Grundsätzlich ist die grundlegende Figur eines Fragments in einer STL-Datei ein Dreieck, das die 3D-Koordinaten enthält. Nachdem die schnittigen Punkte zwischen dem Dreieck und der Ebene erhalten wurden, wird ein G-Code für den Druck generiert, indem jeder Punkt ohne überlappenden Pfad auf einer Ebene18verbunden wird. Jeder G-Code-Generierungsalgorithmus auf der Bordsoftware kann verwendet werden, um Druckpfade für die Chipherstellung zu generieren.
    4. Bereiten Sie einen sterilen Klebstoff und einen hydrophilen Histologie-Objektträger vor.
      HINWEIS: Das hydrophile Objektträgerglas ist entscheidend für die dauerhafte Bindung von Polydimethylsiloxan (PDMS) auf dem Glas und die Haftung der Kollagenkonstrukte, die Krebszellen und Stromazellen verkapseln.
    5. Drucken Sie die PEVA-Opferform mit einer 50 G Präzisionsdüse bei einem pneumatischen Druck von 500 kPa bei 110 °C auf den Schlitten.
      HINWEIS: Die Linienbreite wird durch die Vorschubgeschwindigkeit, die Düsenstärke und die Temperatur des Materials beeinflusst. Es wurde die 50 G Düse verwendet und eine Vorschubgeschwindigkeit von 400 angewendet, um 500 μm Linienbreite für die Opferwand zu erzeugen. Das Düsenmanometer, der pneumatische Druck und die Vorschubgeschwindigkeit werden mit praktischen Ergebnissen definiert19. Die Opferwand muss ausreichend dick sein, um die PDMS-Lösung zu halten, was der nächste Fertigungsschritt ist.
  2. Gießen der Polydimethylsiloxan (PDMS)-Barriere
    1. 6 mL PDMS-Basiselastomer und 0,6 mL Härter homogen über 5 min in einem Kunststoffbehälter mischen. Dies kann 6 hypoxische Krebs-auf-Chips herstellen, wenn man den Verlust aufgrund der klebrigen Eigenschaft von PDMS berücksichtigt.
    2. Laden Sie die gemischte PDMS-Lösung in eine 10-ml-Einwegspritze und besinnen Sie den Spritzenkopf mit einer 20 G kunststoffverjüngten Dosierspitze.
    3. Füllen Sie die PEVA-Opferform mit der gemischten PDMS-Lösung in die Spritze. Das gemischte PDMS füllt die PEVA-Opferform mit einer konvexen Oberfläche. Die Höhe der PDMS-Barriere ist höher als die der PEVA-Form.
    4. Härten Sie die PDMS-Barriere in einem Ofen bei 40 °C für über 36 h aus, um das Schmelzen von PEVA zu vermeiden. Erhöhen Sie die Temperatur nicht auf über 88 °C, was die Schmelztemperatur von PEVA ist.
    5. Lösen Sie die PEVA-Opferform mit einer Präzisionspinzette und sterilisieren Sie die gasdurchlässige Barriere bei 120 °C in einem Autoklaven.

5. Herstellung von zellverkapselten Kollagen-Bio-Tinten

  1. Ablösung der präparierten Krebszellen und Stromazellen
    HINWEIS: Unter Berücksichtigung der Zelllebensfähigkeit sollte der gesamte Druckprozess so schnell wie möglich nach dem Ablösen der Zellen abgeschlossen sein.
    1. Waschen Sie Krebs- und Stromazellen mit 10 ml 1x PBS mit einer serologischen Pipette; mit 2 mL 0,25% Trypsin-Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) mit einer Pipette behandeln und 3 min bei 37 °C inkubieren.
    2. Neutralisieren Sie die trypsinisierten Zellen mit 3 ml Zellkulturmedien; sammeln Sie die Suspensionen der Zellen in 15 mL konischen Röhrchen und zentrifugieren Sie bei 516 x g für 5 min bei 20 °C.
    3. Saugen Sie den Überstand langsam an; Resuspendieren Sie die Zellpellets in 5 ml Zellkulturmedien und zählen Sie die Anzahl der Zellen mit einem Hämozytometer.
    4. 5 x 106 Zellen jedes Zelltyps in neue 15 mL konische Röhrchen geben und bei 516 x g für 5 min bei 20 °C zentrifugieren.
    5. Saugen Sie den Überstand ab und legen Sie ihn auf nasses Eis.
  2. Mischen jedes Zelltyps mit der 1% igen neutralisierten Kollagen-Pre-Gel-Lösung
    HINWEIS: Um eine thermische Erstarrung der 1% igen neutralisierten Kollagen-Pre-Gel-Lösung zu vermeiden, sollte dieser Prozess auf nassem Eis durchgeführt werden.
    1. Resuspend jede Art von Zellpellet, das in Schritt 5.1.4 gesammelt wurde, mit jeweils 20 μL Zellkulturmedien.
    2. Fügen Sie 1 ml der 1% igen neutralisierten Kollagen-Pre-Gel-Lösung in jede der resuspendierten Zellsuspensionen hinzu und mischen Sie sie homogen mit einer Verdrängerpipette. Die Endkonzentration jedes Zelltyps wird 5 x 106 Zellen/ml sein.
    3. Die zellverkapselten Kollagen-Biotinten mit einer positiven Einwegpipette in 3-ml-Einwegspritzen überführen und die Spritzen bis zum 3D-Zelldruck bei 4 °C lagern.

6.3D Zelldruck von krebs-stroma-konzentrischen Ringen

  1. 3D-Zelldruck von Kollagen-Biotinten, die Krebszellen und Stromazellen verkapseln
    1. Generieren Sie die 3D-Geometrie der in Schritt 1.2 definierten konzentrischen Krebs-Stroma-Ringe mit einer 3D-CAD-Software.
      HINWEIS: Die Abmessungen der konzentrischen Krebsstromaringe werden über simulierte Parameter definiert. Die endgültigen Dimensionen der Dimensionsparameter sind in Abbildung 3A dargestellt.
    2. Konvertieren Sie die 3D-CAD-Datei in ein STL-Dateiformat und generieren Sie einen G-Code der konzentrischen Krebs-Stroma-Ringe mit einem STL-CAD-Austauscher.
      HINWEIS: Informationen zum G-Code-Generierungsalgorithmus finden Sie im Hinweis in Schritt 4.1.2.
    3. Laden Sie die zellverkapselten Kollagen-Biotinten, die in 3-ml-Einwegspritzen enthalten sind, auf den Kopf des 3D-Druckers und stellen Sie die Temperatur von Kopf und Platte auf 15 °C ein.
      HINWEIS: Erreicht die Temperatur von Kopf und Platte des Druckers über 37 °C, wird die Biotinte vernetzt und druckt nicht mehr.
    4. Laden Sie den generierten Druckpfad in die Steuerungssoftware des 3D-Druckers.
    5. Drucken Sie mit einem Klick auf die Schaltfläche Start die Kollagen-Biotinten, die Krebszellen und Stromazellen auf der gasdurchlässigen Barriere nach dem geladenen G-Code verkapseln, mit einer 18 G-Kunststoffnadel bei pneumatischem Druck von ca. 20 kPa bei 15 °C.
    6. Legen Sie am Ende jedes Druckvorgangs manuell eine sterilisierte 22 mm x 50 mm Glasabdeckung auf die gasdurchlässige Barriere, um den hypoxischen Gradienten zu erzeugen.
      HINWEIS: Vergleichen Sie zwei Gruppen in Abhängigkeit vom Vorhandensein einer Glasabdeckung (GR+) und dem Fehlen (GR-) dieser, um die Erzeugung des hypoxischen Gradienten zu überprüfen.
    7. Nachdem drei hypoxische Krebs-auf-Chips erzeugt wurden, werden die Chips für 1 h in einen Inkubator bei 37 °C überführen, um die Kollagen-Biotinen zu vernetzen.
  2. Abschluss des Herstellungsprozesses und Wartung des hypoxischen Krebs-on-a-Chips
    1. Nach Abschluss aller 3D-Zelldruckverfahren des hypoxischen Krebs-auf-einem-Chips reiben Sie die Deckbrille vorsichtig auf die gasdurchlässigen Barrieren mit dem Zell-Scrapper zur dichten Verklebung (Abbildung 4A,B).
      HINWEIS: Das Deckglas und die gasdurchlässige Barriere werden durch hydrophobe Bindung ohne chemische Klebstoffe zusammengefügt, wobei das gebundene Teil einfach zwischen dem Deckglas und der PDMS-Barriere abgekratzt wird.
    2. 1,5 ml Endotheliales Wachstumsmedium in jeden Chip einführen. Um eine Ablösung des Krebskonstrukts zu vermeiden, führen Sie Zellkulturmedium von einer Seite des Chips ein. Neigen Sie den Chip, damit das Zellkulturmedium mit einer Pipette fließen kann.
    3. Aktualisieren Sie die Zellkulturmedien eine Woche lang jeden Tag. Verwenden Sie eine Pipette, um das Zellkulturmedium abzusaugen; Verwenden Sie keine Druckpumpe.

7. Bewertung der Lebensfähigkeit der Post-Printing-Zelle

  1. Probenvorbereitung und Behandlung mit Calcein AM und EthD-1 Lösung
    1. 1x PBS im Wasserbad bei 37 °C erwärmen.
    2. Die Assay-Lösung wird durch Zugabe von 0,75 μL Calceinacetoxymethyl (Calcein AM) und 3 μL Ethidiumhomdimer (EthD-1) zu 1,5 ml vorgewärmtem PBS zubereitet.
    3. Saugen Sie vorsichtig alle Medien mit einer Pipette vom Chip ab.
    4. Waschen Sie das Krebskonstrukt mit vorgewarmtem PBS. Füllen Sie 1,5 mL PBS mit einer Pipette in den Chip und lassen Sie ihn 10 min bei Raumtemperatur stehen. Um eine Verformung des Krebskonstrukts zu vermeiden, führen Sie 1x PBS von einer Seite der Chips ein und neigen Sie die Chips, damit 1x PBS fließen kann.
    5. Saugen Sie das PBS vom Chip ab; Behandeln Sie die 1,5 ml Assay-Lösung und inkubieren Sie den Chip bei 37 °C für 20 min mit einer Folie zum Schutz vor Licht. Verwenden Sie eine Pipette, um 1x PBS anzusaugen; Verwenden Sie keine Saugpumpe.
  2. Abbildung der Zelllebensfähigkeit mit einem Fluoreszenzmikroskop
    1. Betrachten und erfassen Sie die markierten Zellen mit einem Fluoreszenzmikroskop (Abbildung 4C).
      HINWEIS: Calcein AM markiert lebende Zellen mit grüner Fluoreszenz (Wellenlänge ~ 488 nm). EthD-1 stellt das Signal toter Zellen mit roter Fluoreszenz (Wellenlänge ~594 nm) dar.
    2. Zählen Sie die Anzahl der lebenden und toten Zellen mit Bildgebungssoftware, einem Open-Source-Bildverarbeitungsprogramm, und berechnen Sie die Lebensfähigkeit mit den Zahlen.

8. Immunfluoreszenz zur Validierung der Bildung der zentralen Hypoxie und ihrer Wirkung auf die Malignität von Krebs

  1. Fixierung, Permeabilisierung und Blockierung des Krebskonstrukts
    1. Bereiten Sie 1x PBS, 4% Paraformaldehyd (PFA), 0,1% (v/v) Triton X-100 und 2% (w/v) Rinderserumalbumin (BSA) bei Raumtemperatur vor.
    2. Saugen Sie vorsichtig alle Medien mit einer Pipette vom Chip ab und spülen Sie den Chip dreimal mit 1x PBS aus. Um eine Verformung des Krebskonstrukts zu vermeiden, führen Sie 1x PBS von einer Seite der Chips ein und neigen Sie die Chips, damit 1x PBS fließen kann. Lassen Sie den Chip zwischen jedem Waschschritt mit 1x PBS für 5 min stehen, um Restlösungen zu entfernen.
      HINWEIS: 1x PBS wurde mit einer Pipette und nicht mit einer Druckpumpe aspiriert.
    3. Fügen Sie 500 μL von 4% PFA mit einer Pipette zum Krebskonstrukt auf dem Chip hinzu; Lassen Sie es für 15 minuten und waschen Sie dreimal mit 1x PBS, um die Zellen im Krebskonstrukt zu fixieren.
    4. Behandeln Sie das Krebskonstrukt mit 500 μL 0,1% Triton X-100 mit einer Pipette bei Raumtemperatur für 5 min und waschen Sie dreimal mit 1x PBS, um die Zellmembran zu solubilisieren und zu permeabilisieren.
    5. Behandeln Sie das Krebskonstrukt mit 500 μL 2% BSA mit einer Pipette bei Raumtemperatur für 1 h, um reaktive Epitope zu blockieren.
      HINWEIS: Decken Sie den Chip mit Paraffinfilm ab, um eine Verdunstung zu verhindern.
    6. Nach 1 h den Chip dreimal mit 1x PBS waschen.
  2. Behandlung mit primärem Antikörper, sekundärem Antikörper und DAPI und Abbildung der Struktur mit einem konfokalen Mikroskop.
    1. Bereiten Sie Isotyp-Kontrollantikörper und den Cocktail der primären Antikörper vor, indem Sie die Antikörper in 1x PBS auf jede gewünschte Arbeitskonzentration verdünnen.
      HINWEIS: Die spezifischen Details der Antikörper sind in der Materialtabelleaufgeführt. Es sollten die gleichen Arbeitskonzentrationen von Isotyp-Kontrollantikörpern wie bei den primären Antikörpern verwendet werden.
    2. Saugen Sie vorsichtig alle 1x PBS mit einer Pipette vom Chip ab und behandeln Sie den Chip über Nacht mit 200 μL primärer Antikörperlösung bei 4 °C. Decken Sie die Chips mit Paraffinfilm ab, um eine Verdunstung zu verhindern.
    3. Saugen Sie die primäre Antikörperlösung an und waschen Sie den Chip dreimal mit 1x PBS.
    4. Sekundäre Antikörper und DAPI in 1x PBS auf die gewünschte Arbeitskonzentration verdünnen.
      HINWEIS: Ein grüner fluoreszenzkonjugierter sekundärer Antikörper wird in diesem Fall im Verhältnis 1:200 verwendet. DAPI wurde im Verhältnis 1:1000 verwendet.
    5. Saugen Sie vorsichtig alle 1x PBS mit einer Pipette vom Chip ab und behandeln Sie den Chip mit 200 μL sekundärer Antikörper-DAPI-Lösung bei 4 °C für 3 h. Bedecken Sie den Chip mit Paraffinfilm, um eine Verdunstung zu verhindern, und wickeln Sie ihn dann mit Aluminiumfolie ein, um Einblendung zu verhindern.
    6. Saugen Sie die sekundäre Antikörper-DAPI-Lösung ab und waschen Sie den Chip dreimal mit 1x PBS.
    7. Nachdem Sie den Färbeschritt beendet haben, übertragen Sie das Krebskonstrukt in eine konfokale Schale, indem Sie vorsichtig mit einer Zette greifen.
    8. Visualisieren und erfassen Sie die markierten Zellen mit einem konfokalen Mikroskop (Abbildung 5).
      HINWEIS: Die Wellenlänge des konfokalen Mikroskops wurde je nach Art der fluoreszierenden Marker angepasst. Die spezifischen Details der Antikörper sind in der Materialtabelle aufgeführt. Um die Zellposition effizient zu erfassen, wäre es besser, zunächst die DAPI-gefärbten Kerne des Konstrukts zu beobachten. Die Detektionsanregungs-/Emissionswellenlängen der fluoreszierenden Signale waren 358/461 nm (DAPI, Blau), 494/517 nm (Grün) und 590/617 nm (Rot). Die Vergrößerungen waren 4x, 10x und 20x, angepasst von der niedrigsten zur höchsten.

9. Statistische Auswertung

  1. Zellzählung mit Bildverarbeitungsprogramm
    1. Führen Sie ein Bildverarbeitungsprogramm aus, um die Anzahl der lebenden und toten Zellen zu zählen.
    2. Öffnen Sie die fluoreszierenden Bilddateien. Klicken Sie auf Datei | Öffnen und importieren Sie die TIFF-Bilder.
    3. Konvertieren Sie die Bilder in 16-Bit-Graustufenbilder. Klicken Sie auf Image | Typ | 16-Bit-Graustufen.
    4. Passen Sie den Schwellenwert an, indem Sie auf Image | | anpassen Schwellenwert und wählen Sie dann die Farbe der Zellen aus, die schwarz sein sollen.
    5. Schneiden Sie zusammengeführte Zellen auseinander, indem Sie auf Prozess | Binäre | Wasserscheide für präzises Zellzählen.
    6. Zählen Sie die Anzahl der Zellen, indem Sie dreimal auf Analysieren und dann auf Partikel analysieren klicken. Berechnen Sie den Durchschnitt und präsentieren Sie die Daten als Mittelwert ± Standardfehlers.
      HINWEIS: Immunfluoreszenzmarker wurden durch Vergleich der Fluoreszenzintensität analysiert.

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Representative Results

Der hypoxische Krebs-auf-einem-Chip wurde mit computergestützter 3D-Zelldrucktechnologie entwickelt, um Hypoxie und krebsbedingte Pathologie zu rekapitulieren (Abbildung 1). Sauerstofftransport und -verbrauch wurden mit dem 3D-Geometriemodell simuliert. Der Chip wurde in Form von konzentrischen Ringen entwickelt, um die radiale Sauerstoffdiffusion und -erschöpfung in Krebsgeweben nachzuahmen (Abbildung 2A). Nach der Definition des Kontrollvolumens eines Raumes, in dem Sauerstoff diffundierte und von Zellen verbraucht wurde, wurde durch rechnerische Finite-Elemente-Analyse eine geeignete Zelldichte für die zentrale Hypoxie-Erzeugung bestimmt (Abbildung 2B,C).

Basierend auf früheren Ergebnissen wurde ein 3D-Druckpfadcode für den hypoxischen Krebs-on-a-Chip generiert (Abbildung 3). Die CAD-Dateien der PEVA-Opferform und Krebskonstrukte wurden in das STL-Dateiformat konvertiert (Abbildung 3A, B). Der Druckpfad wurde codiert und mit einer hauseigenen Software an das Multidrucksystem übertragen (Bild 3C).

Ein hypoxischer Krebs-auf-einem-Chip wurde mit der 3D-Zelldrucktechnologie hergestellt. Um die strukturelle, biochemische und biophysikalische Heterogenität von festem Krebs zu rekapitulieren, wurde ein schrittweiser Herstellungsprozess für das Krebskonstrukt und die gasdurchlässige Barriere etabliert, der die einzige Möglichkeit ist, wie Sauerstoff in das System eindringen kann (Abbildung 4A). Eine kompartimentierte Krebs-Stroma-Konzentrische Ringstruktur wurde geschaffen, um die anatomischen Merkmale des soliden Krebses zu reproduzieren (Abbildung 4B). Die heterogene Geometrie des Krebsgewebes wurde in vitro mit der 3D-Zelldrucktechnologie realisiert. Die Zelllebensfähigkeit wurde nach dem Drucken bewertet, um die chemische und mechanische Beanspruchung während des Herstellungsprozesses zu bestätigen. Das Verhältnis der grün gefärbten lebenden Zellen war signifikant höher als das der rot gefärbten toten Zellen. Quantitativ betrug die Lebensfähigkeit der Post-Printing-Zelle mehr als 96,92% ± 2,46%(Abbildung 4C). Dieses Ergebnis bestätigt, dass die Herstellungsbedingungen für Krebszellen und Stromazellen geeignet waren.

Zwei Gruppen wurden in Abhängigkeit vom Vorhandensein (GR+) und Fehlen (GR-) des Sauerstoffgradienten verglichen, um die Auswirkungen des hypoxischen Gradienten auf das Fortschreiten des Krebses zu überprüfen (Abbildung 5A). Unter beiden Bedingungen existierten in den peripheren Regionen ausgereifte CD31+ Endothelzellen, was darauf hindeutete, dass räumlich gemustertes lebendes Konstrukt mit 3D-Bioprinting-Technologie hergestellt wurde. Im Vergleich zurGR-Bedingung zeigte die GR+-Bedingung einen hypoxischen Gradienten, was auf die allmähliche Expression von HIF1α hinweist (Abbildung 5B), wobei SHMT2+ pseudopalisadierende Zellen und SOX2+ pluripotente Zellen beobachtet wurden, die das aggressive pathophysiologische Merkmal von festem Krebs darstellten (Abbildung 5C). Nämlich wurden die pathologischen Merkmale des Glioblastoms unter dem technisch hergestellten hypoxischen Zustand15rekapituliert.

Figure 1
Abbildung 1: Schematische Darstellung der Entwicklung von hypoxischem Krebs auf einem Chip. Diese Zahl wurde von Nature biomedical engineering15 (Copyright, 2019) modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Computergestützte Simulation der Bildung von Sauerstoffgradienten bei hypoxischem Krebs auf einem Chip. (A) Eine 3D-Geometrie von hypoxischem Krebs auf einem Chip. (B) Ein Schema, das den Bereich für die Sauerstoffverteilungsanalyse angibt. Diese Zahl wurde von Nature biomedical engineering15 (Copyright, 2019) modifiziert. (C) Ein Jet-Color-Map-Bild des Sauerstoffverteilungsprofils. Diese Zahl wurde von Nature biomedical engineering15 (Copyright, 2019) modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Generierung eines 3D-Druckpfadcodes für hypoxischen Krebs auf einem Chip. (A) Eine 3D-Geometrie der PEVA-Opferform. (B) Ein Bild der PEVA-Opferform im STL-Dateiformat. (C) Ein G-Code von PEVA-Opferform. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: 3D-Zelldruck von hypoxischem Krebs auf einem Chip. (A) Ein Schema des Herstellungsprozesses von hypoxischem Krebs auf einem Chip. (B) Eine gedruckte hypoxische Krebs-auf-einem-Chip und kompartimentierte Struktur von Krebs-Stroma-konzentrischen Ringen; Maßstabsbalken stellen 200 μm dar. (C) Ein Fluoreszenzbild des 3D-zellgedruckten Krebskonstrukts zur Bewertung der Lebensfähigkeit; Maßstabsbalken stellen 200 μm dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 5
Abbildung 5: Erzeugung eines hypoxischen Gradienten und Bewertung pathologischer Merkmale von künstlichem festem Krebs. (A) Experimentelle Gruppen unter zwei verschiedenen Sauerstoffdurchlässigkeitsbedingungen. (B) Repräsentative immunschätzende Bilder der Erzeugung von Sauerstoffgradienten unter Verwendung von HIF1α; Skalenbalken stellen 200 μm dar. (C) Repräsentative immunhaltige Bilder pathologischer Merkmale von hypoxischem Krebs unter Verwendung von SHMT2, SOX2 und CD31; Maßstabsbalken stellen 200 μm dar. Diese Zahl wurde von Nature biomedical engineering15 (Copyright, 2019) modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Discussion

In dieser Studie beschreiben wir den Herstellungsprozess eines hypoxischen Krebs-auf-einem-Chips auf Basis der 3D-Zelldrucktechnologie. Die Bildung des hypoxischen Gradienten im entworfenen Chip wurde durch Computersimulationen vorhergesagt. Die Umgebung, die einen heterogenen hypoxischen Gradienten induzieren kann, wurde über eine einfache Strategie reproduziert, die die 3D-gedruckte gasdurchlässige Barriere und die Glasabdeckung kombiniert. Die hypoxiebedingten pathologischen Merkmale des Glioblastoms, einschließlich Pseudopalisade und einer kleinen Population von Krebsstammzellen, wurden unter hypoxischen Gradientenbedingungen des Chips rekapituliert.

Um die Produktivität und Wiederholbarkeit zu verbessern, wurden im Vergleich zum zuvor veröffentlichten Modell15zwei wichtige Fertigungsschritte sequenziell modifiziert. Zunächst wurde indirekt eine PDMS-Barriere hergestellt, um die schlechte Bedruckbarkeit von PDMS zu überwinden, das ein Härter enthält, das in Echtzeit und nicht durch ein einstufiges Direktdruckverfahren ausgehärtet wird. Daher wurde biokompatibles PEVA mit höherer Bedruckbarkeit angepasst, um die Opferform herzustellen, und PDMS wurde hinzugefügt, um die gasdurchlässige Barriere zu schaffen. Zweitens wurde die Art des Objektträgerglases in ein hydrophil beschichtetes Objektträgerglas umgewandelt, das günstig ist, um die Bioinkablagerung und Formtreue zu unterstützen. Schließlich wurde der Aufbau der Mediumsreservoirs an beiden Enden des Chips ein effizienter Medienaustausch ermöglicht.

Kritische Faktoren in jedem Herstellungsschritt von hypoxischem Krebs-on-a-Chip über 3D-Bioprinting sollten vorsichtig kontrolliert werden. Beim Gießen sollte die Höhe des PDMS größer sein als die der PEVA-Opferform, da sich sonst der mit dem Deckglas festgezogene Chip löst, was sich negativ auf die hypoxische Kernerzeugung auswirkt. Beim Druck von Kollagen, einem thermisch empfindlichen Hydrogel, sollte die Temperatur des Druckkopfes bei 15 °C gehalten werden, um ein Verstopfen der Düse aufgrund eines Sol-Gel-Übergangsphänomens zu verhindern. Wird das Hydrogel zeitlich vernetzt, kann die verstopfte Düse mit einem hohen pneumatischen Druck und einer scharfen Nadel leicht gereinigt werden. Wenn die Blockierung jedoch schwerwiegend ist, sollte das Hydrogel erneut vorbereitet werden. Darüber hinaus sollte der Zelldruckprozess unter Berücksichtigung der Zelllebensfähigkeit innerhalb von 1 h abgeschlossen sein.

Die 3D-Bioprinting-Technologie ermöglicht die Entwicklung eines hypoxischen Krebs-on-a-Chips, mit dem der zugrunde liegende Mechanismus von Krebs untersucht und die therapeutische Resistenz verschiedener solider Tumoren vorhergesagt werden kann15. Insbesondere der Einsatz der extrusionsbasierten 3D-Bioprinting-Technologie ermöglichte eine schnelle und repetitive Produktion mit einem hohen Maß an Freiheit. Darüber hinaus ermöglichen die Reproduzierbarkeit und der schnelle Zeitrahmen für die Krebsmodellierung dem pharmazeutischen Bereich, einen Datensatz von Arzneimittelkombinationskandidaten für die Krebsbehandlung zu erstellen. Aufgrund der begrenzten Auflösung der Technologie wird der gedruckte Hypoxic-Cancer-on-a-Chip jedoch im Bereich von mehreren hundert Mikrometern hergestellt, was eine große Menge an Materialien erfordert. Darüber hinaus ist es schwierig, eine Hochdurchsatz-Wirkstoff-Screening-Plattform unter den Platzbeschränkungen zu entwickeln20. Daher sollte die Technologie verbessert werden, um Modelle zu entwickeln, die In der Lage sind, Multiparameterstudien mit begrenzten Ressourcen und räumlicher Ausdehnung zu unterstützen.

Der entwickelte Hypoxic-Cancer-on-a-Chip kann auf die gewebespezifische Krebsmodellierung angewendet werden, indem gewebespezifische Materialien wie ein Hydrogel aus einer dezellularisierten extrazellulären Matrix (ECM) verwendet werden. Da die biochemischen und physiologischen Variationen des ECM die Zellfunktionen beeinflussen, kann eine überlegene Emulation zahlreicher Krebsarten mit einer organspezifischen Krebsmikroumgebung realisiert werden21. Darüber hinaus können durch die Kombination mit anderen künstlichen Gewebekonstrukten, einschließlich künstlicher Blutgefäße, die kritische Auswirkungen auf die Krebsentwicklung haben, dynamische pathophysiologische Veränderungen der angiogenen, immunogenen und metastasierten Eigenschaften untersucht werden. Darüber hinaus kann mit dem entwickelten Chip eine personalisierte Krebstherapie durch den Einsatz von patientenabgeleiteten Zellen15durchgeführt werden. Die Prüfung der Arzneimittelsensitivität vor der klinischen Behandlung wäre ein wichtiger Schritt, um die Wirksamkeit der Therapie während des Prozesses der rechtzeitigen Suche nach einem geeigneten therapeutischen Regime für einen einzelnen Patienten zu verbessern. Es wird erwartet, dass ein patientenspezifisches Krebsmodell mit einer vom Patienten abgeleiteten Quelle das Patientenprofil verbessert, um Unterschiede in der Pathophysiologie und Chemosensitivität jedes Patienten vorherzusagen. In der vorangegangenen Studie wurden patientenspezifische therapeutische Wirkungen gegen verschiedene Wirkstoffkombinationen innerhalb eines angemessenen Zeitrahmens (1-2 Wochen) mit dem 3D-gedruckten hypoxischen Krebs-on-a-Chip vorhergesagt, was im Vergleich zu anderen Methoden zu relativ schnellen Schlussfolgerungen führt, was auf das Potenzial für das patientenspezifische präklinische Modellhindeutet 15.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass der 3D-Zelldruck von Krebs-auf-einem-Chip für die Rekapitulation einer heterogenen Krebsmikroumgebung günstig ist. Die nachgeahmte Mikroumgebung treibt das pathologische Fortschreiten von Krebs an, einschließlich der Bildung eines nekrotischen Kerns, der aus Hypoxie resultiert. Dieses Protokoll kann auf Krebsmedikamentetests und patientenspezifische Krebsmodelle angewendet werden. In dieser Hinsicht erwarten wir, dass dieser hochgradig kontrollierbare Ansatz für den Aufbau verschiedener Krebsmodelle von Vorteil sein kann.

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Disclosures

Die Autoren haben keine Angaben.

Acknowledgments

Diese Forschung wurde von der National Research Foundation of Korea (NRF) unterstützt, die vom Bildungsministerium (Nr. 2020R1A6A1A03047902 und NRF-2018H1A2A1062091) und der koreanischen Regierung (MSIT) (Nr. NRF-2019R1C1C1009606 und NRF-2019R1A3A3005437).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cells
Human umbilical vein endothelial cells Promocell C-12200
U-87 MG cells ATCC ATCC HTB-14
Disposable
0.2 μm syringe filter Sartorius 16534-K
10 mL disposable syringe Jung Rim 10ml 21G32
10 mL glass vial Hubena A0039
10 mL Serological pipette tip SPL lifescience 91010
15 mL conical tube SPL lifescience 50015
18G plastic needle Musashi engineering PN-18G-B
20G plastic tapered dispense tip Musashi engineering TPND-20G-U
22x50 glass cover MARIENFIELD 0101142
25 mL Serological pipette tip SPL lifescience 90125
3 mL disposable syringes HENKE-JET 4020-X00V0
40 µm cell strainer Falcon 352360
5 mL Serological pipette tip SPL lifescience 91005
50 mL conical tube SPL lifescience 50050
50 mL Serological pipette tip SPL lifescience 90150
50N precision nozzle Musashi engineering HN-0.5ND
Aluminum foil SINKWANG
Capillary tips Gilson CP1000
Cell-scrapper SPL lifescience 90030
Confocal dish SPL lifescience 200350
Parafilm Bemis PM996
Pre-coated histology slide MATSUNAMI MAS-11
Reservoir SPL lifescience 23050
T-75 cell culture flask SPL lifescience 70075
Equipment
3DX printer T&R Biofab
Autoclave JEIOTECH AC-12
Centrifuger Cyrozen 1580MGR
Confocal laser microscopy Olympus Life Science FV 1000
Fluorescence microscope FISHER SCEINTIFIC O221S366
Forcep Korea Ace Scientific HC.203-30
Hand tally counter KTRIO
Hemocytometer MARIENFIELD 0650030
Incubator Panasonic MCO-170AIC
Laminar flow cabinet DAECHUNG SCIENCE CB-BMMS C-001
Metal syringe IWASHITA engineering SUS BARREL 10CC
Operating Scissors Hirose HC.13-122
Oven JEIOTECH OF-12, H070023
Positive displacement pipette GILSON NJ05652
Refrigerator SAMSUNG CRFD-1141
Voltex Mixer DAIHAN scientific VM-10
Water bath DAIHAN SCIENTIFIC WB-11
Water purifier WASSER LAB DI-GR
Materials
0.25 % Trypsin-EDTA Gibco 25200-072
10x PBS Intron IBS-BP007a
4% Paraformaldehyde Biosesang
70% Ethanol Daejung 4018-4410
Anti-CD31 antibody Abcam ab28364
Anti-HIF-1 alpha antibody Abcam ab16066
Anti-SHMT2/SHMT antibody Abcam ab88664
Anti-SOX2 antibody Abcam ab75485
Bovine Serum Albumin Thermo scientific J10857-22
Collagen from porcine skin Dalim tissen PC-001-1g
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) Thermofisher D1306
Endothelial Cell Growth Medium-2 Promocell C22011
Fetal bovine serum Gibco 12483-020
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Theromofisher A-11001
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 Theromofisher A-11012
High-glucose Dulbecco’s Modified Eagle Medium(DMEM) Hyclone SH30243-0
Hydrochloric acid Sigma-Aldrich 311413-100ML
Live/dead assay kit Invitrogen L3224
Mouse IgG1, kappa monoclonal [15-6E10A7] - Isotype Control Abcam ab170190
Penicillin/streptomycin Gibco 15140-122
Phenol red solution Sigma-Aldrich P0290-100ML
Poly(ethylene-vinyl acetate)  Poly science 06108-500
Polydimethylsiloxane Dowhitech sylgard 184
Rabbit IgG, polyclonal - Isotype Control Abcam ab37415
Sodium hydroxide solution Samchun S0610
Triton X-100 Biosesang TRI020-500-50
Trypan Blue Sigma-Aldrich T8154
Software
COMSOL Multiphysics 3.5a COMSOL AB
IMS beamer in-house software
SolidWorks Package Dassault Systems SolidWorks Corporation

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References

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Bioengineering 3D-Zelldruck 3D-mikrophysiologisches System Organ-on-a-Chip solider Krebs Mikroumgebung Hypoxie Sauerstoffgradient Pathologie
3D-zellgedruckter hypoxischer Krebs-on-a-Chip zur Rekapitulation des pathologischen Verlaufs von solidem Krebs
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Park, W., Bae, M., Hwang, M., Jang,… More

Park, W., Bae, M., Hwang, M., Jang, J., Cho, D. W., Yi, H. G. 3D Cell-Printed Hypoxic Cancer-on-a-Chip for Recapitulating Pathologic Progression of Solid Cancer. J. Vis. Exp. (167), e61945, doi:10.3791/61945 (2021).

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