固体癌の病理学的進行を再現するための3D細胞印刷低酸素癌オンチップ
Summary
低酸素症は腫瘍微小環境の特徴であり、癌の進行において重要な役割を果たしている。この記事では、低酸素関連の癌関連病理を再現するための3D細胞印刷技術に基づく低酸素癌オンチップの製造プロセスについて説明する。
Abstract
がん微小環境は、疾患の進行に大きな影響を与えます。特に、低酸素症は癌の生存、浸潤、および化学抵抗の主要な原動力である。低酸素関連癌病理を研究するためにいくつかのin vitroモデルが開発されているが、生体内で観察された癌微小環境の複雑な相互作用は、正確な空間制御の欠如のためにまだ再現されていない。その代わりに、がん生態学のより良いエミュレーションと正確な抗癌治療評価のための微小生理学的システムを作成するための3Dバイオファブリケーションアプローチが提案されている。ここでは、低酸素癌オンチップを作製する3D細胞印刷アプローチを提案する。チップ中の低酸素誘導成分は、酸素分布のコンピュータシミュレーションに基づいて決定した。癌-ストロマ同心円環は、神経膠芽腫細胞および内皮細胞を含むバイオインクを用いて、固体癌の一種を再現するために印刷された。得られたチップは、代表的な病態生理学的マーカーの形成を伴う癌における中央低酸素および悪化した悪性腫瘍を実現した。全体として、固形がん模倣微小生理学的システムを作るための提案されたアプローチは、がん研究のためのin vivoモデルとin vitroモデルの間のギャップを埋めることが期待される。
Introduction
がんの微小環境は、がんの進行を促進する重要な要因です。生化学的、生物物理学的、細胞の手掛かりを含む複数の成分が、癌の病理学的特徴を決定する。これらの中でも、低酸素症は、がんの生存、増殖、および浸潤1と強く関連している。がん細胞の増殖と分裂が無限に生じるため、栄養素と酸素が継続的に枯渇し、低酸素勾配が生成されます。低酸素条件下では、細胞は低酸素転写因子(HIF)関連分子カスケードを活性化します。このプロセスは壊死性コアを誘導し、代謝変化を引き起こし、血管過形成および転移を2,3に開始する。その後、がん細胞の低酸素症が隣接する正常組織の破壊を引き起こす。さらに、低酸素症は、多因子的な様式における固形腫瘍の治療抵抗性と強く関連している。低酸素症は、放射線感受性が活性酸素種1,4のために制限される放射線療法を著しく妨げる可能性がある。また、癌微小環境のpHレベルを低下させると、薬物蓄積が減少する1.したがって、インビトロでの低酸素症に関連する病理学的特徴を再現することは、科学的および前臨床所見のための有望な戦略である。
がんの特定の微小環境をモデル化することは、がんの発症を理解し、適切な治療法を探求するために不可欠です。動物モデルは、その強い生理学的関連性のために広く使用されてきたが、種の違いや倫理的問題に関連する問題は5.さらに、従来の2Dおよび3Dモデルは、がん細胞の操作とリアルタイムイメージングを可能にして詳細な分析を行うことができますが、その構造と細胞の複雑さは完全に再現できません。例えば、スフェロイド中の癌細胞凝集がコアに自然に低酸素症を発生させることができるので、癌スフェロイドモデルは広く使用されている。さらに、多数の均一なサイズのセルラースフェロイドは、プラスチックまたはシリコーンベースのマルチウェルシステム6,7を使用して製造されている。しかし、従来のプラットフォームで癌組織の正確な不均一構造を捕捉することに関しては柔軟性が低く、がん研究を改善するための高度なバイオ模倣プラットフォームを構築するための高度なバイオファブリケーション技術の確立が必要とされている8。
3D微小生理学的システム(MPS)は、癌細胞の複雑な幾何学的および病理学的進行を再現するための有用なツールである9.癌細胞は、成長因子およびケモカインの生化学的勾配を感知し、機械的不均一性をシステム上で再現するので、がんの開発の重要な特徴をインビトロで調べることができる。例えば、癌の生存率、転移性悪性度、および様々な酸素濃度に応じて薬剤耐性がMPS10、11を用いて検討されている。最近の進歩にもかかわらず、in vitroモデルの低酸素状態を発生させることは、物理的なガスポンプとの接続を含む複雑な製造手順に依存しています。そのため、がん特有の微小環境を構築するための簡便で柔軟な方法が必要です。
3D細胞印刷技術は、生体材料の空間的配置を正確に制御して、ネイティブの生物学的アーキテクチャ12を再現するため、かなりの注目を集めています。特に、がん微小環境の空間的特徴を構築するための高い制御性と実現可能性により、3D低酸素モデルの既存の限界を克服しています。3Dプリンティングは、レイヤごとのプロセスを通じてコンピュータ支援製造を容易にし、それによって、実際の組織アーキテクチャを模倣する複雑な形状の迅速で正確で再現可能な構造を提供します。3D MPSに対する既存の製造戦略の利点に加えて、癌進行の病態生理学的特徴は、生化学的、細胞、および生物物理学的成分13、14をパターニングすることによって再現することができる。
ここで、固体癌の不均質性を再現するための低酸素癌オンチップの3D細胞印刷戦略を提示する(図1)15。製造パラメータは、システム中枢低酸素形成の計算シミュレーションを介して決定した。がん-ストロマ同心円環は、神経膠芽腫細胞および内皮細胞を含むコラーゲンバイオインクスを用いて、固体癌の一種である神経膠芽腫の病態生理をエミュレートするために印刷された。放射状酸素勾配の形成は癌悪性腫瘍を悪化させた、強化された攻撃性を示す。さらに、患者固有の前臨床モデルへのチップの適用に関する将来の展望を示す。固形がん・模倣微小生理学的システムを作るための提案されたアプローチは、生体内およびインビトロの癌モデルとの間のギャップを埋めることが期待される。
Protocol
Representative Results
Discussion
本研究では、3D細胞印刷技術に基づく低酸素癌オンチップの製造プロセスについて説明する。設計されたチップにおける低酸素勾配の形成は、コンピュータシミュレーションを通じて予測された。不均質な低酸素勾配を誘発できる環境を、3Dプリントされたガス透過性バリアとガラスカバーを組み合わせた簡単な戦略を通じて再現した。偽パリセードおよび癌幹細胞の少ない集団を含む神経膠…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、文部省(2020R1A6A1A03047902およびNRF-2018H1A1A1062091)と韓国政府(MSIT)が出資する韓国国立研究財団(NRF)によって支援されました。NRF-2019R1C1C1009606およびNRF-2019R1A3A3005437)。
Materials
| Cells | |||
| Human umbilical vein endothelial cells | Promocell | C-12200 | |
| U-87 MG cells | ATCC | ATCC HTB-14 | |
| Disposable | |||
| 0.2 μm syringe filter | Sartorius | 16534-K | |
| 10 mL disposable syringe | Jung Rim | 10ml 21G32 | |
| 10 mL glass vial | Hubena | A0039 | |
| 10 mL Serological pipette tip | SPL lifescience | 91010 | |
| 15 mL conical tube | SPL lifescience | 50015 | |
| 18G plastic needle | Musashi engineering | PN-18G-B | |
| 20G plastic tapered dispense tip | Musashi engineering | TPND-20G-U | |
| 22×50 glass cover | MARIENFIELD | 0101142 | |
| 25 mL Serological pipette tip | SPL lifescience | 90125 | |
| 3 mL disposable syringes | HENKE-JET | 4020-X00V0 | |
| 40 µm cell strainer | Falcon | 352360 | |
| 5 mL Serological pipette tip | SPL lifescience | 91005 | |
| 50 mL conical tube | SPL lifescience | 50050 | |
| 50 mL Serological pipette tip | SPL lifescience | 90150 | |
| 50N precision nozzle | Musashi engineering | HN-0.5ND | |
| Aluminum foil | SINKWANG | ||
| Capillary tips | Gilson | CP1000 | |
| Cell-scrapper | SPL lifescience | 90030 | |
| Confocal dish | SPL lifescience | 200350 | |
| Parafilm | Bemis | PM996 | |
| Pre-coated histology slide | MATSUNAMI | MAS-11 | |
| Reservoir | SPL lifescience | 23050 | |
| T-75 cell culture flask | SPL lifescience | 70075 | |
| Equipment | |||
| 3DX printer | T&R Biofab | ||
| Autoclave | JEIOTECH | AC-12 | |
| Centrifuger | Cyrozen | 1580MGR | |
| Confocal laser microscopy | Olympus Life Science | FV 1000 | |
| Fluorescence microscope | FISHER SCEINTIFIC | O221S366 | |
| Forcep | Korea Ace Scientific | HC.203-30 | |
| Hand tally counter | KTRIO | ||
| Hemocytometer | MARIENFIELD | 0650030 | |
| Incubator | Panasonic | MCO-170AIC | |
| Laminar flow cabinet | DAECHUNG SCIENCE | CB-BMMS C-001 | |
| Metal syringe | IWASHITA engineering | SUS BARREL 10CC | |
| Operating Scissors | Hirose | HC.13-122 | |
| Oven | JEIOTECH | OF-12, H070023 | |
| Positive displacement pipette | GILSON | NJ05652 | |
| Refrigerator | SAMSUNG | CRFD-1141 | |
| Voltex Mixer | DAIHAN scientific | VM-10 | |
| Water bath | DAIHAN SCIENTIFIC | WB-11 | |
| Water purifier | WASSER LAB | DI-GR | |
| Materials | |||
| 0.25 % Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-072 | |
| 10x PBS | Intron | IBS-BP007a | |
| 4% Paraformaldehyde | Biosesang | ||
| 70% Ethanol | Daejung | 4018-4410 | |
| Anti-CD31 antibody | Abcam | ab28364 | |
| Anti-HIF-1 alpha antibody | Abcam | ab16066 | |
| Anti-SHMT2/SHMT antibody | Abcam | ab88664 | |
| Anti-SOX2 antibody | Abcam | ab75485 | |
| Bovine Serum Albumin | Thermo scientific | J10857-22 | |
| Collagen from porcine skin | Dalim tissen | PC-001-1g | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermofisher | D1306 | |
| Endothelial Cell Growth Medium-2 | Promocell | C22011 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 12483-020 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Theromofisher | A-11001 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 | Theromofisher | A-11012 | |
| High-glucose Dulbecco’s Modified Eagle Medium(DMEM) | Hyclone | SH30243-0 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 311413-100ML | |
| Live/dead assay kit | Invitrogen | L3224 | |
| Mouse IgG1, kappa monoclonal [15-6E10A7] – Isotype Control | Abcam | ab170190 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Phenol red solution | Sigma-Aldrich | P0290-100ML | |
| Poly(ethylene-vinyl acetate) | Poly science | 06108-500 | |
| Polydimethylsiloxane | Dowhitech | sylgard 184 | |
| Rabbit IgG, polyclonal – Isotype Control | Abcam | ab37415 | |
| Sodium hydroxide solution | Samchun | S0610 | |
| Triton X-100 | Biosesang | TRI020-500-50 | |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| Software | |||
| COMSOL Multiphysics 3.5a | COMSOL AB | ||
| IMS beamer | in-house software | ||
| SolidWorks Package | Dassault Systems SolidWorks Corporation | ||
References
- Jing, X., et al. Role of hypoxia in cancer therapy by regulating the tumor microenvironment. Molecular Cancer. 18 (1), 157 (2019).
- Al Tameemi, W., Dale, T. P., Al-Jumaily, R. M. K., Forsyth, N. R. Hypoxia-modified cancer cell metabolism. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 4 (2019).
- Petrova, V., Annicchiarico-Petruzzelli, M., Melino, G., Amelio, I. The hypoxic tumour microenvironment. Oncogenesis. 7 (1), 1-13 (2018).
- Hockel, M., Vaupel, P. Tumor hypoxia: definitions and current clinical, biologic, and molecular aspects. Journal of the National Cancer Institute. 93 (4), 266-276 (2001).
- Kim, H., Lin, Q., Glazer, P. M., Yun, Z. The hypoxic tumor microenvironment in vivo selects the cancer stem cell fate of breast cancer cells. Breast Cancer Research. 20 (1), 16 (2018).
- Jeong, G. S., Lee, J., Yoon, J., Chung, S., Lee, S. -. H. Viscoelastic lithography for fabricating self-organizing soft micro-honeycomb structures with ultra-high aspect ratios. Nature Communications. 7 (1), 1-9 (2016).
- Razian, G., Yu, Y., Ungrin, M. Production of large numbers of size-controlled tumor spheroids using microwell plates. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (81), e50665 (2013).
- Nunes, A. S., Barros, A. S., Costa, E. C., Moreira, A. F., Correia, I. J. 3D tumor spheroids as in vitro models to mimic in vivo human solid tumors resistance to therapeutic drugs. Biotechnology and Bioengineering. 116 (1), 206-226 (2019).
- Wan, L., Neumann, C., LeDuc, P. Tumor-on-a-chip for integrating a 3D tumor microenvironment: chemical and mechanical factors. Lab on a Chip. 20 (5), 873-888 (2020).
- Nam, H., Funamoto, K., Jeon, J. S. Cancer cell migration and cancer drug screening in oxygen tension gradient chip. Biomicrofluidics. 14 (4), 044107 (2020).
- Palacio-Castañeda, V., Kooijman, L., Venzac, B., Verdurmen, W. P., Le Gac, S. Metabolic switching of tumor cells under hypoxic conditions in a tumor-on-a-chip model. Micromachines. 11 (4), 382 (2020).
- Ronaldson-Bouchard, K., Vunjak-Novakovic, G. Organs-on-a-chip: a fast track for engineered human tissues in drug development. Cell Stem Cell. 22 (3), 310-324 (2018).
- Mi, S., Du, Z., Xu, Y., Sun, W. The crossing and integration between microfluidic technology and 3D printing for organ-on-chips. Journal of Materials Chemistry B. 6 (39), 6191-6206 (2018).
- Yi, H. -. G., Lee, H., Cho, D. -. W. 3D printing of organs-on-chips. Bioengineering. 4 (1), 10 (2017).
- Yi, H. -. G., et al. A bioprinted human-glioblastoma-on-a-chip for the identification of patient-specific responses to chemoradiotherapy. Nature Biomedical Engineering. 3 (7), 509-519 (2019).
- Kang, T. -. Y., Hong, J. M., Jung, J. W., Yoo, J. J., Cho, D. -. W. Design and assessment of a microfluidic network system for oxygen transport in engineered tissue. Langmuir. 29 (2), 701-709 (2013).
- Woo Jung, J., et al. Evaluation of the effective diffusivity of a freeform fabricated scaffold using computational simulation. Journal of Biomechanical Engineering. 135 (8), (2013).
- Brown, A. C., De Beer, D. Development of a stereolithography (STL) slicing and G-code generation algorithm for an entry level 3-D printer. 2013 Africon (IEEE). , 1-5 (2013).
- Shim, J. -. H., Lee, J. -. S., Kim, J. Y., Cho, D. -. W. Bioprinting of a mechanically enhanced three-dimensional dual cell-laden construct for osteochondral tissue engineering using a multi-head tissue/organ building system. Journal of Micromechanics and Microengineering. 22 (8), 085014 (2012).
- Gillispie, G., et al. Assessment methodologies for extrusion-based bioink printability. Biofabrication. 12 (2), 022003 (2020).
- Kim, B. S., Das, S., Jang, J., Cho, D. -. W. Decellularized extracellular matrix-based bioinks for engineering tissue-and organ-specific microenvironments. Chemical Reviews. 120 (19), 10608-10661 (2020).
