Denne protokollen beskriver anvendelser av prøve immobilisering ved hjelp av Fibrin-blodpropper, begrense drifting, og tillate tilsetning og utvasking av reagenser under levende avbildning. Prøver overføres til en dråpe Fibrinogen som inneholder kulturmedium på overflaten av en deksler, hvorpå polymerisasjon induserer ved å legge til trombin.
Drosophila er et viktig modellsystem for å studere et stort utvalg av biologiske spørsmål. Ulike organer og vev fra ulike utviklingsstadier av flyet som imaginale plater, larvalhjernen eller eggkamrene til voksne kvinner eller voksentarmen kan ekstraheres og holdes i kultur for avbildning med tidsforløpmikroskopi, noe som gir verdifull innsikt i celle- og utviklingsbiologi. Her beskriver vi i detalj vår nåværende protokoll for disseksjon av Drosophila larvalhjerner, og presenterer deretter vår nåværende tilnærming for immobilisering og orientering av larvalhjerner og andre vev på en glassdekslelip ved hjelp av Fibrin-blodpropper. Denne immobiliseringsmetoden krever bare tilsetning av Fibrinogen og Trombin til kulturmediet. Den er egnet for høyoppløselig tidsforløpavbildning på inverterte mikroskoper av flere prøver i samme kulturfat, minimerer lateraldriften ofte forårsaket av bevegelser av mikroskopstadiet i multipunktsbesøkende mikroskopi og tillater tilsetning og fjerning av reagenser i løpet av avbildning. Vi presenterer også skreddersydde makroer som vi rutinemessig bruker til å korrigere for drifting og for å trekke ut og behandle spesifikk kvantitativ informasjon fra tidsforløpanalyse.
Drosophila er fortsatt et viktig modellsystem for å studere et stort spekter av biologiske spørsmål og har utmerket seg i å fremme kunnskap innen mange disipliner i flere tiår. En funksjon som gjør at den spesielt skiller seg ut, er at den er spesielt godt egnet for levende bildebehandling. Evnen til å overvåke subcellulære prosesser eller oppførselen til celler og vev i sanntid fortsetter å bidra til å generere nøkkelbegreper som er relevante for celle- og utviklingsbiologi. Mange vellykkede protokoller har blitt utviklet av forskjellige grupper for å opprettholde slike Drosophila-prøver levende og sunne for å studere oppførselen til prøven og fluorescerende molekyler lever. Organer og vev fra fluen som imaginale plater1,2, larvalhjernen3,4,5,6eller eggkamre av voksne kvinner7,8,9eller voksentarmen10 kan for eksempel ekstraheres og holdes i kultur for avbildning med tidsforløpmikrokopi. En viktig utfordring for levende bildebehandling er å sikre at prøven holdes nær bildeflaten for optimal oppløsning og immobil uten at det går på bekostning av prøveintegritet som kan være følsom for mekaniske påvirkninger. For å studere nevrale stamceller, kalt nevroblaster eller nevroner i Drosophila larvalhjernen, for eksempel, kan du holde prøver nær bildeflaten ved å dekke dem med kulturmedier i forseglede bildekamre11,12,13. Denne tilnærmingen tillater imidlertid ikke lett medieutveksling og begrenser dermed eksperimentelt handlingsrom. Alternativt kan prøver tilberedes og plasseres på coverlips som behandles for å øke vedheft av celler og tillate multi-point besøkende mikroskopi og utvidet live-celle avbildning i åpne kulturretter, som potensielt tillater medieutveksling, men gir ikke enkle midler for å forhindre prøvedrift eller tap under medieutveksling14,15.
Fibrin-blodproppmetoden som opprinnelig ble utviklet for å studere meiosis i levende kranflue spermatocytter16, er spesielt egnet til å overvinne disse problemene. Fibrinogen er oppløst i relevant kulturmedium, prøvene plassert og orientert i en dråpe av denne løsningen på et tilstrekkelig glassoverflate bildekammer før Trombin tilsetts, noe som resulterer i rask dannelse av en uoppløselig Fibrin-blodpropp, et klebrig fibrøst nett som fester seg til glassoverflaten og prøvene samtidig som de sikrer tilgang til prøven til kulturmediet. Mediet kan deretter byttes uten å fortrenge blodpropp eller prøveposisjon. Kulturmediumutveksling under avbildning er for eksempel ønskelig når inhibitorer skal tilsettes som i den opprinnelige metoden eller for utvasking eller pulsjakteksperimenter eller når fluorescerende fargestoffer skal tilsettes under levende celleavbildning mens celler og vev holdes på plass. Fibrin blodpropper er egnet for avbildning av Drosophila vev samt individuelle celler13,17. Fibrin-blodpropper kan videre brukes til å orientere prøver, som på grunn av deres form eller andre egenskaper normalt ikke ville være orientert på ønsket måte ved å modulere prøveposisjon i Fibrin-blodpropp og formen på blodpropp selv.
Her gir vi en oppdatering om våre nåværende Fibrin-blodproppbaserte avbildningsmetoder og gir verktøy for segmenteringsbasert bildeanalyse og fokus på bruk av denne metoden for å studere nevroblastomdivisjoner i den utviklende fluehjernen. Vi bruker rutinemessig Fibrin-blodproppmetoden til å følge flere prøver i forskjellige blodpropper i samme kulturrett. Dette tillater i) avbildning av subcellulære hendelser som sentrosom atferd eller mRNA lokalisering live18,19, ii) overvåking av oppførselen til prøver ved farmakologisk behandling av forskjellige genotyper under samme bildebehandlingsinnstillinger ved hjelp av flerpunktsbesøk mikroskopi20, iii) studere effekten av akutt inhibering av enzymer21 og iv) minimere drifting for å studere endringer i orienteringen av celledeling av celler i deres fysiologiske miljø ved målrettet laser-ablasjon22. Mens uønskede effekter av Trombin og Fibrinogen og Fibrin-blodpropp må testes empirisk for hver prøve, denne metoden er i prinsippet egnet til å immobilisere enhver type prøve som skal analyseres av levende celleavbildning og i Drosophila har blitt brukt til å studere flere aspekter av nevroblasterbiologi5,19,20, men også dynamikken i cytosensorprojeksjoner av kvinnelige bakterielinje stamceller23 og endringer i polaritet ved akutt aPKC-hemming av follikkelceller av Drosophila kvinnelige eggkamre21.
Tidsforløp fluorescerende avbildning resulterer i generering av komplekse tidsavklarte 3D-datasett som krever metoder for å trekke ut denne kvantitative informasjonen. Her beskriver vi vår videre utvikling av ImageJ-baserte24 makroer som kan brukes til å korrigere for drifting i hyperstakker og skreddersydde ImageJ-makroer som tillater halvautomatisk kvantifisering av flerkanals fluorescens ved cellebarken utviklet for å kvantifisere kortikale proteiner i nevroblaster av Drosophila larvalhjerner eller av individuelle nevroblaster i primærcellekultur.
Levende avbildning av hele fjellet D. melanogaster larvalhjerner gir mulighet til å observere asymmetriske nevrale stamcelledelinger under forhold nær en fysiologisk kontekst. Den første delen av vår protokoll introduserer vår tilnærming til disseksjon av larvalhjerner. Som allerede nevnt13, er et kritisk aspekt av preparatet å unngå å skade hjernen. Det mest utfordrende aspektet ved dette er å skille hjernen fra de nærliggende imaginale diskene uten å trekke for mye på hjernen. Vår tilnærming til å “kutte uten å trekke” er å utføre enten en slipebevegelse med spissene på ett par tang, eller å skyve en tangspiss langs to andre tangspisser som holder forbindelsen mellom vev (Figur 1A), mens Lerit et al. beskriver saglignende bevegelser med en dissekeringspinne. Vi anbefaler eksperimentet å prøve alle tilnærminger og å vedta den best egnede for seg selv. Vi foreslår også at du bruker BSA- eller FCS-belagte pipettespisser i stedet for disseksjonsverktøy for å overføre isolerte hjerner. Belegget forhindrer vev i å holde seg til plasten og tillater sikker overføring av vev mens de alltid holder dem helt nedsenket, uten å utsette dem for en mulig forbigående deformasjon når de holder seg til disseksjonsverktøyet under overføringen. Belagte tips har andre fordeler for å tillate overføring av flere hjerner samtidig, noe som er spesielt nyttig når det er viktig å kontrollere oppholdstiden til prøvene innenfor et bestemt medium; de er egnet for overføring av andre vev, selv skjøre som for eksempel fettlegemer; De kan romme et bredt spekter av forskjellige prøvestørrelser ved å bruke større spisser eller kutte ekstremiteten til spissen.
Deretter beskriver denne protokollen bruken av Fibrinogen koagulering for å immobilisere larvalhjerner på forsiden av en kulturrett. En hjerne er orientert innenfor en dråpe kulturmedium + Fibrinogen, hvorpå koagulering induseres ved tilsetning av Trombin. Fibrinformasjonen er gradvis, noe som gir et tidsvindu der retningen på prøven kan finjusteres, om nødvendig (Figur 2C). Hvis det er nødvendig med en liten kompresjon av prøven – som vi fraråder når det gjelder larvalhjerner – kan den også finjusteres ved å trykke på blodpropp mer eller mindre nær prøven i trinn 3.4.4 og 3.5.2. Den største fordelen med denne Fibrinogen koagulering over protokollen beskrevet i Lerit et al., der hjerner er montert mellom en gassgjennomtrengelig membran og en coverlip, er evnen til å erstatte kulturmediet under levende avbildning. En mulig fordel ved å bruke en gassgjennomtrengelig membran over vår protokoll kan være at den gir en optimal oksygenering av prøvene, noe som kan være mer begrenset med vår tilnærming ettersom hjernen er skilt fra luften av blodpropp og noe medium. Av denne grunn, selv om vi ikke vurderte effekten av mengden kulturmedium i kulturretten, foreslår vi å begrense mengden kulturmedium på toppen av blodproppene mens du holder blodproppene helt nedsenket.
Siden manipuleringen av blodproppene kan være eksperimentelt vanskelig og tidkrevende, anbefaler vi at eksperimentatoren først praktiserer å manipulere blodpropper uten prøver. Modulering av volumet av dråpen av kultur medium + Fibrinogen på dekslenelip, konsentrasjonen av Fibrinogen eller volumet og konsentrasjonen av Trombin kan bidra til å gjøre preparatet enklere og kan være viktig når du tilpasser protokollen til andre typer vev. Med nok erfaring til å manipulere blodproppene, kan flere hjerner immobiliseres i en blodpropp om nødvendig, selv om det kompliserer finjusteringen av orienteringen. Flere blodpropper kan dannes på dekslene, slik at for eksempel bildeprøver av forskjellige genotyper. Det er også mulig å eksponere forskjellige blodpropper på samme coverlip til forskjellige kulturmedier, selv om det må tas hensyn til aldri å blande dråper kulturmedium som dekker de forskjellige blodproppene. Når larvalhjerner er immobilisert og klare for levende avbildning, anbefaler vi å følge anbefalingene fra Lerit et al.13 for å unngå overdreven fotodamage. Vi legger bare til disse anbefalingene for ikke bare å opprettholde hjernen ved 25 °C under levende avbildning med en sceneinkubator, men også for å forvarme dette stadiet i minst 30 minutter før starten av avbildningen. I våre hender resulterer det systematisk i en sterk fokusdrift å unnlate å gjøre det.
Det kan være en fordel i noen sammenhenger å kunne utføre korrelert mikroskopi og fikse og immunostain en prøve etter levende avbildning. En begrensning ved bruk av Fibrin-blodpropper er imidlertid at det er nesten umulig å mekanisk isolere en hjerne fra en blodpropp uten å skade den. En mulig måte å overvinne denne begrensningen kan være å utvikle metoder for å forringe Fibrin-blodpropper med Plasmin eller å indusere blodpropp demontering ved å legge til et peptid som etterligner knottene som tillater Fibrin-polymerisering28. Vi bruker vanligvis Fibrin-blodpropper på prøver som spenner fra enkeltceller til 200 μM lange vev, men vi kan også lykkes med å immobilisere i blodpropper og bildehjerner fra voksne humle over 3 mm brede. Den øvre grensen for prøvestørrelsen som kan immobiliseres i blodpropper gjenstår å bestemme. På samme måte, selv om vi vanligvis ser for oss immobiliserte prøver i 4 til 5 timer, har vi med hell avbildet nevroblaster i primærkulturen i opptil 3 dager, noe som indikerer at blodpropp i det minste ikke forstyrrer langsiktig levedyktighet. Tvert imot kan blodpropper lette den vanlige utskiftingen av mediet, et krav om langsiktig avbildning, uten behov for enheter som peristaltiske pumper til dette formålet. Selv om vi ikke har målt permeabilitetsparametrene til fibrin-blodpropper, ser blodproppenes fibrøse gellignende natur ut til å være gjennomførbare av cellegjennomtrengelige molekyler. Vi fant ut at Latrunculin A, Colcemid eller 1-NAPP1, HALO-tag ligander og andre standardfarger som brukes i cellebiologi, når cellene i fibrin-blodpropp uten problemer og har så langt ikke møtt molekyler som vil bli beholdt av blodpropp, som imidlertid er en mulighet som må testes empirisk.
Til slutt gir bruk av Fibrin-blodpropper en pålitelig og relativt enkel å implementere en måte å immobilisere levende vev for levende avbildning. Utover sin nytte i å begrense lateral drifting, evnen til å endre kulturmediet under levende avbildning har vist seg uvurderlig for vår kjemiske genetikk tilnærming til å studere asymmetrisk celledeling av D. melanogaster neuroblaster21. Vi forventer at denne teknikken vil være gunstig for studier i et bredt spekter av forskjellige vev, spesielt hvis de involverer kjemisk genetikk eller for eksempel protein selvmerking29.
Vår MultiHyperStackReg makro er avhengig av TurboReg ImageJ plugin, som justerer etterfølgende rammer eller skiver av en stabel, og MultiStackReg ImageJ plugin, som gjør det mulig å bruke transformasjoner til andre stabler. MultiHyperStackReg gjør det ganske enkelt mulig å bruke disse transformasjonene på hyperstakker (stabler med minst fire dimensjoner). Ettersom bruken av MultiHyperStackReg, som vi beskriver det, krever mange handlinger og kan bli ganske tidkrevende, skrev vi også Makroen AutoHyperStackReg, som automatisk utfører alle trinnene som er beskrevet i trinn 6.2 og 6.3. Men i motsetning til MultiHyperStackReg mangler AutoHyperStackReg for øyeblikket muligheten til å beregne justeringen av en stabel basert på en underregion av denne stakken, et alternativ som vi fant noen ganger er avgjørende for en tilfredsstillende justering. En annen begrensning ved AutoHyperStackReg er at bruken er begrenset til oversettelser og ikke de andre transformasjonene foreslått av TurboReg og MultiStackReg, mens MultiHyperStackReg kan gjelde for en hyperstakk enhver transformasjonstype hvis brukeren trenger det. Fremtidige utgivelser vil implementere disse funksjonene og vil være tilgjengelige på GitHub30. Til slutt gir vår roterende linjer en enkel måte å raskt måle kortikale signaler i tidsforløp, selv om cortexen endrer sin posisjon eller orientering over tid. Hvorvidt sporingsmodusen eller ikke-sporingsmodusen er best egnet for analyse, avhenger av kvaliteten og konsistensen til det kortikale signalet. Sporingsmodusen er enklere å bruke, da brukeren ikke trenger å vurdere hvor cortex vil være for hvert tidspunkt og kan imøtekomme store endringer i posisjon og orientering over tid. Det er imidlertid bare egnet hvis det kortikale signalet forblir sterkt nok til deteksjon under hele filmen: manglende registrering av noe annet enn cortex (f.eks. et lyst cytoplasmisk rom nær cortex) kan kompromittere deteksjonen for hvert følgende tidspunkt (f.eks. det cytoplasmiske rommet beveger seg bort fra cortex og de kortikale linjene kan følge det resten av tiden bortfall). Ikke-sporingsmodusen har ikke denne fallgruven, da deteksjonen er begrenset til linjen som opprinnelig ble tegnet av brukeren (f.eks. et lyst cytoplasmisk rom kan føre til at deteksjonen mislykkes i noen få tidspunkter, men ettersom det cytoplasmiske rommet beveger seg bort fra deteksjonsområdet, fortsetter riktig deteksjon av cortex), men oppfører seg ikke bra hvis cortex-posisjonen eller orienteringen endres mye over tid. Den neste funksjonen (som vil være tilgjengelig på GitHub30) som skal utvikles for sporingsmodus, vil være alternativet for å bare analysere angitte tidspunkter og definere et referansetidspunkt (i stedet for det første tidspunktet) før og etter hvilken deteksjonen vil bli utført, noe som gjør at brukeren i det minste kan unngå problematiske tidspunkter.
The authors have nothing to disclose.
Arbeidet i Januschke-laboratoriet støttes av Wellcome trust grants 100031/Z/12/A og 1000032/Z/12/A. Vevsavbildningsanlegget støttes av tilskuddet WT101468 fra Wellcome.
Albumin bovine serum, BSA | Merck | 5470 | |
D-(+)-Glucose | Sigma | G7021 | |
Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | |
Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | |
Fetal Bovie Serum, suitable for cell culture | Sigma | F7524 | |
Fibrinogen from human plasma | Sigma | F3879 | |
FluoroDish Cell Culture Dish – 35mm, 23 mm well | World Precision Instruments | FD35-100 | |
PP1 Analog (1NA-PP1) | Merck Millipore | 529579 | |
Pyrex spot plate with nine depressions | Sigma | CLS722085-18EA | |
Schneider's Insect Medium | Sigma | S0146 | |
Thrombin from bovine plasma | Merck | T4648 |