Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Toepassingen van immobilisatie van Drosophila-weefsels met fibrinestolsels voor live beeldvorming

Published: December 22, 2020 doi: 10.3791/61954
Automatic Translation
1, 1
1Cell & Developmental Biology, School of Life Sciences, University of Dundee

Summary

Dit protocol beschrijft toepassingen van monsterimmobilisatie met behulp van Fibrine-stolsels, waardoor driften worden beperkt en de toevoeging en washout van reagentia tijdens live beeldvorming mogelijk is. Monsters worden overgebracht naar een druppel Fibrinogeen met kweekmedium op het oppervlak van een afdeklip, waarna polymerisatie wordt geïnduceerd door toevoeging van trombine.

Abstract

Drosophila is een belangrijk modelsysteem om een breed scala aan biologische vragen te bestuderen. Verschillende organen en weefsels uit verschillende ontwikkelingsstadia van de vlieg, zoals imaginaire schijven, de larvale hersenen of eikamers van volwassen vrouwtjes of de volwassen darm, kunnen worden geëxtraheerd en in cultuur worden gehouden voor beeldvorming met time-lapse microscopie, wat waardevolle inzichten biedt in cel- en ontwikkelingsbiologie. Hier beschrijven we in detail ons huidige protocol voor de dissectie van Drosophila larvale hersenen, en presenteren we vervolgens onze huidige aanpak voor het immobiliseren en oriënteren van larvale hersenen en andere weefsels op een glazen hoeslip met behulp van Fibrine-stolsels. Deze immobilisatiemethode vereist alleen de toevoeging van Fibrinogeen en Trombine aan het cultuurmedium. Het is geschikt voor timelapse-beeldvorming met hoge resolutie op omgekeerde microscopen van meerdere monsters in dezelfde kweekschaal, minimaliseert het laterale driften dat vaak wordt veroorzaakt door bewegingen van het microscoopstadium in meerpuntsbezoekmicroscopie en maakt het mogelijk om reagentia toe te passen en te verwijderen tijdens de beeldvorming. We presenteren ook op maat gemaakte macro's die we routinematig gebruiken om te corrigeren voor driften en om specifieke kwantitatieve informatie uit time-lapse-analyse te extraheren en te verwerken.

Introduction

Drosophila blijft een belangrijk modelsysteem om een breed scala aan biologische vragen te bestuderen en blinkt al tientallen jaren uit in het bevorderen van kennis in vele disciplines. Een functie die het bijzonder opvalt, is dat het bijzonder geschikt is voor live beeldvorming. Het vermogen om subcellulaire processen of het gedrag van cellen en weefsels in realtime te volgen, blijft bijdragen aan het genereren van sleutelbegrippen die relevant zijn voor cel- en ontwikkelingsbiologie. Veel succesvolle protocollen zijn ontwikkeld door verschillende groepen om dergelijke Drosophila-monsters levend en gezond te houden om het gedrag van het monster en fluorescerende moleculen te bestuderen. Organen en weefsels van de vlieg, zoals fantasieschijven1,2,de larvale hersenen3,4,5, 6of eierkamers van volwassen vrouwtjes7,8,9,of de volwassen darm10 kunnen bijvoorbeeld worden geëxtraheerd en in cultuur worden gehouden voor beeldvorming met time-lapse microscopie. Een belangrijke uitdaging voor live beeldvorming is ervoor te zorgen dat het monster dicht bij het beeldoppervlak wordt gehouden voor een optimale resolutie en onbeweeglijk zonder afbreuk te doen aan de integriteit van het monster dat gevoelig kan zijn voor mechanische schokken. Om neurale stamcellen te bestuderen, neuroblasten of neuronen genoemd in de drosophila larvale hersenen, bijvoorbeeld, kan het houden van monsters dicht bij het beeldvormingsoppervlak worden bereikt door ze te bedekken met kweekmedia in verzegelde beeldvormingskamers11,12,13. Deze aanpak maakt media-uitwisseling echter niet gemakkelijk mogelijk, waardoor de experimentele manoeuvreerruimte wordt beperkt. Als alternatief kunnen monsters worden bereid en op afdeklips worden geplaatst die worden behandeld om de hechting van cellen te verhogen en multi-point bezoekende microscopie en uitgebreide live-cell imaging in open kweekgerechten mogelijk te maken, die media-uitwisseling mogelijk maken, maar geen gemakkelijke middelen bieden om monsterdrift of verlies tijdens media-uitwisseling te voorkomen14,15.

De Fibrin-stolselmethode die oorspronkelijk is ontwikkeld om meiose in levende kraanvlieg spermatocyten16 te bestuderen, is specifiek geschikt om deze problemen te overwinnen. Fibrinogeen wordt opgelost in een relevant kweekmedium, de monsters worden in een druppel van deze oplossing op een geschikte beeldkamer voor het glasoppervlak geplaatst en georiënteerd voordat trombine wordt toegevoegd, wat resulteert in de snelle vorming van een onoplosbaar Fibrine-stolsel, een kleverig vezelig gaas dat zich hecht aan het glasoppervlak en de monsters en tegelijkertijd de toegang van het monster tot het kweekmedium garandeert. Het medium kan vervolgens worden verwisseld zonder de stolsel- of monsterpositie te storen. Uitwisseling van kweekmedia tijdens beeldvorming is bijvoorbeeld wenselijk wanneer remmers moeten worden toegevoegd zoals in de oorspronkelijke methode of voor uitwas- of pulsachtervolgingsexperimenten of wanneer fluorescerende kleurstoffen moeten worden toegevoegd tijdens live cell imaging terwijl cellen en weefsels op hun plaats blijven. Fibrinestolsels zijn geschikt voor beeldvorming van Drosophila-weefsels en individuele cellen13,17. Fibrinestolsels kunnen verder worden gebruikt om monsters te helpen oriënteren, die vanwege hun vorm of andere eigenschappen normaal gesproken niet op de gewenste manier zouden worden georiënteerd door de monsterpositie binnen het Fibrin-stolsel en de vorm van het stolsel zelf te moduleren.

Hier geven we een update over onze huidige Fibrin-stolselgebaseerde beeldvormingsmethoden en bieden we tools voor segmentatiegebaseerde beeldanalyse en richten we ons op het gebruik van deze methode om neuroblastafdelingen in het zich ontwikkelende vliegbrein te bestuderen. We gebruiken routinematig de Fibrin-stolselmethode om meerdere monsters in verschillende stolsels in hetzelfde kweekgerecht te volgen. Dit maakt i) beeldvorming van subcellulaire gebeurtenissen zoals centrosoomgedrag of mRNA-lokalisatie live18,19, ii) het monitoren van het gedrag van monsters bij farmacologische behandeling van verschillende genotypen onder dezelfde beeldvormingsinstellingen met behulp van meerpuntsbezoekmicroscopie20, iii) het bestuderen van de effecten van acute remming van enzymen21 en iv) het minimaliseren van driften om veranderingen in de oriëntatie van celdeling van cellen binnen hun fysiologische omgeving te bestuderen bij gerichte laserablatie2. Hoewel ongewenste effecten van Trombine en Fibrinogeen en het Fibrine-stolsel empirisch moeten worden getest voor elk monster, is deze methode in principe geschikt om elk type monster te immobiliseren dat moet worden geanalyseerd door live cell imaging en in Drosophila is met succes gebruikt om meerdere aspecten van neuroblastenbiologie5,19,20te bestuderen , maar ook de dynamiek van cytosensorprojecties van vrouwelijke kiemlijnstamcellen23 en veranderingen in polariteit bij acuteaP.

Time-lapse fluorescerende beeldvorming resulteert in het genereren van complexe tijd-opgeloste 3D-gegevens sets die methoden vereisen om deze kwantitatieve informatie te extraheren. Hier beschrijven we onze verdere ontwikkeling van imagej-gebaseerde24 macro's die kunnen worden gebruikt om te corrigeren voor drifting in hyperstacks en op maat gemaakte ImageJ-macro's die semi-geautomatiseerde kwantificering van multi-channel fluorescentie in de celschors mogelijk maken, ontwikkeld om corticale eiwitten te kwantificeren in neuroblasten van Drosophila larvale hersenen of van individuele neuroblasten in primaire celcultuur.

Protocol

1. Bereiding van reagentia

OPMERKING: Alle stappen in dit protocol, tenzij anders uitgelegd, worden uitgevoerd bij kamertemperatuur.

  1. Om een oplossing van 1x PBS-BSA (0,1% w/v) te bereiden, lost u 1 mg Bovine Serum Albumine (BSA) op in 1 ml PBS. Om een voorraadoplossing van Trombine 1.000 eenheden·ml-1te bereiden, lost u 1.000 eenheden trombine op in 1 ml PBS-BSA (0,1% w/v). Maak aliquots van 10 μL en bewaar bij -20 °C gedurende maximaal 4 maanden.
  2. Om het kweekmedium voor te bereiden op Drosophila-hersenen, lost u 1 g glucose op in 1 L van Schneiders medium in steriele omstandigheden. Filtreer en bewaar tot 3 maanden bij 4 °C.
  3. Om de Fibrinogeenoplossing te bereiden, lost u 10 mg Fibrinogeen op in 1 ml kweekmedium gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur of 5 minuten bij 37 °C.
    OPMERKING: Als een ander kweekmedium wordt gebruikt dan het bij stap 1.2 bereide medium en fibrinestolsels zich al bij deze stap vormen, bevat het kweekmedium waarschijnlijk actieve trombine, die vooraf moet worden geactiveerd. Een waarschijnlijke bron van trombine is Foetale Runderserum, dat kan worden geactiveerd door het serum gedurende 30 minuten te verwarmen tot 56 °C.
  4. Om een coatingoplossing van PBS-BSA (5% w/v) te bereiden, lost u 50 mg Bovine Serum Albumine (BSA) op in 1 ml 1x PBS.
  5. Voor het voorbeeldreagens dat in stap 4 wordt gebruikt, bereidt u een stamoplossing van 10 mM NAPP1 voor door 1 mg NAPP1 in 315 μL Dimethylsulfoxide op te lossen.

2. Dissectie van drosophila larvale hersenen

OPMERKING: Voer deze stap uit onder een verrekijker voor dissectie.

  1. Gebruik een borstel om L3-larven over te brengen in een 9-well borosilicaat glazen schaal met PBS. Roer om het grootste deel van het vliegvoedsel los te maken van de larven en over te brengen naar een ander goed bevattend kweekmedium.
  2. Gebruik een tang (bijv. Dumont #55) om een larve over zijn hele diameter te grijpen, in het midden van zijn lichaamslengte (zie figuur 1A,B). Terwijl u de larve vasthoudt, breng u deze over naar een andere put van de borosilicaatplaat met 200 μL vers kweekmedium.
  3. Laat de larve niet los. Om de larve doormidden te snijden over zijn gehele diameter(figuur 1B),maalt u het gegrepen gebied met zijdelingse beweging van de tangpunten(figuur 1A,bovenpaneel) of schuift u een punt van een ander paar tangen tussen de twee tangpunten die de larve vasthouden(figuur 1A,onderste paneel). Snijd de larve niet doormidden door aan een van zijn ledematen te trekken, omdat deze de hersenen kan beschadigen door eraan te trekken via de zenuwen die de lichaamslengte overschrijden (rode lijnen in figuur 1B).
  4. Gebruik een tang om de larve bij de nagelriem te houden en een ander paar tangen om de nagelriem uit elkaar te halen zonder aan de hersenen te trekken (Figuur 1C). Herhaal dit totdat de zenuwen afkomstig uit de hersenen zichtbaar zijn en de organen die de hersenen verbinden met de monddelen toegankelijk zijn zoals weergegeven in figuur 1D.
  5. Gebruik een tang om de zenuwen uit de hersenen vast te houden. Gebruik bij het andere paar tangen een van de technieken in figuur 1A om de verbinding tussen de hersenen en de monddelen te verbreken en de hersenen te scheiden van de rest van de cuticula (figuur 1D).
  6. Gebruik een tang om de hersenen vast te houden bij de axonen die uit het ventrale zenuwkoord komen. Pluk de in grijs afgebeelde organen in figuur 1E door ze voorzichtig van de hersenen af te trekken.
    OPMERKING: Trek niet aan de oog-/antenneschijven (donkergeel) om ze los te maken van de hersenen. De verbinding tussen deze weefsels is te robuust om te worden verbroken door te trekken zonder de hersenen te beschadigen.
  7. Terwijl u nog steeds de zenuwen vastgrijpt om de hersenen vast te houden en te oriënteren, grijpt u de verbinding tussen de fantasieschijven van het oog / de antenne (donkergeel) en de hersenen met het andere paar tangen (figuur 1F). Gebruik een van de technieken in figuur 1A om deze verbinding te verbreken zonder aan de hersenen te trekken. Controleer of de hersenen op de juiste wijze zijn ontdaan van andere weefsels (figuur 1G) en niet beschadigd zijn (figuur 1H). Gooi de hersenen weg als het tekenen van schade vertoont.
  8. Pipetteer de coatingoplossing met een P20 in en uit om de pipettip te coaten. Pipetteer de hersenen met de gecoate punt samen met 3 μL medium(figuur 2A, links)en pipetteer het uit in een andere put met 200 μL schoon kweekmedium.
  9. Herhaal stap 2.2–2.8 totdat voldoende hersenen zijn ontleed, waarbij af en toe het cultuurmedium van de put waarin de dissecties worden uitgevoerd, wordt vervangen.

Figure 1
Figuur 1: Dissectie van D. melanogaster larvale hersenen. (A) Techniek voor snijden zonder te trekken met behulp van een tang. Het monster (lichtgroen) kan worden gesneden door te worden gemalen tussen de uiteinden van de tang (bovenpaneel) of door een punt van een paar tangpunten langs de uiteinden van een paar tangen te laten lopen die het monster vasthouden (onderste paneel). (B–F) Stappen voor het isoleren van de larvale hersenen zonder deze te beschadigen (zie tekst). Rood: hersenen. Donkergeel: oog-/antenneschijven. Blauwe tekst: acties om uit te voeren met de bijbehorende tang. (G) Uiterlijk van een geïsoleerd brein zonder zichtbare schade. D is de dorsale kant en V is de ventrale kant op het zijaanzicht. (H) Veel voorkomende schade veroorzaakt door overmatig trekken aan de hersenen tijdens de dissectie. Bovenpaneel: loslating van het ventrale zenuwkoord. Onderpaneel: vervorming van een kwab. Posterior is links en voorste is rechts in alle panelen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

3. Immobilisatie op coverslip met Fibrinestolsels

OPMERKING: Voer deze stap uit onder een verrekijker voor dissectie.

  1. Gebruik een P20 pipet met een gecoate punt zoals in stap 2.8 om de ontlede hersenen over te brengen naar een andere put van de borosilicaatplaat met 200 μL kweekmedium + Fibrinogeen (Figuur 2A).
  2. Pipet in één brein samen met 9 μL kweekmedium + Fibrinogeen. Als het uiteinde van de punt bijna de glazen bodem van een 35 mm celkweekschaal raakt, spuit u de inhoud (het kweekmedium en de hersenen) uit, waardoor het kweekmedium de afdeklip direct na het verlaten van de pipetpunt aanraakt, zodat de hersenen en het medium niet naar de zijkanten van de punt glijden, waardoor de hersenen mogelijk worden beschadigd (figuur 2A).
  3. Gebruik een punt van een tang of een gesloten paar tangen om de hersenen voorzichtig binnen het kweekmedium + Fibrinogeendruppel te duwen en te plaatsen.
    OPMERKING: Het aanraken van de druppel met een open paar tangen kan ertoe leiden dat het cultuurmedium wordt getrokken door capillariteit tussen de tangpunten (Figuur 2B).
  4. Als het ventrale deel van de hersenen in beeld moet worden gebracht, induceer dan fibrinogeenstolling als volgt om de hersenen in het stolsel goed te oriënteren (figuur 2C).
    1. Duw de hersenen naar één kant van de druppel. Met een P1 pipet uitgerust met een P1 tip, pipet 1 μL trombine oplossing, raak de rand van de druppel aan de andere kant van de hersenen met de pipet tip, en pipet uit de Trombine (Figuur 2C, eerste tekening).
    2. Wacht 1-2 minuten tot het Fibrinogeen begint te polymeriseren, wat resulteert in de vorming van een troebel neerslag aan één kant van de druppel(figuur 2C,tweede tekening). Duw en "stop" de hersenen voorzichtig in het Fibrin-stolsel en zorg ervoor dat het deel dat in beeld komt (bijv. de ventrale kant) zo dicht mogelijk bij de deklip ligt zonder de hersenen te vervormen(figuur 2C,derde tekening).
    3. Pipetteer 1 μL trombineoplossing dicht bij de zijkant van de hersenen die niet in het Fibrine-stolsel is weggestopt. (Figuur 2C, vierde tekening).
    4. Wacht 2-3 minuten tot het tweede Fibrine-stolsel is ingesteld(figuur 2C,vijfde tekening). Druk op de randen van het stolsel om het sterker aan de deklip te laten hechten, waarbij u ervoor zorgt dat de hersenen niet vervormen(figuur 2C,zesde en zevende tekeningen). Als de hersenen te ver van de coverslip lijken te zijn, breng het dan dichterbij door het Fibrin-stolsel dicht bij de hersenen te drukken.
  5. Als het dorsale deel van de hersenen moet worden afgebeeld, induceer dan de Fibrine-stolling als volgt (Figuur 2D).
    1. Plaats de hersenen in het midden van de druppel, dorsaal deel tegenover de coverslip. Met een P10 pipet uitgerust met een dunne punt, pipet 1 μL trombine-oplossing, raak de rand van de druppel aan de andere kant van de hersenen aan met de pipetpunt en pipet uit de trombine(figuur 2D,eerste tekening).
    2. Wacht 2-3 minuten tot het Fibrinogeen begint te polymeriseren, wat resulteert in de vorming van een troebel, vezelig neerslag(figuur 2D,tweede tekening). Druk op de randen van het stolsel om het sterker aan de deklip te laten hechten, waarbij u ervoor zorgt dat de hersenen niet vervormen(figuur 2D,derde en vierde tekeningen).
  6. Herhaal stap 3.1–3.5 als meerdere stollingsmonsters op de afdeklip moeten worden geïmmobiliseerd.
  7. Met het uiteinde van de punt ongeveer 0,5 cm boven het stolsel(en) geplaatst, pipet u voorzichtig 390 μL kweekmedium zonder Fibrinogeen druppelgewijs bovenop het stolsel(en) (figuur 2B, rechter Petrischaal). Voeg het kweekmedium niet toe aan de zijkanten van het stolsel, omdat het los kan komen van de afdeklip.
  8. Om de resterende trombine uit te wassen, gebruikt u een pipet om 300 μl van het kweekmedium te verwijderen en voegt u 300 μl schoon kweekmedium toe, zodat de stolsels volledig ondergedompeld blijven. Herhaal dit twee keer om overtollige trombine uit te wassen.

Figure 2
Figuur 2: Immobilisatie van een Drosophila larvale hersenen met behulp van Fibrine stolsels. (A) Met behulp van een met BSA gecoate pipetpunt worden de hersenen overgebracht van het kweekmedium (geel) naar een kweekmedium + Fibrinogeenoplossing (oranje) en vervolgens op de afdeklip (lichtblauw) van een kweekschaal gepipeteerd, samen met 3,5 μL kweekmedium + Fibrinogeen. Fibrinogeenstolling wordt geïnduceerd door toevoeging van trombine om hersenen in dorsale of ventrale positie te immobiliseren (zie D en E). De beveiligde hersenen in de stolsels worden vervolgens bedekt met kweekmedium zonder Fibrinogeen en overtollige trombine wordt verwijderd door het toevoegen en verwijderen van kweekmedium drie keer. (B) De positie van de hersenen binnen de druppel van kweekmedium + Fibrinogeen (oranje) op de afdeklip mag alleen worden aangepast door deze voorzichtig te duwen met de punt van een gesloten paar tangen, of slechts één tangpunt. Het aanraken van de druppel met op open paar tangen kan ertoe leiden dat het cultuurmedium wordt getrokken door capillariteit tussen de uiteinden van de tang. (C) Stappen voor het positioneren van de larvale hersenen voor het weergeven van de ventrale kant (zie tekst). (D) Stappen voor het positioneren van de larvale hersenen voor het weergeven van de dorsale kant (zie tekst). In (D) en (E), groen: Trombine. Donkeroranje: Fibrinestolsel. Lichtblauw: coverslip. Blauwe pijlen: randen van het stolsel dat tegen de afdeklip moet worden geduwd om het stolsel te stabiliseren. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

4. Toevoeging van reagentia tijdens live beeldvorming

  1. Om temperatuurveranderingen te voorkomen die focusveranderingen veroorzaken, moet u de oplossing met de reagentia die aan de kweekschaal worden toegevoegd op dezelfde temperatuur houden als de kweekschotel zelf om deze op dezelfde temperatuur te brengen voordat u deze toevoegt. Als een milieukamer wordt gebruikt, laat u de oplossing in de kamer.
  2. Verwijder het deksel van de kweekschotel zonder de kweekschotel zelf te verplaatsen. Om het verwijderen te vergemakkelijken, plaatst u het deksel van de 35 mm schotel ondersteboven op de schaal voordat u deze in beeld zet.
  3. Plaats met een P1000 pipet de pipetpunt dicht bij het oppervlak van het kweekmedium in de kweekschaal en laat er voorzichtig het juiste volume reagensoplossing op los om de gewenste reagensconcentratie te bereiken (bijv. 400 μL van een oplossing van 20 μM NAPP1 op 400 μL kweekmedium voor een eindconcentratie van 10 μM NAPP1) , zonder sterke fluxen te genereren die de stolsels kunnen losmaken.
  4. Om de oplossing in de kweekschaal te homogeniseren, gebruikt u een P200 pipet om een kleine hoeveelheid van de oplossing vijf keer langzaam in en uit te pipeten (bijv. 150 μL voor een volume van 800 μL in de schaal).
  5. Plaats het deksel bovenop de kweekschaal terug zonder de kweekschotel zelf te verplaatsen en hervat de beeldvorming.

5. Washout van reagentia tijdens live beeldvorming

  1. Houd de wasoplossing vóór de washout op dezelfde temperatuur als de kweekschotel.
  2. Verwijder het deksel van de kweekschotel zonder de kweekschotel zelf te verplaatsen.
  3. Verwijder met een P200- of P1000-pipet langzaam een kweekmedium uit de kweekschaal zonder de bovenkant van het stolsel bloot te leggen (verwijder bijvoorbeeld 600 μL van 800 μL kweekmedium in de schaal).
  4. Om het reagens te verdunnen met een P1000 pipet, plaatst u de pipetpunt dicht bij het oppervlak van het kweekmedium in de kweekschaal en laat u de wasoplossing langzaam los (voeg bijvoorbeeld 1 ml wasoplossing toe aan het 200 μL kweekmedium dat in de schaal achterbleef voor een verdunningsfactor van 6).
  5. Herhaal stap 5.3 en 5.4 totdat het reagens zo nodig wordt verdund (nog eens drie vergelijkbare rondes resulteren bijvoorbeeld in een verdunningsfactor van 1296, waardoor de beginconcentratie van 10 μM NAPP1 tot 7,7 nM wordt verminderd).
  6. Plaats het deksel bovenop de kweekschaal terug zonder de kweekschotel zelf te verplaatsen en hervat de beeldvorming.

6. Correctie van de xyz drifting op tridimensionale en/of multichannel time-lapses

  1. voorbereiding
    1. Download en installeer ImageJ24. Download de TurboReg25 en MultiStackReg26 plugins en plaats ze in de plugins map van ImageJ.
    2. Download de MultiHyperStackReg (Aanvullend coderingsbestand 1) en AutoHyperStackReg ImageJ macro's (Aanvullend coderingsbestand 2). Als u een macro wilt installeren, plaatst u het .ijm-bestand in de map plug-ins van ImageJ of voegt u de inhoud van het .ijm-bestand toe aan het bestand ImageJ/macros/StartupMacros.txt.
    3. Open op ImageJ een timelapsefilm met verschillende segmenten en/of meerdere kanalen (voortaan "hyperstack" genoemd, figuur 3A,4A). Als de time-lapse slechts één segment en één kanaal bevat, kan de uitlijning rechtstreeks worden uitgevoerd met MultiStackReg.
  2. Correctie van laterale drift met MultiHyperStackReg
    1. Bepaal welk kanaal en/of segment van de hyperstack moet worden gebruikt als referentie voor uitlijning. Als u een referentiestack met één kanaal en één segment wilt genereren (voortaan "referentiestack" genoemd), klikt u op Afbeelding | Dupliceren..., vink het selectievakje Dubbele hyperstack aan, typ het relevante kanaalnummer in kanalen (c): (vervang bijvoorbeeld 1–2 door 1) en/of het relevante kanaalnummer in segmenten (z): (vervang bijvoorbeeld 1-15 door 8) en zorg ervoor dat frames: (t) alle frames (bijv. 1-50) bevatten voordat u op OK klikt (figuur 3B).
    2. Als alternatief voor stap 6.2.1, als een projectie van meerdere segmenten de voorkeur heeft voor de referentiestack met één kanaal en één segment, klikt u op Afbeelding | Stapels | Z Project..., selecteer de eerste en laatste segmenten en het type projectie, zorg ervoor dat Alle tijdframes zijn aangevinkt en klik op OK. Als de time-lapse meerdere kanalen heeft, verwijdert u de irrelevante kanalen (Afbeelding | Stapels | Segment verwijderen) uit de resulterende projectie of het gekozen referentiekanaal dupliceren (Afbeelding | Duplicaat) (figuur 3B).
    3. Als u de referentiestapel bijsnijdt om slechts één deel als afbeelding als referentie te gebruiken, selecteert u het gereedschap Rechthoek op de werkbalk, volgt u een rechthoek over het interessegebied en klikt u op Afbeelding | Bijsnijden.
    4. Om MultiStackReg te starten, klik op Plugins | Registratie | MultiStackReg. Selecteer in het pop-upmenu Stapel 1:de naam van de éénkanaals stapel met één segment die in de vorige stappen is gegenereerd. Selecteer Vertaling in het pop-upmenu Transformatie:, selecteer Vertaling; vink het selectievakje Transformatiebestand opslaan aan en negeer alle andere velden.
      OPMERKING: Andere soorten transformatie (zie25).
    5. Klik op OK. Selecteer een locatie en naam om het uitlijningsbestand op te slaan en klik op Opslaan. Wacht in het venster van de referentiestack tot de frames automatisch stoppen met bewegen, wat aangeeft dat de registratie voorbij is (figuur 3B).
    6. Controleer de referentiestack om te zien of de uitlijning bevredigend is. Zo niet, herhaal dan stap 6.2.1–6.2.5 met een ander referentiesegment, kanaal en/of bijsnijden. Sluit de referentiestack.
    7. Selecteer het hyperstackvenster en voer de Macro MultiHyperStackReg uit. Selecteer het transformatiebestand dat in stap 6.2.5 is gemaakt en klik op Openen. Wacht tot de uitlijning op elk kanaal en/of segment van de hyperstack wordt toegepast, waarna een nieuw venster met het achtervoegsel "_aligned" wordt geopend (figuur 3C).
  3. Correctie van focus drift met Behulp van MultiHyperStackReg
    1. Klik op Afbeelding | Eigenschappen..., kopieert u de waarde die wordt weergegeven in Pixelbreedte. Als u de hyperstack met één kanaal met een afstand van één pixel orthogonaal wilt resliceren, klikt u op Afbeelding | Stapels | Reslice [/]..., plak de pixelbreedtewaarde in het veld Uitvoerafstand: numeriek; selecteer Boven in het pop-upmenu Start At: vink Interpolatie vermijden aan en klik op OK.
      OPMERKING: Als het geheugen op ImageJ moet worden vrijgemaakt, kan de hyperstack worden gesloten na de reslice.
    2. Selecteer het nieuwe venster gegenereerd door de reslice (voortaan aangeduid als "resliced hyperstack", Figuur 4B). Als de hyperstack met resliced meerdere kanalen heeft, selecteert u een referentiekanaal om de uitlijning uit te voeren en verwijdert u de andere kanalen door ze te selecteren in de kanaalrolbalk. klik op Afbeelding | Stapels | Segment verwijderen, selecteer Kanaal in het pop-upmenu Huidige verwijderen en klik op OK.
    3. Genereer een hyperstack met één segment (voortaan "resliced reference stack" genoemd), hetzij door een enkel segment van de resliced hyperstack te dupliceren (zie stap 6.2.1) hetzij door meerdere segmenten van de resliced hyperstack te projecteren (zie stap 6.2.2) (Figuur 4C).
    4. Snijd desgewenst de referentiestack met resliced bij om slechts één deel als referentie te gebruiken (zie stap 6.2.3).
    5. Voer de afbeeldingsregistratie uit op de resliced reference stack met MutiStackReg (zie stap 6.2.4–6.2.6) (Figuur 4C).
    6. Selecteer het venster hyperstack met resliced en voer de macro MultiHyperStackReg uit. Selecteer het transformatiebestand dat in stap 6.3.5 is gemaakt, klik op Openen en wacht tot de uitlijning op elk kanaal en/of segment van de hyperstack is toegepast, waarna een nieuw venster met het achtervoegsel "_aligned" wordt geopend (voortaan aangeduid als "resliced reference stack", figuur 4D). Sluit de originele resliced hyperstack.
    7. Als u de geresliceerde uitgelijnde hyperstack wilt converteren naar de xy-weergave van de oorspronkelijke hyperstack, klikt u op Stapels | Reslice [/]..., selecteer Boven in het pop-upmenu Start At: vink Interpolatie vermijden aan en klik op OK. Zodra een nieuw venster met de uiteindelijke focus-uitgelijnde hyperstack wordt geopend(figuur 4E),sluit u de geresliceerde uitgelijnde hyperstack.
  4. Voer de macro AutoHyperStackReg uit om de laterale drift en focus drift automatisch te corrigeren. Selecteer het referentiekanaal, indien van toepassing, en of de laterale en/of focus drift moet worden corrigeren. Klik op OK.

Figure 3
Figuur 3: Pijplijn voor de correctie van laterale drift met MultiHyperstackReg. (A) Laterale en focus drifts kunnen worden waargenomen op een hyperstack met verschillende segmenten en tijdspunten. (B) Een enkele segment, single channel referentie stack wordt gegenereerd uit de hyperstack, hetzij door duplicatie of Z projectie. De referentiestack wordt uitgelijnd door de MultiStackReg-plug-in, waardoor een uitlijningsbestand wordt gegenereerd. (C) De Macro MultiHyperstackReg wordt gebruikt om het uitlijningsbestand op de hyperstack toe te passen, wat resulteert in een uitgelijnde hyperstack waarvoor de laterale drift wordt gecorrigeerd. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Pijplijn voor het corrigeren van focus drift met MultiHyperstackReg. (A) Focus drifts kunnen worden waargenomen op een hyperstack met verschillende segmenten en tijdspunten. (B) De hyperstack wordt orthogonaal geresliceerd vanaf de bovenkant, langs elke lijn pixels langs de Y-as, zonder interpolatie. Dit resulteert in een resliced hyperstack met dezelfde informatie als de hyperstack, met zijn y en z coördinaten geschakeld. De focus drift (in z) van de oorspronkelijke hyperstack treedt op als een drift in y op de resliced hyperstack. (C) Een enkele slice, single channel resliced reference stack wordt gegenereerd uit de resliced hyperstack, hetzij door duplicatie of Z projectie. De referentiestack met resliced wordt uitgelijnd door de MultiStackReg-plug-in, waardoor een uitlijningsbestand wordt gegenereerd. (D) De macro MultiHyperstackReg wordt gebruikt om het uitlijningsbestand toe te passen op de geresliceerde hyperstack, wat resulteert in een uitgelijnde resliced hyperstack waarvoor de focus drift (in y) wordt gecorrigeerd. (E) Een tweede orthogonale reslice herstelt de oorspronkelijke coördinaten van de hyperstack, die nu geen focus drift (in z) meer vertoont. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

7. Corticale signaalmeting met roterende linescans

  1. Download de macro Rotating Linescans ImageJ (Aanvullend coderingsbestand 3).
  2. Open een time-lapse in ImageJ. Plaats de schuifbalk van de frames op het eerste frame en, als de time-lapse meerdere segmenten bevat, plaatst u de schuifbalk van de segmenten op het segment waarop het signaal wordt gemeten.
  3. Trackingmodus
    1. Selecteer het gereedschap Rechte lijn op de werkbalk. Traceer een lijn over de te meten corticale zone (figuur 5A), zorg ervoor dat de lijn ongeveer loodrecht op de cortex staat en dat de lijn lang genoeg is om de cortex bij elk volgend keerpunt te kruisen (figuur 5B, eerste en tweede paneel).
    2. Dubbelklik op het pictogram van het gereedschap Lijn op de werkbalk om het venster Lijnbreedte te openen. Vergroot de breedte van de lijn zoveel als nodig is, terwijl het snijpunt tussen de lijn en de cortex een rechte lijn blijft (figuur 5B, derde paneel).
    3. Start de macro Rotating Linescans. Stel het rotatiebereik (figuur 5E) in op een lage waarde (ongeveer 10°) als de oriëntatie van de te meten corticale zone niet veel verandert van het ene tijdspunt naar het andere. Stel de waarde Measure Around in op 0 pixels om alleen het signaal te meten op de lijn waar de maximale signaalintensiteit wordt gedetecteerd, of op hogere waarden om ook het signaal rond deze lijn te meten.
      OPMERKING: De meetwaarde Rond heeft alleen invloed op de signaalmeting na detectie van de cortex en heeft geen invloed op de detectie zelf.
    4. Selecteer in het pop-upmenu Cortex zoeken op kanaal: het kanaal waarop de detectie wordt uitgevoerd. Om te visualiseren waar de cortex op elk tijdstip is gedetecteerd, houdt u het selectievakje Weergavepositie... aangevinkt (aanbevolen). Houd het selectievakje Recenter en heroriënteren... aangevinkt. Klik op OK.
    5. Zodra de status Gereed, Resultaten gekopieerd naar Klembord wordt weergegeven in de imagej-vensterstatus, bladert u door de time-lapse om te controleren of de gedetecteerde cortexposities (gele overlay) en het gemeten gebied (cyaanoverlay) bevredigend zijn. Zo niet, herhaal dan stap 7.3.1–7.3.4 met een andere lijnpositie, lengte of breedte en verschillende instellingen in het venster Opties voor roterende linescans.
    6. Plak de metingen in een spreadsheetsoftware.
      OPMERKING: Kolommen komen overeen met kanalen in de volgorde van hun uiterlijk in de time-lapse en lijnen komen overeen met frames.
  4. Niet-trackingmodus
    1. Selecteer het gereedschap Rechte lijn op de werkbalk. Traceer een lijn (aangegeven in cyaan, figuur 5A) over de te meten corticale zone, zorg ervoor dat de lijn ongeveer loodrecht op de cortex staat en dat de lijn lang genoeg is om de cortex op elk tijdstip te kruisen (figuur 5C, eerste en tweede paneel).
    2. Dubbelklik op het pictogram van het lijngereedschap op de werkbalk om het venster Lijnbreedte te openen. Vergroot de breedte van de lijn zoveel als nodig is, terwijl het snijpunt tussen de lijn en de cortex een rechte lijn blijft (figuur 5C, derde paneel).
    3. Start de macro Rotating Linescans. Stel het rotatiebereik (figuur 5E) in op de richtingsveranderingen van de corticale zone die gedurende de gehele tijdspanne moeten worden gemeten. Stel de waarde Measure Around in op 0 pixels om alleen het signaal te meten op de lijn waar de maximale signaalintensiteit wordt gedetecteerd, of op hogere waarden om ook het signaal rond deze lijn te meten.
      OPMERKING: De meetwaarde Rond heeft alleen invloed op de signaalmeting na detectie van de cortex en heeft geen invloed op de detectie zelf.
    4. Selecteer in het pop-upmenu Cortex zoeken op kanaal: het kanaal waarop de detectie wordt uitgevoerd. Om te visualiseren waar de cortex op elk tijdstip is gedetecteerd, houdt u de weergaveposities... aangevinkt (aanbevolen). Schakel het selectievakje Recenter en Heroriënteren... uit. Klik op OK.
  5. Eenmaal voltooid, worden resultaten gekopieerd naar klembord weergegeven in de imagej-vensterstatus, blader door de time-lapse om te controleren of de gedetecteerde cortexposities (gele overlay) en het gemeten gebied (cyaanoverlay) bevredigend zijn. Zo niet, herhaal dan de vorige stappen met een andere lijnpositie, lengte of breedte en verschillende instellingen in het venster Opties voor Roterende linescans.
  6. Plak de metingen in een spreadsheetsoftware.
    OPMERKING: Kolommen komen overeen met kanalen in de volgorde van hun uiterlijk in de time-lapse en lijnen komen overeen met frames.

Figure 5
Figuur 5: Meting van het corticale signaal met roterende linescan. (A) Een lijn (cyaan) wordt loodrecht op de cortex (zwart) getraceerd waar het signaal zal worden gemeten. Verschillende grijstinten tonen de celpositie die over drie tijdspunten verandert (t1, t2, t3). (B) Links: correcte positionering van de lijn in trackingmodus. Midden: onjuiste positionering van de lijn in trackingmodus omdat er op het volgende keerpunt geen overlap is met de cortex. Rechts: te brede lijn waardoor het snijpunt (oranje lijn) tussen de cortex en de lijn niet recht is. (C) Links: correcte positionering van de lijn in de niet-trackingmodus. Midden: onjuiste positionering van de lijn in niet-trackingmodus omdat er op elk moment geen overlap is met de cortex. Rechts: te brede lijn waardoor het snijpunt (oranje lijn) tussen de cortex en de lijn niet recht is. (D) Lengte en breedte van de scanlijn. (E) Linescans worden uitgevoerd binnen een reeks oriëntaties rond de oorspronkelijke oriëntatie weergegeven in (D) gedefinieerd door de parameter "rotatiebereik", met een interval dat wordt gedefinieerd door de parameter "rotatiestap". (F) Niet-optimale oriëntatie van de scanlijn ten opzichte van de cortex, wat resulteert in een laag signaal gemeten langs de lijn. (G) De optimale oriëntatie van de lijn wordt gedefinieerd als de lijn die resulteert in de hoogste piek van de signaalintensiteit gemeten langs de lijn. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Representative Results

Immobilisatie van Drosophila weefsels met Fibrine stolsels en uitwisseling van kweekmedia tijdens live beeldvorming.
Na te zijn ontleed volgens de procedure gepresenteerd in stap 2 (figuur 1) en geïmmobiliseerd in Fibrin-stolsels op dezelfde coverslip na de procedure gepresenteerd in stap 3 (figuur 2), werden larvale hersenen die GFP-gelabelde Bazooka (Baz::GFP), de vliegenortholoog van het polariteitseiwit Par-3, uitdrukken gedurende 30 minuten afgebeeld in time-lapse confocale beeldvorming met meerdere standen. Baz::GFP wordt gecombineerd met apkcas4, een allel dat acute remming van atypische eiwitkinase C (aPKC) mogelijk maakt door de toevoeging van de kleine ATP analoge 1-NAPP120. 1-NAPP1 werd daarom toegevoegd aan het cultuurmedium na de procedure in stap 4 en live beeldvorming werd gedurende 2,5 uur hervat. Controlehersenen met een wild-achtige versie van de kinase-aPKC reageerden niet op de ATP-analoog, terwijl hersenen met bovendien een analoog-gevoelige mutatie van aPKC (apkcas4) een samentrekking van het neuro-epitheel en heldere clusters van Baz in neuroblasten en hun nageslacht vertoonden ( Figuur6, Video 1). Neuroblasten blijven zich gedurende de time-lapse verdelen, wat aangeeft dat het weefsel gezond blijft, en hersenen vertonen weinig drift ondanks de verandering van het cultuurmedium, wat aangeeft dat ze goed geïmmobiliseerd zijn. Evenzo, na te zijn ontleed na de procedure gepresenteerd in27, ovarioles uitdrukken Baz::GFP werden geïmmobiliseerd in Fibrin stolsels op dezelfde coverslip en afgebeeld gedurende 8 min, waarna toepassing van 1-NAPP1 veroorzaakte de samentrekking van apkcas4 mutant folliculaire cellen, maar niet van controles (Figuur 7, Video 2).

Correctie van laterale en focus drift met behulp van MultiHyperstackReg.
Een hyperstack met zowel laterale als focus drift(Video 3,linker paneel) werd eerst gecorrigeerd voor laterale drift (stap 6.2, Figuur 3, Video 3, middenpaneel), vervolgens focus drift (stap 6.3, Figuur 4, Video 3, rechter paneel) met behulp van de MultiStackReg plugin en de MultiHyperstackReg macro, wat resulteerde in een aanzienlijke vermindering van de bewegingen waargenomen in de oorspronkelijke hyperstack.

Corticale signaalmeting met behulp van roterende linescans
Een neuroblast die Baz uitdrukt::GFP (groen) en het transmembrane-eiwit CD4 gelabeld met een infrarood fluorescerend eiwit (CD4::mIFP, rood) werd afgebeeld tijdens één mitose. Het CD4::mIFP-signaal werd gebruikt als referentie om de cortex op verschillende delen van de neuroblast te detecteren met linescans (stap 7, figuur 5, figuur 8A–C) en het Baz::GFP-signaal werd gemeten op de gedetecteerde posities Figuur 8D). Tijdens hun deling polariseerden neuroblasten tijdelijk door verschillende en tegenovergestelde corticale domeinen vast te stellen: de apicale pool en de basale pool. Baz definieert de apicale pool en, consequent, het Baz::GFP-signaal verhoogd bij de apicale pool van de neuroblast en verlaagd aan de basale pool tijdens de deling (Figuur 8C,D). De positie van de cortex werd bevredigend bijgehouden gedurende de time-lapse (Figuur 8C, Video 4). De Drosophila-lijnen en genotypen worden genoemd in aanvullende tabel 1–2.

Figure 6
Figuur 6: Toepassing van een ATP analoog op geïmmobiliseerde larvale hersenen tijdens live beeldvorming. (A) Levende beeldvorming van twee larvale hersenen die Baz uitdrukken::GFP geïmmobiliseerd op dezelfde coverslip. Het kweekmedium wordt na 0 min veranderd in een concentratie van 10 μM van de ATP analoge 1-NAPP1. Controlehersenen reageren niet zichtbaar op het ATP-analoog, terwijl hersenen met een analoge gevoelige mutatie van aPKC (aPKCAS4) een samentrekking van het neuro-epitheel (pijlpunten) en heldere clusters van Baz in neuroblasten en hun nakomelingen vertonen. Maximale intensiteitsprojectie van 33 plakjes voor een diepte van 23 μM. Schaalbalk: 20 μM. (B) Vergroting van het neuro-epitheel. Schaalbalk: 10 μM. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figure 7
Figuur 7: Toepassing van een ATP-analoog op geïmmobiliseerde eierkamers tijdens live beeldvorming. Live beeldvorming van twee ovarioles die Baz uitdrukken::GFP geïmmobiliseerd op dezelfde coverslip. Het kweekmedium wordt na 0 min veranderd in een concentratie van 10 μM van de ATP analoge 1-NAPP1. Controle-eierkamers reageren niet zichtbaar op de ATP-analoog, terwijl eierkamers met een analoge gevoelige mutatie van aPKC (aPKCAS4) een samentrekking van het epitheel (pijlpunten) vertonen, wat uiteindelijk leidt tot de schijnbare afbraak van aanhangverbindingen. Maximale intensiteitsprojectie van 33 plakjes voor een diepte van 27 μM. Schaalbalk: 20 μM. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 8
Figuur 8: Meting van het corticale signaal met behulp van roterende linescans. (A) Live D. melanogaster neuroblast met Baz::GFP (groen) en CD4::mIFP (rood). Cyaanlijnen: initiële scanlijnen loodrecht getraceerd naar verschillende corticale zones om te meten. Schaalbalk: 5 μM. (B) Identificatie van de cortex (donkerblauwe lijn) met behulp van corticale linescans en CD4::mIFP (rood) als referentiekanaal. Cyaanlijn: gebied gedefinieerd door de parameter "Meten rond" (hier 2 pixels), waarbij het signaal wordt gemeten na cortexdetectie. Schaalbalk: 2 μm. (C) Cyaan: corticale gebieden die tijdens een neuroblastdeling zijn geïdentificeerd door de roterende linescans-methode vanaf de eerste scanlijnen die in (A) worden weergegeven, met CD4::mIFP (rood) als referentiekanaal. Schaalbalk: 5 μM. Pijl: apicale pool. Pijlpunt: basale pool. (D) Meting van de Baz::GFP-signaalintensiteit in de loop van de tijd in de twee overeenkomstige zones die worden geïdentificeerd door roterende linescans weergegeven in (C). Tijdens mitose wordt Baz::GFP tijdelijk verrijkt aan de apicale pool van de neuroblast en is uitgeput van de tegenoverliggende basale pool. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Video 1: Toepassing van media-uitwisseling op geïmmobiliseerde larvale hersenen tijdens live beeldvorming om een remmer toe te voegen, gepresenteerd in figuur 6, schaalbalk: 20 μm. Klik hier om deze video te downloaden.

Video 2: Toepassing van media-uitwisseling op geïmmobiliseerde eierkamers tijdens live beeldvorming om een remmer toe te voegen, weergegeven in figuur 7, schaalbalk: 20 μm. Klik hier om deze video te downloaden.

Video 3: Correctie van laterale en focus drift met behulp van MultiHyperStackReg. Live beeldvorming van een neuroblast die de membraansonde PH::GFP uitdrukt. Xy: enkel brandpuntsvlak. Xz: orthogonale reslice. Links: voor correctie van de drift. Midden: na correctie van de laterale drift. Rechts: na correctie de laterale en focus drift, schaalbalk: 10 μm. Klik hier om deze video te downloaden.

Video 4: Detectie van de cortex met behulp van roterende linescans, weergegeven in figuur 8, schaalbalk: 5 μm. Klik hier om deze video te downloaden.

Aanvullende tabel 1: Genotypen van afgebeelde Drosophila weefsels. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Aanvullende tabel 2: Oorsprong van gebruikte transgenen. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Aanvullend coderingsbestand 1: Oorsprong van gebruikte transgenen. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend coderingsbestand 2: Oorsprong van gebruikte transgenen. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend coderingsbestand 3: Oorsprong van gebruikte transgenen. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussion

Live beeldvorming van hele mount D. melanogaster larvale hersenen biedt de mogelijkheid om asymmetrische neurale stamceldelingen te observeren in omstandigheden die dicht bij een fysiologische context liggen. Het eerste deel van ons protocol introduceert onze aanpak van de dissectie van larvale hersenen. Zoals reeds vermeld13, een kritiek aspect van de voorbereiding is om te voorkomen dat de hersenen beschadigen. Het meest uitdagende aspect hiervan is om de hersenen te scheiden van de naburige fantasieschijven zonder overmatig aan de hersenen te trekken. Onze benadering van "snijden zonder trekken" is om ofwel een slijpbeweging uit te voeren met de uiteinden van een paar tangen, of om een tangpunten langs twee andere tangpunten te schuiven die de verbinding tussen weefsels vasthouden (figuur 1A) terwijl Lerit et al. zaagachtige bewegingen beschrijven met een ontleedpen. We raden de experimenteerder aan om alle benaderingen uit te proberen en de meest geschikte voor zichzelf te gebruiken. We raden ook aan om BSA- of FCS-gecoate pipettips te gebruiken in plaats van dissectietools om geïsoleerde hersenen over te dragen. De coating voorkomt dat weefsels aan het plastic blijven plakken en maakt de veilige overdracht van weefsels mogelijk terwijl ze altijd volledig ondergedompeld blijven, zonder ze te onderwerpen aan een mogelijke voorbijgaande vervorming terwijl ze tijdens de overdracht aan het dissectiegereedschap blijven plakken. Gecoate tips hebben andere voordelen om de overdracht van meerdere hersenen tegelijk mogelijk te maken, wat vooral handig is wanneer het van cruciaal belang is om de verblijfstijd van de monsters binnen een bepaald medium te regelen; ze zijn geschikt voor de overdracht van andere weefsels, zelfs kwetsbare als bijvoorbeeld dikke lichamen; ze zijn geschikt voor een breed scala aan verschillende monstergroottes door grotere uiteinden te gebruiken of het uiteinde van de punt te snijden.

Vervolgens beschrijft dit protocol het gebruik van Fibrinogeenstolling om larvale hersenen op de coverslip van een kweekschaal te immobiliseren. Een hersenen is georiënteerd binnen een daling van cultuurmedium + Fibrinogeen, waarna de stolling wordt geïnduceerd door de toevoeging van Trombine. De vorming van fibrines is geleidelijk en biedt een tijdvenster waarin de oriëntatie van het monster kan worden verfijnd, indien nodig (figuur 2C). Als een lichte compressie van het monster vereist is - wat we afraden in het geval van larvale hersenen - kan het ook fijn worden aangepast door het stolsel min of meer dicht bij het monster te drukken tijdens stap 3.4.4 en 3.5.2. Het belangrijkste voordeel van deze Fibrinogeenstolling ten opzichte van het protocol beschreven in Lerit et al., waarin hersenen zijn gemonteerd tussen een gasdoorlatend membraan en een deklip, is het vermogen om het cultuurmedium te vervangen tijdens live beeldvorming. Een mogelijk voordeel van het gebruik van een gasdoorlatend membraan ten opzichte van ons protocol zou kunnen zijn dat het een optimale oxygenatie van de monsters biedt, wat met onze aanpak beperkter zou kunnen zijn omdat hersenen van de lucht worden gescheiden door het stolsel en een medium. Om deze reden, hoewel we het effect van de hoeveelheid kweekmedium binnen het kweekgerecht niet hebben beoordeeld, stellen we voor om de hoeveelheid kweekmedium bovenop de stolsels te beperken terwijl de stolsels volledig ondergedompeld blijven.

Omdat de manipulatie van de stolsels experimenteel moeilijk en tijdrovend kan zijn, raden we de experimenteerder aan om eerst stolsels zonder monsters te manipuleren. Het moduleren van het volume van de druppel kweekmedium + Fibrinogeen op de deklip, de concentratie van Fibrinogeen of het volume en de concentratie trombine kan helpen de voorbereiding gemakkelijker te maken en kan belangrijk zijn bij het aanpassen van het protocol aan andere soorten weefsels. Met voldoende ervaring met het manipuleren van de stolsels, kunnen verschillende hersenen indien nodig in één stolsel worden geïmmobiliseerd, hoewel het de fijnafstelling van de oriëntatie bemoeilijkt. Op de coverslip kunnen verschillende stolsels worden gevormd, waardoor bijvoorbeeld monsters van verschillende genotypen kunnen worden gebeeldomd. Het is ook mogelijk om verschillende stolsels op dezelfde coverslip bloot te stellen aan verschillende cultuurmedia, hoewel er nooit voor moet worden gezorgd dat de druppels kweekmedium de verschillende stolsels bedekken. Zodra larvale hersenen zijn geïmmobiliseerd en klaar zijn voor live beeldvorming, raden we aan om de aanbevelingen van Lerit et al.13 op te volgen om overmatige fotodamage te voorkomen. We voegen alleen aan deze aanbevelingen toe om niet alleen de hersenen op 25 °C te houden tijdens live beeldvorming met een stadium-incubator, maar ook om deze fase minstens 30 minuten voor te verwarmen voor het begin van de beeldvorming. In onze handen resulteert het niet systematisch doen in een sterke focusdrift.

Het kan in sommige contexten voordelig zijn om gecorreleerde microscopie uit te voeren en een monster te repareren en te immunostaineren na live beeldvorming. Een beperking van het gebruik van Fibrin-stolsels is echter dat het bijna onmogelijk is om een brein mechanisch te isoleren van een stolsel zonder het te beschadigen. Een mogelijke manier om deze beperking te overwinnen zou kunnen zijn om methoden te ontwikkelen om Fibrine-stolsels met Plasmin af te afbraak of om stolseldemontage te induceren door toevoeging van een peptide dat de knoppen nabootst waardoor Fibrin-polymerisatie28mogelijk is. We gebruiken meestal Fibrine-stolsels op monsters variërend van enkele cellen tot 200 μM lange weefsels, maar we kunnen ook met succes immobiliseren in stolsels en beeldhersenen van volwassen hommels van meer dan 3 mm breed. De bovengrens van de steekproefgrootte die in stolsels kan worden geïmmobiliseerd, moet nog worden bepaald. Evenzo, hoewel we meestal geïmmobiliseerde monsters gedurende 4 tot 5 uur in beeld brengen, hebben we neuroblasten in primaire cultuur met succes gedurende maximaal 3 dagen in beeld brengen, wat aangeeft dat het stolsel op zijn minst de levensvatbaarheid op langere termijn niet verstoort. Integendeel, stolsels kunnen de regelmatige vervanging van het medium vergemakkelijken, een vereiste voor beeldvorming op langere termijn, zonder dat hiervoor apparaten zoals peristaltische pompen nodig zijn. Hoewel we de permeabiliteitsparameters van fibrinestolsels niet hebben gemeten, lijkt de vezelige gelachtige aard van de stolsels doordringbaar te zijn door celdoorlatende moleculen. We ontdekten dat Latrunculine A, Colcemid of 1-NAPP1, HALO-tag liganden en andere standaardkleurstoffen die in de celbiologie worden gebruikt, zonder problemen de cellen in het fibrinestolsel bereiken en tot nu toe geen moleculen zijn tegengekomen die door het stolsel zouden worden vastgehouden, wat echter een mogelijkheid is die empirisch moet worden getest.

Kortom, het gebruik van Fibrin-stolsels biedt een betrouwbare en relatief eenvoudig te implementeren manier om levende weefsels te immobiliseren voor live beeldvorming. Afgezien van het nut ervan bij het beperken van laterale drifting, is het vermogen om het cultuurmedium te veranderen tijdens live beeldvorming van onschatbare waarde gebleken voor onze chemische geneticabenadering voor het bestuderen van de asymmetrische celdeling van D. melanogaster neuroblasten21. We verwachten dat deze techniek gunstig zal zijn voor studies in een breed scala van verschillende weefsels, met name als het gaat om chemische genetica of bijvoorbeeld eiwitzelfetikettering29.

Onze MultiHyperStackReg macro is afhankelijk van de TurboReg ImageJ plugin, die opeenvolgende frames of segmenten van een stack uitlijnt, en de MultiStackReg ImageJ plugin, waarmee de transformaties op andere stacks kunnen worden toegepast. MultiHyperStackReg maakt het eenvoudig mogelijk om deze transformaties toe te passen op hyperstacks (stacks met ten minste vier dimensies). Omdat het gebruik van MultiHyperStackReg, zoals we het beschrijven, veel acties vereist en behoorlijk tijdrovend kan worden, hebben we ook de AutoHyperStackReg-macro geschreven, die automatisch alle stappen uitvoert die worden beschreven in stap 6.2 en 6.3. In tegenstelling tot MultiHyperStackReg mist AutoHyperStackReg momenteel echter de mogelijkheid om de uitlijning van een stack te berekenen op basis van een subregio van deze stack, een optie die we soms cruciaal vonden voor een bevredigende uitlijning. Een andere beperking van AutoHyperStackReg is dat het gebruik ervan beperkt is tot vertalingen en niet tot de andere transformaties die worden voorgesteld door TurboReg en MultiStackReg, terwijl MultiHyperStackReg op een hyperstack elk transformatietype kan toepassen als de gebruiker het nodig heeft. Toekomstige releases implementeren deze functies en zijn beschikbaar op GitHub30. Ten slotte biedt onze roterende linescan macro een eenvoudige manier om snel corticale signalen te meten in timelapses, zelfs als de cortex in de loop van de tijd van positie of oriëntatie verandert. Of de trackingmodus of de niet-trackingmodus het meest geschikt is voor analyse, hangt af van de kwaliteit en consistentie van het corticale signaal. De trackingmodus is gemakkelijker te gebruiken omdat de gebruiker niet hoeft te overwegen waar de cortex zal zijn voor elk tijdspunt en in de loop van de tijd grote veranderingen in positie en oriëntatie kan opvangen. Het is echter alleen geschikt als het corticale signaal sterk genoeg blijft voor detectie tijdens de hele film: een falen om iets anders dan de cortex te detecteren (bijv. een helder cytoplasmatisch compartiment dicht bij de cortex) kan de detectie voor elk volgend tijdspunt in gevaar brengen (bijv. het cytoplasmatische compartiment beweegt weg van de cortex en de corticale linescan volgt het voor de rest van de time-lapse). De niet-trackingmodus heeft deze valkuil niet, omdat de detectie beperkt is tot de lijn die oorspronkelijk door de gebruiker werd getrokken (een helder cytoplasmatisch compartiment kan er bijvoorbeeld voor zorgen dat de detectie een paar keer mislukt, maar naarmate het cytoplasmatische compartiment zich van de detectiezone verplaatst, wordt de juiste detectie van de cortex hervat), maar gedraagt zich niet goed als de cortexpositie of oriëntatie in de loop van de tijd veel verandert. De volgende functie (die beschikbaar zal zijn op GitHub30) die moet worden ontwikkeld voor de trackingmodus, is de optie om alleen opgegeven tijdspunten te analyseren en een referentietijdpunt te definiëren (in plaats van het eerste tijdspunt) waarvoor en waarna de detectie zal worden uitgevoerd, waardoor de gebruiker op zijn minst problematische tijdspunten kan voorkomen.

Disclosures

De auteurs hebben niets bekend te maken.

Acknowledgments

Het werk in het Januschke laboratorium wordt ondersteund door Wellcome trust grants 100031/Z/12/A en 1000032/Z/12/A. De weefselbeeldvormingsfaciliteit wordt ondersteund door de subsidie WT101468 van Wellcome.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Albumin bovine serum, BSA Merck 5470
D-(+)-Glucose Sigma G7021
Dimethyl sulfoxide Sigma D2650
Dumont #55 Forceps Fine Science Tools 11255-20
Fetal Bovie Serum, suitable for cell culture Sigma F7524
Fibrinogen from human plasma Sigma F3879
FluoroDish Cell Culture Dish - 35mm, 23 mm well World Precision Instruments FD35-100
PP1 Analog (1NA-PP1) Merck Millipore 529579
Pyrex spot plate with nine depressions Sigma CLS722085-18EA
Schneider's Insect Medium Sigma S0146
Thrombin from bovine plasma Merck T4648

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Restrepo, S., Zartman, J. J., Basler, K. Cultivation and live imaging of Drosophila imaginal discs. Methods in Molecular Biology. 11478, 203-213 (2016).
  2. Tsao, C. K., Ku, H. Y., Lee, Y. M., Huang, Y. F., Sun, Y. H. Long term ex vivo culture and live imaging of Drosophila larval imaginal discs. PloS One. 11 (9), 0163744 (2016).
  3. Cabernard, C., Doe, C. Q. Apical/basal spindle orientation is required for neuroblast homeostasis and neuronal differentiation in Drosophila. Developmental Cell. 17 (1), 134-141 (2009).
  4. Basto, R., et al. Flies without centrioles. Cell. 125 (7), 1375-1386 (2006).
  5. Januschke, J., Gonzalez, C. The interphase microtubule aster is a determinant of asymmetric division orientation in Drosophila neuroblasts. The Journal of Cell Biology. 188 (5), 693-706 (2010).
  6. Rusan, N. M., Peifer, M. A role for a novel centrosome cycle in asymmetric cell division. Journal of Cell Biology. 177 (1), 13-20 (2007).
  7. Dai, W., Montell, D. J. Live imaging of border cell migration in Drosophila. Methods in Molecular Biology. 1407, 153-168 (2016).
  8. Haigo, S. L., Bilder, D. Global tissue revolutions in a morphogenetic movement controlling elongation. Science. 331 (6020), 1071-1074 (2011).
  9. Tissot, N., et al. Distinct molecular cues ensure a robust microtubule-dependent nuclear positioning in the Drosophila oocyte. Nature Communications. 8, 15168 (2017).
  10. Martin, J. L., et al. Long-term live imaging of the Drosophila adult midgut reveals real-time dynamics of division, differentiation and loss. eLife. , (2018).
  11. Cabernard, C., Doe, C. Q. Live imaging of neuroblast lineages within intact larval brains in Drosophila. Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (10), 970-977 (2013).
  12. Sabado, V., Nagoshi, E. Single-cell resolution fluorescence live imaging of Drosophila circadian clocks in larval brain culture. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), (2018).
  13. Lerit, D. A., Plevock, K. M., Rusan, N. M. Live imaging of Drosophila larval neuroblasts. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (89), (2014).
  14. Egger, B., van Giesen, L., Moraru, M., Sprecher, S. G. In vitro imaging of primary neural cell culture from Drosophila. Nature Protocols. 8 (5), 958-965 (2013).
  15. Homem, C. C., Reichardt, I., Berger, C., Lendl, T., Knoblich, J. A. Long-term live cell imaging and automated 4D analysis of drosophila neuroblast lineages. PloS One. 8 (11), 79588 (2013).
  16. Forer, A., Pickett-Heaps, J. D. Cytochalasin D and latrunculin affect chromosome behaviour during meiosis in crane-fly spermatocytes. Chromosome Research: An iIternational Journal On the Molecular, Supramolecular and Evolutionary Aspects of Chromosome Biology. 6 (7), 533-549 (1998).
  17. Pampalona, J., Januschke, J., Sampaio, P., Gonzalez, C. Time-lapse recording of centrosomes and other organelles in Drosophila neuroblasts. Methods in Cell Biology. 129, 301-315 (2015).
  18. Ramat, A., Hannaford, M., Januschke, J. Maintenance of miranda localization in Drosophila neuroblasts involves interaction with the cognate mRNA. Current Biology: CB. 27 (14), 2101-2111 (2017).
  19. Rebollo, E., et al. Functionally unequal centrosomes drive spindle orientation in asymmetrically dividing drosophila neural stem cells. Developmental Cell. 12 (3), 467-474 (2007).
  20. Hannaford, M. R., Ramat, A., Loyer, N., Januschke, J. aPKC-mediated displacement and actomyosin-mediated retention polarize Miranda in Drosophila neuroblasts. eLife. 7, 166 (2018).
  21. Hannaford, M., Loyer, N., Tonelli, F., Zoltner, M., Januschke, J. A chemical-genetics approach to study the role of atypical Protein Kinase C in Drosophila. Development. 146 (2), (2019).
  22. Loyer, N., Januschke, J. The last-born daughter cell contributes to division orientation of Drosophila larval neuroblasts. Nature Communications. 9 (1), 3745 (2018).
  23. Wilcockson, S. G., Ashe, H. L. Drosophila ovarian germline stem cell cytocensor projections dynamically receive and attenuate BMP signaling. Developmental Cell. 50 (3), 296-312 (2019).
  24. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  25. Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).
  26. Busse, B. MultiStackRef [software]. , Available from: http://bradbusse.net/sciencedownloads.html (2011).
  27. Prasad, M., Montell, D. J. Cellular and molecular mechanisms of border cell migration analyzed using time-lapse live-cell imaging. Developmental Cell. 12 (6), 997-1005 (2007).
  28. Chernysh, I. N., Nagaswami, C., Purohit, P. K., Weisel, J. W. Fibrin clots are equilibrium polymers that can be remodeled without proteolytic digestion. Scientific Reports. 2, 879 (2012).
  29. Liss, V., Barlag, B., Nietschke, M., Hensel, M. Self-labelling enzymes as universal tags for fluorescence microscopy, super-resolution microscopy and electron microscopy. Scientific Reports. 5, 17740 (2015).
  30. Loyer, N. ImageJ macros [software]. , Available from: https://github.com/nicolasloyer?tab=repositories (2020).

Tags

Ontwikkelingsbiologie live imaging fibrine clot Drosophila,culture medium exchange ImageJ macro
Toepassingen van immobilisatie van <em>Drosophila-weefsels</em> met fibrinestolsels voor live beeldvorming
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Januschke, J., Loyer, N.… More

Januschke, J., Loyer, N. Applications of Immobilization of Drosophila Tissues with Fibrin Clots for Live Imaging. J. Vis. Exp. (166), e61954, doi:10.3791/61954 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter