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Developmental Biology

लाइव इमेजिंग के लिए फिब्रिन क्लॉट्स के साथ ड्रोसोफिला ऊतकों के स्थिरीकरण के अनुप्रयोग

Published: December 22, 2020 doi: 10.3791/61954
Automatic Translation
1, 1
1Cell & Developmental Biology, School of Life Sciences, University of Dundee

Summary

यह प्रोटोकॉल फिब्रिन क्लॉट्स का उपयोग करके नमूना स्थिरीकरण के अनुप्रयोगों का वर्णन करता है, बहती को सीमित करता है, और लाइव इमेजिंग के दौरान रीएजेंट्स के अलावा और वॉशआउट की अनुमति देता है। नमूनों को एक कवरस्लिप की सतह पर संस्कृति माध्यम युक्त फिब्रिनोजेन की एक बूंद में स्थानांतरित कर दिया जाता है, जिसके बाद थ्रोम्बिन जोड़कर पॉलीमराइजेशन को प्रेरित किया जाता है।

Abstract

ड्रोसोफिला जैविक प्रश्नों की एक विशाल श्रृंखला का अध्ययन करने के लिए एक महत्वपूर्ण मॉडल प्रणाली है। फ्लाई के विभिन्न विकासात्मक चरणों जैसे कल्पनीय डिस्क, वयस्क महिलाओं या वयस्क आंत के लार्वा मस्तिष्क या अंडे के कक्षों से विभिन्न अंगों और ऊतकों को निकाला जा सकता है और समय-चूक माइक्रोस्कोपी के साथ इमेजिंग के लिए संस्कृति में रखा जा सकता है, जो कोशिका और विकासात्मक जीव विज्ञान में मूल्यवान अंतर्दृष्टि प्रदान करता है। यहां, हम ड्रोसोफिला लार्वा दिमाग के विच्छेदन के लिए अपने वर्तमान प्रोटोकॉल का विस्तार से वर्णन करते हैं, और फिर फिब्रिन थक्के का उपयोग करके ग्लास कवरलिप पर लार्वा दिमाग और अन्य ऊतकों को स्थिर और उन्मुख करने के लिए हमारे वर्तमान दृष्टिकोण को पेश करते हैं। इस स्थिरीकरण विधि को केवल संस्कृति माध्यम में फिब्रिनोजेन और थ्रोम्बिन के अलावा की आवश्यकता होती है। यह एक ही संस्कृति पकवान में कई नमूनों के उल्टे माइक्रोस्कोप पर उच्च संकल्प समय चूक इमेजिंग के लिए उपयुक्त है, बहु बिंदु पर जाकर माइक्रोस्कोपी में माइक्रोस्कोप चरण के आंदोलनों के कारण अक्सर पार्श्व बहती को कम करता है और इमेजिंग के दौरान रिएजेंट्स के अलावा और हटाने के लिए अनुमति देता है। हम कस्टम-निर्मित मैक्रो भी पेश करते हैं जिनका उपयोग हम नियमित रूप से बहती के लिए सही करने और समय-चूक विश्लेषण से विशिष्ट मात्रात्मक जानकारी निकालने और संसाधित करने के लिए करते हैं।

Introduction

ड्रोसोफिला जैविक प्रश्नों की एक विशाल श्रृंखला का अध्ययन करने के लिए एक महत्वपूर्ण मॉडल प्रणाली बनी हुई है और दशकों से कई विषयों में ज्ञान को आगे बढ़ाने में उत्कृष्ट प्रदर्शन किया है । एक विशेषता जो इसे विशेष रूप से खड़ा करती है वह यह है कि यह लाइव इमेजिंग के लिए विशेष रूप से अच्छी तरह से अनुकूल है। उपकोशिकीय प्रक्रियाओं या वास्तविक समय में कोशिकाओं और ऊतकों के व्यवहार की निगरानी करने की क्षमता कोशिका और विकासात्मक जीव विज्ञान के लिए प्रासंगिक प्रमुख अवधारणाओं को उत्पन्न करने में योगदान देती रहती है। नमूने और फ्लोरोसेंट अणुओं के व्यवहार का अध्ययन करने के लिए इस तरह के ड्रोसोफिला नमूनों को जीवित और स्वस्थ बनाए रखने के लिए विभिन्न समूहों द्वारा कई सफल प्रोटोकॉल विकसित किए गए हैं। मक्खी से अंग और ऊतक जैसे कल्पनात्मक डिस्क1,2,लार्वा मस्तिष्क3,4,5,6,या वयस्क महिलाओं के अंडे के कक्ष7,8,9,या वयस्क आंत10 उदाहरण के लिए निकाला जा सकता है और समय-चूक माइक्रोस्कोपी के साथ इमेजिंग के लिए संस्कृति में रखा जा सकता है। लाइव इमेजिंग के लिए एक प्रमुख चुनौती यह सुनिश्चित करना है कि नमूना को नमूना अखंडता से समझौता किए बिना इष्टतम संकल्प और स्थिर के लिए इमेजिंग सतह के करीब रखा जाए जो यांत्रिक प्रभावों के प्रति संवेदनशील हो सकता है। उदाहरण के लिए, ड्रोसोफिला लार्वा मस्तिष्क में न्यूरोब्लास्ट या न्यूरॉन्स नामक तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं का अध्ययन करने के लिए, नमूनों को इमेजिंग सतह के करीब रखने से उन्हें सीलकिए गए इमेजिंग कक्षों11, 12,13में संस्कृति मीडिया के साथ कवर करके प्राप्त किया जा सकता है। हालांकि, यह दृष्टिकोण आसानी से मीडिया एक्सचेंज की अनुमति नहीं देता है इस प्रकार पैंतरेबाज़ी के लिए प्रयोगात्मक कमरे को सीमित करता है। वैकल्पिक रूप से, नमूनों को तैयार किया जा सकता है और कोशिकाओं के आसंजन को बढ़ाने के लिए इलाज किए गए कवरस्लिप पर रखा जा सकता है और खुले संस्कृति व्यंजनों में बहु-बिंदु पर जाकर माइक्रोस्कोपी और विस्तारित लाइव-सेल इमेजिंग की अनुमति देता है, जो संभावित रूप से मीडिया एक्सचेंज की अनुमति देता है, लेकिन मीडिया एक्सचेंज14,15के दौरान नमूना बहाव या नुकसान को रोकने के लिए आसान साधन प्रदान नहीं करता है।

फिब्रिन क्लॉट विधि मूल रूप से जीवित क्रेन-फ्लाई शुक्राणुओं16 में मेयोसिस का अध्ययन करने के लिए विकसित की गई है जो इन समस्याओं को दूर करने के लिए विशेष रूप से अनुकूल है। फिब्रिनोजेन को प्रासंगिक संस्कृति माध्यम में भंग कर दिया जाता है, थ्रोम्बिन को जोड़ने से पहले पर्याप्त ग्लास-सतह इमेजिंग कक्ष पर इस समाधान की एक बूंद में रखे गए और उन्मुख नमूने, जिसके परिणामस्वरूप एक अघुलनशील फिब्रिन क्लॉट का तेजी से गठन होता है, एक चिपचिपा रेशेदार जाल जो संस्कृति माध्यम तक नमूने की पहुंच सुनिश्चित करते हुए कांच की सतह और नमूनों का पालन करता है। इसके बाद क्लॉट या सैंपल पोजिशन को परेशान किए बिना मीडियम का आदान-प्रदान किया जा सकता है । इमेजिंग के दौरान संस्कृति मध्यम विनिमय, उदाहरण के लिए, वांछनीय है जब अवरोधकों को मूल विधि के रूप में या धोने या पल्स चेस प्रयोगों के लिए जोड़ा जाना है या जब कोशिकाओं और ऊतकों को रखते हुए लाइव सेल इमेजिंग के दौरान फ्लोरोसेंट रंगों को जोड़ा जाना है। फिब्रिन के थक्के ड्रोसोफिला ऊतकों के साथ - साथ13,17की अलग - अलग कोशिकाओं की इमेजिंग के लिए उपयुक्त हैं । फिब्रिन के थक्के का उपयोग नमूनों को उन्मुख करने में मदद करने के लिए किया जा सकता है, कि उनके आकार या अन्य गुणों के कारण आम तौर पर फिब्रिन क्लॉट के भीतर नमूना स्थिति और थक्के के आकार को जोड़कर वांछित तरीके से उन्मुख नहीं किया जाएगा।

यहां हम अपने वर्तमान फिब्रिन क्लॉट-आधारित इमेजिंग विधियों पर एक अपडेट प्रदान करते हैं और विभाजन-आधारित छवि विश्लेषण के लिए उपकरण प्रदान करते हैं और विकासशील फ्लाई मस्तिष्क में न्यूरोब्लास्ट डिवीजनों का अध्ययन करने के लिए इस विधि के उपयोग पर ध्यान केंद्रित करते हैं। हम नियमित रूप से एक ही संस्कृति पकवान में विभिन्न थक्के में कई नमूनों का पालन करने के लिए Fibrin थक्का विधि का उपयोग करें। यह मैं) सेंट्रोसोम व्यवहार या एमआरएनए स्थानीयकरण लाइव18,19,ii जैसे उपकोशिकीय घटनाओं की इमेजिंग की अनुमति देता है) बहु-बिंदु यात्रा का उपयोग करके एक ही इमेजिंग सेटिंग्स के तहत विभिन्न जीनोटाइप के औषधीय उपचार पर नमूनों के व्यवहार की निगरानी करता है माइक्रोस्कोपी 20 , iii) एंजाइमों21और iv के तीव्र अवरोध के प्रभावों का अध्ययन) लक्षित लेजर-एब्लेशन22 पर अपने शारीरिक वातावरण के भीतर कोशिकाओं के कोशिका विभाजन के अभिविन्यास में परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए बहती को कम करने . जबकि थ्रोम्बिन और फिब्रिनोजेन और फिब्रिन क्लॉट के अवांछित प्रभावों को प्रत्येक नमूने के लिए अनुभवजन्य रूप से परीक्षण करने की आवश्यकता है, यह विधि किसी भी प्रकार के नमूने को स्थिर करने के लिए उपयुक्त है जिसका विश्लेषण लाइव सेल इमेजिंग द्वारा किया जाना है और ड्रोसोफिला में न्यूरोब्लास्ट जीव विज्ञान5,19, 2के कई पहलुओं का अध्ययन करने के लिए सफलतापूर्वक उपयोग किया गयाहै।0, लेकिन यह भी महिला रोगाणु रेखा स्टेम सेल23 के साइटोसेन्सर अनुमानों की गतिशीलता और ड्रोसोफिला महिला अंडे कक्षों की कूप कोशिकाओं के तीव्र aPKC निषेध पर ध्रुवता में परिवर्तन21.

समय-चूक फ्लोरोसेंट इमेजिंग के परिणामस्वरूप जटिल समय-हल किए गए 3डी डेटा सेट की पीढ़ी में परिणाम होता है जिसके लिए इस मात्रात्मक जानकारी को निकालने के तरीकों की आवश्यकता होती है। यहां हम ImageJ-आधारित24 मैक्रो के हमारे आगे के विकास का वर्णन करते हैं जिसका उपयोग हाइपरस्टैक और कस्टम-निर्मित इमेजजे मैक्रो में बहती के लिए सही करने के लिए किया जा सकता है जो ड्रोसोफिला लार्वा दिमाग या प्राथमिक सेल संस्कृति में व्यक्तिगत न्यूरोब्लास्ट के न्यूरोब्लास्ट में कॉर्टिकल प्रोटीन की मात्रा निर्धारित करने के लिए विकसित सेल कॉर्टेक्स में बहु-चैनल फ्लोरेसेंस के अर्ध-स्वचालित मात्राकरण की अनुमति देता है।

Protocol

1. रिएजेंट्स की तैयारी

नोट: इस प्रोटोकॉल में सभी कदम जब तक अन्यथा समझाया कमरे के तापमान पर किया जाता है।

  1. 1x पीबीएस-बीएसए (0.1% w/v) का समाधान तैयार करने के लिए, पीबीएस के 1 एमएल में 1 मिलीग्राम गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) को भंग करें। थ्रोम्बिन 1,000 यूनिट्स का स्टॉक सॉल्यूशन तैयार करने के लिए-1,पीबीएस-बीएसए (01% डब्ल्यू/वी) के 1 मिलीएल में थ्रोम्बिन की 1,000 इकाइयों को भंग करें। 10 माइक्रोन के एलिकोट्स बनाएं और 4 महीने तक -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  2. ड्रोसोफिला दिमाग के लिए संस्कृति माध्यम तैयार करने के लिए, बाँझ परिस्थितियों में श्नाइडर के माध्यम के 1 एल में ग्लूकोज के 1 ग्राम भंग। 3 महीने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर फ़िल्टर और स्टोर करें।
  3. फिब्रिनोजेन समाधान तैयार करने के लिए, कमरे के तापमान पर 20 मिनट या 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए संस्कृति माध्यम के 1 एमएल में 10 मिलीग्राम फिब्रिनोजन भंग करें।
    नोट: यदि चरण 1.2 पर तैयार किए गए एक से अलग संस्कृति माध्यम का उपयोग किया जाता है और फिब्रिन के थक्के पहले से ही इस चरण में बनते हैं, तो संस्कृति माध्यम में सक्रिय थ्रोम्बिन होने की संभावना होती है, जिसे पहले से निष्क्रिय करने की आवश्यकता होती है। थ्रोम्बिन का एक संभावित स्रोत भ्रूण गोजातीय सीरम है, जिसे सीरम को 30 मिनट के लिए 56 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करके निष्क्रिय किया जा सकता है।
  4. पीबीएस-बीएसए (5% डब्ल्यू/वी) का कोटिंग सॉल्यूशन तैयार करने के लिए 1x पीबीएस के 1 एमसीएल में 50 मिलीग्राम गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) को भंग करें।
  5. उदाहरण के लिए स्टेप 4 में इस्तेमाल किए जाने वाले रिएजेंट के लिए, 315 माइक्रोन डिमेथिल सल्फॉक्साइड में 1 मिलीग्राम एनएपी1 को भंग करके 10 mM NAPP1 का स्टॉक समाधान तैयार करें।

2. ड्रोसोफिला लार्वा दिमाग का विच्छेदन

नोट: एक विच्छेदन दूरबीन के तहत इस कदम को अंजाम दें।

  1. पीबीएस युक्त 9-वेल बोरोसिलिकेट ग्लास डिश में एल 3 लार्वा को स्थानांतरित करने के लिए ब्रश का उपयोग करें। लार्वा से अधिकांश फ्लाई फूड को अलग करने के लिए हिलाएं और संस्कृति माध्यम से युक्त एक अन्य अच्छी तरह से स्थानांतरित करें।
  2. अपने पूरे व्यास में एक लार्वा को समझने के लिए संदंश (जैसे, ड्यूमोंट #55) का उपयोग करें, इसके शरीर की लंबाई के बीच में (चित्र 1ए, बीदेखें)। लार्वा को पकड़ते समय, इसे बोरोसिलिकेट प्लेट के एक अन्य कुएं में स्थानांतरित करें जिसमें 200 माइक्रोन ताजा संस्कृति माध्यम होता है।
  3. लार्वा जारी न करें। अपने पूरे व्यास(चित्रा 1 बी)में आधे में लार्वा को काटने के लिए, या तो संदंश युक्तियों(चित्रा 1A,शीर्ष पैनल) के पार्श्व आंदोलन के साथ समझा क्षेत्र पीसने या लार्वा(चित्रा 1A, नीचेपैनल) पकड़े दो संदंश युक्तियों के बीच संदंश की एक और जोड़ी की एक टिप स्लाइड । अपने एक छोर पर खींच कर लार्वा को आधे में न काटें, क्योंकि यह शरीर की लंबाई (चित्रा 1Bमें लाल रेखाएं) को पार करने वाली नसों के माध्यम से उस पर खींचकर मस्तिष्क को नुकसान पहुंचा सकता है।
  4. अपने छल्ली द्वारा लार्वा को पकड़ने के लिए संदंश का उपयोग करें और मस्तिष्क(चित्रा 1C)पर खींचे बिना क्यूटिकल को छीलने के लिए संदंश की एक और जोड़ी। तब तक दोहराएं जब तक मस्तिष्क से निकलने वाली तंत्रिकाएं दिखाई न दें और मस्तिष्क को मुंह के हिस्सों से जोड़ने वाले अंगों तक पहुंच जा सके जैसा कि चित्र 1 डीमें दिखाया गया है ।
  5. मस्तिष्क से निकलने वाली नसों को पकड़ने के लिए संदंश का उपयोग करें। संदंश की अन्य जोड़ी के साथ, चित्रा 1A में दिखाए गए तकनीकों में से किसी का उपयोग करने के लिए मुंह के हिस्सों के लिए मस्तिष्क के बीच संबंध में कटौती, cuticle(चित्रा 1D)के बाकी हिस्सों से मस्तिष्क को अलग ।
  6. वेंट्रल नर्व कॉर्ड से बाहर आने वाले एक्सॉन द्वारा मस्तिष्क को पकड़ने के लिए संदंश का उपयोग करें। चित्रा 1E में ग्रे में चित्रित अंगों को धीरे-धीरे मस्तिष्क से दूर खींचकर बांधना।
    नोट: आंख/एंटीना कल्पनाशील डिस्क (गहरे पीले) पर खींचने के लिए उंहें मस्तिष्क से अलग मत करो । इन ऊतकों के बीच संबंध भी मस्तिष्क को नुकसान पहुंचाए बिना खींच कर टूटने के लिए मजबूत है ।
  7. जबकि अभी भी नसों लोभी पकड़ और मस्तिष्क उन्मुख करने के लिए, आंख के बीच संबंध समझ/ मस्तिष्क पर खींच के बिना इस संबंध में कटौती करने के लिए चित्रा 1A में दिखाए गए तकनीकों में से किसी का उपयोग करें। जांच करें कि क्या मस्तिष्क को अन्य ऊतकों(चित्रा 1G)से उचित रूप से मंजूरी दी गई है और क्षतिग्रस्त नहीं है(चित्रा 1H)। यदि यह नुकसान के लक्षण दिखाता है तो मस्तिष्क को त्याग दें।
  8. पिपेट टिप को कोट करने के लिए पी 20 में और बाहर के साथ कोटिंग समाधान को पिपेट करें। 3 माइक्रोन माध्यम(चित्रा 2 ए, बाएं)के साथ लेपित टिप के साथ मस्तिष्क को पिपेट करें और इसे स्वच्छ संस्कृति माध्यम के 200 माइक्रोन युक्त एक अन्य अच्छी तरह से पिपेट करें।
  9. जब तक पर्याप्त दिमाग विच्छेदित न हो जाए, तब तक चरण 2.2-2.8 दोहराएं, कभी-कभी उस कुएं के संस्कृति माध्यम की जगह लें जिसमें विच्छेदन किए जाते हैं।

Figure 1
चित्रा 1: डी मेलनोगास्टर लार्वा दिमाग का विच्छेदन। (A)संदंश का उपयोग किए बिना काटने के लिए तकनीक। नमूना (पीला हरा) संदंश (शीर्ष पैनल) के सुझावों के बीच जमीन जा रहा है या नमूना (नीचे पैनल) पकड़े संदंश की एक जोड़ी के सुझावों के साथ संदंश टिप की एक जोड़ी की एक टिप चलाकर काटा जा सकता है । (बी-एफ) लार्वा मस्तिष्क को नुकसान पहुंचाए बिना अलग-थलग करने के लिए कदम (पाठ देखें)। लाल: मस्तिष्क। गहरा पीला: आंख/एंटीना डिस्क । नीला पाठ: इसी संदंश के साथ प्रदर्शन करने के लिए कार्रवाई। (जी)कोई दिखाई क्षति के साथ एक अलग मस्तिष्क की उपस्थिति । डी पृष्ठीय पक्ष है और वी पार्श्व दृश्य पर वेंट्रल साइड है। (ज)विच्छेदन के दौरान मस्तिष्क को जरूरत से ज्यादा खींचने के कारण होने वाले सामान्य नुकसान । शीर्ष पैनल: वेंट्रल तंत्रिका कॉर्ड की टुकड़ी। नीचे पैनल: एक पालि का विरूपण। पीछे छोड़ दिया है और पूर्वकाल सभी पैनलों में सही है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

3. फिब्रिन के थक्के के साथ कवरलिप पर स्थिरीकरण

नोट: एक विच्छेदन दूरबीन के तहत इस कदम को अंजाम दें।

  1. एक लेपित टिप के साथ एक P20 पिपेट का उपयोग करें क्योंकि 2.8 चरण में विच्छेदन दिमाग को बोरोसिलिकेट प्लेट के एक अन्य कुएं में स्थानांतरित करने के लिए संस्कृति माध्यम + फिब्रिनोजेन(चित्रा 2 ए)के 200 माइक्रोन युक्त हैं।
  2. एक मस्तिष्क में पिपेट संस्कृति माध्यम + फिब्रिनोजेन के 9 माइक्रोन के साथ। टिप के अंत के साथ लगभग एक 35 मिमी सेल संस्कृति पकवान के कवर ग्लास नीचे को छूने, सामग्री (संस्कृति माध्यम और मस्तिष्क) बाहर पिपेट टिप से बाहर निकलने के तुरंत बाद कवरस्लिप को छूने के लिए संस्कृति माध्यम स्पर्श कर रही है ताकि मस्तिष्क और माध्यम टिप के किनारों को स्लाइड नहीं करते हैं, संभावित रूप से मस्तिष्क(चित्रा 2A)को नुकसान पहुंचाते हैं।
  3. संस्कृति माध्यम + फिब्रिनोजेन ड्रॉप के भीतर मस्तिष्क को धीरे-धीरे पुश और स्थिति में रखने के लिए संदंश की एक जोड़ी या एक बंद जोड़ी संदंश का उपयोग करें।
    नोट: संदंश की एक खुली जोड़ी के साथ ड्रॉप को छूने के परिणामस्वरूप संस्कृति माध्यम को संदंश युक्तियों(चित्रा 2B)के बीच केशिका द्वारा खींचा जा सकता है।
  4. यदि मस्तिष्क के वेंट्रल भाग को इमेज डे करना है, तो क्लॉट(चित्र 2सी)के भीतर मस्तिष्क को ठीक से उन्मुख करने के लिए फिब्रिनोजेन क्लॉटिंग को प्रेरित करें।
    1. मस्तिष्क को बूंद के एक तरफ धकेलें। पी 1 टिप से लैस पी 1 पिपेट के साथ, थ्रोम्बिन समाधान के पिपेट 1 माइक्रोन के साथ, पिपेट टिप के साथ मस्तिष्क के विपरीत दिशा में बूंद के किनारे को छूएं, और थ्रोम्बिन(चित्रा 2 सी,पहली ड्राइंग) को पिपेट करें।
    2. फिब्रिनोजन को बहुलक शुरू करने के लिए 1-2 मिनट की प्रतीक्षा करें, जिसके परिणामस्वरूप ड्रॉप के एक तरफ बादल छाए रहेंगे(चित्रा 2 सी, दूसरीड्राइंग)। धीरे से पुश और "टक" Fibrin थक्का में मस्तिष्क, सुनिश्चित करें कि छवि के लिए हिस्सा (जैसे, वेंट्रल पक्ष) मस्तिष्क को विकृत किए बिना कवरस्लिप के लिए संभव के रूप में बंद है(चित्रा 2C,तीसरी ड्राइंग) ।
    3. मस्तिष्क के पक्ष के करीब थ्रोम्बिन समाधान के 1 माइक्रोन को फिब्रिन क्लॉट में नहीं लपेटा जाता है। (चित्रा 2C,चौथा ड्राइंग) ।
    4. सेट करने के लिए दूसरे फिब्रिन क्लॉट के लिए 2-3 मिनट की प्रतीक्षा करें(चित्रा 2C,पांचवीं ड्राइंग)। थक्के के किनारों पर दबाएं ताकि यह कवरस्लिप के लिए अधिक दृढ़ता से पालन किया जा सके, मस्तिष्क को विकृत न करने का ध्यान रखा जाए(चित्र 2सी, छठेऔर सातवें चित्र)। अगर दिमाग कवरस्लिप से बहुत दूर दिखाई देता है तो उसे ब्रेन के करीब फिब्रिन क्लॉट दबाकर करीब लाएं।
  5. यदि मस्तिष्क के पृष्ठीय भाग को चित्रित किया जाना चाहिए, तो फिब्रिन क्लॉटिंग को इस प्रकार प्रेरित करें(चित्रा 2डी)।
    1. ड्रॉप के केंद्र में मस्तिष्क की स्थिति, कवरस्लिप का सामना करना पड़ पृष्ठीय हिस्सा। एक पतली टिप से लैस P10 पिपेट के साथ, थ्रोम्बिन समाधान के पिपेट 1 माइक्रोन, पिपेट टिप के साथ मस्तिष्क के विपरीत दिशा में बूंद के किनारे को छूएं, और थ्रोम्बिन(चित्रा 2D,पहली ड्राइंग) को पिपेट करें।
    2. फिब्रिनोजेन के लिए पॉलीमराइजिंग शुरू करने के लिए 2-3 मिनट की प्रतीक्षा करें, जिसके परिणामस्वरूप बादल,रेशेदार वर्षा (चित्रा 2D, दूसरीड्राइंग) का गठन होता है। थक्के के किनारों पर दबाएं ताकि यह कवरस्लिप का अधिक दृढ़ता से पालन कर सके, मस्तिष्क को विकृत न करने का ध्यानरखते हुए (चित्र 2डी, तीसराऔर चौथा चित्र)।
  6. यदि कई थक्के नमूनों को कवरस्लिप पर स्थिर किया जाना है तो चरण 3.1-3.5 दोहराएं।
  7. थक्के (एस) के ऊपर लगभग 0.5 सेमी की टिप के अंत के साथ, क्लॉट (एस)(चित्रा 2 बी,दाएं पेट्री डिश) के शीर्ष पर फिब्रिनोजेन ड्रॉपवाइज के बिना संस्कृति माध्यम के धीरे-धीरे 390 माइक्रोन को पिपेट करें। थक्के के किनारों पर संस्कृति माध्यम न जोड़ें क्योंकि यह इसे कवरस्लिप से अलग कर सकता है।
  8. शेष थ्रोम्बिन को धोने के लिए, संस्कृति माध्यम के 300 माइक्रोन को हटाने के लिए एक पिपेट का उपयोग करें और स्वच्छ संस्कृति माध्यम के 300 माइक्रोल जोड़ें, जिससे यह सुनिश्चित हो सके कि थक्के पूरी तरह से डूबे रहें। अतिरिक्त थ्रोम्बिन को धोने के लिए दो बार दोहराएं।

Figure 2
चित्रा 2: फिब्रिन थक्के का उपयोग करके ड्रोसोफिला लार्वा मस्तिष्क का स्थिरीकरण। (क)बीएसए-लेपित पिपेट टिप का उपयोग करके, दिमाग को संस्कृति माध्यम (पीला) से संस्कृति माध्यम + फिब्रिनोजेन समाधान (नारंगी) में स्थानांतरित कर दिया जाता है, फिर संस्कृति माध्यम + फिब्रिनोजेन के 3.5 माइक्रोन के साथ एक संस्कृति पकवान के कवरलिप (हल्के नीले) पर पिपेट किया जाता है। फिब्रिनोजेन क्लॉटिंग को पृष्ठीय या वेंट्रल स्थिति (डी और ईदेखें) में दिमाग को स्थिर करने के लिए थ्रोम्बिन के अलावा प्रेरित किया जाता है। थक्के में सुरक्षित दिमाग बाद में फिब्रिनोजेन के बिना संस्कृति माध्यम में कवर किया जाता है और अतिरिक्त थ्रोम्बिन को तीन बार संस्कृति माध्यम को जोड़कर और हटा दिया जाता है। (ख)कवरस्लिप पर संस्कृति माध्यम + फिब्रिनोजेन (नारंगी) की बूंद के भीतर मस्तिष्क की स्थिति को केवल धीरे से इसे एक बंद जोड़ी संदंश की नोक के साथ धकेलकर समायोजित किया जाना चाहिए, या केवल एक संदंश टिप। संदंश की खुली जोड़ी के साथ ड्रॉप को छूने से संस्कृति माध्यम में परिणाम हो सकता है जो संदंश के सुझावों के बीच केशिका द्वारा खींचा जा रहा है। (ग)वेंट्रल साइड इमेजिंग के लिए लार्वा मस्तिष्क को स्थिति में रखने के लिए कदम (पाठ देखें)। (घ)पृष्ठीय पक्ष इमेजिंग के लिए लार्वा मस्तिष्क की स्थिति के लिए कदम (पाठ देखें) । में(घ)और(ई),हरे: Thrombin । डार्क ऑरेंज: फिब्रिन क्लॉट। पीला नीला: कवरस्लिप। नीले तीर: थक्के को स्थिर करने के लिए कवरस्लिप के खिलाफ धक्का देने के लिए थक्के के किनारों। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

4. लाइव इमेजिंग के दौरान रिएजेंट्स के अलावा

  1. तापमान में बदलाव से बचने के लिए, रिएजेंट्स के साथ समाधान रखें जिसे संस्कृति पकवान के समान तापमान पर जोड़ा जाए, ताकि इसे जोड़ने से पहले इसे उसी तापमान पर लाया जा सके। यदि किसी पर्यावरण कक्ष का उपयोग किया जा रहा है, तो समाधान को कक्ष के भीतर छोड़ दें।
  2. संस्कृति पकवान ही विस्थापित बिना संस्कृति पकवान के ढक्कन हटा दें । आसान हटाने के लिए, इमेजिंग से पहले डिश के शीर्ष पर 35 मिमी डिश के ढक्कन को उल्टा रखें।
  3. एक P1000 पिपेट के साथ, संस्कृति पकवान के अंदर संस्कृति माध्यम की सतह के करीब पिपेट टिप की स्थिति और धीरे से वांछित अभिकर्मक एकाग्रता तक पहुंचने के लिए उस पर अभिकर्मित समाधान की पर्याप्त मात्रा जारी (जैसे, 400 μM NAPP1 के समाधान के 400 माइक्रोन संस्कृति माध्यम पर 10 μM NAPP1) की अंतिम एकाग्रता के लिए , मजबूत प्रवाह पैदा किए बिना जो थक्के को अलग कर सकता है।
  4. संस्कृति पकवान के भीतर समाधान को समरूप बनाने के लिए, पांच बार में और बाहर समाधान की एक छोटी राशि को धीरे-धीरे पिपेट करने के लिए P200 पिपेट का उपयोग करें (उदाहरण के लिए, डिश के भीतर 800 माइक्रोन की मात्रा के लिए 150 माइक्रोन)।
  5. संस्कृति पकवान ही विस्थापित और इमेजिंग फिर से शुरू बिना संस्कृति पकवान के शीर्ष पर ढक्कन की जगह ।

5. लाइव इमेजिंग के दौरान रीएजेंट्स की वॉशआउट

  1. वॉशआउट से पहले, वॉशिंग सॉल्यूशन को कल्चर डिश के समान तापमान पर रखें।
  2. संस्कृति पकवान ही विस्थापित बिना संस्कृति पकवान के ढक्कन हटा दें ।
  3. P200 या P1000 पिपेट के साथ, धीरे-धीरे क्लॉट के शीर्ष को उजागर किए बिना संस्कृति पकवान से कुछ संस्कृति माध्यम को हटा दें (उदाहरण के लिए, पकवान के भीतर संस्कृति माध्यम के 800 माइक्रोन से 600 माइक्रोन निकालें)।
  4. एक P1000 पिपेट के साथ, रीएजेंट को पतला करने के लिए, संस्कृति पकवान के अंदर संस्कृति माध्यम की सतह के करीब पिपेट टिप की स्थिति और धीरे-धीरे धोने के समाधान को जारी करें (उदाहरण के लिए, 6 के कमजोर पड़ने वाले कारक के लिए पकवान के भीतर छोड़े गए संस्कृति माध्यम के 200 μL में धोने के समाधान का 1 मिलियन जोड़ें)।
  5. जब तक रिएजेंट को आवश्यकतानुसार पतला नहीं किया जाता है तब तक चरण 5.3 और 5.4 दोहराएं (उदाहरण के लिए, एक और तीन समान राउंड 12 9 6 के कमजोर पड़ने वाले कारक में परिणाम देंगे, जिससे 10 μM NAPP1 की प्रारंभिक एकाग्रता को 7.7 एनएम तक कम किया जा सकेगा)।
  6. संस्कृति पकवान ही विस्थापित और इमेजिंग फिर से शुरू बिना संस्कृति पकवान के शीर्ष पर ढक्कन की जगह ।

6. त्रिआयामी और/या मल्टीचैनल समय-खामियों पर बहती जाइज़ का सुधार

  1. तैयारी
    1. डाउनलोड करें और इमेजजे24 स्थापितकरें। टर्बोरेग25 और मल्टीस्टैक्रेग26 प्लगइन्स डाउनलोड करें और उन्हें इमेजजे के प्लगइन्स फ़ोल्डर के अंदर रखें।
    2. मल्टीहाइपरस्कैकग्रेग(पूरक कोडिंग फाइल 1)और ऑटोहाइपरस्टैकरेग इमेजजे मैक्रो(पूरक कोडिंग फाइल 2)डाउनलोड करें। मैक्रो इंस्टॉल करने के लिए या तो इमेजजे के प्लगइन्स फोल्डर के अंदर .ijm फाइल रखें या इमेजजे/मैक्रो/स्टार्टअपमैकरोस.txt फाइल में .ijm फाइल की सामग्री जोड़ें ।
    3. ImageJ पर, कई स्लाइस और/या कई चैनलों सहित एक समय-चूक फिल्म खोलें (अब से "हाइपरस्टैक", चित्रा 3A,4Aके रूप में संदर्भित) । यदि समय-चूक में केवल एक टुकड़ा और एक चैनल शामिल है, तो संरेखण सीधे मल्टीस्टैक्रेग का उपयोग करके किया जा सकता है।
  2. मल्टीहाइपर्सस्टक्रेग का उपयोग करके पार्श्व बहाव में सुधार
    1. यह तय करें कि हाइपरस्टैक के किस चैनल और/या स्लाइस का उपयोग संरेखण के संदर्भ के रूप में किया जाना चाहिए । एक चैनल उत्पन्न करने के लिए, एक-स्लाइस संदर्भ स्टैक (अब से "संदर्भ स्टैक" के रूप में संदर्भित), इमेज | पर क्लिक करें डुप्लिकेट..., डुप्लीकेट हाइपरस्टैक चेकबॉक्स पर टिक करें, चैनलों में प्रासंगिक चैनल नंबर टाइप करें (सी): (उदाहरण के लिए, 1-2 को 1से बदलें) और/या स्लाइस में प्रासंगिक चैनल नंबर (z): (उदाहरण के लिए, 1-15 को 8से बदलें), और यह सुनिश्चित करें कि फ्रेम: (टी) में ओके (चित्रा 3B)पर क्लिक करने से पहले सभी फ्रेम (जैसे, 1-50)शामिल हैं ।
    2. वैकल्पिक रूप से 6.2.1 कदम करने के लिए, यदि एक चैनल, एक-स्लाइस संदर्भ स्टैक के लिए कई स्लाइस का प्रक्षेपण पसंद किया जाता है, तो इमेज | पर क्लिक करें ढेर | जेड परियोजना..., पहले और अंतिम स्लाइस और प्रक्षेपण के प्रकार का चयन करें, सुनिश्चित करें कि सभी समय फ्रेम टिक और ठीक पर क्लिक करें। यदि समय-चूक में कई चैनल हैं या तो अप्रासंगिक चैनलों को हटा दें(Image | ढेर | परिणामस्वरूपप्रक्षेपण से स्लाइस हटाएं या चुने हुए संदर्भ चैनल को डुप्लिकेट करें(इमेज | डुप्लीकेट)(चित्रा 3B)।
    3. वैकल्पिक रूप से, टूलबार में आयत उपकरण का चयन करके, ब्याज के क्षेत्र में आयत का पता लगाकर, और इमेज | पर क्लिक करके संदर्भ के रूप में केवल एक भाग का उपयोग करने के लिए संदर्भ स्टैक को क्रॉप करें फसल।
    4. मल्टीस्टैक्रेग शुरू करने के लिए, प्लगइन्स | पर क्लिक करें पंजीकरण | मल्टीस्टैक्रेग। पॉप-अप मेनू स्टैक 1 में:,पिछले चरणों में उत्पन्न एक-चैनल, वन-स्लाइस स्टैक के नाम का चयन करें। पॉप-अप मेनू ट्रांसफॉर्मेशन में:अनुवाद काचयन करें; सेव ट्रांसफॉर्मेशन फाइल चेकबॉक्स पर टिक करें और अन्य सभी क्षेत्रों को अनदेखा करें।
      नोट: परिवर्तन के अन्य प्रकार(25देखें) ।
    5. ठीक हैपर क्लिक करें । अलाइनमेंट फाइल को सेव करने के लिए एक स्थान और नाम चुनें और सेवपर क्लिक करें। संदर्भ स्टैक विंडो पर, फ्रेम को स्वचालित रूप से आगे बढ़ने से रोकने के लिए प्रतीक्षा करें, यह दर्शाता है कि पंजीकरण समाप्त हो गया है(चित्रा 3B)।
    6. यह देखने के लिए संदर्भ स्टैक पर जांच करें कि संरेखण संतोषजनक है या नहीं। यदि नहीं, तो एक अलग संदर्भ टुकड़ा, चैनल और/या फसल के साथ कदम 6.2.1-6.2.5 दोहराएं । संदर्भ ढेर बंद करो।
    7. हाइपरस्टैक विंडो का चयन करें और मल्टीहाइपरस्टैकरेग मैक्रो चलाएं। चरण 6.2.5 में बनाई गई परिवर्तन फ़ाइल का चयन करें और ओपनपर क्लिक करें। संरेखण के लिए प्रतीक्षा करें हर चैनल और/या हाइपरस्टैक के टुकड़े पर लागू किया जाना है, जिस पर प्रत्यय "_aligned" के साथ एक नई खिड़की बिंदु(चित्रा 3C)खुल जाएगा ।
  3. मल्टीहाइपर्सस्टक्रेग का उपयोग करके फोकस बहाव में सुधार
    1. इमेज | पर क्लिक करें गुण..., पिक्सेल चौड़ाई में प्रदर्शित मूल्य की प्रतिलिपि । एक-पिक्सेल स्पेसिंग के साथ एक चैनल हाइपरस्टैक को ऑर्थोगोनली रूप से फिर से रीस्लिक करने के लिए, इमेज | पर क्लिक करें ढेर | रीसलाइस [/]..., आउटपुट स्पेसिंग में पिक्सेल चौड़ाई मूल्य चिपकाएं: संख्यात्मक क्षेत्र; स्टार्ट एट में टॉप का चयन करें: पॉपअप मेनू, टिक इंटरपोलेशन से बचें और ओकेपर क्लिक करें।
      नोट: यदि मेमोरी को इमेजजे पर मुक्त किया जाना है, तो रिस्लाइस के बाद हाइपरस्टैक को बंद किया जा सकता है।
    2. रिस्लिकेशन द्वारा उत्पन्न नई विंडो का चयन करें (अब से "रिसा हुआ हाइपरस्टैक", चित्रा 4Bके रूप में जाना जाता है)। यदि रिस्लिज्ड हाइपरस्टैक में कई चैनल हैं, तो संरेखण करने के लिए एक संदर्भ चैनल का चयन करें और चैनल स्क्रॉल बार में उन्हें चुनकर अन्य चैनलों को हटा दें; इमेज | पर क्लिक करें ढेर | स्लाइस डिलीट करें, डिलीट करेंट पॉपअप मेन्यू में चैनल चुनें और ओकेपर क्लिक करें ।
    3. एक एकल-स्लाइस रिसित हाइपरस्टैक उत्पन्न करें (जिसे अब से "रिस्लिकित संदर्भ स्टैक" कहा जाता है), या तो रिसित हाइपरस्टैक (चरण 6.2.1 देखें) के एक टुकड़े को डुप्लिकेट करके या फिर से स्लाइस हाइपरस्टैक के कई स्लाइस पेश करके (चरण 6.2.2 देखें)(चित्र 4 सी)।
    4. वैकल्पिक रूप से, एक संदर्भ के रूप में छवि के रूप में केवल एक भाग का उपयोग करने के लिए रिस्लाण संदर्भ स्टैक फसल (चरण 6.2.3 देखें)।
    5. MutiStackReg के साथ रिसा हुआ संदर्भ स्टैक पर छवि पंजीकरण करें (चरण 6.2.4-6.2.6)(चित्रा 4C)देखें।
    6. रिस्पना हाइपरस्टैक विंडो का चयन करें और मल्टीहाइपरस्टैकरेग मैक्रो चलाएं। चरण 6.3.5 में बनाई गई परिवर्तन फ़ाइल का चयन करें, ओपन पर क्लिक करें और हाइपरस्टैक के हर चैनल और/या स्लाइस पर लागू होने के लिए संरेखण की प्रतीक्षा करें, जिस पर प्रत्यय "_aligned" के साथ एक नई खिड़की खुलेगी (अब से "रिस्लिकित संदर्भ स्टैक", चित्रा 4D)के रूप में संदर्भित किया जाएगा। मूल रिसा हुआ हाइपरस्टैक बंद करें।
    7. रिस्लाक्ड गठबंधन हाइपरस्टैक को मूल हाइपरस्टैक के जाय दृश्य में बदलने के लिए, स्टैक पर क्लिक करें | Reslice [/]...,स्टार्ट एट में शीर्ष का चयन करें: पॉपअप मेनू, टिक इंटरपोलेशन से बचें और ठीकपर क्लिक करें । एक बार अंतिम फोकस-गठबंधन हाइपरस्टैक के साथ एक नई खिड़की(चित्रा 4E)खुलती है, जो पुनः प्राप्त गठबंधन हाइपरस्टैक को बंद कर देती है।
  4. पार्श्व बहाव को स्वचालित रूप से सही करने और बहाव को ध्यान केंद्रित करने के लिए, ऑटोहाइपरस्कैकरेग मैक्रो चलाएं। संदर्भ चैनल का चयन करें, यदि लागू हो, और क्या पार्श्व और/या फोकस बहाव को सही करना है । ठीक हैपर क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: मल्टीहाइपरस्टैकरीग के साथ पार्श्व बहाव के सुधार के लिए पाइपलाइन। (क)पार्श्व और फोकस ड्रिफ्ट कई स्लाइस और टाइमपॉइंट वाले हाइपरस्टैक पर देखे जा सकते हैं। (ख)एक एकल टुकड़ा, एकल चैनल संदर्भ स्टैक हाइपरस्टैक से उत्पन्न होता है, या तो दोहराव या जेड प्रक्षेपण द्वारा। संदर्भ स्टैक मल्टीस्टैक्रेग प्लगइन द्वारा गठबंधन किया गया है, जो एक संरेखण फ़ाइल उत्पन्न करता है। (ग)मल्टीहाइपरस्टैकरेग मैक्रो का उपयोग संरेखण फ़ाइल को हाइपरस्टैक पर लागू करने के लिए किया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप एक गठबंधन हाइपरस्टैक होता है जिसके लिए पार्श्व बहाव को ठीक किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: मल्टीहाइपर्सटकैक्रेग के साथ फोकस बहाव के सुधार के लिए पाइपलाइन। (क)कई स्लाइस और टाइमपॉइंट वाले हाइपरस्टैक पर फोकस ड्रिफ्ट देखे जा सकते हैं। (ख)हाइपरस्टैक को बिना इंटरपोलेशन के वाई-एक्सिस के साथ पिक्सल की प्रत्येक पंक्ति के साथ ऊपर से आर्थोगोनली रिसा हुआ है । इसके परिणामस्वरूप एक रीस्लाइड हाइपरस्टैक होता है जिसमें हाइपरस्टैक के समान जानकारी होती है, इसके वाई और जेड निर्देशांक बंद हो जाते हैं। मूल हाइपरस्टैक का फोकस बहाव (जेड में) रिस्लित हाइपरस्टैक पर वाई में बहाव के रूप में होता है। (ग)एक एकल टुकड़ा, एकल चैनल रिस्लिकित संदर्भ स्टैक रिस्लाइड हाइपरस्टैक से उत्पन्न होता है, या तो दोहराव या जेड प्रक्षेपण द्वारा। पुन: प्राप्त संदर्भ स्टैक मल्टीस्टैक्रेग प्लगइन द्वारा गठबंधन किया गया है, जो एक संरेखण फ़ाइल उत्पन्न करता है। (घ)मल्टीहाइपरस्टैकरेग मैक्रो का उपयोग रिसेशमेंट फाइल को रिस्लीट हाइपरस्टैक पर लागू करने के लिए किया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप एक गठबंधन पुन: प्राप्त हाइपरस्टैक होता है जिसके लिए फोकस बहाव (वाई में) को ठीक किया जाता है। (ई)एक दूसरा ऑर्थोगोनल रिसाल हाइपरस्टैक के मूल निर्देशांक को पुनर्स्थापित करता है, जो अब एक फोकस बहाव (जेड में) प्रस्तुत नहीं करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

7. घूर्णन लाइनकैन के साथ कॉर्टिकल सिग्नल माप

  1. रोटेटिंग लाइनकैन इमेजजे मैक्रो(पूरक कोडिंग फाइल 3)डाउनलोड करें।
  2. ImageJ में एक समय चूक खोलें। फ्रेम स्क्रॉलबार को पहले फ्रेम में रखें और, यदि समय-चूक में कई स्लाइस होते हैं, तो स्लाइस स्क्रॉलबार को उस स्लाइस में रखें जिस पर सिग्नल मापा जाएगा।
  3. ट्रैकिंग मोड
    1. टूलबार में सीधी लाइन के उपकरण का चयन करें। कॉर्टिकल जोन में एक लाइन को मापा जाना चाहिए(चित्रा 5A),यह सुनिश्चित करने के लिए कि लाइन कॉर्टेक्स के लिए लगभग लंबवत है और यह लाइन हर अगली बार बिंदु(चित्रा 5B, पहले और दूसरे पैनल)पर कॉर्टेक्स को पार करने के लिए पर्याप्त है।
    2. लाइन चौड़ाई खिड़की खोलने के लिए टूलबार में लाइन टूल आइकन को डबल-क्लिक करें। लाइन और कॉर्टेक्स के बीच चौराहे को एक सीधी रेखा(चित्रा 5B, तीसरा पैनल) रखतेसमय लाइन की चौड़ाई को जितना आवश्यक हो, बढ़ाएं।
    3. घूर्णन लाइनकैन मैक्रो शुरू करें। यदि कॉर्टिकल ज़ोन को मापा जाना है तो रोटेशन रेंज(चित्रा 5E)को कम मूल्य (लगभग 10 डिग्री) पर सेट करें, यदि कॉर्टिकल ज़ोन का अभिविन्यास एक समय बिंदु से अगले तक बहुत कुछ नहीं बदलता है। केवल उस लाइन पर सिग्नल को मापने के लिए मूल्य के आसपास के उपाय सेट करें जहां अधिकतम सिग्नल तीव्रता का पता चला है, या इस लाइन के आसपास सिग्नल को मापने के लिए उच्च मूल्यों के लिए।
      नोट: मूल्य के आसपास उपाय केवल प्रांतस्था का पता लगाने के बाद संकेत माप को प्रभावित करेगा और पता लगाने ही प्रभावित नहीं करेगा ।
    4. चैनल पर खोज कॉर्टेक्स पर: पॉपअप मेनू, उस चैनल का चयन करें जिस पर पता लगाया जाएगा। प्रत्येक समय बिंदु पर कॉर्टेक्स का पता कहां लगा है, यह कल्पना करने के लिए, डिस्प्ले पोजीशन रखें... चेकबॉक्स टिक (अनुशंसित)। हाल ही में रखें और reorient... चेकबॉक्स टिक । ठीक हैपर क्लिक करें ।
    5. एक बार किया, क्लिपबोर्ड स्थिति के लिए नकल परिणाम ImageJ खिड़की की स्थिति में प्रदर्शित किया जाता है, समय चूक के माध्यम से स्क्रॉल करने के लिए जांच की है कि पता चला प्रांतस्था पदों (पीले ओवरले) और मापा क्षेत्र (सियान ओवरले) संतोषजनक हैं । यदि नहीं, तो रोटेटिंग लाइनकैन विकल्प विंडो में एक अलग लाइन स्थिति, लंबाई या चौड़ाई और विभिन्न सेटिंग्स के साथ चरण 7.3.1-7.3.4 दोहराएं।
    6. माप को स्प्रेडशीट सॉफ्टवेयर में चिपकाएं।
      नोट: कॉलम समय-चूक में उनकी उपस्थिति के क्रम में चैनलों के अनुरूप हैं और लाइनें फ्रेम के अनुरूप हैं।
  4. नॉन-ट्रैकिंग मोड
    1. टूलबार में सीधी लाइन के उपकरण का चयन करें। कॉर्टिकल जोन में एक लाइन (सियान, चित्रा 5Aमें इंगित) को मापा जाना है, जिससे यह सुनिश्चित हो सके कि लाइन कॉर्टेक्स के लिए लगभग लंबवत है और यह लाइन हर समय बिंदु(चित्रा 5C, प्रथम और दूसरा पैनल)पर कॉर्टेक्स को पार करने के लिए काफी लंबित है।
    2. लाइन चौड़ाई खिड़की खोलने के लिए टूलबार में लाइन टूल आइकन पर डबल-क्लिक करें। लाइन और कॉर्टेक्स के बीच चौराहे को एक सीधी रेखा(चित्रा 5C, तीसरा पैनल) रखतेसमय लाइन की चौड़ाई को जितना आवश्यक हो, बढ़ाएं।
    3. घूर्णन लाइनकैन मैक्रो शुरू करें। पूरे समय-चूक के दौरान मापा जाने वाले कॉर्टिकल जोन के अभिविन्यास के परिवर्तनों के अनुसार रोटेशन रेंज(चित्रा 5E)सेट करें। केवल उस लाइन पर सिग्नल को मापने के लिए मूल्य के आसपास के उपाय सेट करें जहां अधिकतम सिग्नल तीव्रता का पता चला है, या इस लाइन के आसपास सिग्नल को मापने के लिए उच्च मूल्यों के लिए।
      नोट: मूल्य के आसपास उपाय केवल प्रांतस्था का पता लगाने के बाद संकेत माप को प्रभावित करेगा और पता लगाने ही प्रभावित नहीं करेगा ।
    4. चैनल पर खोज कॉर्टेक्स पर: पॉपअप मेनू, उस चैनल का चयन करें जिस पर पता लगाया जाएगा। प्रत्येक टाइमपॉइंट पर कॉर्टेक्स का पता कहां लगा है, इसकी कल्पना करने के लिए, डिस्प्ले पोजीशन रखें... चेकबॉक्स टिक (अनुशंसित) । Untick हाल ही में और Reorient... चेकबॉक्स । ठीक हैपर क्लिक करें ।
  5. एक बार किया, क्लिपबोर्ड के लिए नकल परिणाम ImageJ खिड़की की स्थिति में प्रदर्शित किया जाता है, समय चूक के माध्यम से स्क्रॉल करने के लिए जांच की है कि क्या पता चला प्रांतस्था पदों (पीला ओवरले) और मापा क्षेत्र (सियान ओवरले) संतोषजनक हैं । यदि नहीं, तो घूर्णन लाइनकैन विकल्प विंडो में एक अलग लाइन स्थिति, लंबाई या चौड़ाई और विभिन्न सेटिंग्स के साथ पिछले चरणों को दोहराएं।
  6. माप को स्प्रेडशीट सॉफ्टवेयर में चिपकाएं।
    नोट: कॉलम समय-चूक में उनकी उपस्थिति के क्रम में चैनलों के अनुरूप हैं और लाइनें फ्रेम के अनुरूप हैं।

Figure 5
चित्र 5: घूर्णन लाइनस्कैन के साथ कॉर्टिकल सिग्नल का माप। (A)एक लाइन (सियान) को कॉर्टेक्स (ब्लैक) में लंबवत पता लगाया जाता है जहां सिग्नल को मापा जाएगा । ग्रे के विभिन्न रंगों में सेल की स्थिति तीन टाइमपॉइंट (टी 1, टी-2, टी 3) पर बदलती दिखाई देती है। (ख)लेफ्ट: ट्रैकिंग मोड में लाइन की सही पोजिशनिंग । मध्य: ट्रैकिंग मोड में लाइन की गलत स्थिति के रूप में अगले समय बिंदु पर प्रांतस्था के साथ कोई ओवरलैप नहीं है । सही: पीढ़ी चौड़ी लाइन प्रांतस्था और लाइन के बीच चौराहे (नारंगी लाइन) में जिसके परिणामस्वरूप सीधे नहीं किया जा रहा है । (ग)लेफ्ट: नॉन-ट्रैकिंग मोड में लाइन की सही पोजिशनिंग । मध्य: गैर-ट्रैकिंग मोड में लाइन की गलत स्थिति क्योंकि हर समय बिंदु पर कॉर्टेक्स के साथ कोई ओवरलैप नहीं है। सही: पीढ़ी चौड़ी लाइन प्रांतस्था और लाइन के बीच चौराहे (नारंगी लाइन) में जिसके परिणामस्वरूप सीधे नहीं किया जा रहा है । }स्कैनिंग लाइन की लंबाई और चौड़ाई। (ई)लाइनकैन "रोटेशन चरण" पैरामीटर द्वारा परिभाषित अंतराल पर "रोटेशन रेंज" पैरामीटर द्वारा परिभाषित मूल अभिविन्यास(डी)में दिखाए गए मूल अभिविन्यास के चारों ओर झुकाव की एक श्रृंखला के भीतर किया जाता है। (एफ)कॉर्टेक्स के सापेक्ष स्कैनिंग लाइन का गैर-इष्टतम अभिविन्यास, जिसके परिणामस्वरूप लाइन के साथ मापा गया कम संकेत होता है। (जी)लाइन के इष्टतम अभिविन्यास को एक के रूप में परिभाषित किया गया है जिसके परिणामस्वरूप लाइन के साथ मापा गया सिग्नल तीव्रता का उच्चतम शिखर होता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Representative Results

लाइव इमेजिंग के दौरान फिब्रिन क्लॉट्स और कल्चर मीडियम एक्सचेंज के साथ ड्रोसोफिला ऊतकों का इम्मोबिलाइजेशन।
चरण 2(चित्रा 1)में प्रस्तुत प्रक्रिया के बाद विच्छेदन किए जाने के बाद और चरण 3(चित्रा 2)में प्रस्तुत प्रक्रिया के बाद एक ही कवर्लिप पर फिब्रिन थक्के में स्थिर, लार्वा दिमाग जीएफपी-टैग किए गए बज़ोका (बाज::GFP), ध्रुवीकरण प्रोटीन बराबर-3 के फ्लाई ऑर्थोलॉग, समय-चूक बहु-स्थिति कॉन्फ़िलिंग इमेजिंग में 30 मिनट के लिए इमेजकिए गए थे। बाज:: जीएफपी को एपीकेसीas4के साथ जोड़ा जाता है, जो एक एलील है जो छोटे एटीपी एनालॉग 1-एनएपी120के अलावा असामान्य प्रोटीन किनेज़ सी (एपीकेसी) के तीव्र अवरोध की अनुमति देता है। 1-NAPP1 इसलिए कदम 4 में प्रस्तुत प्रक्रिया के बाद संस्कृति माध्यम में जोड़ा गया था और लाइव इमेजिंग २.५ घंटे के लिए फिर से शुरू किया गया था । किनेज़ एपीकेसी के जंगली प्रकार के संस्करण को ले जाने वाले नियंत्रण दिमाग ने एटीपी एनालॉग पर प्रतिक्रिया नहीं दी, जबकि इसके अतिरिक्त एपीकेसी(एपीकेसीए4) के एनालॉग-संवेदनशील उत्परिवर्तन को ले जाने वाले दिमाग ने न्यूरोब्लास्ट में न्यूरोएपिथेलियम और बाज के उज्ज्वल समूहों और उनकी संतान(चित्रा 6, वीडियो 1)का संकुचन प्रदर्शित किया। न्यूरोब्लास्ट समय-चूक के दौरान विभाजित होते रहते हैं, यह दर्शाता है कि ऊतक स्वस्थ रहता है, और दिमाग संस्कृति माध्यम परिवर्तन के बावजूद थोड़ा बहाव दिखाता है, यह दर्शाता है कि वे अच्छी तरह से स्थिर हैं। इसीतरह, 27में प्रस्तुत प्रक्रिया के बाद विच्छेदन किए जाने के बाद, बाज को व्यक्त करते हुए ओवरियोल्स: जीएफपी को एक ही कवरलिप पर फिब्रिन क्लॉट्स में स्थिर किया गया था और 8 मिनट के लिए चित्रित किया गया था, जिसके बाद 1-एनएपी1 के आवेदन ने एपीकेसीके संकुचन को4 उत्परिवर्ती कूप कोशिकाओं के रूप में प्रेरित किया लेकिन नियंत्रण का नहीं(चित्रा 7, वीडियो 2)।

मल्टीहाइपर्सटकैक्रेग का उपयोग करके पार्श्व और फोकस बहाव में सुधार।
पार्श्व और फोकस बहाव(वीडियो 3, बाएंपैनल) दोनों को प्रदर्शित करने वाले हाइपरस्टैक को पहले पार्श्व बहाव (चरण 6.2, चित्रा 3, वीडियो 3,मध्य पैनल) के लिए सही किया गया था, फिर मल्टीस्टैकरेग प्लगइन और मल्टीहिपर्स्कैक रेग मैक्रो का उपयोग करके फोकस बहाव (चरण 6.3, चित्रा 4,वीडियो 3, राइट पैनल) का उपयोग करके, जिसके परिणामस्वरूप मूल हाइपरटैक में देखी गई आंदोलनों में काफी कमी आई।

घूर्णन लाइनकैन का उपयोग करके कॉर्टिकल सिग्नल माप
बाज को व्यक्त करने वाला एक न्यूरोब्लास्ट:: जीएफपी (ग्रीन) और ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन सीडी 4 को एक अवरक्त फ्लोरोसेंट प्रोटीन (सीडी 4:: mIFP, लाल) के साथ टैग किया गया था। CD4::mIFP संकेत लाइनकैन (चरण 7, चित्रा 5, चित्रा 8ए-सी)और बाज के साथ न्यूरोब्लास्ट के विभिन्न भागों में प्रांतस्था का पता लगाने के लिए एक संदर्भ के रूप में इस्तेमाल किया गया था:: GFP संकेत का पता चला पदों पर मापा गया था चित्रा 8 डी)। अपने विभाजन के दौरान, न्यूरोब्लास्ट ने अलग और विपरीत कॉर्टिकल डोमेन स्थापित करके क्षणिक रूप से ध्रुवीकृत किया: एपिकल पोल और बेसल ध्रुव। बाज एपिकल पोल को परिभाषित करता है और लगातार बाज::जीएफपी सिग्नल न्यूरोब्लास्ट के एपिकल पोल पर बढ़ गया और डिवीजन(चित्रा 8सी, डी)के दौरान बेसल पोल पर कमी आई । कॉर्टेक्स की स्थिति को समय-चूक(चित्रा 8 सी, वीडियो 4)के दौरान संतोषजनक रूप से ट्रैक किया गया था। ड्रोसोफिला लाइनों और जीनोटाइप को पूरक तालिका 1-2में संदर्भित किया गया है।

Figure 6
चित्र 6: लाइव इमेजिंग के दौरान स्थिर लार्वा दिमाग पर एटीपी एनालॉग का आवेदन। (क)बाज को व्यक्त करने वाले दो लार्वा दिमाग की लाइव इमेजिंग::GFP एक ही कवरस्लिप पर स्थिर । संस्कृति माध्यम को 0 मिनट पर एटीपी एनालॉग 1-एनएपी1 के 10 माइक्रोन की एकाग्रता में बदल दिया गया है। नियंत्रण दिमाग एटीपी एनालॉग पर प्रतिक्रिया नहीं देता है जबकि एपीकेसी(एपीकेसीएएएस4)के एनालॉग संवेदनशील उत्परिवर्तन को ले जाने वाला दिमाग न्यूरोप्लास्ट (एरोहेड) और न्यूरोब्लास्ट और उनकी संतान में बाज के उज्ज्वल समूहों का संकुचन प्रदर्शित करता है। 23 माइक्रोन की गहराई के लिए 33 स्लाइस का अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण स्केल बार: 20 माइक्रोन(बी)न्यूरोएपिथेलियम का आवर्धन। स्केल बार: 10 μM. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 7
चित्र 7: लाइव इमेजिंग के दौरान स्थिर अंडे कक्षों पर एटीपी एनालॉग का आवेदन। बाज को व्यक्त करने वाले दो अंडाशय की लाइव इमेजिंग::GFP एक ही कवरस्लिप पर स्थिर है। संस्कृति माध्यम को 0 मिनट पर एटीपी एनालॉग 1-एनएपी1 के 10 माइक्रोन की एकाग्रता में बदल दिया गया है। नियंत्रण अंडा कक्ष एटीपी एनालॉग पर प्रतिक्रिया नहीं देते हैं जबकि एपीकेसी(एपीकेसीएएस4)के एनालॉग संवेदनशील उत्परिवर्तन को ले जाने वाले अंडे के कक्ष एपिथेलियम (एरोहेड) के संकुचन को प्रदर्शित करते हैं जिससे अंततः सगुण जंक्शनों का स्पष्ट टूटना होता है। 27 माइक्रोन की गहराई के लिए 33 स्लाइस का अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण स्केल बार: 20 माइक्रोन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 8
चित्र 8: घूर्णन लाइनकैन का उपयोग करके कॉर्टिकल सिग्नल का माप। (A)लाइव डी मेलनोगेस्टर न्यूरोब्लास्ट एक्सप्रेसिंग बाज:: जीएफपी (ग्रीन) और सीडी 4::mIFP (लाल) । सियान लाइनें: प्रारंभिक स्कैनिंग लाइनों को मापने के लिए विभिन्न कॉर्टिकल क्षेत्रों के लिए लंबवत रूप से पता लगाया गया। स्केल बार: 5माइक्रोनएम(बी)कॉर्टिकल लाइनस्कैन और सीडी 4 का उपयोग करके कॉर्टेक्स (डार्क ब्लू लाइन) की पहचान: :: एमआईएफपी (लाल) संदर्भ चैनल के रूप में। सियान लाइन: "उपाय के आसपास" पैरामीटर (यहां, 2 पिक्सल) द्वारा परिभाषित क्षेत्र, जहां कॉर्टेक्स डिटेक्शन के बाद सिग्नल मापा जाता है। स्केल बार: 2 माइक्रोन(सी)सियान: संदर्भ चैनल के रूप में CD4::mIFP (लाल) का उपयोग करके (ए) में प्रदर्शित प्रारंभिक स्कैनिंग लाइनों से घूर्णन लाइनों विधि द्वारा एक न्यूरोब्लास्ट डिवीजन के दौरान पहचाने गए कॉर्टिकल क्षेत्र। स्केल बार: 5 μM. तीर: एपिकल पोल। एरोहेड: बेसल पोल। (घ)बाज का मापन:: जीएफपी सिग्नल तीव्रता(सी)में प्रदर्शित लाइनकैन घुमाने से पहचाने गए दो संबंधित क्षेत्रों में समय के साथ । माइटोसिस के दौरान, बाज:: जीएफपी न्यूरोब्लास्ट के एपिकल पोल पर क्षणिक रूप से समृद्ध हो जाता है और विपरीत बेसल ध्रुव से समाप्त हो जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

वीडियो 1: लाइव इमेजिंग के दौरान इम्मोबिलाइज्ड लार्वा दिमाग पर मीडिया एक्सचेंज का आवेदन एक अवरोधक जोड़ने के लिए, चित्रा 6में प्रस्तुत, स्केल बार: 20 माइक्रोन: 20 माइक्रोन। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

वीडियो 2: लाइव इमेजिंग के दौरान स्थिर अंडे कक्षों पर मीडिया एक्सचेंज का आवेदन एक अवरोधक जोड़ने के लिए, चित्रा 7में प्रस्तुत, स्केल बार: 20 μm । कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

वीडियो 3: मल्टीहाइपर्सस्टक्रेग का उपयोग करके पार्श्व और फोकस बहाव में सुधार। झिल्ली जांच पीएच व्यक्त करने वाले न्यूरोब्लास्ट की लाइव इमेजिंग::: जीएफपी। Xy: एकल फोकल प्लेन। Xz: ऑर्थोगोनल रिस्लिकए। बाएं: बहाव के सुधार से पहले। मध्य: पार्श्व बहाव के सुधार के बाद। सही: पार्श्व और फोकस बहाव में सुधार के बाद, स्केल बार: 10 माइक्रोन। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

वीडियो 4: घूर्णन लाइनकैन का उपयोग करके कॉर्टेक्स का पता लगाना, चित्रा 8,स्केल बार में प्रस्तुत: 5 माइक्रोन। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक तालिका 1: इमेज्ड ड्रोसोफिला ऊतकों के जीनोटाइप। कृपया इस टेबल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक तालिका 2: ट्रांसजीन की उत्पत्ति का उपयोग किया जाता है। कृपया इस टेबल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक कोडिंग फ़ाइल 1: ट्रांसजीन की उत्पत्ति का उपयोग किया जाता है। इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

पूरे माउंट डी मेलनोगास्टर लार्वा दिमाग की लाइव इमेजिंग एक शारीरिक संदर्भ के करीब स्थितियों में असममित तंत्रिका स्टेम सेल डिवीजनों का निरीक्षण करने का अवसर प्रदान करता है। हमारे प्रोटोकॉल का पहला हिस्सा लार्वा दिमाग के विच्छेदन पर हमारे दृष्टिकोण का परिचय देता है। जैसा कि पहले ही13कहा गया है, तैयारी का एक महत्वपूर्ण पहलू मस्तिष्क को नुकसान पहुंचाने से बचना है। इसका सबसे चुनौतीपूर्ण पहलू मस्तिष्क पर जरूरत से ज्यादा खींचने के बिना पड़ोसी कल्पनाशील डिस्क से मस्तिष्क को अलग करना है। "पुलिंग के बिना काटने" के लिए हमारा दृष्टिकोण या तो संदंश की एक जोड़ी के सुझावों के साथ एक पीसने आंदोलन प्रदर्शन करने के लिए है, या दो अंय संदंश ऊतकों के बीच संबंध पकड़े सुझावों के साथ एक संदंश युक्तियां स्लाइड करने के लिए है(चित्रा 1A)जबकि Lerit एट अल वर्णन एक विच्छेदन पिन के साथ देखा की तरह आंदोलनों की तरह । हम प्रयोगकर्ता को सभी दृष्टिकोणों को आजमाने और अपने लिए सबसे उपयुक्त व्यक्ति को अपनाने की सलाह देते हैं। हम अलग दिमाग को स्थानांतरित करने के लिए विच्छेदन उपकरणों के बजाय बीएसए-या एफसीएस-लेपित पिपेट युक्तियों का उपयोग करने का भी सुझाव देते हैं। कोटिंग ऊतकों को प्लास्टिक से चिपके रहने से रोकता है और ऊतकों के सुरक्षित हस्तांतरण की अनुमति देता है, जबकि उन्हें हमेशा पूरी तरह से डुबोया जाता है, उन्हें संभावित क्षणिक विकृति के अधीन किए बिना क्योंकि वे हस्तांतरण के दौरान विच्छेदन उपकरण से चिपके रहते हैं। लेपित युक्तियों में एक बार में कई दिमाग के हस्तांतरण की अनुमति देने के लिए अन्य फायदे होते हैं, जो विशेष रूप से उपयोगी होता है जब यह किसी विशेष माध्यम के भीतर नमूनों के निवास समय को नियंत्रित करने के लिए महत्वपूर्ण होता है; वे अन्य ऊतकों के हस्तांतरण के लिए उपयुक्त हैं, यहां तक कि नाजुक लोगों के रूप में, उदाहरण के लिए, वसा शरीर; वे बड़े सुझावों का उपयोग करके या टिप के चरम को काटकर विभिन्न नमूना आकारों की एक विस्तृत श्रृंखला को समायोजित कर सकते हैं।

इसके बाद, यह प्रोटोकॉल एक संस्कृति पकवान के कवरस्लिप पर लार्वा दिमाग को स्थिर करने के लिए फिब्रिनोजेन क्लॉटिंग के उपयोग का वर्णन करता है। एक मस्तिष्क संस्कृति माध्यम + फिब्रिनोजेन की एक बूंद के भीतर उन्मुख होता है, जिसके बाद क्लॉटिंग थ्रोम्बिन के अलावा प्रेरित होता है। फिब्रिन गठन क्रमिक है, एक समय खिड़की प्रदान करता है जिसके दौरान नमूने के अभिविन्यास को ठीक-ठाक किया जा सकता है, यदि आवश्यक हो तो(चित्रा 2 सी)। यदि नमूने के एक मामूली संपीड़न की आवश्यकता है - जिसे हम लार्वा दिमाग के मामले में सलाह देते हैं - इसे चरण 3.4.4 और 3.5.2 के दौरान नमूने के अधिक या कम बंद थक्के को दबाकर भी बारीक समायोजित किया जा सकता है। Lerit et al., जिसमें दिमाग एक गैस पारगम्य झिल्ली और एक कवरस्लिप के बीच मुहिम शुरू कर रहे हैं में वर्णित प्रोटोकॉल पर इस Fibrinogen थक्के का मुख्य लाभ, लाइव इमेजिंग के दौरान संस्कृति माध्यम को बदलने की क्षमता है । हमारे प्रोटोकॉल पर गैस पारमने योग्य झिल्ली का उपयोग करने का एक संभावित लाभ यह हो सकता है कि यह नमूनों का इष्टतम ऑक्सीजन प्रदान करता है, जो हमारे दृष्टिकोण के साथ अधिक सीमित हो सकता है क्योंकि दिमाग को थक्के और कुछ माध्यमों से हवा से अलग किया जाता है। इस कारण से, हालांकि हम संस्कृति पकवान के भीतर संस्कृति माध्यम की मात्रा के प्रभाव का आकलन नहीं किया, हम थक्के के शीर्ष पर संस्कृति माध्यम की मात्रा सीमित सुझाव है, जबकि थक्के पूरी तरह से डूबे रखते हुए ।

चूंकि थक्के का हेरफेर प्रयोगात्मक रूप से कठिन और समय लेने वाला हो सकता है, इसलिए हम अनुशंसा करते हैं कि प्रयोगकर्ता पहले नमूनों के बिना थक्के में हेरफेर करने का अभ्यास करे। कवर्लिक पर संस्कृति माध्यम + फिब्रिनोजन की बूंद की मात्रा को मॉडुलन करना, फिब्रिनोजेन की एकाग्रता या थ्रोम्बिन की मात्रा और एकाग्रता तैयारी को आसान बनाने में मदद कर सकती है और प्रोटोकॉल को अन्य प्रकार के ऊतकों में अनुकूल बनाते समय महत्वपूर्ण हो सकती है। थक्के में हेरफेर करने के पर्याप्त अनुभव के साथ, यदि आवश्यक हो तो एक थक्के में कई दिमाग को स्थिर किया जा सकता है, हालांकि यह अभिविन्यास की ठीक ट्यूनिंग को जटिल बनाता है। कई थक्के कवरस्लिप पर बनाए जा सकते हैं, उदाहरण के लिए, विभिन्न जीनोटाइप के नमूनों की छवि के लिए अनुमति देते हैं। विभिन्न संस्कृति मीडिया के लिए एक ही कवर्लिप पर विभिन्न थक्के का पर्दाफाश करना भी संभव है, हालांकि विभिन्न थक्के को कवर करने वाले संस्कृति माध्यम की बूंदों को मिलाने के लिए कभी भी देखभाल नहीं की जानी चाहिए। एक बार लार्वा दिमाग स्थिर और लाइव इमेजिंग के लिए तैयार कर रहे हैं, हम अत्यधिक फोटोडैमेज से बचने के लिए Lerit एट अल की सिफारिशों का पालनकरने की सलाह देते हैं । हम केवल इन सिफारिशों को जोड़ने के लिए न केवल एक मंच इनक्यूबेटर के साथ लाइव इमेजिंग के दौरान 25 डिग्री सेल्सियस पर दिमाग को बनाए रखने के लिए, लेकिन यह भी इमेजिंग की शुरुआत से पहले कम से 30 मिनट के लिए इस चरण को पहले से गरम करने के लिए । हमारे हाथ में, ऐसा करने में नाकाम रहने के लिए व्यवस्थित रूप से एक मजबूत ध्यान बहाव में परिणाम है ।

लाइव इमेजिंग के बाद सहसंबद्ध माइक्रोस्कोपी और फिक्स और इम्यूनोदाता को एक नमूना करने में सक्षम होने के लिए कुछ संदर्भों में यह लाभप्रद हो सकता है। हालांकि, फिब्रिन थक्के का उपयोग करने की एक सीमा यह है कि मस्तिष्क को हानिकारक हुए बिना मस्तिष्क को थक्के से अलग करना लगभग असंभव है। इस सीमा को दूर करने का एक संभावित तरीका प्लास्मिन के साथ फिब्रिन के थक्के को नीचा दिखाने के तरीकों को विकसित करना या फाइब्रिन बहुलीकरण28की अनुमति देने वाले घुंडी की नकल करने वाले पेप्टाइड के अलावा थक्का अलग करने के तरीकों को विकसित करना हो सकता है। हम आम तौर पर एकल कोशिकाओं से लेकर 200 माइक्रोन लंबे ऊतकों तक के नमूनों पर फिब्रिन के थक्के का उपयोग करते हैं, लेकिन हम 3 मिमी से अधिक वयस्क बम्बेबी से थक्के और छवि दिमाग में भी सफलतापूर्वक स्थिर कर सकते हैं। नमूने के आकार की ऊपरी सीमा जिसे थक्के में स्थिर किया जा सकता है, निर्धारित किया जाना बाकी है। इसी तरह, यद्यपि हम आमतौर पर 4 से 5 घंटे के लिए स्थिर नमूनों की छवि रखते हैं, हमने प्राथमिक संस्कृति में न्यूरोब्लास्ट को 3 दिनों तक सफलतापूर्वक इमेज किया, यह दर्शाता है कि थक्का कम से कम दीर्घकालिक व्यवहार्यता में हस्तक्षेप नहीं करता है। इसके विपरीत, थक्के इस उद्देश्य के लिए पेरिस्टाल्टिक पंप जैसे उपकरणों की आवश्यकता के बिना माध्यम के नियमित प्रतिस्थापन, लंबी अवधि के इमेजिंग के लिए एक आवश्यकता की सुविधा दे सकते हैं। जबकि हमने फाइब्रिन थक्के के पारमेबिलिटी मापदंडों को मापा नहीं है, थक्के की रेशेदार जेल जैसी प्रकृति कोशिका पारमग्न अणुओं द्वारा पेनेट्रेबल प्रतीत होती है। हमने पाया कि लैटरुकुलिन ए, कोलसेमिड या 1-एनएपी1, हेलो-टैग लिगांड और सेल बायोलॉजी में उपयोग किए जाने वाले अन्य मानक रंग बिना किसी समस्या के फाइब्रिन क्लॉट में कोशिकाओं तक पहुंचते हैं और अब तक उन अणुओं का सामना नहीं करते हैं जिन्हें थक्के द्वारा बनाए रखा जाएगा, जो हालांकि, एक संभावना है कि अनुभवजन्य परीक्षण की आवश्यकता है।

अंत में, फिब्रिन थक्के का उपयोग करके लाइव इमेजिंग के लिए जीवित ऊतकों को स्थिर करने का एक तरीका लागू करने के लिए एक विश्वसनीय और अपेक्षाकृत आसान प्रदान करते हैं। पार्श्व बहती सीमित करने में अपनी उपयोगिता से परे, लाइव इमेजिंग के दौरान संस्कृति माध्यम को बदलने की क्षमता डी मेलनोगोस्टर न्यूरोब्लास्ट्स21के असममित कोशिका विभाजन का अध्ययन करने के लिए हमारे रासायनिक आनुवंशिकी दृष्टिकोण के लिए अमूल्य साबित हुई है। हम आशा करते हैं कि यह तकनीक विभिन्न ऊतकों की एक विस्तृत श्रृंखला में अध्ययन के लिए फायदेमंद होगी, खासकर यदि वे रासायनिक आनुवंशिकी को शामिल करते हैं या उदाहरण के लिए, प्रोटीन सेल्फ लेबलिंग29।

हमारा मल्टीहाइपरस्टैकरेग मैक्रो टर्बोरेग इमेजजे प्लगइन पर निर्भर करता है, जो स्टैक के लगातार फ्रेम या स्लाइस को संरेखित करता है, और मल्टीस्टैकरेग इमेजजे प्लगइन, जो अन्य स्टैक पर परिवर्तनों को लागू करने की अनुमति देता है। मल्टीहाइपरस्टैकरेग बस इन परिवर्तनों को हाइपरस्टैक (कम से कम चार आयामों के साथ ढेर) पर लागू करने की अनुमति देता है। जैसा कि हम इसका वर्णन करते हैं, मल्टीहाइपर्सस्टक्रेग के उपयोग के लिए बहुत सारे कार्यों की आवश्यकता होती है और काफी समय लगता है, हमने ऑटोहाइपर्सस्टैकरेग मैक्रो भी लिखा, जो स्वचालित रूप से चरण 6.2 और 6.3 में वर्णित सभी चरणों को करता है। हालांकि, मल्टीहाइपरस्कैक्रेग के विपरीत, ऑटोहाइपरस्कैकरीग में वर्तमान में इस स्टैक के उपक्षेत्र के आधार पर स्टैक के संरेखण की गणना करने की संभावना का अभाव है, एक विकल्प जो हमने पाया है वह कभी-कभी एक संतोषजनक संरेखण के लिए महत्वपूर्ण होता है। ऑटोहाइपर्सस्टक्रेग की एक और सीमा यह है कि इसका उपयोग अनुवादों तक सीमित है न कि टर्बोरेग और मल्टीस्टैकरीग द्वारा प्रस्तावित अन्य परिवर्तनों, जबकि मल्टीहाइपरस्टैक रेग किसी भी परिवर्तन प्रकार पर लागू हो सकता है उपयोगकर्ता को इसकी आवश्यकता होनी चाहिए। भविष्य की रिलीज इन कार्यों को लागू करेगी और गिटहब30पर उपलब्ध होगी। अंत में, हमारे घूर्णन लाइनस्कैन मैक्रो समय चूक में कॉर्टिकल संकेतों को जल्दी से मापने का एक आसान तरीका प्रदान करता है, भले ही कॉर्टेक्स समय के साथ अपनी स्थिति या अभिविन्यास को बदलता है। चाहे इसका ट्रैकिंग मोड या इसका गैर-ट्रैकिंग मोड विश्लेषण के लिए सबसे उपयुक्त है, कॉर्टिकल सिग्नल की गुणवत्ता और स्थिरता पर निर्भर करता है। ट्रैकिंग मोड का उपयोग करना आसान है क्योंकि उपयोगकर्ता को इस बात पर विचार करने की आवश्यकता नहीं है कि कॉर्टेक्स हर समय बिंदु के लिए कहां होगा और समय के साथ स्थिति और अभिविन्यास के बड़े बदलावों को समायोजित कर सकता है। हालांकि, यह केवल उपयुक्त है अगर कॉर्टिकल सिग्नल पूरी फिल्म के दौरान पता लगाने के लिए काफी मजबूत रहता है: कॉर्टेक्स (उदाहरण के लिए, कॉर्टेक्स के करीब एक उज्ज्वल साइटोप्लाज्मिक डिब्बे) से कुछ और का पता लगाने में विफलता हर निम्नलिखित टाइमपॉइंट के लिए पता लगाने से समझौता कर सकती है (उदाहरण के लिए, साइटोप्लाज्मिक डिब्बे कॉर्टेक्स से दूर चले जाते हैं और कॉर्टिकल लाइन्स बाकी समय चूक के लिए इसका पालन करते हैं)। गैर-ट्रैकिंग मोड में यह नुकसान नहीं होता है क्योंकि पता लगाने की मूल रूप से उपयोगकर्ता द्वारा खींची गई रेखा तक सीमित है (उदाहरण के लिए, एक उज्ज्वल साइटोप्लाज्मिक डिब्बे का पता लगाने के लिए कुछ समय बिंदुओं के लिए विफल हो सकता है, लेकिन जैसे साइटोप्लाज्मिक डिब्बा डिटेक्शन जोन से दूर चला जाता है, कॉर्टेक्स का उचित पता लगाना शुरू होता है), लेकिन अगर कॉर्टेक्स स्थिति या अभिविन्यास समय के साथ बहुत कुछ बदलता है तो अच्छा व्यवहार नहीं करता है। ट्रैकिंग मोड के लिए विकसित की जाने वाली अगली सुविधा (जो गिटहब30पर उपलब्ध होगी) केवल निर्दिष्ट टाइमपॉइंट का विश्लेषण करने और पहले समय बिंदु के बजाय एक संदर्भ समय बिंदु को परिभाषित करने का विकल्प होगा, जिसके बाद पता लगाया जाएगा, जो उपयोगकर्ता को कम से कम समस्याग्रस्त टाइमपॉइंट से बचने की अनुमति देगा।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

Januschke प्रयोगशाला में काम वेलकम ट्रस्ट अनुदान 100031/Z/12/A और 1000032/Z/12/A द्वारा समर्थित है । टिश्यू इमेजिंग सुविधा वेलकम से अनुदान WT101468 द्वारा समर्थित है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Albumin bovine serum, BSA Merck 5470
D-(+)-Glucose Sigma G7021
Dimethyl sulfoxide Sigma D2650
Dumont #55 Forceps Fine Science Tools 11255-20
Fetal Bovie Serum, suitable for cell culture Sigma F7524
Fibrinogen from human plasma Sigma F3879
FluoroDish Cell Culture Dish - 35mm, 23 mm well World Precision Instruments FD35-100
PP1 Analog (1NA-PP1) Merck Millipore 529579
Pyrex spot plate with nine depressions Sigma CLS722085-18EA
Schneider's Insect Medium Sigma S0146
Thrombin from bovine plasma Merck T4648

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Januschke, J., Loyer, N. Applications of Immobilization of Drosophila Tissues with Fibrin Clots for Live Imaging. J. Vis. Exp. (166), e61954, doi:10.3791/61954 (2020).

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