Summary
العديد من نماذج القوارض من بطانة الرحم محدودة بسبب التعقيد التقني ، والاستنساخ ، و / أو الحاجة إلى الحيوانات المنافقة المناعية أو الفئران مراسل خاص. نحن نقدم نظام مبسط من تحريض الآفات باستخدام أي فأر تجريبي مع نظام تسجيل موضوعي يمكن التحقق منه بشكل مستقل وبدون أي شرط لاستئصال المبيضين أو جراحة البقاء على قيد الحياة.
Abstract
بطانة الرحم هو السبب الرئيسي لآلام الحوض والعقم. يتم تعريفه من خلال وجود أنسجة بطانة الرحم في مواقع خارج الرحم. كان تطوير علاجات جديدة وأدوات تشخيصية لالتهاب بطانة الرحم محدودا ويرجع ذلك جزئيا إلى التحديات في دراسة المرض. خارج الرئيسيات ، وعدد قليل من الثدييات الحيض ، وليس أي تطوير بطانة الرحم العفوية. نماذج القوارض تحظى بشعبية ولكنها تتطلب تحريض اصطناعي من بطانة الرحم، مع العديد من استخدام الفئران إما منقوص المناعة أو الأمراض المستحثة جراحيا. في الآونة الأخيرة، تم إيلاء المزيد من الاهتمام للنماذج التي تنطوي على الحقن داخل الصفاق. نحن نقدم نموذج مورين من بطانة الرحم الذي يدمج العديد من ميزات نماذج بطانة الرحم الموجودة في نظام جديد ومبسط يعتمد على القياس الكمي المجهري بدلا من الدرجات الذاتية. في هذا النموذج، نقوم بالتحفيز الهرموني للفئران المانحة، والحقن داخل الصفاق، ومسح البطن المنهجي وحصاد الأنسجة، والتحديد الكمي النسيجي الذي يمكن إجراؤه والتحقق منه في أي وقت بعد التشريح. ويتطلب هذا النموذج الحد الأدنى من الموارد والتدريب؛ لا يتطلب خبرة فنيي المختبر في جراحة البقاء على قيد الحياة مورين أو في تحديد الآفات بطانة الرحم الإجمالية; يمكن استخدامها في الفئران المنافضة، والنوافض المناعية، و/ أو الفئران المتحولة؛ ويخلق موثوق الآفات بطانة الرحم التي تتسق النسيجية مع مرض بطانة الرحم البشري.
Introduction
بطانة الرحم هو مرض غامض في الجهاز التناسلي للإناث مع أعباء مالية وصحية كبيرة على النساء1،2. مسببات بطانة الرحم غير مفهومة تماما ، وقد تم اقتراح تفسيرات متعددة بما في ذلك الميتابلاسيا السيلومية ، والراحة المولريانية الجنينية ، وتجنيد خلايا السلف المشتقة من نخاع العظم ، والحيض الرجعي3. في حين أن جوانب متعددة من هذه الآليات المقترحة قد تشارك، وليس هناك تفسير واحد يمكن أن يفسر جميع أشكال المرض، والنموذج الرائد لمسببات الأمراض بطانة الرحم هو الحيض الرجعي. الحيض الرجعي هو مرور النفايات السائلة الحيض من خلال قناتي فالوب وإلى تجويف الصفاق. وتشير التقديرات إلى أن 90٪ من النساء الحائض يخضعن بانتظام الحيض الرجعية4،5. وبالنظر إلى هذه الظاهرة الشائعة من الحيض إلى الوراء، لماذا بطانة الرحم يتطور فقط في مجموعة فرعية من النساء غير واضح5. لفهم مسببات هذا المرض بشكل أفضل ، فإن الدراسات البشرية المباشرة غير مجدية والدراسات الحيوانية مبررة.
بطانة الرحم هو التحدي على حد سواء لعلاج ودراسة. انتشار المرض غير معروف ولكن يقدر أن يكون 10٪1. في حين أن بعض الأنواع المتقدمة من بطانة الرحم يمكن تحديدها بدقة من خلال التصوير غير الباضع ، إلا أن التشخيص النهائي لا يتحقق إلا من خلال التحليل النسيجي لعينات الخزعة التي تم الحصول عليها جراحيا ؛ الآفات التي تظهر بصريا أن تكون مريضة، قد يكون في الواقع التليف أو تندب من أسباب أخرى6. شدة ومدى المرض لا يرتبط مع أعراض7.
تتكون آفات بطانة الرحم من أنواع الخلايا غير المتجانسة والسكان الذين يتفاعلون بطرق معقدة داخل البيئة الدقيقة ، وبالتالي ، مما يحد من فائدة النماذج الخلوية8،9. في نماذج فيفو موجودة، ولكن هذه التحديات والقيود المتأصلة10،11،12. نماذج الرئيسيات مثالية ولكن غالبا ما تكون غير مجدية13،14،15. عدد قليل من الثدييات غير الرئيسيات الحيض وتطوير بطانة الرحم تلقائيا16. نماذج القوارض من بطانة الرحم موجودة ولكن كل منها لديه قيود17. العديد من هذه النماذج تتطلب جراحة البقاء على قيد الحياة لخياطة أو زرع أنسجة بطانة الرحم في جدار المتلقي المانحة أو الأمعاء, إضافة التعقيد التقني, الحاجة إلى التخدير, والعوامل المناعية الخلط من الجراحة نفسها18,19,20. وبالإضافة إلى ذلك, نماذج كثيرة تتطلب استئصال المبيضين ومكملات هرمون الاستروجين; في حين زيادة العائد الآفة، وهذا يضيف الوقت، وحساب، وجراحة البقاء على قيد الحياة إضافية. نماذج الحقن داخل الصفاق (IP) لا تتطلب التخدير أو جراحة البقاء على قيد الحياة، وهذه النماذج تحاكي منطقيا الحيض الرجعية أفضل من خياطة نماذج21،22،23. ومع ذلك، فإن معظم نماذج الملكية الفكرية تخضع لمزيد من التباين في موقع الآفة بسبب التشتت العشوائي لشظايا بطانة الرحم بعد الحقن وبالتالي إلى مزيد من التحيز في تحديد الآفات وقياسها.
هنا نقدم نموذج مورين من بطانة الرحم الذي يدمج العديد من الميزات من نماذج بطانة الرحم القائمة في نظام جديد ومبسط وفعال يعتمد على القياس الكمي المجهري بدلا من الدرجات الذاتية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: تمت الموافقة على استخدام الحيوانات في هذه الدراسة من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها (IACUC) في معهد أبحاث كليفلاند كلينك ليرنر. وقد تم تنفيذ جميع معايير رعاية الحيوانات واستخدامها المتاحة للجمهور وفقا للمبادئ التوجيهية من قبل المعاهد الوطنية للصحة. يستخدم هذا الإجراء تقنيات مطهرة. طبق بيتري معقم. برنامج تلفزيوني / المالحة المستخدمة معقمة. يتم تعقيم الأدوات الجراحية للنخر وتشريح الأنسجة عن طريق الأوتوكلاف. نحن نستخدم 70٪ EtOH على الأدوات بين الحالات الحيوانية (إذا كان أكثر من واحد في الدورة الواحدة) لتقليل التلوث.
1. إعداد الفئران المانحة والمتلقية (انظر الشكل 1)
- ضمان وجود الموافقة المناسبة للعمل مع المختبر.
- تحديد سلالة من الماوس. في هذه التجارب ، تم استخدام الفئران البرية والمتحولة التي لها خلفية C57BL/6J ، ولكن المحققين الذين يستخدمون نماذج مماثلة يبلغون عن النجاح مع سلالات الماوس الأخرى مثل فئران BALB / c10. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن للفئران المانحة و/أو المتلقية استخدام نظم المراسلات، مثل فئران GFP أو RFP (انظر الشكل 2 والشكل 3).
- بالنسبة لتوقيت زراعة أنسجة بطانة الرحم، تأكد من أن الفئران المانحة تتراوح أعمارهم بين 22-24 يوما في وقت حقن الغدد المانحة. وهذا يضمن أنها ساذجة إنجابيا، على سبيل المثال، لم تبدأ بعد ركوب الدراجات estrous.
- تأكد من أن الفئران المتلقية سليمة من الناحية الإنجابية (لا يوجد استئصال المبيضين السابق) بين 2-4 أشهر من العمر. في حين لا يلزم، فمن المستحسن لوضع الفراش غارقة في البول من قفص الفئران الذكور بشكل دوري في قفص المتلقي لتسهيل ركوب الدراجات estrous الجارية ومرة أخرى في 72 ساعة قبل زرع الأنسجة بطانة الرحم.
ملاحظة: هذا لن يضمن تزامن دورة استروس من المتلقين، كما وضع البول غارقة الفراش تعتمد اعتمادا كبيرا على كمية الفراش الذكور المستخدمة ولها نتائج متغيرة. إذا كان من المرغوب مزامنة دورة استروس، ثلاث حقن تحت الجلد متتالية من 100 نانوغرام/100 ميكرولتر استراديول سيجلب جميع الحيوانات إلى مرحلة استروس. في حين أننا لم نجد أي فرق في تحريض الآفة على أساس مرحلة دورة استروس، وجدت مجموعات أخرى مرحلة دورة لتكون مهمة10. - حقن تحت الجلد الحوامل ماري مصل Gonadotropin (PMSG، 2 وحدة IU المخفف إلى 200 ميكرولتر) في الفئران المانحة تحت الجلد باستخدام إبرة ناعمة (25-27 G الموصى بها). لا تعطي PMSG للفئران المتلقية ، لأنها ستثير الإباضة وبيئة البروجسترون العالية اللاحقة ، والتي هي أقل تقبلا لتشكيل بطانة الرحم.
ملاحظة: استخدمت نماذج الماوس السابقة إما PMSG أو الإستروجين لتحفيز انتشار بطانة الرحم في الفئران المانحة قبل حصاد بطانة الرحم23. يوصى PMSG للأسباب التالية: نصف عمر PMSG هو 40 ساعة في حين أن نصف عمر 17 بيتا استراديول هو 2 ساعة فقط. استخدام حقنة واحدة تحت الجلد من PMSG في المتبرعين 40 ساعة قبل شراء أنسجة بطانة الرحم يوفر مدة مستدامة من التعرض لتحفيز gonadotropin, الذي يعمل على تحفيز هرمون الاستروجين الذاتية. تتطلب العديد من الاستعدادات للاستروجين الخارجية حقن متعددة لرئيس بشكل كاف بطانة الرحم. - بعد حقن PMSG ، جدولة التشريح ، والمشتريات ، وزرع في المتلقي بين 38-42 ساعة. الوقت حصاد الأنسجة بطانة الرحم بعد حقن gonadotropin لضمان جمع الأنسجة قبل الإباضة, الذي يحدث في 42 ح بعد الحقن. الإباضة تنتج بيئة البروجسترون عالية (P4)، والتي من شأنها أن تقلل من إنشاء الآفات.
2. شراء الأنسجة بطانة الرحم الماوس المانحة
- بعد القتل الرحيم من الماوس المانحة (باستخدام CO 2 غرفةتليها خلع عنق الرحم), رش البطن مع محلول الإيثانول 70٪; وهذا يعمل على الحد من تلوث الأنسجة المشتراة من النباتات الجلدية ومن الشعر المطرود. مع تشريح مقص، وجعل قصاصة عرضية ضحلة في منتصف الخط من خلال الجلد والأنسجة تحت الجلد. ثم استيعاب كل جانب من شق الجلد، واستخدام الجر حادة لفتح البطن.
- التعرف على الرحم. قبل إزالة الرحم، قم بتقليم النسيج الضام المجاور. عبر كل قرن الرحم فقط تحت قناة فالوب الخاصة بهم ومن ثم عبر عنق الرحم لإزالة الرحم بأكمله في الكتلة.
- بعد الإزالة من تجويف البطن، قم بفحص الرحم بعناية وإزالة أي دهون محيطية إضافية أو نسيج الضام. ضع الرحم في قطرة من برنامج تلفزيوني بارد على طبق بيتري. تحديد وتوثيق الكتلة المجمعة للرحم بأكمله.
- عبر كل قرن من صندوق الرحم ، مما يجعل التحويل أقرب إلى الصندوق قدر الإمكان وذلك لتحقيق أقصى قدر من طول كل قرن. باستخدام المعونة من المجهر تشريح، ضع شفرة واحدة من مقص تشريح داخل تجويف القرن الأول، ثم قطع على طول المحور الرئيسي للأنبوب. افتح الأنبوب بعناية، مع الأخذ في الاعتبار أي جانب هو السروسا وأي جانب هو الظهارة.
- وضع 500 سم مكعب من المالحة أو برنامج تلفزيوني على طبق بيتري جديدة; السائل سيبقى معا بسبب التوتر السطحي.
- ثم، إجراء تجزئة الرحم بطريقة موحدة. فمن الأفضل أن يكون عدد أقل من الآفات أكبر من العديد من الآفات الصغيرة. تبدأ بفصل الظهارة عن الميوميتريوم عن طريق الإمساك بطبقة بطانة الرحم وتقشيرها بعيدا.
- بالتناوب، ببساطة تجزئة الأنسجة دون فصل قبالة عضلة الجسم (طالما أن الجانب الظهاري يتعرض تماما)، ولكن الإبقاء على الميوميتريوم يقلل من أهمية فسيولوجيا هذا النموذج لمرض الإنسان. التأكد من أن شظايا كبيرة قدر الإمكان ولكن صغيرة بما يكفي لتمرير من خلال إبرة 18 G; (يوصى ب 1 مم × 1 مم).
- جمع 10-12 من هذه 1 مم × 1 مم شظايا من القرن الأول (الذي يتوافق تقريبا مع 40 ملغ الأنسجة في الفئران C57BL/6J). مكان جمعت شظايا في جمع السائل.
- تنفيذ نفس الخطوات للقرن الرحم الأخرى لما مجموعه حوالي 24 شظايا لكل فأر. توثيق العدد الإجمالي للأجزاء.
3. حقن البريتوني من شظايا الأنسجة في الماوس المتلقي
- يستنشق شظايا 1 مم × 1 مم المعلقة باستخدام الطرف الحاد من حقنة 1 سم مكعب؛ يجب أن يكون إجمالي الحجم 1 مل.
- قم بإرفاق إبرة 18 G بحقنة كاملة وحمل السائل في الإبرة. النظر في حقن وهمية مرة أخرى في طبق بيتري لضمان أن جميع الأنسجة سوف تمر عبر الإبرة.
- خذ الماوس المستلم. إما قبل أو بعد حقن IP، والحصول على مسحة مهبلية من الماوس المتلقي لتوثيق دورة استروس (10 ميكرولتر من المالحة باستخدام حقنة لمبة في فتحة المهبل ومطلي على الشريحة الزجاجية مع coverslip).
- إجراء الحقن داخل الصفاق من شظايا مع حقنة في زاوية 45 درجة، مع الحرص على عدم حقن تحت الجلد.
- إذا بقيت الشظايا بعد الحقن، ارسم 200 ميكرولتر إضافية من السائل في الحقنة للحقن لضمان حقن جميع الشظايا بنجاح بشكل غير متناسب.
- بمجرد التأكد من عدم وجود نزيف أو مضاعفات ، ضع الفئران المتلقية مرة أخرى في أقفاصها وأطعم نظاما غذائيا طبيعيا.
4. حصاد الآفات بطانة الرحم
- قتل الفئران المتلقية في حوالي 21 يوما بعد حقن جزء بعد زرع.
ملاحظة: من التجربة ومن النقاش مع المتعاونين باستخدام نماذج مماثلة، يحدث الحد الأقصى لحجم الآفة وعددها في حوالي 3 أسابيع بعد عملية الزرع؛ بعد 3 أسابيع ، تبدأ الآفات في التراجع في الحجم. يتم استخدام طريقة IACUC المعتمدة للقتل الرحيم. - بعد القتل الرحيم وخلع عنق الرحم ، رش بطن الحيوان بالإيثانول بنسبة 70٪ وخيمة الجلد لقطع سطحيا بمقص تشريح. قطع الجلد والفضاء تحت الجلد مع مقص لفتح البطن بصراحة.
- قبل إجراء أي تشريح آخر ، يتم إجراء مسح كامل للآفات الإجمالية ، مع قياس الحجم بالفرجار وتوثيقه فيما يتعلق بمنطقتهم التشريحية (انظر أدناه).
- إجراء مجموعة كاملة من ثلاث مناطق تشريحية متميزة في الكتلة (بغض النظر عما إذا كان يمكن تقدير الآفات بشكل صارخ أم لا). إذا شوهدت الآفات في مناطق أخرى (مثل الأمعاء) ، فيجب تجاهلها وعدم جمعها ما لم تجتاز الآفة أحد المناطق الثلاث أدناه.
- A = جدار البطن / الصفاق (يمكن إما أن تكون بالارض في كاسيت أو تدحرجت، طالما متسقة بين العينات).
- ب = البنكرياس والدهون السينتيرية.
- C = النسيج الضام شبه الرحمي والدهون (الأنسجة البيضاء اللامعة التي تحيط بالرحم ولكنها لا تنطوي على أي أعضاء أخرى غير المثانة؛ الحرص على عدم خطأ المثانة لآفة).
- ضع كل منطقة تشريح في كاسيت ، وصفت بشكل مناسب ، ووضعها في الفورماتين وعملية وفقا لبروتوكول المختبر للقسم النسيجي.
- كتل الفورماتين القسم في شريحتين (D1 و D2) لكل منطقة نسيج في عمقين موحدة.
5. تسجيل الآفات بطانة الرحم
- المسح الضوئي (في 40x التكبير) وأرشيف الشرائح.
- استخدام برنامج قراءة الشرائح الرقمية، وتحديد أطول مسافة (X) بين حواف آفة بطانة الرحم- ما إذا كانت الحافة تتكون من الغدد أو ستروما-ووضع علامة عليه. يتم تعريف الآفة المستمرة من خلال الغدد المحاطة بالستروما. الخط لا يجتاز بالضرورة فقط الأنسجة بطانة الرحم (كما هو الحال في تحديد نقاط النهاية على شكل غير منتظم أو متموجة التركيز بطانة الرحم) ولكن النقطتين نهاية تحتاج إلى أن تكون متصلة من قبل ستروما المستمر و / أو الغدد (انظر الشكل 4).
- جعل خط ثان (Y) 90 درجة عبر السطر الأول، مع طول السطر الثاني المحددة وفقا للقواعد أعلاه.
- إذا تمت مواجهة آفات متعددة غير متجاورة، فمنح كل منها قياسات X وY الخاصة بها.
- حساب النتيجة النهائية لكل شريحة كما جمع المناطق (س * ص) من كل آفة.
- خذ أكبر الدرجات من الشرائح اثنين (D1 مقابل D2) كنتيجة نهائية لتلك المنطقة (A، B، C).
- مجموع الدرجات من كل منطقة لإعطاء النتيجة المجهرية النهائية لهذا الحيوان.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
للحصول على دليل أولي على تجربة المفهوم ، تم حقن بطانة الرحم المانحة من فئران RFP في الفئران المتلقية للنمط البري. كشفت تلطيخ H &؛ E تأكيد الهستوباثولوجية للهندسة المعمارية الكلاسيكية لآفة بطانة الرحم(الشكل 3A). وأكد المجهر الفلوري أن الآفة الملاحظة المعنية نشأت من المتبرع(الشكل 3ب).
وقد أجريت التجربة الثانية باستخدام 10 متبرعين من النوع البري C57BL/6J و10 متلقين. وتلقى 5 متلقين آخرين علاجا صوريا (حقنوا ب PBS وليس بشظايا بطانة الرحم) وأسندت إليه رقم تعريف عشوائي؛ تم تعمية المراجعين قبل التشريح ومراجعة الهستوباثولوجية.
تلقى جميع المتلقين أنسجة بطانة الرحم المانحة في غضون 42 ساعة من العلاج من المتبرعين PSMG. لم يكن هناك ارتباط بين هذه الفترة الزمنية والوزن الرحمي النهائي أو حجم الآفة. وفي وقت شراء المانحين، كان متوسط الوزن الإجمالي للرحم 54 ± 9.5 ملغ. وبلغ متوسط عدد الأجزاء 22.4 ± 5.2، مما أدى إلى متوسط وزن جزء من 2.5 ± 0.5 ملغ. حدثت جراحة نقطة النهاية إما في اليوم 20 أو اليوم 22 لجميع المتلقين.
مع متوسط عدد الآفات من 1.5 ومتوسط إجمالي قطر الآفة الإجمالية من 3.7 ملم، وهذه النقاط نهاية مماثلة لدراسات أخرى باستخدام نماذج الماوس مع وزن مماثل من شظايا بطانة الرحم حقن (الشكل 2)10. وكان انتشار الآفات لجميع الفئران 80٪. كان لدى الفئران التي لا بها آفات تجزئة بطانة الرحم أكبر بكثير مقارنة بالفئران ذات الآفات (30.5 شظايا إجمالية مقابل 20.3 على التوالي؛ وكان متوسط إجمالي الشظايا لجميع الفئران 22.4) مما أدى إلى انخفاض متوسط حجم الشظايا في وقت الحقن (1.9 ملغ مقابل 2.6 ملغ). كما هو متوقع، لم يكن لدى الضوابط الصورية (التي تم حقنها بشظايا ملحية وليس بطانة الرحم) أي مرض إجمالي أو مجهري. في دراسة لاحقة باستخدام عدد موسع من الفئران ، لم تكن المرحلة estrous من الماوس المتلقي مرتبطة بعدد الآفة أو درجة المرض المجهري.
يبدو أن إجمالي عدد الآفات علامة بديلة ضعيفة لإجمالي عبء الآفة ، حيث كان هناك خلاف بين الفحص الكلي والمرض المجهري الموجود في الأنسجة. في 60٪ (ن = 6) من الحالات، كان هناك اتفاق بين الدرجات العيانية والمجهرية (اتفاق يعرف بأنه يظهر الوجود أو الغياب والفرق في الحجم الإجمالي كان ضمن 3 ملم). ومع ذلك، في 40٪ (ن = 4) من الحالات، كان هناك خلاف، مع 10٪ (ن = 1) من الوقت كان المرض العياني غائبا ولكن المرض المجهري كان موجودا من قبل علم الأنسجة، 10٪ (ن = 1) شوهد مرض العيان على الرغم من عدم وجود بطانة الرحم على الأنسجة التأكيدية (الشكل 5)، و20٪ المتبقية (ن = 2) كان هناك اتفاق في وجود ولكن ليس حجم حجم الآفة. وبالتالي ، فإن الفحص العياني للآفات وحدها لا يكفي للقياس الكمي لعبء مرض بطانة الرحم.
الشكل 1:نظرة عامة على النموذج. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2:المناطق التي تم مسحها من أجل تحديد حجم الآفة. في حين أن الأمعاء وغيرها من المواقع داخل الصفاق يمكن أن تؤوي الآفات ، فمن الأصعب التمييز بين هذه بشكل صارخ ، وسيكون مسح شامل للبطن أكثر كثافة من الوقت مع تناقص العائدات. لذلك ، يتم تنفيذ نهج ثابت ومنهجي لحصاد الأنسجة الكاملة (بغض النظر عما إذا كان المرض الإجمالي موجودا) في المناطق الثلاث الأكثر شيوعا لتشكيل بطانة الرحم: جدار البطن / الصفاق (A) والبنكرياس والدهون المتوسطية(B)والدهون شبه الرحمية(C). وصفت هي صور تمثيلية للنتائج المجهرية للآفات من كل من المناطق الثلاث. 40x التكبير. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3:تحريض بطانة الرحم باستخدام بطانة الرحم الفئران المانحة التعبير عن البروتين الفلوري الأحمر. (أ) قسم H &؛ E من الآفة. (ب) المجهر الفلوري مع تلطيخ DAPI. 40x التكبير. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4:صور تمثيلية للبرنامج المستخدم لقياس أبعاد أبعاد الآفة وتحديد حجم عبء الآفة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: عينات تمثيلية من إجمالي "الآفات" التي ليست بطانة الرحم عن طريق فحص الهستوباثولوجي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
توضح دراستنا أنه يمكن تحريض بطانة الرحم بشكل موثوق في الفئران دون الحاجة إلى استخدام استئصال المبيضين و / أو جراحة البقاء على قيد الحياة ، وأنه يمكن تحديد آفات بطانة الرحم خارج الرحم وقياسها كميا باستخدام مسح موحد للبطن والتحليل النسيجي.
تستخدم العديد من دراسات المورين لبطانة الرحم بطانة الرحم المستحثة جراحيا حيث يتم خياطة بطانة الرحم المانحة في مكانها إلى الأمعاء أو جدار البطن أو غيرها من المواقع داخل الصفاق12و20. هذا له ميزة توحيد حجم وموقع الأنسجة المزروعة. ومع ذلك ، بالإضافة إلى التحديات اللوجستية الإضافية لجراحة البقاء على قيد الحياة ، قد يؤدي هذا إلى متغيرات محيرة من الجراحة نفسها ، بالنظر إلى أن بطانة الرحم مرض التهابي وأنه في بيئة سريرية ، يتطور بطانة الرحم عادة قبل أي إجراء جراحي. الحقن داخل الصفاق، من ناحية أخرى، نماذج أكثر دقة الحيض الرجعية التي يعتقد أنها تسبب غالبية آفات بطانة الرحم.
غالبا ما يتم إجراء استئصال المبيض في نماذج القوارض لتقليل التباين الذي أدخلته الدورة الأستروية. وكما بطانة الرحم هو مرض يعتمد على الهرمونات, ثم تدار جرعات فوقفيزيولوجية من استراديول في هذه الحالات. ويمكن القول إن هذه الممارسة تحد من إمكانية تطبيق نموذج الماوس على الأمراض البشرية. توضح دراستنا أن استئصال المبيضين ليس ضروريا لإنشاء آفات بطانة الرحم بشكل موثوق وأن مرحلة الدورة ال استروس لا تؤثر على القدرة على إنشاء الآفات.
نقص في نماذج الحقن الأخرى داخل الصفاق هو الاعتماد على مقاييس ذاتية لحجم الآفة أو العبء. وفي حين أن استخدام الفرجار أو غيرها من الأدوات قد يوفر تدابير موضوعية، فإن هذه القياسات تسجل وقت حصاد الآفات، وبالتالي لا يمكن التحقق منها فيما بعد وقد تخضع لتباين داخل المراقب. في نموذجنا ، يمكن إجراء القياس الكمي النسيجي والتحقق منه بعد فترة طويلة من التشريح ، مما يعني أن أولئك الذين يؤدون التشريح لا يحتاجون إلى خبرة في تحديد الآفات الإجمالية ويتم تعميةهم بسهولة أكبر فيما يتعلق بالتدخل الذي تم تلقيه. وعلاوة على ذلك، وكما يوضح عملنا، قد لا تكون هناك نسبة من الأمراض عند الاعتماد فقط على الأمراض الجسيمة؛ بالإضافة إلى ذلك ، قد يكون العديد من الآفات المشتبه بها في الواقع فسيولوجيا (على سبيل المثال ، الأنسجة اللمفاوية) أو التليف. وأخيرا، فإن أخذ أقسام موحدة من مناطق تشريحية بأكملها في كل فأر يقلل من التباين. هذا النهج من شراء نفس الكمية من الأنسجة لكل فأر يمنع التأكيد لا مفر منه التي من شأنها أن تحدث مع عينات صغيرة والإفراط في تسجيل عينات كبيرة، لا سيما وأن المرض المجهري قد تكون موجودة.
في نهاية المطاف ، تعمل هذه التحسينات على توحيد وتبسيط النهج ، مما يؤدي إلى نموذج الماوس الذي يمكنه دراسة بطانة الرحم بطريقة عالية الإنتاجية. هذا النموذج هو طريقة قابلة للقول لفحص المسارات وأهداف المخدرات ، ويستخدم مختبرنا حاليا هذا النموذج لدراسة التحقق من صحة الدواء. هذا النموذج مفيد بشكل خاص عند محاولة تحديد الأهمية النسبية للتعبير الجيني الشاذ (أو العلاج الدوائي) في بطانة الرحم المانحة مقابل البيئة الصفاق المتلقية. ويمكن أيضا أن تستخدم مع الفئران مراسل (كما أظهرنا) والفئران منقوص المناعة بالضربة القاضية.
باختصار، نحن نقدم العديد من الابتكارات الهامة التي توفر نموذج مورين مع موثوقية عالية، والاستنساخ، والموضوعية في دراسة بطانة الرحم. نهجنا يتقدم في الميدان ليس فقط من خلال توفير عملية واضحة ومبسطة لتحريض الآفات ولكن أيضا طريقة موحدة لقياس البيانات والإبلاغ عنها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ولا يوجد لدى صاحبي البلاغ تضارب في المصالح يكشفان عنه.
Acknowledgments
نود أن نشكر أعضاء مختبر إعادة الزلازل على مراجعتهم النقدية وأفكارهم أثناء إعداد المخطوطة، وكذلك نواة التصوير والأنسجة في معهد ليرنر للأبحاث لمساعدتهم في جمع البيانات وتحليل البيانات. وقد تم دعم هذا العمل من خلال تمويل منحة داخلية من خلال لجنة برنامج البحوث في كليفلاند كلينك ومنحة خارجية من خلال جمعية التحقيق الإنجابي وباير. كما يتم تمويل البحوث في مختبر الزلازل من خلال الدراجة VeloSano لعلاج، مركز التميز البحثي في سرطان النساء، ومن خلال كرسي لورا J. فوغارتي هبت لأبحاث سرطان الرحم. كليفلاند كلينك تمتلك إذن حقوق الطبع والنشر للشخصية 1 والشكل 2.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Supplies for injecting PMSG into donor mouse | |||
| 1 mL Tuberculin syringe with 27G needle | Fisher Scientific | 14-826-87 | |
| Pregnant mare serum gonadotropin | Sigma-Aldrich | 9002-70-4 | |
| Supplies for necropsy of donor mouse and tissue processing | |||
| 6” serrated forceps, curved tip | Electron Microscopy Sciences | 72993-6C | |
| 70% ethanol solution | Pharmco | 33000HPLCCS4L | 70% solution dilute ethyl acetate 200 proof |
| Analytical balance | Mettler Toledo | ME54TE | |
| Carbon dioxide | TriGas Supplier | ||
| Dissecting tray | Fisher Scientific | S14000 | |
| No. 10 disposable scalpel | Fisher Scientific | NC9999403 | |
| Scissors, curved | Electron Microscopy Sciences | 72941 | |
| Scissors, straight | Electron Microscopy Sciences | 72940 | |
| Stereo microscope | Leica Microsystems | Leica SE 4 | For tissue dissection |
| Sterile phosphate buffered saline (PBS) | Institutional core facility supplies | ||
| Surgical instrument sterilization tray | Electron Microscopy Sciences | 66112-02 | |
| Tissue culture dishes | Fisher Scientific | 08-772E | |
| Weighing dishes | Fisher Scientific | 02-202-103 | |
| Supplies for injecting into recipient mouse | |||
| 1 cc syringe | BD Biosciences | 301025 | |
| 18 G needle | Fisher Scientific | 148265d | |
| 200 uL pipette tip | Fisher Scientific | 02-707-422 | |
| Double distilled water | Institutional core facility supplies | ||
| Latex bulb | Fisher Scientific | 03-448-21 | |
| Micro cover glass slip | VWR | 48366-067 | |
| Microscope slide | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Standard light microscope | Leica Microsystems | DM IL | For evaluating vaginal cytology smears |
| Supplies for harvesting tissue from recipient mouse | |||
| 10% Buffered formalin | Fisher Scientific | SF100-4 | |
| Biopsy foam pads | Fisher Scientific | 22-038-222 | |
| Precision Digital Calipers | Electron Microscopy Sciences | 62065-40 | |
| Processing/embedding cassettes | Fisher Scientific | 22-272416 |
References
- Zondervan, K. T., Becker, C. M., Missmer, S. A.
- Schwartz, K., Llarena, N. C., Rehmer, J. M., Richards, E. G., Falcone, T. The role of pharmacotherapy in the treatment of endometriosis across the lifespan. Expert Opinion on Pharmacotherapy. 21 (8), 893-903 (2020).
- Giudice, L. C.
- D'Hooghe, T. M., Debrock, S. Endometriosis, retrograde menstruation and peritoneal inflammation in women and in baboons. Human Reproduction Update. 8 (1), 84-88 (2002).
- Ahn, S. H., et al. Pathophysiology and immune dysfunction in endometriosis. BioMed Research International. 2015, (2015).
- Falcone, T., Flyckt, R.
- Vercellini, P., et al. Association between endometriosis stage, lesion type, patient characteristics and severity of pelvic pain symptoms: a multivariate analysis of over 1000 patients. Human Reproduction. 22 (1), 266-271 (2007).
- Bulun, S. E., et al.
- Brueggmann, D., et al. Novel three-dimensional in vitro models of ovarian endometriosis. Journal of Ovarian Research. 7, 17 (2014).
- Dodds, K. N., Beckett, E. A. H., Evans, S. F., Hutchinson, M. R. Lesion development is modulated by the natural estrous cycle and mouse strain in a minimally invasive model of endometriosis. Biology of Reproduction. 97 (6), 810-821 (2017).
- Martinez, J., Bisbal, V., Marin, N., Cano, A., Gómez, R. Noninvasive monitoring of lesion size in a heterologous mouse model of endometriosis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (144), (2019).
- Pelch, K. E., Sharpe-Timms, K. L., Nagel, S. C. Mouse model of surgically-induced endometriosis by auto-transplantation of uterine tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (59), e3396 (2012).
- Nishimoto-Kakiuchi, A., et al. Spontaneous endometriosis in cynomolgus monkeys as a clinically relevant experimental model. Human Reproduction. 33 (7), Oxford, England. 1228-1236 (2018).
- Nair, H. B., et al. An efficient model of human endometriosis by induced unopposed estrogenicity in baboons. Oncotarget. 7 (10), 10857-10869 (2016).
- Laganà, A. S., et al. Translational animal models for endometriosis research: a long and windy road. Annals of Translational Medicine. 6 (22), 431 (2018).
- Bellofiore, N., et al. First evidence of a menstruating rodent: the spiny mouse (Acomys cahirinus). Amercian Journal of Obstetrics and Gynecology. 216 (1), 1-11 (2017).
- Bruner-Tran, K. L., Mokshagundam, S., Herington, J. L., Ding, T., Osteen, K. G. Rodent models of experimental endometriosis: identifying mechanisms of disease and therapeutic targets. Current Women's Health Reviews. 14 (2), 173-188 (2018).
- Bilotas, M. A., et al. Interplay between endometriosis and pregnancy in a mouse model. PloS One. 10 (4), 0124900 (2015).
- Peterse, D., et al. Of mice and women: a laparoscopic mouse model for endometriosis. Journal of Minimally Invasive Gynecology. 25 (4), 578-579 (2018).
- Richards, E. G., et al. KLF11 is an epigenetic mediator of DRD2/dopaminergic signaling in endometriosis. Reproductive Sciences. 224 (8), Thousand Oaks, Calif. 1129-1138 (2017).
- Jones, R. L., Lang, S. A., Kendziorski, J. A., Greene, A. D., Burns, K. A. Use of a Mouse Model of Experimentally Induced Endometriosis to Evaluate and Compare the Effects of Bisphenol A and Bisphenol AF Exposure. Environmental Health Perspectives. 126 (12), 127004 (2018).
- Greaves, E., et al. A novel mouse model of endometriosis mimics human phenotype and reveals insights into the inflammatory contribution of shed endometrium. The American Journal of Pathology. 184 (7), 1930-1939 (2014).
- Nothnick, W. B., Graham, A., Holbert, J., Weiss, M. J. miR-451 deficiency is associated with altered endometrial fibrinogen alpha chain expression and reduced endometriotic implant establishment in an experimental mouse model. PloS One. 9 (6), 100336 (2014).
